Souris

100 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour former des étudiants. Chaque étudiant explore l'équilibre et l'audition d'une souris d'un modèle du syndrome de Usher, avec des tests comportementaux puis des tests auditifs sous anesthésie profonde. Le porteur indique qu'aucun effet indésirable n'est attendu et que les souris retournent ensuite dans les cages de reproducteurs de la colonie. Il affirme que l'oreille interne ne peut s'étudier in vitro et que le modèle animal reste le "seul outil disponible".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de former les étudiants sélectionnés dans le cadre de notre cours sur l’Audition à la réalisation de tests d’équilibres et de tests auditifs sur des souris adultes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à former nos étudiants aux bonnes pratiques de laboratoire dans le domaine de l’exploration des fonctions audio-vestibulaires.

Procédures

Les souris seront utilisées pour des tests comportementaux non invasifs (50 minutes) et pour des tests audiologiques réalisés sous anesthésie profonde (40 minutes). Chaque étudiant étudiera l’équilibre et les capacités auditives d’une souris. Un maximum de 20 étudiants sera sélectionné chaque année. Vingt souris seront de fait utilisées chaque année, soit 100 souris sur 5 ans. D’un point de vue pratique, les étudiants seront divisés en 2 groupes. Pour le groupe 1 (10 souris), les tests auditifs auront lieu le 1er jour et les tests d’équilibre le 2ème jour. Pour le groupe 2 (10 souris), les tests d’équilibre auront lieu le 1er jour et les tests auditifs le 2ème jour.

Impact sur les animaux

Les souris seront utilisées pour des tests comportementaux non invasifs (50 minutes) et pour des tests audiologiques réalisés sous anesthésie profonde (40 minutes). Aucun effet indésirable n’est attendu.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris retourneront dans les cages de reproducteurs utilisés pour l’entretien de la colonie.

Remplacement

Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux neurones spiraux ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la surdité et les troubles de l’équilibre.

Réduction

Chaque étudiant du cours se verra confier une souris sur laquelle il réalisera ses tests comportementaux et auditifs. A la fin des tests, toutes les souris retourneront dans les cages de reproducteurs utilisés pour l’entretien de la colonie. Les données générées pendant ce cours viendront compléter d’autres produites dans le cadre d’un projet de notre laboratoire, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes creux en carton et de bâtonnets en bois. Une roue sera disposée dans les cages de souris mâles pour limiter les risques de bagarres. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies. Les animaux anesthésiés seront placés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet. L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins bien établis. Mâles et femelles seront utilisés, les déficiences auditives et vestibulaires étant similaires dans les deux sexes.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris double knock-out sont suivies de 3 à 10 mois par des tests visuels dont un test optocinétique et un électrorétinogramme sous anesthésie, pour étudier une dégénérescence de la rétine. Le porteur indique qu'il retire délibérément tout enrichissement de la cage pendant les mois d'expérimentation, l'enrichissement modifiant la progression de la maladie. Il affirme que la fonction de la rétine ne peut s'étudier sur des cellules en culture et renvoie la thérapie envisagée à une preuve de concept.

Objectifs

L’objectif du projet est de suivre la progression du déficit de vision des souris avec des gènes doubles knock-out, y compris la fonction des photorécepteurs cône et bâtonnet, l’acuité visuelle, la structure de la rétine, etc. Les deux gènes sont paralogue et les deux knock-out existent pour chaque gène. Le phénotype de chacune de ces souris a été étudié précédemment. Elles présentent toutes deux un déficit de vision important avec une fréquence différente en terme de dégénérescence des cônes. Ceci suggère que les deux gènes ont une fonction distincte dans la protection des cônes. Nous nous attendons à un déficit de vision plus sévère chez les souris dont les deux gènes sont inactives, permettant ainsi d explorer la future stratégie de traitement de type combinatoire.

