Souris

1340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes carencés ou enrichis en gras et sucre pendant seize semaines, des injections répétées, des gavages, et 90 d'entre elles une chirurgie d'accès aux ganglions et au tissu adipeux, avant prélèvement des organes. Le porteur répertorie une gêne à l'administration, des variations de poids et une douleur modérée liée à la chirurgie soulagée par antalgiques. Il affirme que les expériences in vivo sont "absolument essentielles" faute de système in vitro assez complexe.

Objectifs

Ce projet s'intéresse au rôle du microenvironnement immunitaire des organes périphériques comme le foie et l’intestin en conditions physiologiques et au cours de l’inflammation. L’inflammation s'accompagne de modifications des cellules immunitaires au voisinage du site d’inflammation et même jusqu’aux organes plus centraux producteurs de nouvelles cellules effectrices. Pour comprendre la régulation cellulaire et moléculaire de la réponse des cellules immunitaires dans l’intestin et le foie lors de stimuli inflammatoires, les souris sont mises dans des contextes de régimes alimentaire inflammatoires (MCD) et un régime gras et sucré (High-fat High glucose Diet, HFHG). Globalement, les désordres tissulaires engendrés par ces stimulations vont modifier le comportement des cellules immunitaires en agissant à différents niveaux (métabolisme, survie, prolifération, activation...). Ainsi, les cellules immunitaires seront étudiées pour leur propriété de prolifération, différenciation, de motilité et de circulation au niveau des organes primaires du système immunitaire (thymus et moelle osseuse), des organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate, plaques de Peyer) ainsi qu’au niveau des organes périphériques (poumons, l’intestin, le foie et le tissu adipeux). L’étude de la réponse immunitaire des différentes populations impliquées dans l’inflammation tissulaire, permettra de cibler les processus cellulaires et moléculaires mis en place par le système immunitaire en parallèle des modifications globales corporelles et systémiques (infiltration tissulaire, réponse systémique pathophysiologique avec l’analyse des caractéristiques hématologiques, biochimiques, cytologiques et histologiques). L’étape suivante consistera en l’analyse de molécules permettant de moduler la réponse inflammatoire et d’évaluer leur potentiel thérapeutique et leur mode d’action sur les cellules immunitaires et la répercussion sur l’état inflammatoire tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors d’inflammation tissulaire au cours de pathologies de type stéatose non alcoolique. A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit l’accumulation de certaines populations immunitaires dans le foie et l’intestin à la suite des inflammations causées par des régimes alimentaires spécifiques. Cela devrait renseigner sur les mécanismes moléculaires mis en jeu dans les tissus en inflammation pour réparer ou amplifier la stéato-hépatite et l’implication des modifications métaboliques associées comme l’insulinorésistance. Le rôle des différentes populations immunitaires sur l’évolution de la pathologie du foie et la perméabilité intestinale associée est encore mal compris. Cependant, des études indiquent que ces populations immunitaires seraient cruciales pour lutter contre une mise en place de modifications irréversibles, comme la fibrose. De plus, nous étudierons si ces processus relancent une hématopoïèse et quels en sont les mécanismes moléculaires associés. A long terme, ces données moléculaires sur l’inflammation pourraient représenter une source importante de moyens thérapeutiques avec des actions supplémentaires pour lutter contre l’évolution de la pathologie de type stéato-hépatite. Le nombre de cas est en constante progression au vu de l’augmentation mondiale de l’obésité qui y est associée.

Procédures

Les interventions sont: Un régime riche en gras et en sucre donné sur une période de 16 semaines à un grand nombre des souris en parallèle de leur contrôle sous régime alimentaire « normal ». Des injections intra-péritonéales (ip) (quelques secondes) tous les 5 jours pendant un maximum de 8 semaines. Des injections ip (quelques secondes) réalisées quotidiennement pendant 7 jours sur d’autres lots de souris. Une seule injection en ip (quelques secondes) sera réalisée soit 10H ou 24H avant la mise à mort. Un gavage de 2 minutes en 1 seule fois par animal sera suivi d’un dosage sanguin de quelques secondes sur une cinétique de 1, 3 et 5 heures pour certains animaux ou de 5, 15, 30, 60, 90, et 120 min pour les autres (quelques gouttes sur bandelettes). 90 animaux subiront une procédure chirurgicale (avec un maximum de 10min) permettant d’accéder aux ganglions et tissu adipeux. Des antalgiques sont administrés en pré et post opératoire et la chirurgie se fait sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Nous avons répertorié 4 points de nuisances qui sont les suivants : 1- Une gêne légère liée à l’administration et/ou les prélèvements effectués. 2- Une perte de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire déficient en Methionine et choline (MCD). 3- Une prise de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire enrichi en gras et en sucre (High-fat High glucose Diet, HFHG). 4- Une douleur modérée liée à la chirurgie et améliorée par la prise d’antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés pour prélèvement de leurs organes et l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.

