Souris

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection de composés, un stress chronique de trois semaines par glucocorticoïdes dans l'eau de boisson, un gavage d'un marqueur fluorescent ou des jeûnes suivis de repas gras, puis une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever l'intestin. Le porteur étudie la perméabilité intestinale et sa modulation par le stress ou les lipides, à l'aide d'une méthode d'imagerie qu'il présente comme sensible. Sur le remplacement, il affirme que seule une approche in vivo rend compte de la complexité physiologique de l'intestin.

Objectifs

Le contrôle de la perméabilité intestinale joue un rôle crucial dans son rôle de barrière intestinale contrôlant l’entrée de nombreux nutriments ou xénobiotiques (adjuvants, médicaments, drogues), potentiellement toxiques ou de microbes, dans le tube digestif tout en permettant une digestion optimale des nutriments. De nombreux cas de stress psychologique ou de fragilités ou de pathologies intestinales ont été associés à une augmentation de la perméabilité intestinale. Elle peut être observée de façon transitoire ou permanente et consiste souvent en un passage paracellulaire, c'est à dire entre les cellules épithéliales, mais parfois aussi par passage par absorption à l’intérieur de ces cellules. Une très faible perméabilité est déjà existante à bas bruit dans le tissu sain, notamment au niveau des cellules caliciformes, productrices de mucus et des cellules M des ganglions lymphoïdes. Nous souhaitons identifier et caractériser la perméabilité paracellulaire sur tissu sain et mesurer l’impact d’un stress sur une potentielle augmentation ainsi que celle de la nutrition standard ou enrichie en graisse, en une prise unique. Cette étude sera menée en parallèle sur épithélium en culture cellulaire et sur l’intestin de souris et utilisant une nouvelle méthode d’étude de la perméabilité paracellulaire par imagerie que nous avons développée. Elle a le mérite d’être sensible et d’identifier quelles sont les cellules perméables dans l’épithélium, de permettre une analyse dans une partie ou dans l’ensemble de l’intestin grêle et colique. C’est une méthode ex vivo sur tissus prélevés après euthanasie ce qui est nécessaire pour une appréhension de la physiologie intestinale tout en limitant le stress et la souffrance des animaux.

Bénéfices attendus

La perméabilité intestinale est mesurée de longue date. Elle peut rester difficile à identifier et localiser précisément dans l’intestin, pour ensuite la relier à des pénétrations tissulaires de nutriments ou xénobiotiques et aux réponses physiopathologiques qui peuvent en découler. Nous avons développé une nouvelle technique d’imagerie cellulaire qui permet de localiser précisément les régions intestinales perméables, les cellules impliquées, certaines molécules ou organismes pénétrant dans le tissu et leurs modes d’entrée. Ceci nous permet une analyse fine du processus en visualisant les évènements de perméabilité ou la pénétration de composés qui ont eu lieu ex vivo, à l’aide de marqueurs fluorescents visibles à postériori par imagerie des tissus fixés post mortem. Nous nous en servirons pour caractériser les perméabilités intestinales chez des souris en condition physiologique normale, lors d’un stress chronique ou pendant la digestion classique d’un aliment standard ou gras. Les bénéfices attendus sont des mesures précises et reproductibles des perméabilités intestinales paracellulaires ou transcellulaires dans une barrière intacte ou potentiellement fragilisée un stress ou par l’alimentation. Ces expériences permettront une meilleure connaissance et compréhension de ces processus de perméabilité intestinale et de leur analyse expérimentale.

Procédures

Dans une expérience, 36 animaux seront maintenus une fois en contention et recevront une injection en sous cutanée ou en intrapéritonéal de composés non toxiques, d’une durée totale de 30 secondesd'une durée totale de 30 secondes. Dans une autre expérience, une mesure de la perméabilité intestinale in vivo, 24 souris vigiles seront mises à jeun de nourriture mais pas de boisson, soumises à un gavage unique avec un marqueur fluorescent non toxique et enfin, un petit volume de sang sera prélevé dans une durée totale de 30 secondes, à l’aide d’une lancette dans la veine latérale de la queue préalablement anesthésiée. Dans une dernière expérience, 64 souris seront mises à jeun de nourriture mais pas d’eau, pendant 12 heures puis alimentées pendant 1 heure avec des croquettes pauvres ou enrichies en graisse. Elles seront ensuite maintenues sans nourriture pour 3 heures (pic de digestion lipidique par l’intestin, 32 animaux) ou 8 heures pour une fin complète de la digestion lipidique (8 animaux).

Impact sur les animaux

Certains animaux recevront une injection intrapéritonéale ou sous-cutanée unique de composés à des doses pharmacologiques non toxiques qui seront aussi peu stressantes et peu douloureuses. Un stress chronique de 3 semaines sera induit chez certaines souris par addition de faibles doses de glucocorticoïdes dans l’eau de boisson, donc sans contrainte ou intervention directe sur les animaux. Il s’agit d’un stress à bas bruit donc peu contraignant pour les animaux. Certains animaux recevront une administration unique orale par gavage d’une solution fluorescente aqueuse et non toxique, effectué par des expérimentateurs formés. Les animaux auront au préalable été habitués au gavage en vue de réduire le stress que cela pourrait engendrer chez eux. Des prises de sang à la queue seront aussi effectuées par ponction dans la veine latérale de la queue, sous analgésie locale après désinfection. La ponction n'entraine pas de saignement prolongé de l’animal. Ceci permettra de mesurer le passage du marqueur fluorescent depuis l'intestin vers le sang. Ces prises de sang seront effectuées par des personnes expérimentées. A la fin de chaque expérimentation, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour une analyse post mortem de leur intestin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, l’arrêt total du cœur et de la circulation sanguine seront vérifiés et leur intestin sera prélevé.

Remplacement

Seule une approche in vivo d’activation des récepteurs cholinergiques, du stress chronique ou de l’effet d’une digestion physiologique nous permettra de prendre en compte la complexité physiologique de l’intestin des souris étudiées et de ces régulations nutritionnelles immunitaires, nerveuses et sanguines dans la mesure de la perméabilité intestinale.

Réduction

Pour les expériences 1 (traitement cholinergique) et 3 (digestion lipidique) le nombre d’animaux sera réduit à 8 par condition, pour permettre de s’assurer de la reproductibilité et de la validité scientifique du travail. Pour l’expérience 2 de stress aux glucocorticoïdes, sera effectuée qui nécessitera 12 souris témoins et 12 traitées aux glucocorticoïdes. En effets, des expériences antérieures effectuées dans le laboratoire ont montré que ces nombres de 8 ou 12 animaux sont nécessaires pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement solides et fiables dans l’analyse de la perméabilité intestinale in vivo, mais aussi une validation par les expériences d’imagerie ex vivo sur les intestins prélevés.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages transparentes pour ne pas souffrir d’isolement et leur bon état de santé sera suivi journellement par le personnel de l’animalerie. Chaque cage sera agrémentée d’un tunnel en inox pour raffinement. La température et l’hygrométrie seront maintenues constantes. Pour leur confort, un change de litière hebdomadaire sera effectué et l'accès à l'eau sera illimité. L'accès à la nourriture sera aussi illimité, à part certains animaux qui seront ponctuellement mis à jeun de nourriture avant gavage avec un marqueur fluorescent ou avant alimentation par des croquettes témoins ou enrichies en huile. Lors de l’étude de la prise alimentaire de croquettes pendant une heure, les souris seront isolées pour pouvoir quantifier leur prise alimentaire. Elles seront ensuite replacées dans leur cage d’origine. Les interventions sur les animaux (contention, injections intrapéritonéales ou sous-cutanée, gavages et prises de sang à la queue) seront réalisées par des techniciens expérimentés et après une habituation des souris, afin de limiter leur stress. Les prises de sang seront effectuées à l’aide d’une lancette sur la veine latérale des queues préalablement anesthésiées et désinfectées. Tout signe de modification du comportement des animaux indiquant un point limite en terme de souffrance physique ou psychique et de perte de poids entrainera l’exclusion des animaux concernés qui seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les expériences seront effectuées sur des souris jeunes adultes de 8 à 12 semaines dont la croissance est terminée et dont le développement physiologique de l’intestin est achevé en utilisant une lignée couramment utilisée pour l’étude de la physiologie intestinale, du stress psychologique et de l’absorption et du métabolisme des lipides et qui montre une barrière intestinale intacte sous régime standard.

2000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales, des traitements répétés par voies orale, intraveineuse ou intracardiaque, des prélèvements de sang et de moelle osseuse, et pour certains une mesure de mécanique pulmonaire par trachéotomie sous anesthésie profonde avant euthanasie. Le porteur prévoit une cinquantaine d'études sur cinq ans pour évaluer des médicaments anticancéreux sur des cancers disséminés, en admettant que les modèles alternatifs in vitro restent "marginaux" et difficilement transposables. Le développement tumoral peut provoquer perte de poids, difficultés locomotrices et respiratoires, la mise à mort étant déclenchée à des points limites définis.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, - l’impact du développement de métastases pulmonaires sur les paramètres ventilatoires fonctionnels (pléthismographie) Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Induction tumorale sous anesthésie (moins de 10 minute s, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 5 heures aller, 5 heures retour). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 heure). Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 10 minutes) . Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 10 minutes). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 10 minutes) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Transport vers le site où est réalisée l’éventuelle irradiation ou l’éventuelle imagerie ou l’éventuelle radiothérapie -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale par IV -Traitements -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique -Induction en intraartérielle et intracardiaque. Si nécessité d’incision Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : -Prélèvements de sang par ponction dans une veine. -Prélèvements de sang sous contention. -Prélèvement de moelle osseuse Les prélèvements de moelle osseuse pourraient générer des fractures dans de rares cas (point limite). Le développement tumoral induira une perte de poids, des difficultés locomotrices. En cas de développement de métastases pulmonaires, des difficultés respiratoires pourraient éventuellement apparaître. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde et suivies d’une euthanasie sans réveil.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de collecter de grands volumes de sang et les organes pertinents.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Nous prévoyons environ 50 études sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 10 études sont réalisées chaque année , mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisée dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. En général, en oncologie et du fait de la randomisation, le nombre d’animaux greffés est supérieur au nombre d’animaux utilisés randomisés dans chaque groupe. Pour les modèles disséminés ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Au-delà, une dérogation sera demandée et le modèle sera expertisé pour évaluer si plus de 10% des animaux sont réellement nécessaires. Dans tous les cas, il sera recommandé l’utilisation d’un minimum d’animaux surnuméraires La taille des groupes nécessaires pour obtenir des modifications statistiquement significatives de paramètres mécaniques pulmonaires ou de saturation en oxygène sera optimisée suite à des études pilotes utilisant ces technologies. En première approximation, 10 animaux par groupe seront utilisés, s’agissant du nombre qui a été déterminé pour les mesures similaires dans d’autres modèles. S’agissant d’une mesure terminale, s’il est nécessaire d’évaluer la mécanique pulmonaire à plusieurs points de temps, un groupe d’animaux par point de temps sera constitué.

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la SBEA. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis et des antalgiques pourront être prescrits. Dans la mesure du possible, les animaux seront achetés déjà irradiés. Cependant, dans ce cas, la période d’acclimatation devra être réduite à 24h minimum, avec implantation dans les 24-72h suivant l’irradiation. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse (Intradermique, intramusculaire), les animaux recevront une antalgie adaptée. L’induction en intraartérielle et intracardiaque se fera sous anesthésie En cas d’ouverture chirurgicale, une administration de buprénorphine (30 minutes avant minimum) sera prévue. Les injections intracardiaques seront accompagnées d’une analgésie (alpha2 agoniste et un opiacé).. Des soins opératoires (maintien de la température) seront apportés, et feront l’objet d’une surveillance et de soins post opératoires adaptés. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations de la SBEA en termes de volume, fréquence et antalgie. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie avec l’analgésie appropriée (administration d’anti-inflammatoires non-stéroïdiens et/ou d’antalgiques opiacés/alpha-2 agoniste). Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux et un scoring sera mis en place. Dans toutes les cages, un gel nutritif sera rajouté, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés. Les scores cliniques les plus élevés constitueront des points limites, ainsi que l’accumulation de scores intermédiaires (cf procédure). Les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront un point limite. Des points limites adaptés et prédictifs permettant de limiter la souffrance des animaux sont indiqués dans les procédures.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

756 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pancréatiques humaines, puis on injecte des molécules par la veine de la queue avant de les mettre à mort pour prélever tumeurs et organes, afin de tester un traitement à base d'ARN transporté par un dendrimère. Le porteur suit la taille des tumeurs et prévoit une mise à mort dès qu'un point limite est atteint. Il affirme avoir essayé des approches cellulaires en deux et trois dimensions sans pouvoir se passer de l'animal, invoquant l'étude au sein d'un "organisme entier", les retombées contre ce cancer restant conditionnées à l'efficacité du modèle.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer de très mauvais pronostique. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement efficace, et l’espérance de vie du patient excède rarement 6 mois. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer le traitement personnalisé à base de l’ARN, car l'utilisation de petits ARN interférents (siARN) et de petits ARN d'activation (saARN) pour réguler l’expression des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur émerge comme un traitement précise, offrant une thérapie efficace et personnalisée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est l’évaluation et la validation d’un nouveau traitement pour le cancer du pancréas, une maladie de très mauvais pronostic sans traitement efficace à ce jour. Si notre stratégie thérapeutique se révèle efficace sur ce modèle tumoral, nous pourrions envisager de tester cette approche sur d’autres cancers résistants à la chimiothérapie classique ou à la radiothérapie, ou sur d’autres maladies pour lesquelles il n'existe pas de traitement efficace.

Procédures

Pour atteindre les objectifs de ce projet, les souris seront étudiées pour la biodistribution et l’efficacité anti tumorale après injection intraveineuse, dans la veine de la queue, de molécules fluorescentes sous anesthésie générale. À terme, les souris seront mises à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes.

Impact sur les animaux

Les souris seront sous anesthésie générale par gaz lors de l'implantation des tumeurs afin de faciliter la manipulation tout en réduisant le stress et la douleur des animaux. Les animaux recevront, si nécessaire, un antidouleur. L’efficacité et la toxicité de des combinaisons seront étudiées en mesurant les tailles des tumeurs, les poids et les comportements des souris. À terme, les souris seront mise à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes pour l’analyse biochimique et histologique

Devenir

Les animaux seront mise à mort sous anesthésie générale à la fin de cette étude ou lorsqu’un des points limites suscités sera atteint (voir annexe I). Le sang et les tumeurs seront prélevées, tout comme le cœur, le foie, la rate, les poumons, les reins, le pancréas et le cerveau afin de chercher des lésions éventuelles sur ces organes.

Remplacement

Dans le respect de la règle des 3R et concernant le remplacement, nous avons tenté d'utiliser toutes les méthodes substitutives possibles notamment les approches cellulaires 2D et 3D, mais nous ne pouvons pas nous passer du recours à l’animal pour l’étude de l’efficacité et la bio-distribution de nos traitements. Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation de souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale et ont fait l’objet de plusieurs milliers de publications, est justifiée et ne peut être remplacée pour plusieurs raisons. Le fait que ces souris ai un système immunitaire diminué facilite la prise de la greffe de cellules tumorales pancréatique humaine, et limite le phénomène de rejet. De plus, l’utilisation de ces modèles de souris immunodéficientes permettent le maintien des caractéristiques moléculaires, histologiques, phénotypiques et génotypiques des tumeurs pancréatiques d’origine, ce qui ne peut pas être obtenu in vitro. Ces souris nous permettront d’étudier au sein d’un organisme entier l’efficacité et la bio-distribution de nos nanomédicine, et obtenir des résultats fiables représentatifs de la tumeur d’origine.

Réduction

Concernant la réduction dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d’animaux grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant d’optimiser la taille des effectifs. Nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de t de Student. En conséquence, des effectifs de 8 individus par groupe devraient permettre d’obtenir des résultats statistiques fiables pour l’évaluer l’efficacité, et des effectifs de 5 individus par groupe pour étudier la bio-distribution de chaque, soit sur chaque modèle de tumeur, il faut 12 groupes de 8 souris (en total 96 souris) pour l’évaluer l’efficacité de chaque nano-médicine, et 6 groupes de 5 souris (en total 30 souris) pour étudier la bio-distribution de chaque combination. Le nombre total d’animaux pour ce projet est estimé à 756 souris : 576 souris pour évaluer l’efficacité (procédure 1) et 180 souris pour la bio-distribution (procédure 2) sur les ensembles de 6 modèles de cancer pancréas primaire.

Raffinement

Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement (rouleaux de papier, dôme de cellulose, carrés de coton, etc.) ; les litières sont changés toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement (groupe de 5 souris pour une cage de 530cm²) ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum Les souris sont endormies sous anesthésie gazeuse Vetflurane pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs états le nécessitent, Une grille de score a été mise en place pour évaluer les signes de souffrance, identifier les points limites et indiquer la conduite à tenir en fonction de l’état de santé de l’animal.

Choix des espèces

Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d’une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des greffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien étbalies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et, d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité des agents thérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu couteuse, ce qui fait un modèle expérimental de choix pour notre projet.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur vingt semaines, chaque animal reçoit des injections, six prélèvements sanguins et vingt prélèvements d'urine sous contention, les trois quarts subissant en plus vingt-quatre instillations nasales et une chirurgie terminale, pour reproduire une maladie rénale auto-immune liée aux particules fines. Le porteur indique que les contentions répétées provoquent stress et douleurs, avec des risques de saignement, d'infection et de chute de tension. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne confirme in vivo l'effet de la pollution, les retombées de santé publique restant à envisager.

Objectifs

Notre projet vise à étudier l’impact des particules fines contenues dans la pollution atmosphérique dans la physiopathologie de la glomérulonéphrite extra-membraneuse.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait une meilleure compréhension de l’impact de la pollution sur le système immunitaire et le développement des maladies auto-immunes, notamment de la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Cela pourrait déboucher sur la mise en place de politiques de santé publique et d’une prise en charge spécifique visant à bloquer la suractivation des voies de signalisation inflammatoires.

Procédures

Par animal sur tous les animaux du projet (20 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 20 Prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 procédure chirurgicale terminale sous anesthésie/analgésie Par animal, sur 75% des animaux du projet : - 24 instillations intranasales (8 semaines de traitement X 3 instillations par semaine). 15 secondes par instillations.

Impact sur les animaux

Les nuisances et complications eventuelles de la procdure incluents : - Stress et angoisse, voire des douleurs, liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections, de prélèvements d’urine et de sang et les instillations nasales. - Des complications éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou une chute de la tension artérielle voire une hypovolémie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique des organes d’intérêts (reins).

Remplacement

Nos résultats préliminaires in vitro sur cellules immunitaires périphériques et ex vivo suggèrent que la pollution atmosphérique induit une réponse immunitaire pro-inflammatoire favorisant le développement de maladies auto-immunes comme la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour confirmer l’impact des particules fines dans le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse.

Réduction

Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les groupes.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limite précoces et adaptés appuyés sur des fiches de suivi individuels des animaux tout au long du projet.

Choix des espèces

Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, il existe des études publiées montrant l'efficacité du modèle d’immunisation active de souris avec la protéine d'intérêt pour reproduire exactement la pathologie etudiée, la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).