Bénéfices attendus

L’analyse des phénotypes chez les souris à double gène nous aidera à mieux comprendre l’interaction et leur effets compares à un seul gène. Nous possédons des arguments pour anticiper que l’administration des deux gènes d’intérêt aurait un effet thérapeutique synergétique. A plus long terme l’objectif est de faire la preuve de concept du bénéfice pour la vision d’une thérapie combinant les deux produits du gène comme alternative à la stratégie thérapeutique indépendante de la mutation causale de la rétinopathie pigmentaire.

Procédures

Les différents tests seront réalisés sur les mêmes animaux des quatre génotypes à 3, 6 et 10 mois. Test comportemental optocinétique (OKT, 5 min), fond d’œil grâce à une caméra de fond d'œil numérique (MICRON III, 5 min sous par gaz anesthésie), imagerie de la rétine par tomographie par cohérence optique (OCT, 5 min sous par gaz anesthésie), et électrorétinogramme (ERG, 30 min sous anesthésie par injection intrapéritonéale).

Impact sur les animaux

Nous anticipons des effets indésirables modérés dues aux paramètre suivants : absence d’enrichissement, chambre noir, test de comportement/stress, injection IP/contention/piqûre, anesthésie. Nous prévoyons un stress pour l’hébergement sans enrichissement, chambre noire ou encore comportement ; inflammation locale au site d’injection pour les IP ou encore risque anesthésique pour les actes sous anesthésie générale. Chambre noir est requis pour la mesure d’ERG scotopique. Pour l’absence d’enrichissement, tout est mis à contribution pour pouvoir reproduire le déficit visuel des souris contrôles précédemment étudiées en l’absence d’enrichissement La littérature montre que l'enrichissement affecte la progression de la dégénérescence de la rétine chez les souris rd10. Quinze jours précédant la première expérience, nous acclimatons les animaux en enlevant l'enrichissement. Nous supprimerons donc l'enrichissement uniquement durant la période d'expérimentation, commençant du 3eme mois au 10eme mois.

Devenir

Les souris seront testées à 3, 6 et 10 mois. La durée est fixée à 10 mois par des expériences publiées précédemment, mais la mesure des paramètres à 6 mois pourrait nous amener à repousser ce durée à 12 mois, ou même plus. Après la dernière mesure, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire. Les rétines des deux yeux de ces souris seront prélevées pour mesurer la densité des cônes.

Remplacement

L’étude de la fonctionnalité de la rétine d’un modèle murin au cours du vieillissement ne peut être réalisée sur des modèles de cellules en culture. Les photorécepteurs des organoïdes rétiniens obtenus par reprogrammation de cellules souches n’ont aucune fonction électrophysiologiques.

Réduction

Pour appréhender une aggravation statistiquement significative du phénotype visuel des souris analysées, il faut nécessairement répéter les mesures sur ces dernières car un design expérimental adéquat est requis. Il est aussi nécessaire de valider le déficit visuel pour ces dernières souris en le rapportant à la vision de la souris contrôle. Les quatre groupes sont donc requis scientifiquement. Le nombre de souris par groupe (n = 12), soit au total 48 souris, avec trois répétitions de cette expérience soit n=144. Ce nombre est estimé d’après des travaux antérieurs et par l’estimation du pouvoir statistique à atteindre pour obtenir une différence statistiquement et biologiquement significative. L’information extraite de chaque animal est poussée à son maximum en analysant les deux yeux de chaque souris. Chacun des quatre groupes de souris sera analysé à 3, 6 en 10 mois pour la fonction et la survie des bâtonnets et l’acuité visuelle des cônes leur fonction

Raffinement

De façon générale, les animaux seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou l’expérimentateur. Nous les considérons comme en bonne santé si leur pelage est brillant et que leur comportement est normal. S'il y a des signes de malaise, comme un comportement anormal, une perte de poids, une déshydratation, une prostration, un prolapsus rectal, etc. L'expérience sera arrêtée et le personnel qualifié de l'animalerie estimera le niveau de malaise, puis décidera d'observer, de traiter ou de les euthanasier. Toutes les expériences de chaque étape sont non invasives et l'analgésie et l'anesthésie seront utilisées pour réduire la douleur, le stress et l'inconfort des animaux. Si les risques d'anesthésie sont observés, tels que la dépression respiratoire, l’accident vasculaire cérébral, etc., l'animal sera alors, retiré du groupe et euthanasié. Les tests de comportement sont réalisés par une même personne permettant ainsi de réduire le stress des animaux et d’éviter des variations intra-individuelles.