Remplacement

La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Pour les études dans une seconde étape, toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront entreprises en culture afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, notre étude ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique car les effets du régime sont déjà décrits dans la littérature et nous avons aussi le recul nécessaire avec notre précédent projets sur les mêmes régimes alimentaires. Par exemple, nous savons que l’insulinorésistance et la résistance au glucose ne sont à tester qu’à partir de la 12ème semaine de régime pour des souris sauvages. Les mécanismes cellulaires et leurs modulations ne seront analysés qu’aux stades précis de la cinétique correspondant aux points de temps avec des différences significatives des populations immunitaires détectées lors de la première procédure du projet. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire (sur animal non manipulé), ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. De plus, nous aurons des résultats des procédures qui s’enchainent qui permettront d’éliminer des hypothèses concernant l’implications de certaines populations et/ou molécules. Ainsi, le nombre d’analyse à faire sera réduit par rapport à ce qui a été anticipé en prenant en compte toutes les lignées utilisées à la procédure précédente sans tenir compte de la significativité des résultats. Pour les tests statistiques, nous avons évalué nos nombres finaux à analyser selon les comparaisons à faire entre les variables et selon un niveau de risque fixé à 0.01 et une puissance fixée à 0.66. Quand cela était nécessaire, nous avons appliqué un possible effet cage et donc pondéré par le facteur correspondant. Seulement dans les conditions adéquates (point de cinétique précis) où l'augmentation du taux circulant des cellules immunes est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations bloquées avaient plutôt un effet pro-inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences car ils sont souvent pesés et cela limite leurs stress de suivre cette habitude d’interactions. Une fiche d’observation tout au long des régimes permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Pour la plupart des procédures, les animaux sont mis à mort très peu de temps après le geste invasif. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.

Choix des espèces

La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. Le recours à ces souris génétiquement modifiées va nous permettre d’identifier et de caractériser les processus sous-tendant la stéato-hépatite. Le détail du nombre d'animaux par procédure est mentionné dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte et les régimes débutés chez le jeune adulte âgé de 6 semaines. Cette date a été retenue comme la plus significative pour observer la mise en place et le suivi de la stéatose chez la souris. C’est le stade le plus précoce auquel les souris ont un poids assez stable et assez important pour en perdre suite au régime . De plus, comme le régime se pratique sur au moins 16 semaines, les souris doivent être prises à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après le régime et que l’on ne soit pas sur l’interprétation d’un facteur vieillissement.

560 souris au système immunitaire partiellement humanisé vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales de côlon ou de mélanome, des injections de traitements et un suivi de la tumeur au pied à coulisse, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur indique que la pousse tumorale peut entraîner perte de poids et douleurs au niveau de la tumeur. Il affirme que l'évaluation de thérapies immunitaires est "davantage pertinente dans un organisme entier".

Objectifs

Stimuler le système immunitaire est une stratégie ayant déjà été appliquée en clinique, mais une stimulation plus ciblée serait davantage efficace dans la lutte contre les cellules tumorales. Une substance secrétée par les cellules du système immunitaire (cytokine) a subi des modification structurale afin d'augmenter son efficacité de stimulation du système immunitaire. Une série de trois variants de cette cytokine présentant une activité biologique modifiée a ainsi été obtenue. L’étude de ces molécules constitue l’objectif principal de ce projet. Nous voulons montrer ici que ces variants de la cytokine seront efficaces contre les cellules tumorales de cancer du côlon et de mélanome et que cette efficacité sera potentialisée en combinaison avec une immunothérapie. Nous utiliserons pour cela un modèle de souris possédant une partie de son système immunitaire identique au système immunitaire humain afin de se rapprocher au plus près de la réalité clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il existe aujourd’hui peu de stratégies thérapeutiques pour les cancers résistants. L’étude de nouvelles thérapeutiques va permettre de développer en phase préclinique de nouveaux traitements qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Contention et injections de cellules tumorales en sous cutanée (quelques secondes, 1 fois) - injection de traitements en intra-veineuse sur animaux vigiles (quelques dizaines de secondes, 1 ou 2 fois par semaine selon le traitement) - pesée et mesures des tumeurs (quelques dizaines de secondes, 3 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur courte lors de l’injection en intra-veineuse. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Les animaux sentinelles pour prévelements des tumeurs afin de faire de l'immunophénotypage, et tous les animaux en fin d’étude pour prélèvements des tumeurs pour analyses.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur et de son environnement direct (structure cellulaire, rigidité etc). Une fois les tests in vitro réalisés pour étudier l'effet de molécules potentiellement anticancéreuses en clinique, il est nécessaire par la suite d'étudier leur comportement au sein de l'organisme vivant en présence de ces interactions et de ces paramètres précédemment cités. Pour ces raisons, l’évaluation de thérapies impliquant le système immunitaire est davantage pertinente dans un organisme entier.

