Souris

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras puis hébergées seules à thermoneutralité, elles reçoivent chaque jour pendant plus de six semaines un composé par gavage ou injection, avec pesées, prélèvements sanguins et test de tolérance à l'insuline, pour un laboratoire pharmaceutique client. Le porteur décrit l'isolement et les administrations quotidiennes comme des nuisances et affirme que le choix du modèle a été "validé avec le client". L'objectif déclaré est commercial, constituer un dossier d'autorisation puis mettre sur le marché un médicament contre l'obésité.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'une série de composés en développement induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant réception. Les traitements seront administrés par voie orale ou sous-cutanée pendant 5 semaines, pendant lesquelles les animaux seront soumis au même régime enrichi en graisses. Au cours du traitement, les paramètres suivants seront mesurés : poids corporel et prise alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, tolérance à l'insuline. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de sécuriser le développement des composé tests, notamment dans le but de prioriser ceux ayant les effets les plus marqués. Ainsi, ls données obtenues permettront de constituer un dossier de demande d'autorisation pour la réalisation d'études cliniques. A terme, cela permettrait à la société cliente d'obtenir une AMM et de commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) un état d'obésité induit par l'aliment enrichi en graisses (Régime fournis pendant 12 semaines avant réception des animaux et 7 semaines après réception) - 2) un hébergement individuel sur toute la longueur de l'étude (Durée: 7 semaines après réception) - 3) une administration orale ou sous-cutanée quotidienne du traitement test, du véhicule ou du composé de référence à partir de D-11 et jusqu'à D35 (46 jours; durée de l'acte : environ 1-2 minutes) - 4) une pesée quotidienne de D-18 à D-1 (durée de l'acte : environ 1-2 minutes) - 5) une mise à jeun de 4h + un prélèvement sanguin à la queue à D-6 (durée de l'acte : environ 5 minutes)- 6) des mesures de prise alimentaire et de poids corporel trois fois par semaine à partir de D1 (soit un total de 15 mesures; durée de l'acte : environ 2-3 minutes) - 7) deux analyses de leur composition corporelle à D-6 et D29 (Durée de l'acte < 2 minutes) -8) un test oral de tolérance à l'insuline (ITT) à D29 [(Mise à jeun pendant 6h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 0, 15, 30, 60 et 120min après administration du glucose; Durée de l'acte : 2,5 heures) . - 9) Une anesthésie générale et euthanasie à D35 (Durée de l'acte: environ 5 minutes) .

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire et les mesures en cages métaboliques prévues en cours d'étude imposent un hébergement individuel des animaux imposent un hébergement individuel des animaux constituant une nuisance. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Les animaux seront pesés régulièrement afin d'administrer le bon volume de véhicule ou de traitement. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins pour mesure de glycémie, un test de tolérance à l'insuline (avec une mise à jeun de 6h), et deux analyses de la composition corporelle par RMN sont prévus et pourront être source de stress ou de nuisance pour les animaux. Enfin, les gavages oraux et les administration sous-cutanées quotidiens à partir de D-11 et jusqu'à D35 (soit 46 jours) sont une source de nuisance. Il est à noter que les administrations (orales ou sous-cutanées) d'habituation effectuées entre D-11 et D1 s'avèrent nécessaires car sans cette précaution, ces procédures induiraient des modification du prise alimentaire et de poids corporel au début du traitement et seraient et donc seraient à même de fausser les résultats de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète des effets des composés test.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt compte tenu des paramètres mesurés dans la présente étude mais également de l'hétérogénéité connue du modèle obèse. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance à l'insuline (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas), HbA1c, triglycérides et le poids du tissu adipeux inguinal gauche et droit.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Pour chaque prélèvement sanguin, de la lidocaïne en gel sera appliquée à l'extrémité de la queue 30 minutes avant prélèvement afin de prévenir la douleur pouvant résulter de ce geste. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. En cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique (buprénorphine) sera administré. Si aucune amélioration n'est constatée passé un certain délai, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (16 semaines à réception). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules de lymphome ou de cancer du côlon, laissées croître jusqu'à un volume de deux mille millimètres cubes, avec des prélèvements sanguins par la queue, pour identifier le mécanisme d'un vaccin antitumoral déjà commercialisé en médecine vétérinaire. Le porteur écrit qu'un anti-inflammatoire "introduirait des biais" en défaveur de l'étude et ne sera donc pas administré, et annonce une efficacité qui "devrait" reproduire celle observée chez le chien. Sur le remplacement, il indique avoir mené des travaux in vitro et ex vivo mais juge la vérification in vivo "primordiale".

