Système gastrointestinal
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Évaluation des effets d’une nouvelle formulation d’un principe actif cyto-protecteur sur la survie et la régénération tissulaire post-irradiation.
- Recherche fondamentale
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- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
4 906 souris vont être utilisées, chacune subissant jusqu'à 27 gestes en 30 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont irradiées sur le corps entier sans anesthésie ou sur l'abdomen sous anesthésie, puis reçoivent une molécule par sonde ou par injection, avec des pesées tous les un à deux jours et une prise de sang par semaine. Le porteur liste parmi les effets attendus perte de poids, anémie, prostration, déshydratation, "ou la mort", et mesure l'efficacité du traitement à la survie des souris, suivies de 30 jours à six mois puis tuées. Les autres sont tuées à différents temps après l'irradiation pour prélever les tissus touchés. La molécule doit servir de contre-mesure aux irradiations par accident ou lors d'"attaques", pour des militaires, des secouristes et "un grand nombre de victimes".
Objectifs
L’exposition accidentelle ou malveillante à une dose forte ou modérée de rayonnements ionisants en un temps très court provoque un syndrome d’irradiation aiguë (SIA), engageant immédiatement le pronostic vital. À ce jour, les thérapies sont limitées. Si des facteurs de croissance hématopoïétique existent, leur usage est limité par un coût très élevé et la survenue d’effets secondaires à long terme. Les autres options, comme les greffes de moelle osseuse, sont lourdes et invasives. Enfin, les soins de support classiques ne traitent que les symptômes (diarrhées, vomissements, infections) sans garantir la survie. Il existe donc un besoin critique de développer des contre-mesures médicales efficaces et facilement administrables. Ce projet vise à évaluer l’efficacité une nouvelle molécule auto-administrable, capable d’agir en prévention (avant une irradiation) ou en traitement (après une irradiation). L’étude se concentre sur la protection et la régénération de deux tissus vitaux particulièrement sensibles aux rayonnements : 1. la moelle osseuse : garante de la production des cellules sanguines (syndrome hématopoïétique). 2. l’intestin grêle, dont la barrière épithéliale, renouvelée tous les 4 à 5 jours, empêche le passage des bactéries dans le sang (syndrome gastro-intestinal). L’efficacité des traitements sera mesurée par la survie des animaux et la capacité de ces tissus à se reconstituer rapidement après l’irradiation. Le protocole utilise un modèle murin, référence validée et standardisée dans les études radiobiologiques internationales. Ce choix est justifié par la similarité des réponses physiologiques des tissus hématopoïétiques et intestinaux entre la souris et l’homme face aux rayonnements.
Bénéfices attendus
Le projet vise à démontrer l'efficacité de la molécule d'intérêt dans un modèle murin par trois indicateurs concrets : • Amélioration de la survie des animaux exposés aux radiations. • Réduction des effets indésirables associés à l'irradiation. • Accélération de la récupération grâce à une régénération plus rapide des tissus lésés (moelle osseuse et intestin grêle). Si les résultats sont positifs, le projet offre des avantages majeurs pour la prise en charge des populations exposées (accidents nucléaires, attaques, ou professionnels à risque) : • Une solution d'urgence autonome : la possibilité d'une administration rapide et autonome du traitement sur le terrain, sans attendre une infrastructure hospitalière parfois difficile d’accès. • Une approche préventive et curative : • en préventif : protection des personnes à risque (militaires, secouristes, civils en zone sensible) avant l'exposition. • en curatif : amélioration du pronostic vital et de la récupération hématopoïétique et intestinale après l'exposition. • Une alternative aux traitements actuels limités : Le projet répond à un besoin critique car les solutions actuelles sont soit inexistantes (pour l'atteinte gastro-intestinale), soit inapplicables à grande échelle (greffes, facteurs de croissance). Par rapport aux traitements actuels (greffes de moelle, facteurs de croissance), ce nouveau traitement présenterait des avantages décisifs pour une gestion de crise : • Réduction des coûts : alternative aux traitements actuels très coûteux. • Simplification logistique : évite les contraintes lourdes comme la recherche de donneurs compatibles, les traitements immunosuppresseurs à vie et les risques de rejet associés aux greffes. • Gestion de masse : permet une généralisation du traitement à un grand nombre de victimes, ce qui est impossible avec les méthodes invasives actuelles.
Procédures
Dans l’étude du syndrome hématopoïétique induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : Pour 1448 souris sur 3572 : - 1 irradiation sur corps entier en vigile (durée < 10 minutes) Pour 1104 souris sur 3572 : - 1 administration par sonde flexible (4 maximum d’une durée de 2 minutes) Pour 1548 souris sur 3572 : - 1 injection (4 maximum d’une durée de 30 secondes) - Pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) Pour 2612 souris sur 3572 : - 1 prélèvement de sang /semaine sur une durée de 30 jours (4 maximum de 3 minutes), puis 1 prélèvement de sang juste avant l’euthanasie sous anesthésie (35 min). Pour 56 souris sur 3572 : - 3 injections (30 secondes /injection) Pour 960 souris sur 3572 : - 1 injection sous anesthésie gazeuse (10 min en comptant l’effet de l’anesthésie et l’injection) Les souris subiront au maximum 27 gestes techniques sur 30 jours. Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : Pour 996 souris sur 1334 : - 1 irradiation locale au niveau abdominal, sous anesthésie (20 min en comptant l’anesthésie et l’irradiation) Pour 432 souris sur 1334 : - 1 administration (4 maximum d’une durée de 2 minutes chacune) Pour 592 souris sur 1334 : - 1 injection (4 maximum d’une durée de 30 secondes chacune) Pour 1334 souris : - Pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) - 1 prélèvement de sang juste avant l’euthanasie, sous anesthésie gazeuse avec analgésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). Les souris subiront au maximum 23 gestes techniques sur 30 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une anémie, une prostration, de la déshydratation, ou la mort. Un stress est envisagé lors des pesées, et au moment des administrations orales ou injectables des molécules. Des douleurs ponctuelles sont possibles lors des prélèvements et/ou des injections.