Réduction

Les modèles seront faits séquentiellement et une évaluation de l’efficacité des composés sera effectuée après la réalisation des expériences sur le premier modèle, ce qui donnera lieu à une décision d'arrêter ou de continuer l'étude pour les modèles suivants. Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Pour la comparaison des poids et des volumes tumoraux, nous utiliserons un test statistique validé et fiable. Celui-ci nous a permis de déterminer qu'il nous faudra 10 animaux par groupe en suivi de l'éfficacité et de la survie. Nous utiliserons 4 souris sentinelles supplémentaires par groupe pour des analyses de chaque tumeur traitée.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général des souris sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseignent une grille de suivi basé sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos vouté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés sur une litière en cellulose en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour se cacher).

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire complet, et de modèles tumoraux murins. La souris avec un système immunitaire complet est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. De plus, cette souche a été génétiquement modifiée pour répondre à notre question scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime obésogène pendant douze à vingt-quatre semaines, des injections deux fois par semaine, des mises à jeun et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline nécessitant gavages et prélèvements caudaux répétés. Le porteur indique que le surpoids peut gêner les déplacements et que la contention dans le tube d'échoMRI peut être anxiogène. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes, et limite l'étude aux mâles.

Objectifs

L'obésité et le diabète de type 2 constituent des défis majeurs pour la santé publique à l'échelle mondiale, engendrant des conséquences graves sur la qualité de vie des individus et imposant un fardeau économique croissant. Ces affections sont souvent associées à un état inflammatoire , communément appelée "inflammation à bas bruit". L'inflammation à bas bruit représente un état caractérisé par des niveaux d'inflammation systémique faibles, mais persistants, qui peuvent ne pas être détectés par les symptômes cliniques traditionnels. Cette inflammation chronique de bas niveau a été étroitement associée à la pathogenèse et à la progression de l'obésité et du diabète de type 2. Cependant cette inflammation à bas bruit est-elle la cause ou la conséquence de ces pathologies est une question qui n’est pas encore tranchée dans la communauté scientifique. Comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent cette relation complexe est impératif pour développer des stratégies de prévention et de traitement efficaces visant à atténuer l'inflammation à bas bruit et, par conséquent, à améliorer la prise en charge des maladies métaboliques. Ce projet de recherche vise à approfondir notre compréhension de cette interaction complexe en examinant en détail les voies biologiques et les facteurs déclencheurs qui contribuent à l'inflammation à bas bruit dans le contexte de l'obésité et du diabète de type 2. En particulier nous allons étudier l’effet d’un composé pharmacologique aux propriétés anti inflammatoire développé par une start-up dans deux situations distinctes : La prévention ou la thérapie de ces maladies métaboliques. En d’autres termes nous espérons apporter des éléments de réponse à la question : Inflammation et maladies métaboliques :cause ou conséquence ?