Choix des espèces

Le phénotype visuel des souris avec inactivation d’un seul des deux gènes a été étudié précédemment. La souris est aussi une modèle pertinent d’étude des dégénérescences rétiniennes héréditaires. Les quatre cohortes seront suivies entre 3 et 10 mois, soit durant la période de perte de vision dans nos études publiées. Ces animaux seront placés dans une pièce dont l’intensité de la lumière et le cycle jour/nuit est contrôlé dès leur sevrage.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues de lignées génétiquement modifiées, dont certaines ont des cellules intestinales incapables de produire de l'acétylcholine, elles sont infectées par voie orale avec un parasite que le résumé ne nomme pas, reçoivent des injections intrapéritonéales et subissent un jeûne de quatre heures. Elles sont enfin opérées une heure sous anesthésie, sans réveil, pour recueillir le contenu de leur intestin et leurs tissus digestifs, l'objectif étant de montrer que ces cellules, dites tuft, produisent des composés antiparasitaires. Le porteur juge lui-même la balance bénéfice/risque "clairement favorable", et qualifie son étude de "potentiellement impactante" pour la santé publique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est simple, et consiste à démontrer que certaines cellules épithéliales du tractus digestif, nommées cellules tuft, sont capables de produire des composés antiparasitaires. Cette démonstration est d’une importance majeure en termes de santé, puisqu’ouvrant la voie à de nouvelles pistes en matière de lutte contre les parasites, qui touchent des millions de personnes dans le monde. Nos données obtenues montrent clairement que les souris dont les cellules tuft sont dans l’incapacité de produire de l’acétylcholine sont très sensible aux infections parasitaires. L’idée de ce projet consiste à montrer le lien direct entre cellules tuft, acétylcholine et ciblage des parasites, en démontrant spécifiquement la présence d’acétylcholine produite au sein de l'intestin. Notre stratégie expérimentale consistera à infecter des souris avec un parasite classiquement utilisé comme modèle expérimental, utilisé avec succès dans notre équipe par le passé. Nous doserons, en fin de procédure, le taux d’acétylcholine produite, via une procédure contrôlée sous anesthésie générale, pour récupérer le contenu intestinal. Ce travail devrait nous permettre de revisiter les modalités de la réponse de l’hôte contre des parasites entériques, dans une étude originale et potentiellement impactante en termes de santé publique.

Bénéfices attendus

La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Cette procédure nous permettra d’obtenir les données nécessaires pour démontrer le rôle des cellules tuft comme cellules productrices de composés antiparasitaires. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, les infections entériques avec des parasites touchant des millions de personnes dans le monde.

Procédures

Contention lors de l'étape d'infection parasitaire, administration de substances par voie intra-péritonéale, procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les étapes susceptibles d’être une source de stress pour les souris sont principalement celles de l’inoculation des parasites par voie orale, les injections de substances par voie intra-péritonéale, la mise à jeun de 4 heures, la réaction immunitaire liée à l'infection parasitaire, ainsi que la procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de récupérer les tissus digestifs et la ponction luminale.

Remplacement

Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains parasites. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse lors d’une précédente étude, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. De manière claire, toute possibilité d’utilisation des modèles ex vivo sera priorisée pour compléter les données acquises avec cette étude.

Réduction

A ce jour, nous avons le recul nécessaire d’un projet précédent, ce dernier nous ayant permis d’obtenir des données encourageantes. Les résultats seront obtenus via des analyses statistiques comparant la réponse antiparasitaire de nos groupes d'animaux. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction du nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité, selon des points limtes ayant été précdemment validés et déterminés. Afin de réduire le stress pendant les infections, les animaux seront anesthésiés. La phase expérimentale de prélevement durera 60 minutes, sous anesthésie générale contrôlée dans le cadre d’une procédure de chirurgie sans réveil. Cette procédure sera réalisée avec des substances anesthésiques, un analgésique local, ainsi qu'un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal.