Devenir
L’étude de la survie des animaux se fera sur une durée de 30 jours à 6 mois. A terme, ils seront euthanasiés. A différents temps après irradiation, les animaux traités ou non seront euthanasiés afin de prélever les tissus et organes connus pour être très impactés par l’irradiation. Les analyses permettront d’évaluer l’efficacité du traitement sur ces tissus au cours du temps.
Remplacement
1) Pour l’étude de la survie des individus après irradiation, aucune alternative non animale ne peut être mise en place. 2) Dans l’analyse de la reconstitution hématopoïétique après irradiation, il n’est pas possible d’utiliser des alternatives comme par exemple des organoïdes ou des cultures cellulaires. En effet, les cellules souches de la moelle osseuse agissent de concert avec leur microenvironnement, constitué de plusieurs types cellulaires, pour permettre la reconstitution hématopoïétique après irradiation. L’étude sur l’animal corps entier est donc la seule approche possible pour une analyse physiologique des effets d’un traitement après irradiation depuis la cellule souche jusqu’aux cellules matures. 3) Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal aigu, bien que les organoïdes intestinaux constituent un outil pertinent pour des analyses moléculaires ou cellulaires ciblées, ils ne permettent pas d’évaluer la restauration de la barrière intestinale dans un contexte physiologique réel. Le syndrome gastro-intestinal radio-induit (GI-ARS) n’est pas seulement une perte cellulaire locale ; c’est une rupture de l’équilibre gastro intestinal impliquant l’interaction avec le microbiote et le système immunitaire. Notre projet vise à mesurer des paramètres physiologiques critiques, tels que la perméabilité intestinale in vivo, le passage des bactéries vers la circulation sanguine et la réponse inflammatoire associée. Ces phénomènes, qui déterminent le risque de septicémie et de défaillance des organes, nécessitent impérativement un organisme fonctionnel avec une circulation sanguine et un système immunitaire intacts. Par conséquent, l’étude sur l’animal corps entier est la seule approche valide pour démontrer l’efficacité du traitement sur la restauration d’une barrière intestinale fonctionnelle et son impact sur la survie globale.
Réduction
Les modèles de souris que nous utiliserons sont des lignées consanguines montrant moins de variabilité génétique entre les individus. Ainsi, il sera possible d’obtenir des résultats significatifs en utilisant moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. Ceci permet de réduire le nombre de souris. En effet, en utilisant des lignées consanguines (où les individus sont génétiquement quasi identiques), on élimine le « bruit » de fond causé par les différences naturelles entre les souris. Par conséquent, si une différence est observée entre deux groupes expérimentaux, il est beaucoup plus probable qu'elle soit due au traitement testé plutôt qu'au hasard génétique. Nous avons également utilisé un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant par groupe d’étude pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris seront régulièrement pesées et observées (posture, comportement, niveau d’activité, déshydratation). Nous utiliserons une grille de score pour évaluer leur état général et avons établi des points limites. Pour éviter une infection due à une diminution du système immunitaire, les cages seront placées en portoirs ventilés. Les souris seront hébergées en groupe, avec enrichissement (coton, tunnels en carton). Certains gestes pouvant être source de stress, les souris seront anesthésiées. Pour des gestes pouvant être source de douleur, elles recevront un antalgique préalablement à l’anesthésie.
Choix des espèces
Les souris consanguines sont les mieux caractérisées en biomédecine et sont largement utilisées pour étudier le rôle d’un gène spécifique dans un organisme. Elles font l’objet d’un grand nombre d’études pour analyser les effets biologiques des rayonnements ionisants et leur consanguinité réduit les effectifs utilisés car elles montrent moins de variabilité phénotypique. Ainsi, la puissance statistique est obtenue avec moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. De plus, les syndromes d’irradiation que nous souhaitons étudier sont bien caractérisés chez les souris. Tout ceci présente des avantages scientifiques et éthiques. Nous utiliserons des souris adultes de 10 à 15 semaines (une souris est considérée comme étant adulte à l’âge de 7 semaines). Une souris prépubère (moins de 7 semaines) a un environnement de sa moelle osseuse (nécessaire à la production des cellules sanguines et à la préservation des cellules souches) qui n’est pas définitif. Une souris de plus de 7 mois est considérée comme âgée d’un point de vue hématopoïétique. Ceci restreint notre choix à l’utilisation de jeunes souris adultes. Pour des raisons de reproductibilité des expériences, le poids et la taille des souris doivent être identiques entre les groupes, ce qui est le cas chez les jeunes adultes à l’âge choisi.
Développement d’hépatocytes humains fonctionnels via leur amplification initiale in vivo MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tuées au plus tard huit mois après une greffe de cellules de foie humain, ou trois mois après le début de l'essai pour les groupes pilotes, 430 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie de leur foie est d'abord détruite chimiquement, par une injection unique ou hebdomadaire pendant neuf semaines, puis jusqu'à 370 d'entre elles sont opérées pour recevoir les cellules humaines sous la capsule d'un rein ou dans la rate, et prélevées jusqu'à deux fois par mois. Le porteur ne décrit aucune nuisance pour la destruction partielle du foie, et choisit des lignées immunodéprimées pour que les cellules humaines s'implantent. Il juge la greffe "indispensable" pour obtenir des lignées de cellules qui diminueraient, au conditionnel, l'usage de souris et d'autres animaux non-humains en toxicologie.