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : Le composé pharmacologique aux propriétés anti-inflammatoires démontrées, est-il en capacité de prévenir l’installation des maladies métaboliques et/ou de traiter ces maladies une fois qu’elles sont installées. Les résultats obtenus devraient nous permettre d’apporter des éléments de réponses quant à l’association des maladies métaboliques à l’inflammation à bas bruit. De plus si ce composé à des effets bénéfiques, alors on peut imaginer que cela puisse un jour être un traitement pour ces maladies.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire obésogène de type HFHS et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire (12 24 pesées sur 12 ou 24 semaines de régime pour la procédure 1 ou 2 respectivement ). Une mesure de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 12 et 24 sera réalisée. Des prélèvements sanguins au niveau caudal après légère incision du bout de la queue (0,5-1mm) et post anesthésie locale (crème EMLA 30-45 minutes avant le premier prélèvement) seront également réalisés en semaines -S11 (pocédure 1 et 2) et S23 (procédure 2) pour la réalisation des tests métaboliques (OGTT et ITT). Dans chaque procédure il y a aura deux injections par semaines pendant 12 semaines soit 24 injections. Une injection IP (volume 100µl), réalisée par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne prends pas plus de 10 secondes, préhension de l’animal incluse. Concernant OGTT et ITT, respectivement 6 et 5 prélèvements caudal seront nécessaire. Un prélèvement réalisé par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne dépasse pas 15 secondes, préhension de l’animal incluse

Impact sur les animaux

Les animaux en régime High Fat /High Sucrose peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’a jamais observé après 12 semaines de régime. Une attention particulière sera portée aux animaux de la procédure 2 qui eux seront sous régime HF/HS pendant 24 semaines Les préhensions des animaux lors des pesées, des injections intra péritonéales peuvent causer au moins au début du protocole un peu de stress sur les animaux. Pour diminuer au maximum ce stress (et éviter également que ce dernier puisse perturber le protocole), les animaux seront manipulés lors de la deuxième semaine d’acclimatation par le même expérimentateur qui procédera au différentes mesures hebdomadaires. De la même manière, les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur maitrisant parfaitement ce geste technique Les test de tolérance oral au glucose (OGTT), les test de tolérance à l’insuline (ITT) nécessitent des mises à jeun de 4h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact mais permet de s’affranchir des variations interindividuelles du métabolisme glucidique. L’OGTT, nécessite une préhension des animaux afin de les gaver avec la solution de glucose ce qui est invasif pour les souris (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). L’ITT nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale d’insuline qui peut également être invasive (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). OGTT et ITT nécessitent des mesures de glycémie pendant 2h. Ces mesures sont réalisées à l’aide d’un glucomètre par prélèvement d’une micro goutte de sang L’EchoMRI nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène (maîtrise du geste par un expérimentateur formé).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétrique sachant qu’il y a des variations individuelles dans la mise en place de l’obésité. - Cette série d’expérience se fait uniquement sur les mâles. Si des effets sont observés, la necessité impérative de reproduire les données avant publication se fera alors sur les deux sexes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale, soit sous anesthésie générale. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. . Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique dans les études de maladies métaboliques Les animaux seront réceptionnés au centre de zootechnie à l’âge de 8 semaines, stade adulte des souris. Le début du régime HF/HS commencera à partir de 10 semaines et se terminera soit a 22 semaines (S12) (procédure 1) soit à 34 (S24) semaines (procédure 2)

1038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections de composés radioactifs et des prélèvements de sang, pour étudier la réponse immunitaire induite par la radiothérapie interne vectorisée. Le porteur affirme que cette radiothérapie n'induit aucune nuisance car utilisée à dose réduite, et fixe le volume tumoral toléré à 1500 mm3. Il conclut qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo".

Objectifs

Les mécanismes associant la radiothérapie et la réponse immunitaire dirigée contre les tumeurs restent à explorer. La radiothérapie conventionnelle utilisant des rayons X (RTE) est dédiée aux tumeurs localisées, la radiothérapie interne vectorisée (RIV) permet elle d'irradier spécifiquement les tumeurs métastatiques. Nous proposons d’étudier l’immunité induite par la RIV et la RTE. Dans ce projet, 4 approches complémentaires seront utilisées pour évaluer cette réponse immunitaire en fonction de la présence ou de l’absence de gènes d’intérêt dans les souris. Au maximum 1038 souris pourront être utilisées pour ces 4 études sur une durée de 5 ans. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum tout en ayant un nombre suffisant pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Toutes les expériences sont menées par du personnel formé et compétent. Ces études découlent de premiers résultats in vitro et in vivo réalisés au sein du laboratoire. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine. Dès qu’un animal présentera l'un des points limites définis dans le cadre de nos expériences, il sera pris en charge immédiatement.