Choix des espèces

Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l'homme et nos modèles génétiquement modifiés nous permettent de répondre à nos questions et finaliser notre étude. Ces dernières seront utilisées à l'âge de 8 semaines, lorsque le système digestif est mature.

Des souris reçoivent un ADN censé faire produire en continu par leurs cellules musculaires la kisspeptine, un peptide qui stimule les hormones de la reproduction, afin de mettre au point un "outil permettant de maitriser la reproduction". 765 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent trois poses chirurgicales de mini-pompes à 28 jours d'intervalle ou une injection hydrodynamique dans la veine saphène, des prises de sang répétées, des frottis vaginaux, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, un open field, une chambre claire-obscure et un test de reconnaissance d'objet. Certaines subissent seize prises de sang en moins de onze heures après une injection de GnRH, et la mise à mort se fait sous anesthésie, par décapitation ou par perfusion de paraformaldéhyde dans le cœur. Le porteur présente ces études comme un "chainon essentiel" avant des expérimentations sur des "espèces de rente telles que les ovins".

Objectifs

La kisspeptine (Kp), produite dans le cerveau, est un puissant stimulateur de la sécrétion de gonadolibérine (GnRH) qui, à son tour, induit la libération de l’hormone lutéinisante (LH) dans la circulation sanguine chez les mammifères. A ce jour, de très nombreuses études ont évalué l’effet d’une injection aigüe de kisspeptine pour tenter de comprendre et de maitriser la reproduction de plusieurs mammifères (notamment la souris, l’Homme, mais aussi les animaux de rente pour lesquels le système reproducteur n’est pas actif tout au long de l’année). De ce fait, les mécanismes impliquant le contrôle de la sécrétion de LH et l'action de la Kp sont alors très bien connus et documentés. Cependant, une faiblesse majeure de la kisspeptine, utilisée en tant que telle pour maitriser la reproduction, est le délai d’action de la protéine qui est relativement vite dégradée. Des études ont alors tenté de mettre au point une forme modifiée de la kisspeptine afin de la rendre plus résistante aux processus de dégradation. A ce jour, aucune forme modifiée du peptide n’a cependant été assez performante pour être utilisée comme outils de maitrise de la reproduction. Le présent projet vise alors à adopter une approche totalement innovante à la lumière de ce qui est en cours de développement dans le domaine des biomédicaments : faire produire la kisspeptine directement par les cellules musculaires qui sont des cellules définitivement différenciées, qui ne se divisent pas, et sont capables de fortement exprimer une protéine puis de l'excréter dans le système circulatoire. Concrètement, l’idée est d’injecter dans le muscle un complexe ADN pour faire produire de la Kp qui sera excrété du muscle vers le système sanguin. Comme ils n’impliquent pas d’agents viraux, ces complexes sont plus faciles d’utilisation et n’ont pas d’effet inflammatoire. Nous souhaitons donc tester si l’injection de ces complexes dans le muscle peut être une technique efficace pour, à terme, faire produire de façon stable la Kp dans l’optique de stimuler ou inhiber la reproduction de l’organisme cible qui, dans ce projet, est la souris.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à mettre au point une méthode permettant de sécréter de la kisspeptine de façon continue par les cellules musculaires de l’organisme cible. Les bénéfices sont donc multiples 1) étudier l’effet d’une diffusion continue de kisspeptine sur la physiologie de l’organisme, 2) mettre au point une technique de production de peptides par les cellules musculaires et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction.