Objectifs
Les atteintes du foie ou atteintes hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché et de l’échec de nouvelles molécules en développement au cours des essais cliniques. Les études pré-cliniques de toxicité hépatique et de pharmacocinétique sont des éléments essentiels pour réduire ces retraits et échecs et les conséquences médicales graves parfois observées chez les patients ainsi que pour accélérer le développement de nouveaux médicaments. Le foie est principalement constitué de cellules appelées hépatocytes dont l’une des fonctions est la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Ainsi, la culture de cellules de foie humain constitue le modèle de référence pour prédire le métabolisme et la toxicité hépatique des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité et ils présentent l’inconvénient majeur d’une grande variabilité entre donneurs. Ainsi, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires modifiées éloignés de la physiologie humaine. L’objectif général du projet est de développer des lignées d’hépatocytes humains hautement fonctionnels à la manière de ce que nous avons précédemment réalisé avec des cellules du pancréas actuellement considérées comme un modèle in vitro de référence des cellules sécrétrices d'insuline humaines. Afin de parvenir à cet objectif, le projet nécessite tout d’abord de mettre au point un protocole de greffe d’hépatocytes humains dans la souris. En effet l’amplification et la sélection initiale des cellules dans l’animal a été un élément décisif de la génération des lignées de cellules béta humaines fonctionnelles. Puis dans un second temps le projet consistera à générer plusieurs lignées d’hépatocytes à partir de tissus issus de patients qui seront ensuite caractérisées in vitro afin de sélectionner les lignées d’hépatocytes fonctionnels adaptées aux études pré-cliniques.
Bénéfices attendus
Le développement d’hépatocytes, les cellules actives du foie, humains et fonctionnels, aurait des conséquences directes positives sur la santé humaine tout en diminuant l’utilisation de modèles animaux. Des hépatocytes humains, représentatifs des différences de métabolisme et de toxicité des médicaments entre individus, permettraient la caractérisation fiable et précoce des nouveaux médicaments en développement, réduisant les échecs et accélérant le développement de nouvelles thérapies. De plus cette caractérisation du métabolisme et de la toxicité des molécules en développement faite sur des cellules humaines, permettrait de rendre les médicaments plus sûrs en amont des essais cliniques, augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché et diminuerait les risques de toxicité chez les patients. Enfin, l’accès à de tels hépatocytes humains prédictifs diminuerait l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et de toxicité. En effet, alors même que les modèles animaux utilisés en recherche pharmaceutique sont seulement partiellement prédictifs, ils sont utilisés du fait de l’absence d’une alternative. La validation de la capacité de prédiction de la toxicité et du métabolisme des cellules que nous allons générer, qui est prévue comme un objectif principal du projet, aurait pour conséquence immédiate une diminution de l’utilisation d’animaux. Finalement, ces cellules humaines fonctionnelles accélèreraient la recherche sur la physiologie des cellules du foie et sur les mécanismes des maladies du foie. Elles faciliteraient ainsi grâce à leur reproductibilité et au fait que ce soit un modèle humain, l’identification de cibles thérapeutiques.
Procédures
Un groupe de 60 animaux maximum subira une élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant 1 injection (30 animaux) ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines (30 animaux), réalisées à l’état vigile. Puis ces animaux subiront des prélèvements sanguins au rythme de 1 prélèvement par semaine pendant 2 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 3 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes. Un second groupe de 370 animaux maximum subira l'élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant, selon les résultats des groupes pilotes, 1 injection ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines, réalisées à l’état vigile. Les animaux subiront ensuite la greffe d’hépatocytes humains. Cette procédure de chirurgie sera effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Puis les animaux subiront 3 injections d’analgésique post-chirurgie (30 secondes par acte). Ces injections seront réalisées à l'état vigile. Enfin, les animaux subiront des prélèvements sanguins. Le nombre de prélèvements sera de 1 prélèvement par semaine pendant 4 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 8 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les souris seront soumises à une élimination partielle de leurs hépatocytes, induite chimiquement, puis à une chirurgie pour greffe d’hépatocytes humains sous la membrane qui entoure un de leur rein ou par injection dans la rate et enfin à des prélèvements sanguins et échographies afin de mesurer la multiplication des hépatocytes humains. Plusieurs nuisances liées à la procédure de greffe des hépatocytes pourraient être subies par les animaux. Il s’agit de douleur et de stress liés à la chirurgie et de gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Il pourrait s’agir également d’une hypothermie liée à l’anesthésie ou d’une infection suite à la chirurgie. Par ailleurs les animaux pourraient subir une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections. Enfin les animaux pourraient subir une gêne et du stress lors des prélèvements de sang pour le suivi des cellules implantées. Enfin, il n’y a pas de nuisances décrites induites par l'élimination partielle des hépatocytes. Il n’y a pas non plus de nuisances attendues en conséquence de la multiplication des hépatocytes humains greffés étant donné que la taille du greffon restera très modeste d’après notre expérience sur les précédents types cellulaires générés.
Devenir
Les animaux utilisés pour les études pilotes de déplétion des hépatocytes endogènes seront euthanasiés au maximum 3 mois après la procédure afin de confirmer la déplétion des hépatocytes. Ils ne pourront pas être ré-utilisés pour les expériences de greffe d’hépatocytes humains car ces greffes doivent être effectuées quelques jours après l’induction de la déplétion. Les animaux utilisés pour la greffe d’hépatocytes humains seront euthanasiés au plus tard 8 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour permettre la croissance d’une lignée d’hépatocytes.
Remplacement
Les travaux prévus dans ce projet ne peuvent pas être transposées dans des modèles in vitro par exemple en culture cellulaire. En effet, notre expérience de génération de précédentes cellules humaines fonctionnelles montre qu’une étape essentielle est la greffe des cellules humaines dans l’animal pour une multiplication sélective de cellules qui conservent leur fonction. Ainsi, lors du développement du modèle de cellules sécrétrices d'insuline, aucune stratégie in vitro n’a permis la sélection de cellules qui maintenaient leur fonction. De plus plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro de cellules du foie humain ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées de cellules n’a abouti à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des cellules du foie, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empêche leur utilisation dans les études de toxicologie et de pharmacologie. Pour ces raisons, la greffe initiale des hépatocytes humains à des souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de cellules similaires aux cellules présentes dans le foie.
