Souris
Évaluation de substances à visée thérapeutique contre la peste et les infections causées par les Yersinia entéropathogènes.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
7 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par la peste, sous ses formes bubonique, septicémique et pulmonaire, ou par d'autres Yersinia, puis reçoivent des peptides ou des anticorps à tester, l'infection étant décrite comme fatale pour les témoins non traités. Le porteur définit des points limites déclenchant la mise à mort, tous les animaux étant tués en fin de procédure. Il affirme qu'"aucun modèle non-animal ne peut remplacer l'animal" pour évaluer ces traitements et présente la peste comme une potentielle arme bactériologique.
Objectifs
Face au risque de résistance aux antibiotiques, nous souhaitons tester, en collaboration avec des équipes extérieures les ayant développés, de nouveaux agents thérapeutiques pour lutter contre les Yersinia pathogènes : Y. pestis (l'agent de la peste et potentielle arme bactériologique) et les Yersinia entéropathogènes (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Dans une première phase ces agents vont être sélectionnés pour leur capacité à tuer les bactéries in vitro. Les meilleurs seront ensuite testés pour leur efficacité thérapeutique chez la souris. La peste sera abordée sous ses trois formes principales : la peste bubonique, septicémique et pulmonaire. Ces infections sont modélisées chez la souris car ces animaux y sont sensibles et développent des formes de ces maladies comparables à celle de l’homme. Les infections par Yersinia entéropathogènes (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) seront modélisées par infection orale chez la souris. Ces nouveaux agents thérapeutiques sont : • des anticorps monoclonaux (de souris ou humains) dirigés contre des antigènes cibles spécifiques des Yersinia, • de nouveaux peptides antimicrobiens. En cas de succès leur potentielle synergie avec des antibiotiques sera testée.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques efficaces contre la bactérie Yersinia pestis, en particulier contre des souches résistantes à des antibiotiques, ainsi que contre les Yersinia entéropathogènes (Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia enterocolitica). Le travail sera fait chez la souris pour qu’ensuite les agents thérapeutiques puissent être développés pour l’homme.
Procédures
Procédure 1 : injection (ip, dose unique) de peptides antimicrobiens à toutes les souris vigiles Procédure 2 : injection (ip, dose unique) de peptides antimicrobiens ou d’anticorps à toutes les souris vigiles, puis prélèvement de sang (
Impact sur les animaux
La nuisance résultera principalement de l’infection, qui sera fatale pour le groupe témoin ne recevant pas de traitement thérapeutique, et aussi si les agents testés échouent à contrôler l’infection. La toxicité possible des agents sera évaluée dans le projet. D’autres nuisances moindres viennent de l’injection des agents testés par voie intrapéritonéale et la prise de sang pour suivi pharmacocinétique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les animaux ayant été infectés ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Les tests préliminaires in vitro sur cellules permettront de réduire l’usage des animaux aux agents intéressants : tous les peptides antimicrobiens testés auront montré une capacité à tuer la bactérie in vitro. Les Anticorps auront montré une capacité de blocage de la bactérie in vitro. Leur toxicité aura été évaluée sur des cellules en culture et les agents toxiques ne seront pas testés sur animaux. Toutefois, les infections bactériennes induisent des processus pathologiques complexes impliquant de multiples organes et le système immunitaire dans son ensemble (organes divers, relations entre organes, circulation sanguine et lymphatique, multiples populations cellulaires et mécanismes effecteurs). L'action des agents antibactériens ne se limite donc pas à une action simple sur la bactérie et doit tenir compte de la complexité de la pathologie. C'est pourquoi aucun modèle non-animal ne peut remplacer l'animal pour évaluer des agents thérapeutiques, et des agents à action d’intensité moyenne seront testés.
Réduction
Les procédures seront optimisées : - étude simultanément du plus grand nombre possible de paramètres sur chaque animal, - regroupement des expérimentations de façon à limiter les groupes d'animaux témoins nécessaires. Les groupes (traité, non traité) seront comparés par le test de Student si les valeurs y satisfont (distribution normale, variances égales), sinon par le test non paramétrique de Mann-Whitney. Le test exact de Fisher sera utilisé pour comparer la survie des groupes (naïf, vacciné) exposés à la peste. Des modèles linéaires à effets mixtes pourront être utilisés afin de prendre en compte d'éventuels effets techniques liés à la cage et aux répétitions. Le détail des statistiques est décrit dans les procédures. Le nombre d’animaux indiqué a été obtenu par un calcul de puissance statistique en collaboration avec un biostatisticien, et est basée sur le nombre minimum d'animaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement robustes et reproductibles. Les tests préliminaires in vitro permettront de réduire l’usage des animaux aux agents intéressants.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Durant les infections, un suivi strict des animaux sera opéré tout au long de l’expérience via une observation régulière pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précède généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales, comportement prostré. Les animaux présentant un état pathologique (score de 2 pour un paramètre de la grille de score utilisée ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial) seront mis à mort. Dès l’apparition des signes cliniques des actions seront mises en place pour limiter la souffrance et la déshydratation : mise à disposition de nourriture Dietgel, réhydratation sous-cutanée (10 ml/kg/heure solution saline chaude SC). Si des animaux atteignent les points limites définis, ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des hôtes idéaux pour l'étude de la peste puisqu'ils y sont très sensibles, et sont les principales cibles et réservoirs de la peste dans la nature. La peste se développe chez la souris sous les formes bubonique et pulmonaire avec des cinétiques, signes cliniques et léthalités comparables à celles de la peste humaine. Les souris sont utilisées à l'âge de 7-14 semaines afin d’être représentatifs de l’espèce à l’âge adulte, par souci d’utiliser des animaux comparables tout au long du projet. Les infections par Yersinia pathogènes ne sont pas sensibles à l’âge. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.
Impact des infections graves sur la progression de la leucémie aigüe myéloïde et de la maladie hématologique sur les complications infectieuses
- Recherche appliquée
- Cancers
504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées, greffées avec des cellules leucémiques, rendues septiques par ligature-ponction du caecum, puis traitées par chimiothérapie, avec prélèvements sanguins répétés et biopsies de moelle osseuse, pour étudier l'effet du sepsis sur la leucémie. Le porteur décrit des risques d'infections, d'hémorragies, de thromboses et de douleur, des points limites déclenchant la mise à mort, tous les animaux étant ensuite euthanasiés pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de la moelle osseuse et du sepsis.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome causé par une réponse excessive et inappropriée de l’organisme à une infection. Il peut devenir particulièrement grave et causer le dysfonctionnement de nombreux organes (reins, poumons, cœur, foie...). Le sepsis est la cause la plus importante de mortalité en réanimation, malgré les nombreux progrès de prise en charge réalisés au cours des dernières années. Au cours du sepsis, on observe un changement des cellules qui constituent la surface des vaisseaux (les cellules endothéliales), qui laissent passer plus facilement des substances à travers les vaisseaux et qui modifient leurs fonctions, ainsi que la production d’une grande quantité de molécules potentiellement nocives. Ceci va induire des modifications du système de défense de l’organisme, le système immunitaire, qui est très perturbé après le sepsis et devient incapable de fonctionner correctement. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont un type de cancer du sang. Elles sont causées par la multiplication d'une cellule au sein de la moelle osseuse qui devrait normalement aider à produire des cellules sanguines saines. Cette cellule mutée ne fonctionne plus correctement et ne peut pas produire de cellules sanguines normales. Les LAM peuvent se développer soudainement ou être précédées par des maladies pré-leucémiques. Pendant ces maladies pré-leucémiques, les cellules sanguines commencent à se multiplier de manière anormale avant de se transformer en cellules cancéreuses. La chimiothérapie est le traitement de référence des LAM et si elle est efficace dans la majorité des cas, la résistance à ce traitement et les rechutes sont fréquentes. Dans le développement et la progression de la LAM, l'endroit où les cellules cancéreuses se développent est important. Cet endroit est appelé la niche ostéomédullaire. Le sepsis, par son effet sur les cellules endothéliales et le système immunitaire, perturbe cette niche ostéomédullaire et pourrait ainsi favoriser le développement des cellules cancéreuses. Si le sepsis est une complication très fréquente au cours des LAM, son impact sur l’évolution de cette maladie hématologique n’a jamais été étudié à ce jour. L’objectif principal de nos travaux de recherche est d’étudier le rôle du sepsis sur la niche ostéomédullaire, et donc l’importance des infections graves sur la progression de la LAM ou sur l’évolution d’une maladie pré-leucémique vers une LAM.