Objectifs

Le lymphome B diffus à grandes cellules est le lymphome le plus fréquent. La prise en charge thérapeutique est basée sur une immunochimiothérapie couplant le rituximab à la polychimiothérapie. Pour le patient âgé, cette thérapie n’est pas toujours applicable en particulier en raison de comorbidités notamment cardiaque. Pour pallier ce problème et envisager des traitements pouvant stimuler le système immunitaire, nous avons développé une thérapeutique basée sur l’utilisation de protéines autologues actives sur le système immunitaire. La procédure de préparation de ce vaccin est basée sur la purification de protéines tumorales sur des particules de phosphate de calcium d’hydroxyapatite. Ces particules devront être réinjectés au patient pour une réactivation spécifique de son système immunitaire contre les cellules tumorales. Cette préparation vaccinale est utilisée depuis 2013 en médecine vétérinaire dans le modèle canin. Une étude récente a mis en évidence un doublement de la survie des chiens après traitement par le vaccin. Etant donné Les résultats spectaculaires ont, la mise en place d’un essai clinique est envisagée chez l’homme. Cependant les équipes cliniques requièrent une analyse mécanistique de l’efficacité vaccinale dans un modèle pré-clinique murin. Il est envisagé d’inclure dans le protocole clinique d’autres types de cancers qui font également face à des obstacles thérapeutiques, tel que le cancer colorectal dans le projet. Enfin nos données préliminaires sur la composition du vaccin indiquent la présence de différentes protéines de choc thermique. Il est donc pertinent d’étudier leurs effets dans l’efficacité du vaccin. Nos objectifs sont donc dans ce projet, (1) de mettre au point la préparation vaccinale à partir de tumeur de lymphome B murin et de côlon, (2) de mettre au point la condition de traitement la plus efficace dans le modèle murin, (3) d’identifier les cellules immunitaires anti-tumorale et les protéines de choc thermique impliquées. L’utilisation de ce modèle dans des souris possédant un système immunitaire fonctionnel (Balb/c) a montré, dans plusieurs études, une pertinence pour identifier les cellules contrôlant le développement du lymphome et du cancer du côlon.

Bénéfices attendus

La vaccination des animaux devrait permettre une réduction tumorale significative comme celle observée chez le chien. L’identification des mécanismes antitumoraux de la vaccination nous permettra de valider les prérequis nécessaires à la mise en place d’un essai clinique de Phase I/II dans le lymphome B et le cancer du côlon.