Réduction
Le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué dans ce projet en premier lieu via l’estimation précise du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé par une approche statistique. Une analyse précise des protocoles publiés a également été réalisée afin de sélectionner les conditions expérimentales favorables et ainsi réduire le nombre de conditions expérimentales à comparer ainsi que le risque d’échecs et par conséquence le nombre d’animaux qui seront utilisés. Par ailleurs, le projet est construit en incluant des étapes pilotes afin d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Nous procéderons ainsi lors de l’étape 1 à la comparaison de 2 modèles d'élimination partielle des hépatocytes du foie de l'animal. Seul le modèle permettant l'élimination partielle la plus reproductible sera conservé pour les étapes suivantes. Lors de la seconde étape, deux protocoles de greffe des hépatocytes seront comparés. Seul le modèle permettant la greffe reproductible sera conservé pour la troisième étape de génération des cellules à partir de foie humain. De plus, nous veillons très attentivement à ce que toutes les personnes impliquées dans le projet, que ce soit la partie animale mais aussi les parties cellulaire et biochimique de préparation des cellules et d’analyse, soient parfaitement formées aux procédures employées, ceci de façon à réduire au maximum le risque d’échecs, mais aussi de nuisance pour les animaux en ce qui concerne le travail in vivo, et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderons dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une plus reproductibilité optimale de nos résultats et conséquemment une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
La démarche de raffinement de ce projet implique notamment un personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, ainsi que la surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Un système de mesure objective du niveau d'inconfort, de stress ou de souffrance des animaux est mis en place pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Par ailleurs, différentes actions de raffinement seront également menées. Afin de réduire le stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation avant de les manipuler. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. Lors de la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un traitement analgésique, puis une anesthésie générale. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage séparée dans un environnement également chauffé par un tapis. Sa température corporelle, son hydratation et l'absence de douleur seront suivies. Et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, un traitement analgésique sera administré en préventif pendant 3 jours. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées autour de 10 jours après la chirurgie. Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classiques et surveillé tous les jours. L’apparition d'éventuels signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie sera surveillée. Si une limite prévue par le système de mesure objective est atteinte, des actions de traitement seront prises en accord avec la structure chargée du bien-être des animaux et avec le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou de soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser des souris est lié à l’existence de protocoles de greffe d’hépatocytes humains chez cet animal, à la disponibilité de lignées de souris immuno-déprimées qui favorisent l’implantation des cellules humaines ainsi qu’à notre expérience passée de génération de lignées de cellules humaines hautement fonctionnelles via la greffe de cellules primaires immortalisées dans des souris. Les lignées cellulaires que nous avons précédemment générées (principalement cellules béta pancréatiques) ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires travaillant sur le diabète ou sur la physiologie du pancréas dans le monde. La même stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain complet. La procédure expérimentale de dérivation de cellules fonctionnelles n’a été testée que sur la souris rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet concernant les hépatocytes. Enfin, les souris qui seront utilisées auront entre 7 et 12 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits, ceci afin que l’animal ne soit pas trop petit et pour ainsi faciliter et garantir la réussite de la procédure de chirurgie.
Rôle de l’exercice physique dans un modèle inflammatoire et un modèle de récidive post-opératoire chez le rat HLA-B27 avec et sans nouveau traitement
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 840
Une perte de poids de 10 à 15 % et un arrêt du transit sont attendus après l'ablation d'une partie de l'intestin, une résection iléo-cæcale. Au total, 1 320 rongeurs, 840 rats et 480 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures que le porteur classe toutes au niveau de souffrance sévère. Ils subissent une colite induite chimiquement, au TNBS ou au DSS, ou cette chirurgie, et plusieurs protocoles d'exercice, pour tester l'effet de la course et de molécules candidates sur les maladies inflammatoires de l'intestin. Les rats opérés sont des transgéniques HLA-B27, choisis parce qu'ils développent une colite spontanée vers douze semaines, et le résumé décrit les procédures en une seule phrase : "Les animaux subiront une chirurgie d'une partie d'un organe."
Objectifs
Cette étude a pour objectif de comparer différents protocoles d’exercice dans des modèles expérimentaux d’inflammation intestinale avec et sans traitement : 1 - dans un modèle de colite chez le rat, 2 - dans un modèle de colite chez la souris et 3- dans un modèle de récidive post-opératoire après résection iléocaecale chez un rat transgénique . Il sera ainsi possible d’identifier les mécanismes protecteurs ou délétères associés à l’activité physique et d’optimiser les recommandations en matière d’exercice pour les patients atteints de Maladies Inflammatoires Chronique de l'Intestin. Les molécules candidats utilisées seront des pré et probiotiques mais également des molécules ciblant les voies de l'inflammation et de la fibrose. Ces molécules seront au préalable testées sur des cellules puis séléctionnées afin de limiter aux mieux le nombre d'animaux utiliser (Réduire). Il n'est cependant pas possible de mettre en place un modèle in-vitro concernant l'activité physique (Remplacer). Plusieurs études cliniques suggérent que l'activité physique comme la course à pieds modérée peut apporter des effets bénéfiques. Les procédures seront donc définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant la souffrance (Raffiner). Le nombre total d'animaux sur les 5 ans à venir est estimé à 1320 animaux.
Bénéfices attendus
Des études précliniques ont mis en évidence l'influence de l'intensité et du type d'activité physique sur le contrôle de l'inflammation intestinale. Elles montrent que l'exercice forcé à haute intensité aggrave l'inflammation et les lésions intestinales, tandis que l'exercice volontaire et modéré exerce des effets protecteurs. Cependant, il n'existe pas de données directes et spécifiques de l'effet de l'activité physique sur la récidive post-opératoire dans la maladie de Crohn. Nous voudrions montrer avec ce travail d'une part les bénéfices et les mécanismes associés de l'activité physique chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Et d'autre part, selectionner des molécules candidates permettant d'améliorer et d'approfondir la connaissance des mécanismes d'action dans la physiopathologie des maladies inflammatoires digestives.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie d'une partie d'un organe.