Procédures

Procédure n°1 : 1) Pose de mini pompes osmotiques sur 96 animaux : les mini pompes diffusent la solution qu'ils contiennent pendant 28 jours maximum, le protocole étant prévu pour 3 mois, les mini pompes seront remplacées 2 fois. Au final, ce sera donc 3 pose de mini pompes à ,28 jours d'intervalle sur 630 animaux. 2) Test de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) sur 56 animaux avec des prélèvements de sang d'environ 1ul, réalisés 10 et 20 minutes avant une injection de glucose ou d'insuline et 15, 30, 60, 120 minutes après. L'ITT sera toujours réalisé 1 semaine avant le GTT et ceux ci seront réalisés 3 fois avec 28 jours d'intervalle. 3) Frottis vaginaux réalisés sur 28 femelles sur une période de 8 jours tout les 28 jours. 4) Tests de comportements sur 80 animaux : open field, chambre claire obscure, test de reconnaissance d'objet, réalisés sur une période de 5 jours tout les 28 jours. 5) Prises de 10ul de sang sur 96 animaux tout les 28 jours. L'intervention sera réalisée 4 fois. 6) Injection de GnRH et prélèvements de 4ul de sang de facçon sériée, une seule fois au 84ème jour du protocole. Seiez prélèvements seront réalisés 40 et 20 minutes avant l'injection de GnRH puis 20, 40, 60, 80, 100, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 et 600 minutes après l'injection pour un total de 16 prélèvements de 4ul de sang. 7) Sacrifice après anesthésie, par décpaitation ou perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde. Procédure n°2 et 3 : 1) Injection hydrodynamique d'un vecteur plasmidique via la veine saphène réalisé sur 637 animaux au total sur les deux procédure (630 + 7). 2) Prises de 4 ul de sang tout les 10 jours pendant 3 mois, soit 9 fois. 3) Mise à mort après anesthésie par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde.

Impact sur les animaux

Le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les rongeurs. En termes de manipulation des animaux, les tests comportementaux, chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets secondaires peuvent être observés, notamment suite à la pose des mini pompes (procédure 1) ou l'injection hydrodynamique (procédure 2) : des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'antidouleurs au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence. L’objectif de ce projet est d’induire une production continue de kisspeptine par l’organisme, ce qui n’a encore jamais été testé jusqu’à présent.

Devenir

les animaux sont mis à mort pour prélèvements d’organes pour des études post mortem.

Remplacement

Une grande partie du travail de sélection des meilleurs vecteurs ADN a été réalisé en amont sur des modèles de cultures cellulaire, mais l'étude de l'effet de la Kp sur la fonction de reproduction et sur la physiologie globale de l’organisme nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu, aucune méthode de remplacement n'est donc envisageable dans ce contexte.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement.

Raffinement

Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement (posture voutée, démarche anormale) et l'apparence (pelage négligé, réduction du toilettage, grattage excessif, eczéma) des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours (en prêtant attention au pourcentage de perte et qu'il ne dépasse pas le seuil critique de 20%) pendant 3 jours après les prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique des 20% de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes et injections hydrodynamique, des traitements anesthésiques (kétamine, xylazine) et analgésiques (atipamézole, meloxicam) seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.

Choix des espèces

Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction. De plus les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Cependant, l’effet de la kisspeptine sur le long terme sur la physiologie globale de l’organisme reste assez peu étudiée, or, ce peptide est de plus en plus présenté comme étant un outil prometteur pour la maitrise de la reproduction et le traitement de pathologies associées à la fertilité. La souris est alors un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Enfin, ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront de poursuivre avec des expérimentations sur les espèces de rente telles que les ovins et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse.

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est induite par injection de collagène, qui provoque un gonflement des pattes et des articulations, sans qu'aucun anti-inflammatoire puisse être administré puisqu'il interférerait avec l'expérimentation. Le projet teste des cellules souches mésenchymateuses et leurs sécrétions pour réduire les signes d'arthrite. Le porteur annonce un impact "majeur" et des "retombées énormes" en santé publique, tout en renvoyant l'application humaine à un modèle préclinique.

Objectifs

Notre groupe travaille sur la mise au point d’approches de thérapies cellulaires pour inhiber l’inflammation ou régénérer le cartilage détruit suite à des pathologies ostéo-articulaires notamment dans le cas de la polyarthrite rhumatoïde. L’inhibition de l’inflammation associée à cette pathologie consiste à injecter de manière locale ou systémique des cellules « médicaments », les mitochondries ou les vésicules extracellulaires qu’elles sécrètent capables d’inhiber la réponse immunitaire. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les capacités thérapeutiques de cellules appelées cellules stromales mésenchymateuses (CSM) non-modifiées ou modifiées (ou ce qu’elles sécrètent) pour diminuer les signes d’arthrite. Les CSM sont des cellules qui possèdent des propriétés anti-inflammatoires qui les rendent particulièrement intéressantes pour mettre en place une approche thérapeutique de l’arthrite. Le modèle utilisé couramment est le modèle d’arthrite induite au collagène (CIA).

Bénéfices attendus

En l’absence de traitement de l’arthrite chez environ 30% des patients atteints de formes sévères et résistants aux biothérapies, il est nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’utilisation des cellules souches a déjà montré son intérêt dans plusieurs modèles de pathologies autoimmunes dont l’arthrite rhumatoide. Notre projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de ces cellules dans un modèle pré-clinique d’arthrite chez la souris et à comprendre les mécanismes mis en œuvre par ces cellules afin de déterminer les meilleures options thérapeutiques chez l'homme. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de l’arthrite. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux subiront deux injections dans le tissu cutané, deux intraveineuses ainsi que des prélèvements sanguins. Tous ces gestes seront effectués sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

L’immunisation des animaux et leur suivi constituent un protocole induisant des douleurs modérées et pour lequel il n’est pas possible d’administrer de traitements anti-inflammatoires qui interféreraient avec l’expérimentation. L’immunisation des animaux pour induire l’arthite se fait par des injections dans le tissu cutané après anesthésie gazeuse. Elle provoque un gonflement des pattes et des articulations. Un stress lié à l’anesthésie et une douleur au site d’injection peuvent être provoqués. Cependant, la douleur reste faible et sans impact sur le comportement des animaux.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour prélevés les organes d’intérêt

Remplacement

- Remplacement : Afin de proposer une thérapie cellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses humaines et murines dans un modèle pré-clinique pertinent chez l’animal. Des modèles in vitro ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces cellules ou des molécules ou des vésicules qui en dérivent.

Réduction

- Réduction : le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer (données préliminaires obtenues dans d’autres expériences réalisées au laboratoire)

Raffinement

- Raffinement : toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement. Le bien-être des animaux sera suivi à l’aide d’une grille de score de bien-être. Si les souris ont du mal pour se redresser ou à se nourrir, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition des souris directement dans la cage des animaux.

Choix des espèces

Les souris mâles de la souche utilisée sont susceptibles à l'arthrite au collagène qui est le modèle expérimental de référence pour la pathologie humaine. Les souris doivent être âgées d'au moins 9 semaines et posséder un système immunitaire mature. Les animaux sont utilisés à semaine 9, âge recommandé pour ces modèles d’arthrite induite