Procédures

Il s’agira de prélever une goutte de sang pour déterminer la composition sanguine de l’animal en réponses aux vaccins. Pour dilater la veine de la queue, les souris sont placées sous une lampe d’animalerie chauffante pendant 10 minutes. Elles sont ensuite glissées dans un tube de contention adapté aux souris et acheté chez un fournisseur spécialisé. Le placement des souris ne durera qu’une dizaine de secondes par souris. Le prélèvement de sang est ensuite effectué avec une aiguille (26 Gauge) ou une lame tranchante stérile. Cette opération durera en moyenne 10 secondes par souris. Cette méthode est recommandée pour des prélèvements répétés de moins de 0,1 mL de sang. Les animaux sont maintenus dans le tube de contention pendant toute la durée du prélèvement. Le volume prélevé est au maximum de 100 microlitres (2 à 3 gouttes). Après la prise de sang un point de compression sera réalisé afin d’éviter tout saignement à l’endroit de l’incision. Une prise de sang (100uL) à J-1 avant l’injection des cellules tumorales et le jour de la mise à mort à la fin de la procédure expérimentale seront réalisés. Total de 2 prises de sang par souris. Le nombre de souris concerné par ces prises de sang sera de 532. Les 36 autres souris qui seront employées à la génération des tumeurs nécessaires à la fabrication des vaccins ne seront pas concernées par ces prises de sang. Les injections de cellules tumorales A20 (2x106 cellules) et CT26 (5x105 cellules) seront réalisées en sous-cutanée à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 26 Gauge et concerneront les 568 souris du projet expérimentale. Un maximum de 100 µL de suspension cellulaire seront injectés. Chaque injection de cellules tumorales durera en moyenne une dizaine de seconde. Les injections de préparation vaccinale concerneront ¬532 souris à hauteur de 4 injections vaccinales par souris et seront réalisées à J5, J7, J9 et J14 en post-injection des cellules tumorales. Chaque vaccination durera en moyenne une dizaine de seconde. Au total, pour une souris, deux prises de sang auront lieu, (à J-1 avant injection des cellules tumorales et avant la mise à mort), 5 injections (1 de cellules tumorales A20 ou CT26 et 4 injections de solution vaccinale).

Impact sur les animaux

L’utilisation du vaccin chez le chien depuis 2013 n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection des inhibiteurs d’HSP chez la souris n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection du vaccin peut engendrer de la souffrance et du stress au souris, c’est pour cela que l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. Également, l’injection des cellules cancéreuses A20 et CT26 par voie sous-cutanée se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 2000 mm2.

Devenir

L’analyse de la réponse des souris à la vaccination nécessite une étude approfondie des tumeurs et des cellules du système immunitaires. Le prélèvement de la tumeur ainsi que des organes lymphoïdes (rate et ganglions) contenant les cellules immunitaires nécessite la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les résultats préliminaires obtenus à partir des nombreuses expériences in-vitro et ex-vivo ont été très encourageants et ont permis de réduire le nombre de souris au regard des différents axes restant à être investigués. Des marqueurs phénotypiques ont été découvert via ces expériences ex-vivo. Toutefois, ce modèle ne nous permet pas de tester notre hypothèse d’une stimulation de certaine populations anti-tumorales du système immunitaire. C’est la raison pour laquelle il est primordial de pouvoir vérifier ces résultats dans un modèle in-vivo. Ces expériences constituent des tests pré-cliniques et ont pour but d’observer l’immunogénicité de notre traitement dans un organisme vivant immuno-compétent. Ces expériences in-vivo sont donc nécessaires afin de mettre en valeur les aspects physiologique résultants de notre thérapie. Mais également de retrouver les marqueurs phénotypiques vérifiés par les expériences ex-vivo.

Réduction

Pour chacune des combinaisons thérapeutiques (vaccination préventive ou curative, effets des inhibiteurs de HSP, ou déplétion des HSP) réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 7 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques et valable avec le test non paramétrique adapté aux petits échantillons (< à 10) de Mann-Whitney. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.