Impact sur les animaux
L'induction des colites ainsi que les gestes de la chirurgie sont totalement maitrisés.Tout rongeur montrant des signes de douleur ou de mal-être au cours des procédures (vocalisation, prostration, poil hérissé, perte de masse corporelle supérieure ou égale à 20 % ) par rapport à la masse initiale, sera euthanasié. Les animaux en phase expérimentale seront observés et pesés quotidiennement pour une attention particulière de ces points limites. Le nombre d’animaux estimé tient compte de la règle des 3R et respecte au mieux le bien-être animal en limitant la douleur. Une baisse de poids de 10 à 15% est attendue suite chirurgie et ainsi qu'un arrêt du transit mais tout doit revenir à la normale dans la semaine qui suit l'opération (récupération du poids initial et transit repris avec fécès dans la cage). Aucun effet indésirable attendu pendant ou après la distension colorectale ou l'endoscopie des rats. Concernant le poids des animaux avec colite, une baisse de poids d'environ 10 à 15% maximum est attendue aussi bien pour les rats TNBS que pour les souris avec DSS.
Devenir
Pour chacune des procédures les animaux seront tous euthanasiés
Remplacement
Il est nécessaire de travailler in vivo pour reproduire la physiopathologie complexe de la maladie de Crohn, et ainsi utiliser les mêmes techniques chirurgicales et d’imagerie que chez l’homme. Aucun modèle in vitro n’est possible dans ce contexte. De même, une activité physique ne peut être effectuée que sur un modèle in vivo.
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons. Le nombre d’animaux par groupe est de n = 10, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminées grâce à la littérature et suite à nos expériences pilotes).
Raffinement
Les conditions d'hébergement respecteront les exigences de l'animalerie de l'Institut Pasteur de Lille pour le respect de l'animal. Il y aura 2 à 3 rats par cage selon le poids des animaux, avec nourriture et eau à disposition et enrichissement du milieu. Les animaux ont un cycle de lumière jour/nuit de 12H (lumière allumée de 7H à 19H) et sont en portoir ventilé avec température (20-24°c) et taux d'humidité (30-70°c) contrôlés. Afin de limiter le stress des rats, leur milieu sera enrichi avec du matériel de nidification afin que les animaux puissent s'y cacher. Les procédures sont définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant leur souffrance. Tout animal montrant des signes de douleur ou de mal-être sera euthanasié par dislocation cervicale pour les souris et par boite CO2 pour les rats. Les souris et les rats avec colite induite sont observés et pesés quotidiennement pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris) -une perte de poids supérieure ou égale à 20%. Les rats opérés recevront un analgésique en pré-opératoire et toutes les 12H durant 72H. Ces derniers seront observés 3 fois par jour et pesés 3 fois par semaine pour une attention particulière aux points limites de l'annexe 3 : analyse des rats 5 jours après l'opération si - score de 0 : tout est normal, - score de 1 : perte de poids mineure et reprise du transit, - score de 2 : perte de poids importante, prostration et aucune reprise du transit, le rat continuera à être surveillé 3 fois par jour, l'antalgique continué au delà de 72H puis euthanasie si aucune amélioration, - score de 3 après 5 jours, l'animal sera euthanasié car perte de poids supérieure ou égale à 20% et suspicion de sténose souvent due à une complication chirurgicale.
Choix des espèces
La souris et le rat représentent les modèles les plus accessibles et les plus pertinents pour modéliser la physiologie digestive des vertébrés supérieurs à sang chaud; en particulier, le système immunitaire complexe et la diversité des microbiotes qui sont relativement proches. Les modèles de colite dans ces éspèces sont bien validés. Une cinquantaine de modèles de colite sont décrits chez les rongeurs, mais un seul d’entre eux concerne la récidive post-chirurgicale. Ce modèle a été décrit en 2011 chez la souris IL-10 KO, après résection iléo-caecale et anastomose iléo-colique. Le modèle de colite chez le rat transgénique HLA B27 est intéressant car: - colite spontanée autour de leur 12ème semaine de vie - animal plus gros que la souris ne nécessitant pas de microchirurgie Pour les procédures de colites TNBS et DSS, ce seront des animaux adultes agés de 8-10 semaines (pesant entre 24 et 26 g pour les souris et 250-275g pour les rats), offrant ainsi une physiologie digestive mâture. Pour la procédure de résection iléocaecale, nous utiliserons des rats âgés de 8 semaines car il est impératif de les faire commencer à courir avant l'installation de la colite à leur 10ème semaine de vie.
Rôle d’une lectine et du microbiote intestinal dans les maladies métaboliques du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
380 souris vont être utilisées, chacune nourrie d'un régime riche en calories pendant un à trois cycles, et soumise à la fin de chaque cycle à deux tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec des prises de sang répétées pendant environ deux heures. Le porteur déclare un niveau de souffrance léger, et indique que le régime fait grossir les souris et accumuler de la graisse dans leur foie, parfois avec une baisse d'activité. Le projet emploie une lignée transgénique qui exprime dans le foie une lectine, REG3A, dont l'équipe veut comprendre le rôle dans la maladie du foie gras. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélever leur foie, alors que les pistes de dépistage et de traitement restent annoncées au conditionnel et à "plus long terme".