Bénéfices attendus
Les infections graves (responsables de sepsis), sont des complications fréquentes de la LAM. L’impact du sepsis sur l’évolution de cette maladie hématologique n’a jamais été étudié à ce jour. La compréhension des mécanismes impliqués permettrait de développer des médicaments ciblant l’interaction entre cellules leucémiques et les tissus impactés par le sepsis. De plus, comprendre l’effet des infections aigues sur les cellules leucémiques, et leur environnement est essentiel dans la compréhension de la LAM et de sa réponse au traitement, et pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la gestion des patients septiques ayant une LAM.
Procédures
Afin d’étudier le rôle des cellules leucémiques sur les défaillances d’organes observées au cours du sepsis, nous utiliserons 3 modèles murins de cancer du sang. Dans deux de ces modèles, nous induirons la maladie par une seule injection (durée 1 min sur souris éveillée) de cellules cancéreuses dans la veine de la queue de souris préalablement irradiées (étape de quelques minutes, non douloureuse, pendant laquelle l'exposition aux RX permet d'éliminer les cellules de la moelle osseuse et facilitant la prise de greffe des cellules injectées). Le 3ème modèle est un modèle de souris avec une modification génétique dans les cellules à l’origine des cellules du sang, qui n’entraine aucun symptôme mais qui peut évoluer au cours du temps en leucémie. Les 3 modèles, qui ont des délais d’évolution vers une leucémie différents, nous permettrons d’évaluer quand le sepsis exerce le plus d’influence sur la maladie hématologique. Nous induirons alors le sepsis (infection abdominale par chirurgie du tube digestif) dans ces différents modèles (procédure chirurgicale de 10 min sous anesthésie générale et analgésie) en réalisant une ligature et ponction d’une partie du tube digestif au niveau du caecum (partie terminale de l’intestin en forme de sac au départ du gros intestin). Les antibiotiques sont utilisés pour traiter l’infection et le sepsis causés par la procédure, en simulant ce qui est fait chez l’homme. Les antibiotiques seront administrés dans l'abdomen (injection intra-péritonéale, i.p.) 2 fois par jour pendant 72h. L’analgésie sera réalisée en ip 2 fois par jour pour au moins 72 h et l’hydratation sera réalisée en ip 2 fois par jour pour les 3 premiers jours. Un traitement de chimiothérapie sera également administré à certaines souris (injection dans la cavité abdominale, une fois par jour, d'une durée de 15s). Le suivi du développement des pathologies sera réalisé par prélèvement sanguins toutes les 2 semaines (sur souris éveillée, d'une durée de 30s) et par biopsie de la moelle osseuse (à jour 8 et 15 post-sepsis; sous anesthésie et analgésie, durée: 2 min). Nous réaliserons également un suivi par imagerie afin de visualiser comment les cellules leucémiques pénètrent dans les organes et l’interaction entre les cellules leucémiques et les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins. Cette procédure se réalise sous anesthésie générale et analgésie et dure 30 min par souris. Elle sera réalisée 1 seule fois.
Impact sur les animaux
La procédure d’irradiation sous-létale des animaux nécessaire pour la transplantation de la leucémie ou de la maladie hématologique pré-leucémique peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections, diarrhées et déshydratation. Les souris avec une leucémie ont un risque de diminution de leurs globules blancs ou de leurs plaquettes sanguines et en conséquence, un risque accru d’infections, ainsi que d’hémorragies. Les souris du modèle 3 sont exposées à un risque de thromboses (caillots sanguins) et de saignements. La procédure de ligature et ponction du caecum a pour but de rendre les souris septiques, elle entraine donc une infection et elle peut aussi causer déshydratation, altération de l’état général et douleurs. La chimiothérapie, traitement standard des leucémies, peut causer des diarrhées, de cytopénies (réduction des globules blancs, globules rouges et plaquettes) et sur l’état général des souris (perte de poids, modifications du pelage, réduction de l’activité spontanée etc). Les prélèvements sanguins répétés et les biopsies de moelle osseuse peuvent représenter un risque hémorragique. La biopsie de la moelle osseuse peut aussi causer de la douleur qui se prolonge quelques heures après la procédure. S’agissant d’une procédure chirurgicale, il est possible d’avoir une inflammation au niveau de la suture, ainsi qu’une éventuelle infection avec retard de cicatrisation.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Il n'existe actuellement pas de modèle in vitro pertinent pour l'étude de l’interaction entre sepsis et LAM, ni pour l’étude de la transformation des maladies pré-leucémiques dans un contexte septique. La niche où les cellules leucémiques se forment est caractérisée par un environnement très complexe, au sein duquel différentes cellules interagissent et impactent la survie des cellules leucémiques. Certaines molécules libérées en grande quantité dans le plasma au cours du sepsis agissent sur le développement des cellules leucémiques. De plus, les contraintes mécaniques auxquelles la niche est exposée et les niveaux d’oxygénation différents au sein de la moelle osseuse, ont un impact important sur l’évolution des cellules leucémiques. Pour le moment, nous n’avons pas la capacité de reproduire cette complexité in vitro. D’autre part, la reproduction d’un sepsis in vitro n’est pas possible. Les modifications du système immunitaire et l’invasion des tissus par les acteurs de l’inflammation, ainsi que la défaillance des différents organes pendant un sepsis ne peuvent pas être représentés de façon complète et exhaustive sans le recours à un modèle animal.
Réduction
Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux et d’éviter la répétition inutile de procédures expérimentales (prélèvement d’organes et biopsies de la moelle osseuse), plusieurs analyses différentes seront réalisées sur les mêmes animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour étudier la significativité des résultats obtenus en utilisant le moins d’animaux possible. Si la significativité est rapidement atteinte, une diminution du nombre de souris nécessaires sera donc obtenue.