Raffinement

Dans le but de préserver le bien-être animal et pour anticiper l’arrivée des signes de souffrance liés à la maladie, nous suivrons l’évolution de la croissance tumorale en mesurant tous les 2 jours par un pied à coulisse le volume des tumeurs, puis tous les jours lorsque la tumeur atteindra un volume égal ou supérieur à 1500 mm3. Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse pour l’ensemble de nos animaux (vaccinés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Les injections des cellules cancéreuses A20 et CT26 pourraient engendrer de la souffrance et du stress au souris, ainsi l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. La croissance tumorale sera monitorée et ne dépassera jamais les 2000 mm2. L’injection du vaccin par voie sous-cutanée sera réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales en sous-cutané (s.c.), et des vaccins (s.c.), pour nous assurer que les souris retournent à une activité normale (confort, vivacité, état sanitaire). L’utilisation d’un anti-inflammatoire introduirait des biais en notre défaveur, car cela irait à l’encontre de l’intérêt de l’étude (l’immunisation via l’utilisation d’un biomédicament). Pour pallier à cela, les animaux seront quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée. De plus, des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…). Les animaux seront mis à mort par les personnes formées. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane. Après la mise à mort, la mort des animaux est constatée par l’absence des signes vitaux : respiration, battements cardiaque, absence des mouvements volontaires et des réflexes.

Choix des espèces

Les souris BALB/c seront utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions de développement tumorale en présence d’un système immunitaire compétent. Cette condition est nécessaire pour tester les effets d’une vaccination anti-tumorale sur le système immunitaire. La souris a pour intérêt d’avoir un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Le modèle de lymphome B murin A20 et le modèle CT26 de cancer du côlon ont été montré comme pertinent comme modèles pré-cliniques or ces modèles se développent dans des souris BALB/c. Nous utiliserons des souris femelles et mâles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

3 332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vecteurs viraux par chirurgie intracérébrale sous anesthésie, puis passent une série de tests, exposition à des goûts et à des sons, exploration d'un labyrinthe et test de mémoire contextuelle conditionnée, avant euthanasie pour des analyses d'électrophysiologie et d'imagerie. Le porteur présente l'objectif comme fondamental, mieux comprendre le rôle de la plasticité présynaptique dans la formation des souvenirs, sans application annoncée à court terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico n'étudie la neurotransmission de synapses matures et que les souris transgéniques sont "nécessaires".

Objectifs

La capacité de garder en mémoire une expérience est essentielle pour la survie des organismes supérieurs. Cette capacité est assurée en partie par 2 structures cérébrales appelées néocortex et hippocampe. Ces structures sont composées de cellules appelées "neurones". Ces derniers sont connectés entre eux par des synapses, et sont capables de modifier leurs connexions en fonction des informations qu’ils reçoivent, autrement dit, ils sont capables de « plasticité synaptique ». L'objectif général du projet est de mieux comprendre le rôle de la plasticité présynaptique dans la formation et le stockage des informations des souvenirs dans ces 2 structures du cerveau. La formation de la mémoire et la mémorisation de nouvelles informations dans les circuits neuronaux du cortex dépend de la capacité des neurones et des synapses à modifier leurs propriétés. Nous allons utiliser comme modèle soit des souris contrôle, soit des souris génétiquement modifiées (souis n'exprimant pas des protéines présynaptiques). Nous utilisons des injections localisées de vecteurs viraux (outils permettant de délivrer un gène d'intérêt) pour visualiser les cellules impliquées dans la formation de la mémoire, ou pour réaliser des modifications génétiques, en supprimant par exemple les protéines impliquées dans la plasticité présynaptique. Nous effectuerons ensuite des expériences d'électrophysiologie (enregistrement de l'activité électrique des neurones) et d'imagerie cellulaire sur tranches de cerveau, combinées à des taches comportementales.

Bénéfices attendus

Nous espérons mieux comprendre comment les neurones du cerveau, en particulier dans nos 2 structures cérébrales d'intérêt, traite la formation et le stockage d'informations des souvenirs.