Bénéfices attendus

La radiothérapie interne vectorisée (RIV) peut induire des molécules présentant un fort potentiel thérapeutique. Ces nouveaux agents pourraient constituer une avancée majeure pour la prise en charge des patients atteints de cancer et pour le maintien de leur qualité de vie.

Procédures

- Les greffes sous-cutanées seront effectuées avec un temps de contention réduit au maximum (

Impact sur les animaux

Les nuisances d’un traitement par VECs, administrées par voie intraveineuse ou par voie intratumorale, n’est pas supérieur à celle induite par une greffe de tumeur. Dans ce projet, la RIV n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la MTA (maximal tolerated activity). Nous avons démontré dans des études antérieures qu’il n’y a pas de perte de poids, une numération sanguine constante et au-dessus des seuils pendant toute la durée de l’expérience et aucun changement de comportement observable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit parce qu'ils ont atteint un des points limites définis pour chaque procédure, soit pour prélèvements post-mortem à l'issue des expérimentations. En cours d'étude, tout animal démontrant une souffrance irréversible ou inacceptable sera immédiatement euthanasié.

Remplacement

Il s’agit ici d’évaluer l’impact d’une réponse immunitaire associée à la RIV et son impact sur le développement tumoral. Il n’existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique et fixé à 8 souris par groupe. Enfin, les expériences intègrent les impératifs éthiques, les modalités d’hébergement, d’enrichissement du milieu, de prévention de toute douleur, détresse, et/ou inconfort chez l’animal. En outre, le principe des 3R est respecté puisque nous utiliserons des mâles et des femelles (pas de tri dans la colonie). Enfin, une technique d’imagerie SPECT/CT sera mise en place pour visualiser et suivre dans le temps la biodistribution des VECs de manière non-invasive (pas d’animaux supplémentaires).

Raffinement

Concernant les greffes, le temps de contention sera réduit au maximum (20g) par méthode submandibulaire pendant la durée de l’expérience (espacé d’au moins 8 jours) par du personnel formé et compétent (procédure

Choix des espèces

La souris immunocompétente constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d’expérience sur la réponse immunitaire. L’étude débutera quand les souris auront entre 6 et 8 semaines. En effet, à ce stade le système immunitaire sera mature.

1962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil et, pour 606 d'entre elles, quatre lésions au laser de la rétine sur un œil, avant récupération des yeux après mise à mort. Le porteur classe l'injection intravitréenne en gravité modérée par précaution et affirme que les lésions laser sont indolores et compensées par le cerveau en moins d'une semaine. Il conclut qu'aucune alternative in silico ou in vitro ne donne accès aux "grandes fonctions physiologiques des mammifères", et prévoit d'arrêter si un vecteur atteint 80 % de neutralisation du VEGF.

Objectifs

Les maladies de la rétine sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe, et ce malgré les découvertes mettant à jour certains mécanismes liés à leur progression. Pour la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age (DMLA) seuls existent des traitements palliatifs visant à réduire la prolifération de nouveaux vaisseaux immatures dans la rétine avec des anticorps administrés en Injection Intravitréenne (IVT) et qui sont dirigés contre un facteur de croissance des vaisseaux sangins : le VEGF. Ces nouveaux vaisseaux immatures ne sont pas étanches et laissent passer un liquide qui crée un œdème rétinien responsable de la perte de la vision. Ces traitements ne sont que palliatifs et ne ciblent en aucun cas les mécanismes à l’origine du développement de la pathologie. L’approche visant à bloquer en amont la fabrication du VEGF (avant sa synthèse) via des petits bouts d’ARN interférents (siARN) prend donc tout son sens. En effet dans la cellule, des petits bouts d’ARN quittent le noyau (ARN messagers) pour initier la fabrication du VEGF. Les siARN dirigés contre le VEGF entrent dans les cellules et viennent neutraliser les ARN messagers bloquant ainsi la fabrication du VEGF. Depuis plusieurs années notre société et ses partenaires ont mis en place un consortium permettant le développement de vecteurs (V) améliorant la délivrance de siARN dans le Système Nerveux Central (SNC) dont la rétine. Ces vecteurs se présentent sous la forme d’anticorps modifiés et ciblent les récepteurs impliqués dans le transport au travers des barrières biologiques, par exemple pour passer du sang vers le cerveau ou la rétine, ou pour rentrer directement dans les cellules. A ces vecteurs nous venons y accrocher des molécules thérapeutiques comme des siARN dirigés contre le VEGF. Issus du savoir-faire de notre société, nos candidats médicaments sont couplés à nos vecteurs (V-siARN) et transformés dans le but d’améliorer le transport vers la rétine pour augmenter le pouvoir d’action du traitement.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de ce projet est donc de combattre plus efficacement les rétinopathies à prolifération vasculaire (la DMLA mais aussi la rétinopathie diabétique) au moyen de vecteurs combinées à des brins d’ARN interférents pour bloquer les messagers cellulaires responsable de la synthèse du VEGF et donc lutter contre la pousse de nouveaux vaisseaux dans la rétine. La valeur ajoutée consiste à tester de nombreux de siARN dirigés contre le VEGF et à améliorer leur délivrance grâce à notre technologie (nos Vecteurs). Cette première phase expérimentale nous permettra de sélectionner les meilleurs couples siARN-Vecteurs pour passer, dans une deuxième étape, aux tests d'efficacité sur des modèles animaux pathologiques. Les bénéfices attendus pour de futures applications chez l'homme sont multiples par rapport à l'utilisation d'anticorps actuellement administrés en IVT. En effet notre technologie autorise nos vecteurs à se lier qu’à un seul type de récepteur sur les membranes des cellules de la rétine, ce qui nous permet de cibler précisément les cellules à l'origine de la surproduction pathologique de VEGF. D'autre part, il est connu que l'utilisation de siARN permet de rallonger significativement l'efficacité d'un traitement dans le temps par rapport aux simple anticorps classiques dirigés contre le VEGF, ce qui en théorie permettrai aux patients d'espacer la fréquence (mensuelle) des injections qu'ils reçoivent ; administration IVT qui reste un geste chirurgical particulièrement anxiogène et porteur de potentielles complications.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront soumis à des administrations dans l’œil (IVT) (1440 animaux, durée de l’acte : 5 min par œil) et à 4 lésions laser de la rétine sur un seul œil (606 animaux, durée 30 min environ). Ils seront ensuite hébergés de 4 jours jusqu'à 3 mois maximum (4, 7, 14 jours, 1 et 3 mois pour un petit sous-groupe seulement) avant leur mise à mort pour récupération des yeux. Dans la partie concernant la mise en place du modèle pathologique de pousse de nouveaux vaisseaux immatures induit par lésion laser un groupe restreint d'animaux (30) subira 4 contrôles en imagerie rétinienne des lésions (le jour de la lésion, puis à, 4, 7 et 14 jours, durée 30 min) sous anesthésie générale. Lors de ces contrôles les animaux recevront à chaque fois une injection d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min) pour la visualisation des vaisseaux rétiniens. En point final tous les animaux seront mis à mort dans nos expériences.

Impact sur les animaux

La procédure d'administration IVT est considérée comme légère chez l'homme mais pour plus de sureté nous la classons en modérée. Seule une désinfection du pourtour de l’œil est requise avant de commencer. Pour éviter de stresser les animaux, cette procédure sera effectuée sous anesthésie générale avec des antidouleurs. Avec une très faible fréquence, les nuisances pouvant être rencontrées dans ce type d’administration seront surveillées attentivement tous les jours (infections notamment). Pour éviter ce type de complication une pommade antibiotique sera systématiquement déposée sur la cornée. Concernant nos composés, nos données issues de projets précédents avec les mêmes molécules ne montrent pas de réaction du système immunitaire, ni de toxicité apparente. L'autre aspect susceptible d'affecter les animaux concerne les lésions rétiniennes par laser. Ces dernières, indolores, aboutissent à des déficits visuels qui correspondent à des tâches noires dans le champs visuel (< 15° d'angle visuel, ce qui correspond à peu près à des cercles de 10 cm de diamètre à un mètre de distance de l’œil). Au nombre de 4 par animal (en haut, en bas, à gauche et à droite), ces lésions couvrent au total moins de 10% du champ visuel des animaux et ceci sur un seul œil. De plus il est connu que des mécanismes corticaux au niveau des aires visuelles du cerveau compensent une partie de cette perte en moins d'une semaine (la lésion dans la rétine est toujours présente mais l’animal ne voit plus ces tâches sombres : mécanisme de remplissage perceptif). De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux mais nous nous contenterons d'effectuer ces lésions sur un seul œil pour plus de sureté.

Devenir

Dans la procédure 1, un groupe de 720 animaux est inclus pour étudier le potentiel de nos vecteurs couplés au siARN. Si les analyses montrent qu'un couple de nos Vecteur/si ARN atteint plus de 80% de neutralisation des ARN messagers du VEGF-A alors le reste des animaux ne sera pas utilisé. Sinon le reste des animaux inclus sera mis à mort car il est nécessaire pour les analyses de les perfuser pour enlever le sang et nous récupérons les deux yeux pour analyse. Etant donné que nous commandons les animaux pour chaque expérience individuellement, les animaux inclus dans le projet et non utilisés ne seront pas à replacer. Dans la procédure 2 tous les animaux seront mis à mort car ils doivent être perfusés avant récupération des yeux pour analyse.

Remplacement

Toutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifToutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.ères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous avons opté pour des injections IVT bilatérales chez l’animal sain pour la sélection des différents siARN couplés à nos vecteurs car le geste, bien que classifié ici comme modéré, est à considérer comme une procédure légère sans composante douloureuse, ni impact au niveau de la vision. Le fait d'injecter les deux yeux dans cette phase de sélection nous permet donc de réduire le nombre d’animaux de moitié. Le nombre total d'animaux dans cette procédure fait l'hypothèse de l’échec des précédents V-siRNA testés. Si un des composés atteint plus de 80% de neutralisation du VEGF (observation systématiquement quantifiée dans chaque expérience) alors notre objectif sera atteint et le reste des animaux inclus dans le projet ne sera pas utilisé.

Raffinement

Les animaux seront soumis à un protocole anesthésique et analgésique rigoureux. Dans ce projet nous avons remplacé notre précèdent anesthésique par un de nouvelle génération car il permet un réveil plus rapide des animaux et n'entraine pas d'augmentation de la pression intra-oculaire (problématique pour l'IVT). Une couverture analgésique générale et locale permet d'éviter toute souffrance pendant l'expérimentation. Etant donné le court laps de temps d’exposition de nos V-siRNA dans l’œil (en moyenne 14 j et jusqu'à 3 mois pour un petit sous-groupe), ce type d’action n’est pas à même d’entrainer l’apparition de problèmes dommageables chez les animaux (observation effectuée dans nos précédentes études). Pour des questions de raffinement et de bien-être animal les groupes de lésions rétiniennes au laser passeront de 4 à 8 individus : en effet un seul œil sera lésé pour affecter le moins possible leur vision. De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux. Enfin Le fait de choisir une administration IVT pour combattre les pathologies rétiniennes permet d’utiliser des doses largement revues à la baisse par rapport à une injection intra-veineuse avec une diminution des risques toxiques et immunitaires associés ainsi qu'une distribution dans tout le corps qui n’est pas voulue. Pour éviter toute souffrance animale, nous avons mis en place une grille d'évaluation de la condition des animaux avec toute une série de points limites et les actions y étant associées. Enfin les souris seront hébergées par 4 sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C (portoirs ventilés) et dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglas et dômes en papier, accompagné de nids en coton, de la frisure de papier craft et nous mettrons également à l’intérieur des cages quelques croquettes).

Choix des espèces

Dans ce projet nous avons choisi des souris saines adultes et pigmentées pour 3 raisons : En ophtalmologie il est indispensable d’utiliser des espèces pigmentées (non albinos) car elles ne sont pas dépourvues d’un type de photorécepteur dans la rétine. De plus leur utilisation est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler la version « souris » du récepteur auquel ils se lient. Certains de nos Vecteurs ciblent également la version humaine de ce même récepteur d'où le choix d'une deuxième espèce, des souris adultes, pigmentées et humanisées pour le récepteur ciblé par nos vecteurs et ceci pour évaluer le potentiel de transfert de nos avancées chez l'homme. Enfin nous utiliserons ici uniquement des souris mâles et adultes car il a été prouvé que le modèle de lésion de la rétine que nous allons utiliser est beaucoup plus variable chez les jeunes individus et chez les femelles.

2500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris immunodéprimée reçoit une transplantation de cellules pancréatiques humaines sous la capsule rénale et un prélèvement sanguin hebdomadaire à la queue, pour évaluer la fonction du greffon avant transplantation chez le patient. Le porteur indique n'avoir noté aucune incidence sur le bien-être des souris lors du projet précédent et traiter la douleur chirurgicale, toutes les souris étant tuées pour récupérer le rein porteur du greffon. Il affirme travailler à une technique in vitro de remplacement mais la juge encore trop peu robuste pour fournir des résultats exploitables.