Raffinement
Les souris auront des conditions d’hébergement adéquates au sein de l’animalerie, avec portoir ventilé et des éléments d’enrichissement adaptés (papier kraft et buchette en bois). Les souris auront accès illimité aux boissons et aux croquettes. Les souris du modèle 3 sont caractérisées par une viscosité sanguine élevée et un risque de thrombose et de souffrance. Pour éviter ces phénomènes, des saignées (prélèvements de sang) suivies par l’injection de sérum physiologique en intrapéritonéal seront réalisées de façon systématique. Les souris seront observées après le traitement par chimiothérapie et réhydratées ou traités par des antidouleurs si nécessaire. Après toutes procédures douloureuses et toutes procédures chirurgicales, une analgésie sera mise en place. Les souris septiques, recevront l’administration d’une antibiothérapie à large spectre après l’induction du sepsis et l’hydratation, ainsi que l’analgésie per et post-procédure. Les souris leucémiques seront surveillées au moins quotidiennement et un suivi clinique sera réalisé au minimum 2 fois par semaine à l’aide d’un score (grille de signes cliniques prenant en compte l’apparence physique, le comportement des animaux, la respiration et l’aspect de la cicatrice), dans les 3 modèles. Les souris seront traitées par antidouleurs si des signes de douleurs sont détectés (comme démangeaisons ou grattage important, déplacement anormal, respiration anormale), réhydratation et avec des antibiotiques. Nous avons défini des points limites faisant office de critères d’arrêt conduisant à l’euthanasie des animaux, lorsqu’ils sont atteints.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère, dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. La souris est aussi l’animal le plus utilisé dans les modèles de leucémie et de sepsis. Les souris sont à l’origine d’un grand nombre de connaissances concernant la réponse immunitaire de l’hôte à l’infection. En effet, elles partagent un grand nombre de similitudes avec l’homme, notamment concernant l’évolution du sepsis et du choc septique, ainsi que de la leucémie. Aussi, la souris et l’homme partagent 99% de leurs gènes. Dans l'ensemble du projet, nous utiliserons des souris adultes car la pathologie étudiée apparaît chez l'Homme adulte.
Etude de l’effet curatif et préventif de souches de bactéries probiotiques sur la régulation du métabolisme des glucides et des lipides chez la souris prédiabétique.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par une alimentation grasse et sucrée, elles sont gavées chaque jour pendant cinq semaines, puis soumises à des tests de tolérance au glucose et aux lipides avec incision de la queue, pour comparer des bactéries probiotiques. Le porteur mentionne comme effets un gonflement de l'œsophage, une prostration possible et une infection au point d'incision, les souris étant anesthésiées puis mises à mort pour prélever leurs organes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité éthique de prélever ces organes chez l'humain.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie reconnue comme une priorité urgente et un enjeu majeur de santé publique. La mortalité et la morbidité associées à cette maladie entraînent des coûts exorbitants de santé dans le monde. A ce jour, malgré un arsenal thérapeutique important, le traitement est loin d'être optimal. Il apparaît urgent d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour optimiser le traitement des patients. Une nouvelle voie s’est ouverte depuis que des études ont montré que l’un des effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique très largement prescrit résulte de sa capacité à modifier les populations de bactéries présentes dans l’intestin. Actuellement, des souches de bactéries probiotiques sont développées pour améliorer l’état du métabolisme des patients diabétiques de type 2. Les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité suffisante, confèrent un bienfait pour la santé de l’hôte. Récemment, dans modèle de souris, une nouvelle souche de bactérie probiotique ciblant le diabète de type 2 a été identifiée. Ce projet vise à identifier le mécanisme d’action de cette nouvelle souche en la comparant avec des bactéries probiotiques déjà connues et qui ont des effets bénéfiques sur le diabète.
Bénéfices attendus
A court teme, ce projet permettra de comparer les effets d’une nouvelle bactérie probiotique avec des bactéries probiotiques déjà connues sur le métabolisme du glucose et des lipides afin identifier son mécanisme d’action. A plus long terme, les résultats de ce projet ouvriront la possibilité de valider l’effet anti-diabétique de la nouvelle bactérie vivante ou de préférence de la bactérie sous une forme inactivée pasteurisée (risque sanitaire réduit) chez des personnes diabétiques au cours d’un essai clinique. Ainsi, ce projet doit permettre de développer un nouveau traitement pour les patients avec un diabète de type 2, ce qui est particulièrement précieux face à des traitements médicaux existants qui ne sont pas optimaux.
Procédures
Toutes les souris éveillées seront gavées pendant 5 semaines (tous les jours, une fois par jour, 15 secondes au maximum par souris). A l’issue des 3 premières semaines de traitement à l’âge de 13 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test sanguin permettant de mesurer l’effet du traitement sur la capacité de leur organisme à utiliser le glucose injecté dans la cavité abdominale (une fois, 15 secondes). L’évolution du taux de sucre dans le sang après l’injection du glucose sera mesuré 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère inscision à la queue de l’animal (une seule incision, 5 secondes par prélèvement). A l’âge de 14 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test de charge en lipides donnés par gavage pour tester leur capacité à absorber les lipides (une fois, 15 seconde). L’évolution des taux de lipides dans le sang sera suivie 4 fois par un prélèvement d’une goutte de sang à la queue des souris (5 secondes par prélèvement). A l’âge de 15 semaines, toutes les souris seront anesthésiées par injection (une fois 15 secondes) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).
Impact sur les animaux
On pourrait observer après gavage du sang sur la canule, un gonflement de l’œsophage et/ou une prostration de la souris. Dans les jours qui suivent l’incision superficielle de la veine de la queue (une seule fois par test), une infection au point d’incision peut être observé. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé.
Devenir
A l’issue du protocole, à l’âge de 15 semaines, tous les animaux seront anesthésiés avant une dernière prise de sang, puis les souris seront rapidement mises à mort pour récupérer les organes nécessaires aux analyses biologiques pour permettre l’identification du mécanisme d’action de la bactérie probiotique.
Remplacement
Comme l’effet attendu d’un anti-diabétique se fait par des modifications physiologiques coordonnées entre plusieurs organes (foie, intestin et tissus adipeux, entre autres) et qu’il n’est pas possible éthiquement de réaliser ces prélèvements dans chacun de ces organes chez l’Homme, ils seront réalisés chez la souris, un animal qui fonctionne physiologiquement de manière similaire à l’Homme pour les paramètres physiologiques analysés.
Réduction
Le nombre de 16 animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance statistique et par l’expérience acquise dans des protocoles précédemment réalisés. Avec cet effectif de 16 souris par groupe, les données recueillies pourront être comparées entre le groupe contrôle et les groupes traîtés à l’aide de tests statistiques ce qui permetta de répondre aux questions initialement posées. Plusieurs bactéries seront testées en parallèle afin de ne consituter qu’une seule fois les groupes contrôles et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront surveillées tous les jours avec une attention particulière en période de gavâge pour vérifier l’apparition de troubles du comportement ou de stress. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé. De plus, la personne qui va manipuler les souris lors du gavage est très expérimentée (si possible toujours la même), et réalisera un geste rapide et précis pour limiter la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Au sein de la communauté scientifique, les travaux effectués dans le domaine des bactéries probiotiques sont majoritairement réalisés chez la souris ce qui permet la comparaison des résultats obtenus par les différentes équipes. Comme la physiologie du métabolisme des sucres et des lipides chez la souris est proche de celle de l’Homme, les expériences seront réalisées chez cette espèce animale. La souris C57BL/6J est reconnue comme une souche de référence pour les études du métabolisme et tolère très bien la nourriture riche en gras et en sucres. De plus, les altérations du métabolisme glucidique et lipidique induites chez les souris par une nourriture riche en gras et en sucres sont très bien décrites et maîtrisées. L’intervention nutritionnelle débutera chez les souris âgées de 10 semaines car à cet âge, les souris sont adultes et présentent un microbiote intestinal mature. De plus, à l’âge de 10 semaines de vie, les souris sont métaboliquement prêtes à consommer une nourriture riche en gras et en sucres et à développer les altérations métaboliques voulues.