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau ou l'implantation d'une canule cérébrale reliée à une minipompe, complétées par un régime gras, des tests métaboliques, un jeûne de 24 heures et des prélèvements sanguins. Le porteur décrit une inflammation post-chirurgicale possible et l'isolement des souris en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire. Il situe l'intérêt du projet dans la recherche de cibles contre l'obésité, notant que ces médicaments sont "particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique", et affirme que cette régulation ne peut s'étudier que chez la souris.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. L'organisme doit en permanence recueillir et interpréter des signaux hormonaux, métaboliques et nerveux émis par les tissus périphériques impliqués dans l'utilisation et le stockage de l'énergie (foie, muscle, tissu adipeux). En retour, l'intégration de ces signaux par le cerveau se traduit par la mise en place d'une réponse adaptée au niveau comportemental (manger ou jeûner) et métabolique (production de sucre par le foie et libération de lipides par le tissu adipeux en période de carence, ou bien stockage d'énergie par ces mêmes tissus en période d'abondance). Au niveau du système nerveux central, une région particulière de l'hypothalamus, le noyau arqué (ARC), joue un rôle fondamental dans la signalisation et l'intégration des messages circulants de satiété et de faim. L'ARC contient deux populations neuronales clés dans la régulation du comportement alimentaire : les neurones à Agouti-Related Protein (AgRP) stimulant la prise alimentaire et les neurones à pro-opiomélanocortine (POMC) inhibant la prise alimentaire. Nous avons observé que la prise alimentaire est réduite chez des souris dans lesquelles notre gène d'interêt est invalidé dans les neurones AgRP. Nous voulons maintenant: 1. déterminer les voies de signalisation moléculaires qui sont mises en jeu dans cette population neuronale. 2. Vérifier la réversibilité du phénotype observé chez les souris dont le gène d'intérêt est invalidé. 3. Verifier si la protéine codée par le gène d'intérêt peut être une cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de Type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établie et de façon encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'un gène d'intérêt dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Des mutations du gène étudié ont été trouvées dans de nombreuses cohortes de diabétiques DT2. Nos données laissent entrevoir un rôle spécifique de ce gène dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'a pas été mise en avant jusqu'à présent. Les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage les mécanismes moléculaires reliant notre gène d'intérêt à la prise alimentaire, ce qui sera nécessaire pour déterminer si la protéine codée par ce gène est ou non une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité. Par ailleurs, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la famille de notre protéine d'intérêt nous permettra de fournir une première preuve de concept qui déterminera si l'inhibition pharmacologique est effectivement une voie à privilégier. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction cellulaire. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'obésité.

Procédures

230 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Avant et après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 4 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 90 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Ces animaux subiront, sous anesthésie générale, l’implantation par chirurgie stereotaxique d’une canule dans une zone particulière du cerveau. La canule est reliée à une minipompe implantée sous la peau du dos au cours de la même chirurgie. 1 semaine avant et 1 mois après la chirurgie, un prélèvement sanguin à la veine temporo mandibulaire (durée : 30-45 sec.) est réalisé sur les animaux vigiles. Par ailleurs, au cours du mois suivant la chirurgie, ces animaux seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le premier nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements d’une goutte de sang (2µl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le 2ième nécessitera 4 injections IP (1 inj/jour - durée 10 sec.)

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post-chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim) qui, pour habituer les animaux, nécessite une injection IP de NaCl0.9% quotidienne pendant jours sans aucun effet prévu. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Un troisième test est décrit, il s'agit d'un test de tolérance au glucose. Un bolus de glucose est administré par voie IP, ce qui aura pour effet l'élévation de la glycémie (taux de glucose sanguin). La glycémie est mesurée à différents temps pour évaluer la capacité à Les animaux recevront une injection stéréotaxique qui pourra provoquer une inflammation post-chirugie. La procédure pour tester la sensibilité à la ghréline nécessite l'injection quotidienne intrapéritonéale de NaCL 0.9% afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche gras pour créer une environement obésogène sera mis en place chez les souris traitées avec l'inhibiteur pharmacologique, ce qui peut creer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisees dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 340 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs tests métaboliques (avec un temps de récupération adapté pour les animaux) seront réalisées sur les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Les animaux sont surveillés par le personnel qualifié tous les jours. Le stress lié aux procédures nécéssitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Chaque semaine, la prise de poids, la quantité de nourriture sont mesurées permettant ainsi un suivi hebdomadaire des souris. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour réduire tout inconfort ou douleur qui se développerait et des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Tout signe de douleur sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé, après avis vétérinaire. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formé spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Dans le domaine du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles le gène codant pour la protéine CaMK1D est invalidé. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgées de 8 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale (PE3)

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intradermique puis, cinq jours plus tard, une injection dans la voûte plantaire des deux pattes arrière pour déclencher une réaction inflammatoire, sans analgésique afin de ne pas interférer avec l'inflammation. Le porteur teste des cellules stromales mésenchymateuses censées réduire cette inflammation, en vue de traitements de l'arthrose et de la polyarthrite. Il affirme que les modèles in vitro ne suffisent pas à évaluer l'efficacité dans un contexte inflammatoire complexe.

Objectifs

Dans le cadre du traitement des pathologies ostéo-articulaires telles que l’arthrose ou la polyarthrite rhumatoïde, ldifféretnes approches de thérapies cellulaires sont en cours d’évaluation. Notre projet de recherche consiste à étudier les capacités thérapeutiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) pour diminuer l’inflammation associée à ces maladies. L’évaluation des propriétés anti-inflammatoires des CSM (ou de molécules thérapeutiques libérées par ces cellules) peut être effectuée dans un modèle inflammatoire simple, avant d’avoir recours à des modèles plus complexes et plus lourds à mettre en œuvre. Le modèle que nous utiliserons est le modèle d’hypersensibilité retardée (DTH) chez la souris. Le projet repose sur l’utilisation des cellules stromales mésenchymateuses murines ou humaines. La voie d’injection des cellules est locale. En parallèle, nous évaluerons les mécanismes moléculaires mis en place par ces cellules en utilisant des cellules souches mésenchymateuses déficientes pour l’expression de certains gènes et nous déterminerons l’impact de ces molécules sur l’effet thérapeutique des cellules.

Bénéfices attendus

Le modèle d’hypersensibilité retardée est un modèle rapide, simple et reproductible d’inflammation permettant d’évaluer l’efficacité d’un traitement immunomodulateur médié par les cellules stromales mésenchymateuses et des molécules ou des vésicules extracellulaires qu’elles libèrent. Grâce à ce modèle, nous pourrons valider in vivo une molécule identifiée in vitro ou un nouveau médicament cellulaire plus efficace sur l’inflammation que les approches thérapeutiques déjà en cours d’évualuation clinique chez les patients souffrant de pathologies ostéo-articulaires avec notamment des atteintes inflammatoires importantes. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement efficace des pathologies ostéo-articulaires. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire en identifiant des traitements plus efficaces aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge de l’inflammation des patients touchés par ces pathologies

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intra-dermique puis 5 jours plus tard, à une injection au niveau de la voûte plantaire des deux pattes arrière. Toutes les injections se feront sous anesthésie générale gazeuse (maximum 5 min/animal) au moment de l’intervention.

Impact sur les animaux

Nuisance et effets indésirables : la douleur induite par les injections de BSA méthylée en intradermique puis dans la voûte plantaire des souris sera de degré modéré et ne nécessitera pas l’administration d’analgésique qui pourrait interférer avec les mécanismes d’inflammation. Un stress lié à l’anesthésie peut être présent mais sans impact sur le comportement des animaux. Concernant les molécules qui seront testées : elles auront été sélectionnées et validées in vitro auparavant pour leur effet anti-inflammatoire. Il n’est donc pas attendu qu’elles puissent générer un effet indésirable

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de la procédure.

Remplacement

Avant de proposer une thérapie cellulaire ou acellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des traitements proposés dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte complexe d’inflammation rencontré in vivo.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et une analyse statistique afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour chaque expérience. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe expérimental afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien. L’injection des traitements est réalisée sous anesthésie gazeuse générale. Surveillance liée aux procédures : Les souris seront observées quotidiennement et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés et consignés dans une grille de score. Les points d’injection seront désinfectés à la vétédine avant et après injection et surveillés quotidiennement. Jusqu’à présent, nous n’avons jamais mis en évidence de signes d’irritation aux sites d’injection. La durée très courte de l’expérience garantit également une limitation de la douleur dans le temps.

Choix des espèces

Le modèle murin d’hypersensibilité retardée a été choisi parce qu’il présente l’avantage d’être simple, rapide et qu’il permet d’évaluer rapidement l’effet anti-inflammatoire d’un traitement avant d’avoir recours à des modèles in vivo plus complexes. Les animaux sont utilisés à semaine 7, âge recommandé pour ce modèle murin.