Objectifs
La MASLD (maladie hépatique stéatosique associée à un dysfonctionnement métabolique), souvent appelée « maladie du foie gras », est aujourd’hui très fréquente dans les pays occidentaux. Elle est notamment liée à des troubles comme le surpoids ou le diabète. Dans les cas les plus graves, elle peut évoluer vers des maladies sérieuses du foie, comme la cirrhose ou le cancer. Nous nous intéressons à une lectine de type C, que notre corps produit lorsqu’il est soumis à un stress. Cette protéine joue plusieurs rôles utiles : elle aide à protéger contre certaines bactéries, limite les dommages causés aux cellules et pourrait empêcher le foie de se dégrader. Nos premiers résultats montrent que cette protéine est présente dès les débuts de la maladie chez l’être humain. Chez l’animal, elle semble ralentir l’aggravation des atteintes du foie. Elle agirait notamment en protégeant l’environnement des cellules du foie et en limitant la formation de « cicatrices » dans le tissu, un phénomène qui peut à terme empêcher le foie de fonctionner correctement. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre comment fonctionne cette protéine. À terme, cela pourrait permettre de développer de nouvelles approches pour protéger le foie et éviter que la maladie ne devienne grave.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre ce qui se passe dès les premiers stades de la MASLD. Nous nous intéressons en particulier aux interactions entre l’intestin et le foie, ainsi qu’aux changements qui surviennent dans l’environnement des cellules du foie. En étudiant le rôle d'ue lectine de type C, nous cherchons à comprendre comment elle peut limiter l’inflammation, le stress subi par les cellules et les dérèglements du métabolisme. Mieux connaître ces mécanismes pourrait permettre d’agir très tôt, avant que la maladie n’entraîne des dommages irréversibles. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à détecter la maladie plus précocement grâce à de nouveaux marqueurs biologiques, et à identifier de nouvelles pistes de traitement. L’objectif est de prévenir l’évolution vers des formes graves, comme la cirrhose ou le cancer du foie, qui restent aujourd’hui des maladies lourdes avec des conséquences importantes sur la santé.
Procédures
Les souris recevront une alimentation riche en calories, de façon continue ou alternée avec une alimentation standard, pendant un à trois cycles selon les groupes. De petits prélèvements de sang seront réalisés au début de l’étude et à la fin de chaque cycle. Ces prélèvements, réalisés sous anesthésie locale, dureront environ 30 secondes à 1 minute. À la fin de chaque cycle, les souris seront également placées individuellement pendant environ 15 minutes dans une boîte propre afin de recueillir spontanément des échantillons d’urine et de fèces. Ces échantillons seront utilisés notamment pour étudier le microbiote intestinal, c’est-à-dire l’ensemble des microorganismes présents dans l’intestin. À la fin de chaque cycle, des tests de tolérance au glucose et à l’insuline seront réalisés sur les mêmes animaux, à des jours différents, avec une semaine de récupération entre les deux tests. Ces tests impliquent une administration de glucose par voie orale ou d’insuline par injection, ainsi que de petits prélèvements de sang répétés pendant environ deux heures.
Impact sur les animaux
L’alimentation riche en calories utilisée dans cette étude peut entraîner chez les souris une prise de poids et une accumulation de graisses dans le foie, reproduisant ainsi les premières étapes de la MASLD. Dans certains cas, cela peut s’accompagner d’une légère baisse d’activité ou d’un état général un peu altéré aux stades les plus avancés. Les tests réalisés pour étudier le métabolisme impliquent de petites injections et des prélèvements de sang de très faible volume. Ces procédures peuvent provoquer un stress ponctuel, mais elles sont courtes et encadrées.
Devenir
À la fin des expériences, les animaux sont euthanasiés afin de permettre l’analyse de leurs organes, indispensable pour comprendre les mécanismes de la MASLD. Cette étape est nécessaire, car certaines informations ne peuvent être obtenues qu’en étudiant directement les tissus. Selon les besoins de l’étude, les organes, en particulier le foie, sont prélevés pour différents types d’analyses (observation des tissus, études biologiques ou cellulaires). Ces analyses permettent de mieux comprendre comment la maladie se développe et comment elle pourrait être freinée.
Remplacement
Dans ce projet, il n’est pas possible de remplacer totalement l’utilisation d’animaux. En effet, la MASLD est une maladie complexe qui implique de nombreuses interactions entre différents organes, notamment le foie, l’intestin, le système immunitaire, c’est-à-dire l’ensemble des cellules et mécanismes de défense de l’organisme, et le métabolisme global, qui correspond à l’ensemble des processus permettant à l’organisme de produire, utiliser et stocker l’énergie et de réguler notamment les sucres et les graisses. Ces interactions, qui se produisent à l’échelle du corps entier, ne peuvent pas encore être reproduites de manière fiable en laboratoire avec des cellules isolées ou des modèles informatiques. Des méthodes alternatives existent, comme l’étude de cellules en culture, et elles sont utilisées dès que possible dans ce projet. Elles permettent d’analyser certains mécanismes précis, mais ne suffisent pas à elles seules pour comprendre l’ensemble de la maladie. Dans un souci de limiter au maximum l’utilisation d’animaux, les chercheurs privilégient également l’utilisation de tissus déjà prélevés pour réaliser de nombreuses analyses, sans recourir à de nouveaux animaux. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en poursuivant les objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été soigneusement calculé à partir de résultats préliminaires, afin d’utiliser le minimum d’animaux nécessaire tout en garantissant des résultats fiables. Chaque groupe comprend un nombre limité de souris, suffisant pour observer des effets biologiques significatifs sans excès. Les différentes souris utilisées sont comparables entre elles afin de limiter les variations et d’obtenir des résultats plus précis. Une évaluation intermédiaire est également prévue en cours d’étude pour vérifier s’il est nécessaire de poursuivre jusqu’au nombre maximal d’animaux prévu, ou si des conclusions peuvent être tirées plus tôt. Par ailleurs, tous les échantillons collectés sont conservés et réutilisés pour d’autres analyses. Cette organisation permet d’éviter d’avoir recours à de nouveaux animaux et contribue à réduire leur utilisation au strict nécessaire.
Raffinement
L’alimentation utilisée dans cette étude peut entraîner une prise de poids et une accumulation de graisses dans le foie, reproduisant ainsi les premières étapes de la MASLD, sans douleur attendue pour les animaux. Les souris font l’objet d’un suivi attentif tout au long de l’étude (poids, comportement, mobilité, aspect général) afin de s’assurer de leur bon état de santé. Des critères précis sont définis à l’avance pour intervenir rapidement si nécessaire et éviter toute souffrance prolongée. Les manipulations (pesées, injections, prélèvements) sont limitées au strict nécessaire et réalisées par du personnel qualifié, en veillant à réduire au maximum le stress des animaux. Les souris sont hébergées dans un environnement adapté et enrichi (avec des matériaux pour faire leur nid et des abris), afin d’améliorer leur confort et leur bien-être. Enfin, les procédures réalisées en fin d’étude se déroulent sous anesthésie générale, sans réveil de l’animal, conformément à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
La souris constitue l’espèce la plus pertinente pour ce projet car elle présente des caractéristiques physiologiques et métaboliques permettant d’étudier les mécanismes de la MASLD. Le métabolisme hépatique des lipides et des glucides, ainsi que les interactions entre le foie, le tissu adipeux, l’intestin et le système immunitaire, présentent des similitudes importantes avec ceux observés chez l’être humain. Les souris sont également particulièrement adaptées à l’étude des effets de régimes alimentaires riches en lipides et en sucres sur le développement progressif de la stéatose hépatique, de l’inflammation et du remodelage de la matrice extracellulaire. L’utilisation de la lignée transgénique exprimant spécifiquement REG3A dans le foie permet en outre d’étudier directement le rôle de cette protéine dans la progression de la maladie. Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées. À cet âge, les souris sont adultes et leur croissance est largement achevée. Leur poids corporel présente alors des variations limitées lorsqu’elles reçoivent une alimentation standard, ce qui permet de mieux distinguer les variations de poids et les modifications métaboliques induites par les régimes expérimentaux.
Effet de différents microbiotes sur la physiopathologie de l’infection par Eimeria tenella chez le poulet.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Un microbiote administré par la bouche au premier jour de vie, puis le parasite Eimeria tenella vers deux semaines d'âge : 128 poussins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à J14 ou J21 pour prélever leurs cæcums. Le projet compare trois microbiotes face à la coccidiose, et le bénéfice attendu pour les poussins supplémentés se mesure en "meilleures performances zootechniques", pour une filière qui chiffre ses pertes à plus de 1,5 milliard d'euros par an. Le résumé mentionne aussi une pose de puces sous anesthésie, sans dire où ni pourquoi. Le porteur justifie le choix du poulet par le parasite, qui n'infecte que cette espèce.
Objectifs
Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques (>1,5 milliards d’euros/an dans le monde). Ces maladies sont provoquées par des parasites, Eimeria. La prophylaxie repose sur l’utilisation d’anticoccidiens et sur la vaccination. Le coût élevé des vaccins, l’apparition de résistances aux anticoccidiens et la demande des consommateurs pour limiter l’utilisation des anticoccidiens et des antibiotiques nécessitent le développement de nouveaux moyens de lutte plus naturels. Dans cet objectif, notre ambition est d'utiliser la modulation du microbiote pour atténuer la sévérité de la pathologie liée à l'infection par Eimeria. Comme nous l’avons décrit précédemment, nos résultats mettent en évidence un rôle du microbiote et/ou ses métabolites sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella incluant le développement du parasite E. tenella et sur la réponse inflammatoire associée à l’infection. La nature des bactéries et/ou leur métabolites impliqués dans cet effet restent encore à déterminer.Dans ce projet, nous comparerons différents microbiotes (témoin, adulte, commercial) sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella. Nous évaluerons l'effet de ces différentes compositions microbiennes caecales sur le développement des parasites, la formation de lésions et la réponse inflammatoire. La composition du microbiote et du métabolome seront déterminés avant l’infection expérimentale. Ensuite, les corrélations entre la composition du microbiote, ses fonctions et des paramètres d'infection seront déterminées pour détecter quel(s) microorganisme(s) sont impliqués dans le cas de pathologies plus ou moins sévères. Ce projet fournira des indications pour le développement d'un microbiote limitant les conséquences négatives de l'infection.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que les animaux supplémentés résistent mieux à l’infection (effet anticoccidien) et présentent par conséquent de meilleures performances zootechniques, moins de lésions, moins d’inflammation, moins développement parasitaire. Si l’administration d’un microbiote ne présente pas d’effet, les animaux présenteront des charges parasitaires et des paramètres lésionnels similaires à ceux du groupe témoin.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux administrations orales : une de microbiote et une du parasite Eimeria. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux. Chaque intervention dure environ 30 secondes à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. Une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite, ni des signes cliniques sévères. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux.
Devenir
A J14 et J21, l'euthanasie des animaux est prévue pour des prélèvements des caeca et mesures de différents paramètres (parasitaire, inflammatoire, microbiote, métabolites).
Remplacement
L’agent pathogène Eimeria tenella responsable de la coccidiose a un spectre d’hôte restreint : il infecte exclusivement le poulet Gallus gallus. L’étude de l’influence du microbiote sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella nécessitent des expérimentations in vivo pour lesquelles des analyses des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, et du microbiote intestinal seront réalisées.
Réduction
Le nombre de 128 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Les effectifs sont basés sur les études de la littérature portant sur les analyses de microbiote lors de supplémentations pour avoir une différence significative.
Raffinement
Aucune étude in vitro n’a été réalisée en amont de ce projet, la pathologie étudiée et le cycle parasitaire ne pouvant être reproduits de manière pertinente qu’in vivo. Les poulets seront hébergés dans des conditions environnementales contrôlées et disposeront d’un enrichissement social et comportemental (dans des petites salles séparées au sol : petites rondelles en inox suspendues ou du bolduc suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans, des perchoirs qui apporte un enrichissement qui fait partie du comportement naturel et de la litière favorisant le grattage (litière de miscanthus pour éviter les poussières). Ils seront hébergés en groupe de 32 poussins, au sol, dont la température est régulée (ajout le lampe chauffante) avec aliment et eau ad libitum ainsi qu’un éclairage 12h/24h. Pour la pose de puces, l'anesthésie gazeuse flash dure quelques minutes et récupération très rapide des animaux, qui sont remis en lot dans la foulée. Pas de gène visible, ni de modification d’interactions entre les poussins. Limitation des nuisances sur le bien-être animal : Évaluation de l’état de santé des animaux deux fois par jour par le personnel de la plateforme expérimentale. Si atteinte du point limite : euthanasie des animaux.