Rôle des macrophages résidant dans l’altération de la réparation des organes après une septicémie
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature-ponction du caecum pour déclencher une septicémie, puis la pose d'une pompe osmotique et des échocardiographies sous anesthésie, pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans la réparation du cœur et des reins. Le porteur indique une douleur postopératoire, une perte de poids de 10 à 15 % et une baisse d'activité, tous les animaux étant euthanasiés pour prélever les organes. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", les modèles in vitro ne reproduisant pas l'interaction entre organes, et n'utilise que des mâles.
Objectifs
Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Touchant près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde, le sepsis est un problème majeur de santé publique. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Cet état d’immunodépression induit à long terme à de graves dysfonctions d’organes telles qu'une insuffisance cardiaque ou une insuffisance rénale. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale et cardiaque après un sepsis. Notre hypothèse est qu’après un sepsis, les cellules immunitaires dans les organes tels que le cœur et les reins, se réorganisent dans le temps et l’espace contribuant à l’installation d'une insuffisance cardiaque et rénale. Moduler l’organisation de ces cellules dans les tissus pourrait alors permettre d’améliorer les défaillances cardiaques et rénales induites par un sepsis.
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de ligature ponction caecale sous anesthésie (durée 10 minutes) suivit 14 jours après d'une deuxième chirurgie pour la pose d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée 5 minutes). Ceci est combiné à une échocardiographie sous anesthésie avant les chirurgies et au moment de l’euthanasie de l’animal (3 fois 10 min) ainsi qu'à une mesure de la pression artérielle sur animal vigile chaque jour pendant 5 jours avant la première chirurgie pour habituer l’animal, puis au moment de la deuxième chirurgie et 7 jours, 14 jours et 28 jours après la deuxième chirurgie (9 fois 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales s'accompagnent de douleurs au niveau du site opératoire, un traitement antalgique sera administré durant les 24 premières heures à tous les spécimens, possiblement réitéré à plusieurs reprises en cas de persistance de signes d'inconfort. La perte de poids est une complication attendue suite à la chirurgie, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporel, et régresse en quelques jours. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle (composante du comportement maladie) et n'excède pas 5 à 7 jours. Ces affirmations font suite à une étude antérieure réalisée dans notre laboratoire montrant un retour au poids avant chirurgie et un activité normale des animaux entre 5 et 7 jours après ligature et ponction ceacale. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie et n’induit pas de nuisance spécifique. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress à l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure préalablement à la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés afin de prelever les différents organes à analyser (rate, rein, coeur, moelle osseuse, sang).
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permetent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.
Raffinement
Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus aisée conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures expérimentales, les mesures suivantes seront prises : Injection intrapéritonéale d'anesthésiques; administration systématique d'antalgique par voie intra péritonéale à h6 post-chirurgie pour tous les animaux; surveillance 2 fois/jour pendant les 3 premiers jours après chirurgie et administration à h24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire euthanasiés si le traitement est sans effet au-delà puis surveillances chaque jour par le personnel de l'animalerie pendant toute la durée du protocole.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4 à 8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole car les femelles présentent une protection relative au sepsis liée aux oestrogènes.
Étude des réseaux neuronaux du cerveau activés par la stimulation de la transmission dopaminergique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène et de médicaments psychiatriques, puis passent jusqu'à trois tests comportementaux dont des mesures d'impulsivité et de locomotion, pour étudier l'action de deux composés sur les réseaux neuronaux de la dopamine. Le porteur classe la procédure en modérée en raison des injections et des tests et prévoit une grille de score, tous les animaux étant tués pour prélèvement de tissus. Il affirme que la souris est le "seul organisme modèle" permettant ce type d'étude grâce aux lignées transgéniques.
Objectifs
Les neurones du cerveau communiquent entre eux à l’aide de substances appelées neurotransmetteurs, dont la dopamine. De nombreuses maladies psychiatriques telles que la schizophrénie, les troubles attentionnels et la dépression sont associées à un déséquilibre important des quantités de dopamine libérées dans le cerveau. Les neurones se retrouvent alors suractivés et le comportement est modifié de façon pathologique. Des composés utilisés en clinique, tels que le pramipexole et l'aripiprazole, vont réguler la suractivation des neurones et ainsi neutraliser certains des symptômes. Cependant leur utilisation s’accompagne, à plus ou moins long terme, de complications dont des troubles de l’impulsivité motrice et cognitive qui se manifestent sous forme d'agressivité, impatience, recherche de sensations fortes. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action de ces deux médicaments sur les différents types de neurones du cerveau. Ceci constitue un aspect important pour développer des approches thérapeutiques efficaces pour traiter les troubles de l’impulsivités induites par ces deux médicaments. La réalisation de ce projet nécessite l'utilisation de souris non génétiquement modifiées ainsi que de différentes lignées de souris transgéniques permettant 1) l'identification cellulaire et moléculaire des populations neuronales activées dans le cerveau en réponse à la dopamine et de 2) déterminer le rôle fonctionnel de ces réseaux dans le contrôle des fonctions motrices, cognitives et des émotions.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre d'une meilleure compréhension de l'action dans le cerveau du pramipexole et de l'aripiprazole, deux composés prescrits dans de nombreuses maladies psychiatriques. Les résultats obtenus lors de la réalisation de ce projet permettront également de préciser certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que des troubles anxieux ou de l'impulsivité associés à ces traitements, et à terme de proposer des approches thérapeutiques innovantes.
Procédures
Les animaux recevront différents types d'injections par voie intra péritonéale : de tamoxifène, de composé pharmacologique (pramipexole ou aripiprazole) ou de solution saline (Nacl 0.9%). La durée de ces injections ne dépassant pas 1 minute par animal. Des tests comportementaux sont prévus dans la procédure. Les animaux ne seront jamais soumis à plus de 3 tests (2 tests uniques toujours suivi d’un nécessitant un conditionnement). Ces tests ont une durée comprise entre 10 et 30 min dans la majorité des cas, 45 min à 1h pour certains (impulsivité, locomotion). Chaque test sera répété qu'une fois, à l'exception du protocole d'impulsivité qui, incluant des phases d'habituation et d'apprentissage, prévoit des séances étalées sur plusieurs jours (maximum 3 semaines). Le cumul de ces tests ne dépassera pas les 4 semaines.
Impact sur les animaux
La procédure prévoit des injections intrapéritonéales ainsi que des tests comportementaux. Ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, dégradation de l'apparence physique). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de ces signes cliniques (voir annexe). D'autre part, selon notre expérience le protocole prévu est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La réalisation de notre projet repose sur l'utilisation de nombreuses lignées transgéniques nous permettant de travailler sur différentes populations de neurones. La souris est le seul organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc la seule option à ce jour pour évaluer avec précision et pertinence certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que des troubles anxieux ou de l'impulsivité associés à la prise de pramipexole et d’aripiprazole.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à l'utilisation d'un logiciel statistique sur la base de publications précédentes et de l’expérience acquise au laboratoire depuis plus d’une vingtaine d’année, de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences. Dans le but d'une exploitation maximale des données obtenues, plusieurs régions cérébrales seront systématiquement analysées sur le même animal.
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages: sciure, pellets de coton. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.
Choix des espèces
Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux, au cœur de notre projet. En effet, nous disposons aujourd'hui de nombreux modèles murins transgéniques qui nous permettront d'atteindre les objectifs de notre étude, à savoir l’étude détaillée des réseaux neuronaux. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Les animaux seront utilisés entre 3 et 8 mois ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines.