Procédures

Une injection de virus par chirurgie intra cérébrale: entre 30 et 60 min pour tous les animaux du projet. Tests sensoriels: - gustatifs: exposition à différents gouts pendant 2 Heures une fois par animal. - Exposition à des sons: 5 minutes une fois par animal Tests contextuels: - Exploration dans un labyrinthe: 1H une fois par animal. Tests comportementaux de mémoire contextuelle : une fois par animal pendant 5 minutes. Injcetion intrapéritonéale durant quelques secondes d'une molécule une fois par animal.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique (stess de l'anesthésie, perte de poids légère). Les tests comportementaux ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Le test de mémoire contextuelle conditionnée peut induire un léger stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue d'études électrophysiologiques ou d'imagerie.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à mieux comprendre en quoi la plasticité présynaptique au niveau des synapses contribue à l'encodage et la mémorisation d'informations sensorielles et contextuelles. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici. En effet, les modèles alternatifs ne permettent pas d’étudier la neurotransmission au niveau de synapses matures complètement développées. De plus, l’étude du rôle des différe,tes protéines nécessite d'utiliser des souris transgéniques.

Réduction

Le même animal sera utilisé pour différents protocoles d’électrophysiologie ou d’imagerie afin de récolter un maximum de données scientifiques pour chaque souris. Si cela est possible, le nombre d’animaux sera revu à la baisse en cours d’expérimentation. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (tunnel et matériel de nidification) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex et de l'hippocampe de la souris présentent de nombreuses similitudes avec ceux d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les protocoles utilisés seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. L'introduction des différents gènes d'intérêt doit se faire à l'âge jeune (3 semaines) et le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge jeune adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage.

Des injections de protéines avec adjuvant de Freund, complet la première fois puis incomplet, précèdent une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie pour les souris immunisées : 600 souris âgées de 6 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet doit produire des anticorps polyclonaux contre des protéines de Plasmodium, le parasite du paludisme, et cribler des candidats vaccins à ARNm injectés dans le muscle. Le porteur prévient que les souris "peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d'angoisse". Celles dont le titre d'anticorps suffit sont mises à mort pour leur sérum, et les autres doivent l'être à la fin de chaque procédure, même si le porteur ajoute qu'elles "peuvent être réutilisées dans d'autre projets dans la mesure du possible".

Objectifs

Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire pour P. falciparum et P. knowlesi, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du merozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins.

Bénéfices attendus

Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.

Procédures

1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.

Devenir

Toutes les souris ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.

Remplacement

L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium.

Réduction

Le nombre de souris pour chaque expérimentation a été calculé au plus juste pour permettre un nombre minimum des animaux. Cette estimation a été réalisée en concertation avec un biostatisticien. Ainsi, nous avons choisi des groupes de 5 souris dont les sérums seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse de nos souris, nous mettrons en œuvre un enrichissement de l’environnement avec par exemple des abris et des bâtons de coton pour la nidification. Si les souris montrent des signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation (injections et prélèvements) seront pratiqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes chez la souris. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris avant de continuer leur développement. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.

779 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des pompes osmotiques renouvelées deux fois, des injections dans la veine saphène, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour tenter de faire produire un peptide de la reproduction par leurs cellules musculaires. Le porteur signale des douleurs, une perte de poids et une perte de mobilité liées aux pompes et aux injections, tous les animaux étant mis à mort pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est envisageable pour cette approche encore jamais testée.