Objectifs

Lors de la transplantation des îlots de Langerhans chez le patient, la fonction primaire du greffon apparait comme le principal facteur pronostic de succés et son amélioration représente l'un des principaux enjeux dans le domaine. Aprés l'isolement de ces cellules, même aprés avoir obtenu une préparation d'îlots quantitativement importante, il est difficile de prédire la fonction après transplantation. L'évaluation pré-greffe (in vitro) consiste en un comptage, une viabilité, la pureté et la capacité à secréter de l'insuline. Malheureusemment, ces techniques ne corrèlent pas avec la fonction greffée chez le patient. Le modèle de souris xénogreffée montre, quant à lui, une bonne corrélation de fonction. L'objectif général du projet est donc, d'étudier les cellules pancréatiques humaines transplantées chez le patient, en transplantant une fraction chez la souris immunodéprimée, afin d'en évaluer la fonction. Cela se fait notamment par dosage spécifique du Peptide-C humain circulant dans le plasma de la souris.

Bénéfices attendus

La transplantation des cellules pancréatiques nous permettra : - D'une part, d'étudier la fonction des cellules pancréatiques humaines provenant de donneurs de phénotype différent (age, taille, poids, habitus...) et - D'autre part, de prédire la fonction du greffon cellulaire transplanté chez le patient recevant les cellules issues du meme donneur.

Procédures

Les animaux subiront un seul acte chirurgical à savoir la transplantation de cellules humaines sous la capsule rénale, traité par les anti-douleur adéquats (durée 15 minutes). Aussi, un prélevement sanguin hebdomadaire au niveau de la queue permettra de doser les hormones plasmatiques.

Impact sur les animaux

Ce projet etant un renouvellement d'un projet précédent, nous n'avons noté aucune incidence néfaste au bien etre des animaux transplantés. Les eventuelles douleurs notamment dues à la chirurgie sont palliées par un traitement anti-douleur adéquat. De la même manière, un traitement anti-douleur local (xylocaine) sera effectuée au niveau de la queue pour la prise de sang hebdomadaire.

Devenir

Nous envisageons la mise a mort de tous les animaux car en fin de protocole, nous récupérons le rein proteur du greffon pour étude immunohistochimique ou étude dynamique ex-vivo.

Remplacement

L'étude de fonction des ilots transplantés ne peut se faire sans faire avoir recours à l'animal car il n'xiste pas de technique in vitro performante qui permet de maintenir les cellules pancréatiques vivantes sur le long terme. Nous travaillons sur la mise en place d'une technique in vitro d'étude des cellules appelée périfusion en vue de remplacer l'animal, mais les données ne sont actuellement pas suffisemment robustes pour obtenir des résultats quantifiables et statistiquement exploitables. De plus, du fait de l'extreme hétérogénéité des donneurs d'organe, il n'existe pas de modèle d'étude ex vivo, organe-sur-puce, ou autre modele biostatistique qui permettent d'obtenir des résultats satisfaisants à l'heure actuelle. Aussi, l'usage de l'animal est necessaire pour 1) reproduire l'acte de la transplantation, 2) étudier les cellules humaines dans un organisme entier, et 3) maintenir les cellules vivantes pendant plusieurs semaines.

Réduction

Nous utiliserons le juste nombre d'animaux (n=5 animaux par pancréas traités) afin d'obtenir des résultats probants et statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et traités avec soin (nourriture et eau en illimité, visite quotidienne, cycle jour/nuit régulier). Les animaux recevant une chirugie seront surveiller pluriquotidiennement les 3 premiers jours après chirurgie puis quotidiennement. L'acte chirugicale se fera sous anesthésie et traitement de la douleur (pré et post opératoire - buprénorphine 0,05mg/kg) renouvelé selon le besoin. De plus, la chirurgie et les prélèvement sont réalisées par du personnel formé et sensible aux régles d’éthique expérimentale et qui manipule les animaux quotidiennement afin de les faire coopérer.

Choix des espèces

Les outils génétiques permettent de générer des animaux mutants immunodéficients disponibles facilement. De plus, nous disposons de tous les outils (anticorps, kits de dosages, animalerie) pour mener une étude facilité sur cet animal. Les souris Swiss Nude constituent un bon compromis puisque leur déficience d'immunité permet une bonne implantation des cellules humaines. Nous utiliserons des animaux adultes pour un geste chirurgical aisé.