Etude de l’effet de différentes voies de signalisation sur le muscle en régénération chez la souris C57BL/6 saine
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une lésion musculaire par injection de cardiotoxine puis des injections intramusculaires sous anesthésie, avant d'être mises à mort pour prélever leurs muscles, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la régénération. Le porteur affirme que les injections ne provoquent pas d'effets indésirables aux doses utilisées et que les souris reprennent leur activité dès le réveil. Il conclut qu'"aucune autre méthode alternative" ne peut se substituer à l'animal pour ce processus.
Objectifs
Les muscles squelettiques composent la moitié de la masse totale d'un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires mais également de vaisseaux sanguins, de nerfs et d'un tissu de soutien. Suite à une blessure, les différents types cellulaires qui composent le tissu coopèrent et interagissent pour reconstruire le muscle blessé. Parmi elles, les cellules souches musculaires s'activent et fusionnent ensemble pour former de nouvelles fibres musculaires. Le projet de recherche porte sur l'étude du rôle d'une protéine impliquée dans la fusion de ces cellules souches. Cette protéine est connue pour bloquer la fusion et donc la bonne réparation des muscles blessés. Le projet consiste à étudier par quels mécanismes elle agit sur la régénération. L’hypothèse est que plusieurs types cellulaires participent à ce processus en réponse à la protéine d'intérêt. L’approche qui sera développée consiste à isoler et étudier les cellules issues d'animaux modèles traités avec la protéine lors de la régénération musculaire. Cela permettra d'évaluer quelles sont les cellules répondeuses à cette protéine et comment ces cellules réagissent au traitement par cette protéine. A terme, ce projet de recherche permettra de comprendre les mécanismes par lesquels la protéine contrôle la réparation du muscle blessé.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats du projet permettront de comprendre précisément comment la protéine d'intérêt contrôle les différents types cellulaires lors de la réparation d'un muscle squelettique blessé. En plus d'augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction de ces cellules lors de la régénération, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative.
Procédures
Deux injections intramusculaires dans le muscle releveur de la patte seront réalisées. Elles durent moins de 5 secondes et seront faites sur animaux anesthésiés. Une injection d’analgésique (anti-douleur) sera également réalisée.
Impact sur les animaux
Les injections de la protéine d'intérêt n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal aux doses utilisées. L'utilisation d'anesthésiques au cours des procédures de lésion musculaire et d'injection de la protéine garantit l'absence de douleur chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu'elles ne montrent pas de signes de douleurs pendant les jours suivants.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et les muscles seront prélevés.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative actuelle ne peut se substituer à l'utilisation d'animaux pour l'étude de la régénération du muscle via l'activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entre les tissus blessés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats ne peuvent pas être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de notre projet utilisant des modèles murins.
Réduction
L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlée à l'aide d'analyses statistiques adaptées. Nous avons optimisé notre expérience afin d’utiliser un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiques fiables, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisé. La méthode de lésion musculaire utilisée est déjà très décrite au sein de la littérature et provoque peu de douleur chez l’animal.
Raffinement
Avant le début de la procédure, les animaux suivront une période d'acclimatation d'au moins une semaine. Les animaux seront également pesés 4 jours avant l’injection de cardiotoxine puis 4 jours après afin de vérifier qu'il n'y a pas de perte de poids anormale. Des anesthésiques et des médicaments anti- douleur seront utilisés afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés avant et après la manipulation. Si des changements sont relevés pendant plus de 24h, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d'améliorer les conditions de vie de l'animal et d'éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l'humain, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l'analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 8 à 12 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.
Rôle du peptide Aeta dans le comportement social et anxieux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 264 étant tuées pour analyses histologiques et 132 souris dites "visiteurs" gardées vivantes pour d'autres projets. Elles subissent une chirurgie, un isolement social pouvant durer jusqu'à douze semaines et une série de tests comportementaux dont le RNT donne le nombre sans les nommer précisément, pour étudier le rôle d'un peptide dans le comportement social et anxieux. Le porteur cite l'isolement comme la nuisance principale et l'implantation de minipompes ou de ciment dentaire comme gênes possibles. Il affirme que le comportement social ne peut être reproduit ni par ordinateur ni par cultures de neurones.
Objectifs
Ce projet de recherche porte sur le rôle physiologique du peptide Aeta et son impact sur la fonction cérébrale et le comportement social et anxieux chez la souris. Ce peptide est fortement impliqué dans la modulation d'un récepteur au glutamate impliqué dans la plasticité cérébrale mais également dans le comportement social. Grâce à des animaux transgéniques sur-exprimant ou sous-exprimant ce peptide, nous réaliserons une caractérisation de son rôle dans le comportement social, anxieux et d'anhédonie (manque de plaisir). En fonction des déficits observés chez les animaux sous exprimant, ou surexprimant le peptide, des stratégies de sauvetage , permettront de confirmer son rôle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre l'impact de la modulation de ce peptide sur les comportements sociaux et anxieux. En effet, ce peptide modulant un récepteur qui est très impliqué dans les comportements sociaux, il est très interessant de voir les effets de sa modulation. De plus, nous saurons également si le rôle de ce peptide et plus important lors du developpement ou lors de l'âge adulte. ce projet nous donnera donc potentiellement un nouveau peptide naturel qui pourrait être utilisé comme un nouveau modulateur de ces récepteurs dans certaines pathologies comme la Schizophrénie par exemple mais également dans des troubles sociaux.
Procédures
Les animaux expérimentaux (264) seront soumis à une procédure chirurgicale de 5 minutes. Parmi eux, 72 animaux expérimentaux subirons une procédure chirurgicale de 1h. Des tests comportementaux sont réalisés à l’adolescence et l’âge adulte grâce à 7 ou 9 tâches ( 4 tâches durant 30 min, trois tâches durant 10min environs et une tâche de 3 jours et une de 7 jours). Uniquement à l'âge adulte, un isolement de 12 semaines maximum sera réalisé. Les animaux visiteurs, qui sont un renforcement social dans nos comportements, seront soumis à trois tâches de 10 min avec au maximum deux restriction dans une zone de 20 x 10 cm.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet la majeure nuisance sera un isolement à l'âge adulte .L'anesthésie est également une nuisance , ainsi que la présence de chapeau en ciment dentaire ou l'implantation de minipompes qui pourrait gêner certain animaux par rapport à des éléments dans la cage de vie (Tube ou maison trop étroite).
Devenir
Dans les trois procédures, les animaux expérimentaux seront euthanasiés pour nous permettre de réaliser des analyses histologiques. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets.
Remplacement
Ce projet de recherche porte sur le rôle physiologique du peptide Aeta et l'impact sur le comportement social et anxieux chez la souris qui à l'interêt d'être un mammifère social. Ce peptide est fortement impliqué dans la modulation d'un récepteur au glutamate impliqué dans la plasticité cérébrale ainsi que dans le comportement social. le comportement social ne peut pas encore être remplacé par des modélisations informatiques, ni par des études de neurones en culture. Ce projet ne peux pas non plus être conduit chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
La réduction des animaux est faite par le suivit des mêmes animaux de l'adolescence à l'âge adulte pour eviter d'avoir trop d'animaux. Nous passons également deux fois les animaux "visiteurs" en tests sociaux pour éviter d'avoir le double d'animaux. le nombre d'animaux est choisi en lien avec nos expérimentations précédente et le fait que les comportements sociaux sont très variables. Les tests statistiques spécifiques seront utilisés en fonction de la normalité ou non des distributions.
Raffinement
Pour les chirurgies d’implantation de puces RFID (en anglais Radio Frequency Identification, c'est à dire identification par radiofréquence), ou les mini-pompes, ou les canules intracérébrales, les animaux recoivent l'anesthésie et l'analgésie adéquate. Lors du suivi post opératoire, une grille de score, avec des points limites adaptés et précoce, est utilisé pour réduire la souffrance et réaliser des traitements de la douleur si nécessaire. Si le chapeau en ciment dentaire, ou les minipompes sont une gène par rapport a ce qui est dans la cage, nous adapterons l'enrichissement pour éviter que les animaux se frottent contre un tube trop étroit ou une maison trop petite. Afin de réduire les effets anxiogènes de l'isolement social, des objets permettant de faire un nid, ainsi qu'une cachette (maison ou tube) seront disposés dans les cages de vie. A l’âge adulte, Après ces deux tâches qui nécessitent une mise temporaire en cage individuelle à l’âge adulte, les souris sont replacées en cages collectives pour les manipulations suivantes. Nous avons déjà réalisé ces regroupements qui se passent généralement sans problème. Les animaux seront évalués dans les 3 premiers jours après le regroupement grâce à la grille de score comprenant des points limites.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Notre projet consistant à étudier le comportement des animaux à différents stades de développement, nous utiliserons donc les animaux à l’adolescence (entre 30 et 60 jours) puis à l’âge adulte (à partir de 70 jours).
Évaluation des effets de molécules ayant un intérêt thérapeutique potentiel dans le syndrome de Down chez des souris modélisant le syndrome de Down
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souris modèles de trisomie 21 reçoivent jusqu'à trente-deux injections et passent des tests d'apprentissage et de mémoire (labyrinthe en Y, reconnaissance d'objet, piscine de Morris), tandis que des souriceaux subissent des injections intracérébrales sous anesthésie par le froid, pour tester des molécules contre la trisomie 21 et la maladie d'Alzheimer. Le porteur signale des risques d'hématomes, d'hydrocéphalie chez environ 10 % des animaux et d'hypothermie, tous étant tués pour prélever le cerveau. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthode alternative" au modèle souris.
Objectifs
Le syndrome de Down encore appelé trisomie 21 est la forme génétique de déficience intellectuelle la plus fréquente résultant de la présence d’un chromosome 21surnuméraire. Plus des trois quarts des personnes porteuses de trisomie 21 développent une maladie d'Alzheimer au-delà de 60 ans. Un certain nombre d'études suggèrent qu'il existe des mécanismes pathogènes communs à la maladie d’Alzheimer et à la trisomie 21 comme des altérations de différents types de neurotransmetteurs impliqués dans le fonctionnement du cerveau. Face à l'origine multifactorielle de ces maladies, une thérapie combinée est envisagée. Cependant, l'association de plusieurs médicaments peut entraîner des effets secondaires supplémentaires dus à des interactions entre les différentes substances. Pour éviter ces problèmes, une nouvelle technologie a émergé ces dernières années qui consiste à utiliser des ligands multi-cibles qui rassemblent en une seule structure plusieurs activités biologiques ciblant divers neurotransmetteurs impliqués dans la maladie.
Bénéfices attendus
Les maladies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer et la trisomie 21 vont nécessiter un traitement au long cours avec une exposition permanente aux médicaments qui devront avoir des effets secondaires minimes. Il n'existe aucun traitement pharmacologique de la déficience intellectuelle chez les personnes atteintes de trisomie 21 et seul un traitement symptomatique est actuellement disponible pour la maladie d’Alzheimer. Le présent projet est innovant car il testera des nouvelles molécules ciblant plusieurs mécanismes présentant un intérêt thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer et la trisomie 21. Ces nouvelles molécules seront disponibles sous une formulation conçue pour une administration intranasale qui devrait contribuer à améliorer le passage de la barrière hémato-encéphalique, ce qui limitera également les effets périphériques responsables de la plupart des effets secondaires. Nous testerons en parallèle des molécules ciblant les récepteurs GABA, le principal neurotransmetteur inhibiteur dans le système nerveux central, actives dans le traitement des déficits d’apprentissage et de mémoire dans des modèles murins de trisomie 21. Nous proposons ici une étude qui comparera les effets de deux molécules dont une qui a été utilisée en clinique chez des individus porteurs de trisomie 21.
Procédures
La première étude implique l’utilisation de modèles animaux de trisomie 21 (phénotype considérée dommageable), l'administration des médicaments quelques secondes sur animal vigile à raison de 2 fois par semaine entre 2 et 6 mois (32 injections maximum) puis un prélèvement sanguin qui durera 2-3min par animal et l’anesthésie profonde avant prélèvement du cerveau. La deuxième étude implique l’utilisation d’animaux témoins, l'administration des médicaments quelques secondes sur animal vigile, un prélèvement sanguin qui durera 2-3min par animal vigil et l’euthanasie rapide pour prélever le cerveau. La troisième étude implique l’utilisation de modèles animaux de trisomie 21 (phénotype considérée dommageable), l'administration des médicaments quelques secondes sur animal vigile avant les tests comportementaux (10 injections maximum réparties sur environ 3 semaines). Les capacités cognitives des souris seront évaluées dans 3 différents tests d'apprentissage et de mémoire: Y maze (8 minutes par animal), reconnaissance de nouvel objet (4 sessions de 10 minutes – 1 session par jour - par animal) et piscine aquatique de Morris (4 sessions de 1 minute par jour pendant 7 jours et 1 session - “probe test” - de 1 minute le jour 8 par animal). Après des tests comportementaux, un prélèvement sanguin qui durera 2-3min par animal vigil et l’anesthésie profonde avant prélèvement du cerveau. La quatrième étude implique l’utilisation de souriceaux entre la naissance et 2 jours, des injections intracérébrales qui dureront 2-3 minutes/animal (3 injections par hémisphère cérébral; 6 injections au total/animal). Après 3-10 semaines, ces souris seront anesthésiées avant l’euthanasie pour les enregistrements électrophysiologiques.
Impact sur les animaux
- Contention de l'animal pour l'injection; - Risque d’hématomes lors des injections répétées; - Risque de complications suite à l’injection intracérébrale; - Irritation de la sphère nasale suite aux injections intranasales répétées; -Phénotype dommageable (hydrocéphalie) qui apparaîtra dans environ 10% des animaux; - L'hypothermie due à anesthésie par le froid des nouveau nés pour les injections intracérébrales - Contraintes des tests comportementaux : contention, stress, réalisation individuellement (séparation du groupe), nage dans les tests de mémoire/déficit d’apprentissage.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées par des méthodes réglementaires pour prélèvement de sang et de cerveau pour des analyses biochimiques, électrophysiologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de trisomie 21 pour atteindre les objectifs du projet. La règle des 3R (Réduction, Remplacement, Raffinement) a été prise en compte pour la mise en œuvre du projet. Des points limites adaptées à chaue lignée de souris et chaque procédure seront mis en place.
Réduction
Nous utiliserons sur 4 ans un total de 342 souris. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessite et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment publiées, notamment des études du laboratoire.
Raffinement
Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Des points limites ont été mis en place et les mesures associées seront scrupuleusement respectées.
Choix des espèces
Les modèles de souris ont été essentiels pour mieux comprendre la trisomie 21 au cours des dernières années. Trois chromosomes de souris contiennent des régions similaires au chromosome 21 humain. Les souris modèles de trisomie 21, avec une duplication de la plupart des gènes du chromosome 21, sont actuellement disponibles. Dans la première étude, les performances comportementales seront évaluées sur les souris modèles de trisomie 21 mâles et femelles à l'âge de 6 mois après administration chronique de drogues, et les cerveaux seront prélevés suite aux tests comportementaux et à l’euthanasie. Dans la deuxième étude, les expériences de pharmacocinétique seront réalisées sur des souris témoins mâles à l'âge de 2 à 3 mois. Dans la troisième étude, les performances comportementales seront évaluées sur les souris modèles de trisomie 21 mâles et femelles à l'âge de 3 à 4 mois traités avec les composés inhibiteurs. La dernière étude, sera réalisée sur des souris entre la naissance et 3 jours qui recevront une construction virale permettant d’exprimer une protéine fluorescente dans des neurones très spécifiques permettant leur enregistrement électrophysiologique à entre 25 et 70 jours après euthanasie. Les effets du médicament sur les performances comportementales et la pathologie cérébrale seront évalués chez les souris adultes. D'autre part, l'injection intracérébrale de la construction virale chez les souriceaux est nécessaire pour une expression efficace et à long terme d'une protéine fluorescente dans un sous-type particulier d'interneurone que nous voulons étudier.
Évaluation pharmacologique de différentes approches thérapeutiques dans un modèle de tumeurs pulmonaires chez le rongeurs (rat/souris)
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 400
800 souris et 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte des cellules tumorales dans la veine de la queue, puis on administre des traitements et de la radiothérapie, avec imagerie et prélèvements sanguins sous anesthésie, pour évaluer des candidats médicaments contre le cancer du poumon. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent provoquer nécrose, cachexie et perte de poids et que la radiothérapie entraîne diarrhées et saignements, les animaux étant euthanasiés pour prélèvement d'organes. Il décrit objectifs et bénéfices en une phrase chacun et affirme que l'animal constitue un "passage obligatoire" faute de méthode de substitution.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer les effets anti-tumoraux de différentes nouveaux traitements dans des modèles de cancer du poumon.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du poumons.
Procédures
Les animaux recevront 1 injection de cellules tumorales par injection intraveineuse au niveau de la queue (durée estimé à 1 min). Application / Administrations des traitements (moins de 2min pour les injections et environ 5 min pour la radiothérapie). En cas de prélèvement de sang (moins de 2min) ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésies par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales dans la veine caudale et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la nécrose, cachexie, perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris ou le rat car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les cancers pulmonaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rats sont les espèces les plus adaptées à ce type d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (test de comparaison entre les différents traitements).
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.
Choix des espèces
Les rats et les souris font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes (à partir de 6 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. En effet le cancer du poumon atteint le plus souvent les personnes de 50 ans et plus; en 2007, 95,5 % des nouveaux cas ont été diagnostiqués chez les personnes de ce groupe d'âge.
Etude de l’implication des interneurones parvalbumine et des réseaux périneuronaux dans la douleur chronique et ses comorbidités anxiodépressives.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie de 45 minutes, une deuxième trois semaines plus tard, une troisième de 10 minutes après trois autres semaines, puis quatre tests comportementaux espacés de 24 heures et une restriction alimentaire de 24 heures : un lot de souris franchit toutes ces étapes. Les 396 souris du projet, toutes soumises à une douleur chronique et à des troubles anxio-dépressifs, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, un autre lot ne subissant qu'une chirurgie de 10 minutes sur la patte droite avant les mêmes tests, et d'autres deux chirurgies espacées d'une semaine. Le porteur écrit que la douleur "ne peut être soulagée car c'est l'objet d'étude", et ne précise ni la nature des chirurgies de 45 minutes ni les quatre tests comportementaux. À la fin des procédures, toutes sont mises à mort pour des prélèvements et des analyses cellulaires.
Objectifs
La douleur neuropathique est une douleur chronique consécutive à une lésion ou une pathologie du système somatosensoriel, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population. De plus, cette maladie s’accompagne dans environ 50% des cas de troubles de l’humeur tel que l’anxiété et la dépression, constituant alors un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle, des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données cliniques chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Il y aurait des modifications cellulaires et moléculaires dans ces structures à la suite de la douleur, qui pourrait expliquer l’apparition des troubles anxiodépressifs. L’objectif du projet est alors d’étudier ces changements dans un modèle de douleur neuropathique développant des symptômes anxiodépressifs.
Bénéfices attendus
A l’issu de ce projet, nous comprendrons plus en détail les modifications cellulaires et moléculaires du cerveau suite à une douleur neuropathique, et l’impact de ces modifications sur les troubles anxieux et dépressifs. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles de l’humeur induits par la douleur chronique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Un premier lot d'animaux subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 10 min environ, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, avec une restriction alimentaire de 24h. De plus, un autre lot d'animaux subiront une chirurgie de 45 min, puis 3 semaines après, une deuxième chirurgie de 45 min, puis 3 semaines après, une dernière chirurgie de 10 min, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, chacun espacé de 24h, avec une restriction alimentaire de 24h. Enfin, deux autres lots d'animaux subiront une chirurgie de 45min, puis une semaine après, une chirurgie de 10min et deux autres lots subiront d’abord une chirurgie de 10min puis une semaine après, une chirurgie de 45min, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, chacun espacé de 24h, avec une restriction alimentaire de 24h.
Impact sur les animaux
Il y a présence d’une douleur mais qui ne peut être soulagée car c’est l’objet d’étude. Suite à une chirurgie neuropathique, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparait dans les 48-72h après la chirurgie. Le développement de troubles anxiodépressifs est attendu et ne peut être évité car c’est l’objet d’étude. Les autres chirurgies peuvent induire une douleur aigue mais transitoire qui sera soulagée. La restriction alimentaire de 24h peut provoquer une perte de poids des animaux. Celle-ci sera limitée le plus possible en ne dépassant pas 24h de restriction et en réalimentant les animaux juste après le test. De plus, le poids des animaux sera surveillé tous les jours jusqu’à leur mise à mort pour vérifier que celui-ci ne diminue pas de 80% du poids initial.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort, pour prélevements et analyses cellulaires.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, notre analyse nécessite le développement des troubles anxiodépressifs dans un modèle de douleur neuropathique, nécessitant une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Evaluation de la fibrose rénale induite par l’angiotensine II chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous anesthésie une pompe diffusant de l'angiotensine II pendant quatre semaines, avec des administrations répétées de molécules candidates et des prélèvements sanguins, pour tester des composés censés freiner la fibrose rénale. Le porteur indique que l'hypertension provoquée peut évoluer vers une insuffisance rénale, avec polyurie et déshydratation, et que les reins sont prélevés après mise à mort. Il conclut que les tests sans animaux ne reflètent pas la complexité de l'organisme et que le modèle animal reste "indispensable".
Objectifs
La fibrose est un problème de santé publique affectant des millions de personnes à travers le monde. La fibrose n’est pas une maladie, mais elle se développe le plus souvent suite à un processus inflammatoire marqué. Elle se caractérise par le remplacement d’un tissu parenchymateux par du tissu connectif et la formation d’un tissu cicatriciel épaissi qui affecte de façon plus ou moins importante la fonction initiale de l’organe atteint. La fibrose peut impacter différents types de tissus parmi lesquels les poumons, le foie, le cœur ou encore les reins. Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabètes ou d’hypertension entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Comprendre et lutter contre le développement de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Il n’existe pas actuellement de médicament dont les effets anti-fibrosants soient clairement démontrés au niveau rénal chez l’homme. Ainsi le présent projet aura pour objectif d'évaluer l’efficacité préclinique de candidats médicaments susceptibles de lutter contre l’inflammation et la fibrose dans un modèle d’hypertension et de l'insuffisance/fibrose rénale induits par la perfusion d’angiotensine II chez la souris.
Bénéfices attendus
La fibrose rénale est un problème de santé publique. A l'heure actuelle il n'existe pas de traitements médicamenteux et les patients sont soignés par des thérapies lourdes que sont la dialyse et la transplantation. Ce projet permettra d'évaluer l’activité anti-fibrotique et/ou anti-inflammatoire de substances en développement qui pourraient trouver un intérêt dans le traitement de la fibrose rénale chez l’homme, réduisant ainsi les prises en charges lourdes utilisées actuellement.
Procédures
Les animaux sont anesthésiés transitoirement (la procédure ne dure que quelques minutes) pour être implantés avec un dispositif sous-cutané (pompe osmotique) permettant la perfusion d’une solution d’angiotensine II pendant 4 semaines. Les substances-test peuvent être administrées par bolus (la procédure ne dure que quelques secondes).. Les administrations peuvent être uniques ou le plus souvent répétées pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (nombre limité au strict minimum selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés sous anesthésie (la durée de la procédure de prélèvement est d’environ 30 secondes).
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédure, il est attendu une hypertension artérielle évoluant à terme vers une insuffisance rénale. Les symptômes peuvent comprendre une polyurie et une déshydratation malgré une augmentation de la consommation d’eau. Les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil peuvent être source de stress ou d’inconfort pour l’animal, tout comme les phases de contentions nécessaires aux administrations substances (antalgique en post-chirurgie, produit test).
Devenir
Dans la procédure, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés, de nombreux tests ex vivo, in vitro et in silico, ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substance à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système endocrinien chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8-12 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Si à la suite des premiers essais, il est montrer (par une approche statistique) que les données permettent de diminuer le nombre d’animaux sans impacter la fiabilité des résultats, alors une décision sera prise en ce sens. Par ailleurs, en plus des organes cibles (reins) de ce modèle, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Aujourd’hui encore, les rongeurs (souris) demeurent essentiels pour étudier les fibroses. Le modèle proposé dans ce projet est bien décrit dans la littérature scientifique . Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, soit jeunes (il est notamment prévu de commencer les études autour de l'âge de 2-4 mois), soit agés (jusqu'à environ 18 mois) car l'apparition de la fibrose rénale dans ce modèle est décrite comme de plus en plus importantes avec l'âge.
Identification des mécanismes d’action du phosphate sur les calcifications vasculaires dans un modèle de maladie rénale chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies rénales à une semaine d'intervalle pour induire une insuffisance rénale chronique avec calcifications vasculaires, ainsi que des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle du phosphate dans ces calcifications. Le porteur admet une mortalité de 15 % au moment de la chirurgie et décrit une hypertension chez la plupart des souris opérées. Il qualifie le projet d'"indispensable" et affirme que seule l'expérimentation sur animal entier permet d'étudier cette maladie systémique.
Objectifs
Un taux élevé de phosphate (Pi) sérique est associé au développement de calcifications vasculaires (CV) chez les personnes atteintes d'insuffisance rénale chronique (IRC) et dans la population générale, et peut être une situation mortelle. En effet, l’IRC aboutit à une hyperphosphatémie qui déclenche la calcification de la paroi artérielle, ce qui entraîne une rigidification du système artériel et contribue au développement des maladies cardiovasculaires. Des études prospectives à grande échelle sur la population ont montré que la fonction rénale est inversement associée à la mortalité, les CV étant la principale cause de maladie cardiovasculaire chez les patients atteints d'IRC, et semble être un facteur prédictif important de la mortalité. Cependant, bien que le rôle des niveaux élevés de Pi dans le développement des CV est largement reconnu, son mode d'action est encore inconnu et ne peut donc pas être ciblé de manière appropriée. L'objectif global de ce projet de recherche est de découvrir les mécanismes d'action du phosphate qui entraînent le développement des CV dans le contexte de l'IRC, et d'identifier des cibles thérapeutiques putatives capables de contrecarrer ses effets délétères. Lors de la première étape de ce projet nous avons mis au point un modèle de souris présentant une insuffisance rénale chronique avec CV associées. Pour mieux comprendre le rôle du phosphate dans les CV, nous voulons déterminer si le phosphate modifie les propriétés des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) ou s’il permet la formation de cristaux directement dans le tissu. Nous étudierons l’impact fonctionnel de deux protéines connues pour jouer un rôle dans le transport et la détection du phosphate ainsi que dans la calcification.
Bénéfices attendus
Ce projet est indispensable pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires d’action du phosphate dans les calcifications vasculaires dans l’insuffisance rénale chronique. Les calcifications vasculaires sont un facteur de mortalité, il est donc nécessaire de comprendre ces mécanismes, qui pourront potentiellement servir de cibles thérapeutiques à l’issu de ce projet
Procédures
Deux chirurgies (durée : 25-30 min) à une semaine d'intervalle sont nécessaires pour induire l'IRC chez la souris. Deux prélèvements de 2-3 gouttes de sang, avant la chirurgie 1 (2-3 gouttes de sang à partir de la veine de la joue) et en fin de procédure expérimentale (prélèvement terminal sans réveil), seront réalisés.
Impact sur les animaux
Le microprélèvement sanguin réalisé une seule fois génère un stress et une douleur de classe légère. L’insuffisance rénale chronique induite par chirurgie est bien tolérée chez la souris. Les nuisances liées à cette chirurgie sont de classe modérée (les principales manifestations cliniques de l’insuffisance rénale chronique sont une hypertension artérielle qui survient chez 75 -80% des animaux néphrectomisés et une protéinurie).
Devenir
mise à mort pour prélèvements terminaux d'organes afin d'évaluer le degré d'IRC, l'apparition de calcifications vasculaires dans différents organes, réaliser des dosages hormonaux en lien avec l'homéostasie du phosphate.
Remplacement
S’agissant d’une maladie systémique (insuffisance rénale chronique), l’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude (60 souris) a été calculé au plus juste et en prenant en compte les 15% de mortalité au moment de la chirurgie afin d’offrir la puissance statistique maximum.
Raffinement
Le protocole chirurgical sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane offrant à la fois une bonne sécurité et un bon confort anesthésique. Un protocole d’analgésie et un système de surveillance des points limites adaptés permettra, de prévenir et de contrôler efficacement les douleurs post-opératoires. Si les points limites sont atteints, les animaux concernés seront mis à mort. Les conditions d'hébergement sont adaptées aux besoins des souris (hébergement par groupe de 5 souris maximum, température, enrichissement du milieu de vie avec du frisottis permettant aux souris de se fabriquer un nid)
Choix des espèces
Nous nous intéressons au rôle de deux protéines dans l’apparition des CV dans un contexte d’insuffisance rénale chronique. L’utilisation de souris génétiquement modifiées pour l'une de ces deux protéines permettra d'apporter des réponses importantes sur les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans les CV au cours de l'IRC. Parallèlement à ces travaux, des études réalisées en culture de cellules permettront également de préciser ces mécanismes à l'échelle cellulaire. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 18-20 semaines pour rester proche de la pathologie humaine.