Objectifs

La kisspeptine (Kp), produite dans le cerveau, est un puissant stimulateur de la sécrétion de gonadolibérine (GnRH) qui, à son tour, induit la libération de l’hormone lutéinisante (LH) dans la circulation sanguine chez les mammifères. A ce jour, de très nombreuses études ont évalué l’effet d’une injection aigüe de kisspeptine pour tenter de comprendre et de maitriser la reproduction de plusieurs mammifères (notamment la souris, l’Homme, mais aussi les animaux de rente pour lesquels le système reproducteur n’est pas actif tout au long de l’année). De ce fait, les mécanismes impliquant le contrôle de la sécrétion de LH et l'action de la Kp sont alors très bien connus et documentés. Cependant, une faiblesse majeure de la kisspeptine, utilisée en tant que telle pour maitriser la reproduction, est le délai d’action de la protéine qui est relativement vite dégradée. Des études ont alors tenté de mettre au point une forme modifiée de la kisspeptine afin de la rendre plus résistante aux processus de dégradation. A ce jour, aucune forme modifiée du peptide n’a cependant été assez performante pour être utilisée comme outils de maitrise de la reproduction. Le présent projet vise alors à adopter une approche totalement innovante à la lumière de ce qui est en cours de développement dans le domaine des biomédicaments : faire produire la kisspeptine directement par les cellules musculaires qui sont des cellules définitivement différenciées, qui ne se divisent pas, et sont capables de fortement exprimer une protéine puis de l'excréter dans le système circulatoire. Concrètement, l’idée est d’injecter dans le muscle un complexe ADN pour faire produire de la Kp qui sera excrété du muscle vers le système sanguin. Comme ils n’impliquent pas d’agents viraux, ces complexes sont plus faciles d’utilisation et n’ont pas d’effet inflammatoire. Nous souhaitons donc tester si l’injection de ces complexes dans le muscle peut être une technique efficace pour, à terme, faire produire de façon stable la Kp dans l’optique de stimuler ou inhiber la reproduction de l’organisme cible qui, dans ce projet, est la souris.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à mettre au point une méthode permettant de sécréter de la kisspeptine de façon continue par les cellules musculaires de l’organisme cible. Les bénéfices sont donc multiples 1) étudier l’effet d’une diffusion continue de kisspeptine sur la physiologie de l’organisme, 2) mettre au point une technique de production de peptides par les cellules musculaires et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction.

Procédures

- Pose de mini pompes osmotiques sur 96 animaux : les mini pompes diffusent la solution qu'ils contiennent pendant 28 jours maximum, le protocole étant prévu pour 3 mois, les mini pompes seront remplacées 2 fois. - Test de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) sur 56 animaux avec des prélèvements de sang. L'ITT sera toujours réalisé 1 semaine avant le GTT et ceux ci seront réalisés 3 fois avec 28 jours d'intervalle. - Frottis vaginaux réalisés sur 28 femelles sur une période de 8 jours tout les 28 jours. - Tests de comportements sur 80 animaux - Prises de sang sur 96 animaux tout les 28 jours. L'intervention sera réalisée 4 fois. - Injection d'un solution et 16 prélèvements de 4ul de sang de façon sériée, une seule fois au 84ème jour du protocole. - Mise à mort après anesthésie - Injection hydrodynamique d'un vecteur plasmidique via la veine saphène réalisé sur 637 animaux au total sur les deux procédure (630 + 7). Prises de sang tout les 10 jours pendant 3 mois, soit 9 fois. - Mise à mort après anesthésie - Electroporation ou injection hydrodynamique sur 14 animaux

Impact sur les animaux

Le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les rongeurs. En termes de manipulation des animaux, les tests comportementaux, chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets secondaires peuvent être observés, notamment suite à la pose des mini pompes ou l'injection hydrodynamique : des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'antidouleurs au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence. L’objectif de ce projet est d’induire une production continue de kisspeptine par l’organisme, ce qui n’a encore jamais été testé jusqu’à présent.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes pour des études post mortem

Remplacement

Une grande partie du travail de sélection des meilleurs vecteurs ADN a été réalisé en amont sur des modèles de cultures cellulaire, mais l'étude de l'effet de la Kp sur la fonction de reproduction et sur la physiologie globale de l’organisme nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu, aucune méthode de remplacement n'est donc envisageable dans ce contexte.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement.

Raffinement

Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours pendant 3 jours après les prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes et injections hydrodynamique, des traitements anesthésiques et analgésiques seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.

Choix des espèces

Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction. De plus les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Cependant, l’effet de la kisspeptine sur le long terme sur la physiologie globale de l’organisme reste assez peu étudiée, or, ce peptide est de plus en plus présenté comme étant un outil prometteur pour la maitrise de la reproduction et le traitement de pathologies associées à la fertilité. La souris est alors un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Enfin, ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront de poursuivre avec des expérimentations sur les espèces de rente telles que les ovins et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse.