Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-01-22 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-510934)
330 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des sensibilisants chimiques par application cutanée et par voie respiratoire, cette dernière réalisée en tube de contention, ce qui peut provoquer une irritation de la peau, des voies aériennes et des signes d’asthme. Les ganglions lymphatiques sont prélevés après mise à mort à des temps successifs. Le porteur affirme qu’aucun modèle cellulaire n’est validé pour ce travail et présente le projet lui-même comme une étape vers un tel modèle alternatif.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’allergie est classée au 4ème rang des affections chroniques les plus fréquentes par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les symptômes allergiques peuvent prendre des formes cutanées ou respiratoires et font suite à l’exposition répétée des sujets à une substance dite sensibilisante. Jusqu’à 25% des cas d’asthme déclarés sont d’origine professionnelle et font suite à une exposition répétée, par voie respiratoire ou cutanée, à des substances sensibilisantes chimiques. A ce jour, aucune méthode n’a été validée par les instances règlementaires européennes pour identifier les substances chimiques avec un potentiel sensibilisant respiratoire. Or, ces substances présentent un danger pour les individus exposés. La différenciation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques locaux est une étape déterminante dans le développement de la maladie allergique. L’objectif de ce projet est d’identifier des gènes régulant la différenciation des lymphocytes T au cours du processus de sensibilisation respiratoire chez la souris. Afin d’atteindre cet objectif, deux voies d’exposition seront utilisées sur un modèle murin de sensibilisation qui sera combiné à des outils d’analyse de l’expression des gènes afin d’identifier les gènes cibles exprimés par les cellules immunitaires d’intérêt activées par des sensibilisants respiratoires et des sensibilisants cutanés. L’objectif final est de développer un modèle de culture cellulaire, alternatif au modèle animal, qui permettra d’identifier spécifiquement les substances chimiques ayant le potentiel de déclencher une maladie allergique respiratoire, grâce aux biomarqueurs qui auront été identifiés dans ce projet.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes immunologiques mis en jeu au cours de la sensibilisation respiratoire. Ces connaissances sont nécessaires pour améliorer la description des évènements clés menant au développement de l’allergie respiratoire. En outre, de nouveaux biomarqueurs seront identifiés au cours de ce projet, ils permettront de développer un modèle de culture cellulaire alternatif au modèle in vivo permettant de prédire le potentiel sensibilisant respiratoire des substances chimiques. De telles méthodes sont nécessaires, pour identifier le risque associé à l’exposition aux substances sensibilisantes, afin de prévenir le développement de maladies allergiques. Aucun modèle de culture cellulaire n’est validé à ce jour par les instances européennes pour identifier les substances chimiques avec des propriétés sensibilisantes respiratoires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Un lot de 52 souris vigiles sera exposé par application cutanée à 2 sensibilisants allergiques et au solvant approprié. La veille de la première application, les flancs des animaux seront tondus sous anesthésie gazeuse. Les produits seront appliqués sur les flancs des souris à J0 et J5, puis derrière les oreilles à J10, J11 et J12. Les animaux seront mis à mort J0, J3, J7, J10 et J13 après sédation suivie d’une anesthésie profonde (comme pour tous les animaux mis à mort dans ce projet) et les ganglions lymphatiques locaux seront prélevés pour être analysés en cytométrie en flux (analyse des protéines d’intérêt par marquage fluorescent). Ensuite, trois lots de 28 souris et un lot de 20 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 7 substances et au solvant approprié. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux. Les ganglions lymphatiques locaux seront prélevés pour les analyses d’expression génétique. Un lot de 10 souris sera exposé par voie respiratoire à un mélange d’acétone et d’huile d’olive dans un but de formation. Ces animaux, ainsi que tous ceux qui seront exposés par voie respiratoire au cours du projet, bénéficieront d’une anesthésie légère précédée d’une sédation. Leur réveil sera ensuite induit par injection médicamenteuse après l’instillation. L’exposition respiratoire sera faite à J0, J5, J10, J11 et J12 dans cette procédure. Les animaux seront mis à mort à J13. Un lot de 68 souris sera exposé à un sensibilisant respiratoire et au solvant approprié comme suit : trente-deux de ces animaux seront exposés de façon vigile par voie cutanée à J0 et J5 et 32 autres animaux seront exposés par voie respiratoire à J0 et J5. Tous les animaux seront ensuite exposés à J10, J11 et J12 par voie respiratoire. Les animaux seront mis à mort à J0, J3, J7, J10 et J13. Un lot de 36 animaux sera utilisé pour tester un sensibilisant cutané selon la méthode définie à l’issue du 1er lot de 68 souris. Ensuite, trois lots de 28 souris et 1 lot de 20 souris seront exposés aux mêmes 7 substances que pour l’exposition cutanée par voie respiratoire. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps pour les analyses d’expression génétique.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances subies par les animaux seront principalement dues aux voies d’administration des substances chimiques. Malgré le plus grand soin apporté pour limiter l’inconfort des animaux, la procédure de sensibilisation par application cutanée pourra induire de l’irritation cutanée. L’exposition des animaux par voie respiratoire pourra induire de l’irritation des voies aériennes. L’exposition par inhalation, qui sera faite par voie oro-nasale, pourra induire du stress chez les animaux qui seront mis en tubes de contention. Avec les deux procédures, des signes d’asthme pourront également apparaitre. Dans tous les cas, dès l’apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort dans le but de prélever les différents tissus nécessaires aux analyses prévues dans ce projet.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux à des fins expérimentales car le modèle animal permettra d’étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la différenciation des lymphocytes T lors du processus de sensibilisation in vivo. Aucun modèle de culture cellulaire n’est à ce jour établi et validé pour étudier ces mécanismes. C’est d’ailleurs l’objectif au terme de ce projet : le développement d’un modèle de culture cellulaire à partir des données issues de ce projet afin de proposer un modèle alternatif pour l’évaluation du potentiel sensibilisant respiratoire.
2. Réduction
Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux utilisés afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques valables entre les groupes expérimentaux. En accord avec la littérature, nous avons porté à 4 le nombre de souris par groupe. En outre, nous allons collecter le maximum de tissus afin de pouvoir effectuer les analyses post-mortem nécessaires à ce projet en utilisant un nombre minimal de souris. L’analyse sur cellule unique permet de diminuer la variabilité entre les individus, car environ 2000 cellules seront analysées dans chaque échantillon, ce type d’analyse permet donc de réduire le nombre d’animaux à inclure par groupe expérimental.
3. Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué chaque jour lors des soins quotidiens apportés par les zootechniciens et lors des contrôles quotidiens effectués par les autres membres participant à ce projet (techniciens de recherche et chercheurs). Les souris seront manipulées par préhension dans le creux des mains. Toutes les personnes intervenant dans ce projet sont formées initialement et de façon continue à l’expérimentation animale et en particulier au bien-être animal. Les gestes réalisés seront maitrisés afin de garantir le confort maximum des animaux lors des traitements. Les animaux seront hébergés par groupe dans des cages répondant aux exigences de la réglementation en terme de dimensions. Un enrichissement varié (maisonnette et éléments de nidification) leur sera apporté. Une observation renforcée après les expositions aux substances chimiques permettra la prise en charge rapide des animaux en cas de souffrance ou d’atteinte de point limite.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’utilisation de la souris est justifiée pour plusieurs raisons : -la souris est l’espèce couramment utilisée pour les études de toxicologie, elle est notamment l’espèce sélectionnée dans la ligne directrice 429 de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) portant sur le modèle Local Lymph Node Assay qui permet d’identifier les substances chimiques allergéniques; -la composition et le fonctionnement du système immunitaire de la souris sont semblables à celui de l’Homme et les résultats issus des expériences pourront donc être extrapolés raisonnablement aux effets attendus chez l’Homme ; -la souche BALB/c est choisie car son système immunitaire est adapté aux études de sensibilisation allergique. Cette souche, bien qu’orientée Th2, permet d’étudier la différenciation des lymphocytes T en ses différents sous-types et plusieurs études ont montré qu’elle permet le développement d’une réaction allergique respiratoire aux substances chimiques. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8-10 semaines, stade de développement auquel la souris atteint l’âge adulte. Nous souhaitons étudier la réponse allergique sur des animaux ayant un système immunitaire mature.