Choix des espèces
Les poussins à statut sanitaire protégé et contrôlé seront utilisés et seront l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. L'éclosion constituant une fenêtre unique pour l'implantation de bactéries et l'amélioration précoce des fonctions intestinales, l'implantation de bactéries pour améliorer précocement les fonctionnalités de l'intestin sera réalisée juste après l’éclosion (1er jour d’âge). Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à environ 2 semaines d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire.
Mise en place d’un modèle de colonisation digestive par des bactéries pathogènes d’intérêt du milieu hospitalier chez le macaque cynomolgus permettant l’étude de nouvelles stratégies de décolonisation
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
78 des 174 macaques à longue queue de ce projet doivent être gardés en vie puis réutilisés dans d'autres études, les 96 autres tués pour analyser leurs tissus infectés. Dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 144 d'entre eux sont colonisés par des bactéries hospitalières, parfois multirésistantes, et tous subissent jusqu'à sept anesthésies générales et neuf prises de sang par semaine, des lavages rectaux, des traitements et l'implantation d'une puce de télémétrie, certains des biopsies rectales et des gavages d'antibiotiques. Après l'inoculation, chaque macaque est logé seul, face à un congénère à deux mètres. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'usage de primates "reste nécessaire", malgré "les efforts pour privilégier ces alternatives", qu'il ne décrit pas.
Objectifs
L’étude des sepsis, c’est-à-dire des réactions anormales et excessives de l’organisme face à une infection, constitue un enjeu majeur de santé publique. Les sepsis engendrent une mortalité élevée, estimée à environ 11 millions de décès par an dans le monde, due à l’absence de traitements réellement efficaces. Les formes les plus sévères de sepsis sont le plus souvent liées à des bactéries retrouvées dans les intestins. Ces bactéries finissent par circuler dans les hôpitaux et représentent aujourd’hui une menace importante pour les systèmes de santé. De plus, la résistance aux antibiotiques développée par ces bactéries constitue un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale. Cette augmentation de la résistance aux antibiotiques rend le traitement des infections graves beaucoup plus difficile et accroît le risque de développer des sepsis sévères. Dans ce contexte, le développement de stratégies visant à prévenir l’infection en réduisant ou en éliminant, au niveau de l’intestin, les bactéries susceptibles de provoquer des infections chez les patients à risque apparaît comme une approche prometteuse contre à la fois le sepsis et la multirésistance aux antibiotiques. L’étude envisagée vise à mettre en place un modèle de colonisation digestive chez des primates non humains par des bactéries pertinentes du contexte hospitalier, multirésistantes ou non, afin d’évaluer, tester et optimiser des stratégies innovantes permettant d’éliminer ces bactéries.
Bénéfices attendus
Le projet permettra le développement de modèles de colonisation intestinale par différentes bactéries d’intérêt pour tester de nouvelles stratégies de décolonisation intestinale pouvant être utilisées chez des patients à risque avant le développement d’infections sévères.
Procédures
- Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupées pour limiter leur nombre (1 à 7 fois par semaine, 174 animaux, 30-45 minutes). Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 9 fois par semaine, 174 animaux, 5 minutes - Récoltes de fluides rectaux/trachéaux ou nasaux (1 à 5 fois par semaine, 174 animaux 2 minutes). - Biopsies rectales, (2 fois maximum, 30 animaux, 30 minutes). - Lavages rectaux (1 à 2 fois par semaine, 126 animaux, 20 minutes). - Lavages broncho-alvéolaires (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 10 minutes). Interventions - Inoculation bactérienne (1 fois 144 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des molécules thérapeutiques (ou placebo) (jusqu’à 6 fois, 174 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des antibiotiques par gavage (4 fois 144 animaux, 5 minutes) - Imageries in vivo (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 45 minutes).
Impact sur les animaux
Les méthodes expérimentales ont été définies de manière à éviter toute souffrance lors des interventions (limitation des volumes sanguins prélevés, expositions et traitements réalisés sous anesthésie générale). Anesthésies, prélèvements de sang Perte d’appétit avec perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection au site d’injection possible dans les jours qui suivent le prélèvement (rare, quelques jours). Traitements Réaction locale, démangeaisons et/ou douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Perturbation de la flore intestinale, vomissement et/ou diarrhée transitoire. Colonisation L’étape de colonisation ne s’accompagne souvent d’aucun signe clinique particulier. Cependant, en cas de passage des bactéries dans le sang ou d’infections pulmonaires, des signes cliniques de l’infection bactérienne peuvent apparaitre : fièvre, perte d’appétit, difficultés respiratoires pendant quelques jours. Nuisances liées aux traitements antibiotiques L’altération de la flore intestinale peut causer des diarrhées et entérites (quelques jours) Implantation de puces de télémétrie Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Biopsies rectales : Des signes cliniques liés aux biopsies rectales : réaction inflammatoire au site de la biopsie, perte d’appétit, saignements, pendant quelques heures/jours Nuisances liées à l’hébergement individuel : Les animaux seront hébergés en groupe avant exposition et en hébergements individuels proches, permettant des interactions sociales pendant la phase d’expérimentation. Nuisances suite aux écouvillonnages : Saignement pouvant aller de quelques secondes à quelques minutes. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation de la trachée liée à l’intubation. Toux, difficultés respiratoires légères juste après le geste. Nuisance liée à la mise à jeun (
Devenir
Pour l’étude de mise en place de modèle : les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études compatibles après avis vétérinaire. Cependant, si les animaux montrent des signes d’infection, ils seront euthanasiés afin d’étudier l’infection dans les tissus. Dans l’étude d’évaluation de la sécurité des traitements, les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études après avis favorable du vétérinaire. Dans les études d’efficacité des traitements, tous les animaux seront euthanasiés, dans le but de faire des analyses des tissus infectés.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en place des modèles de colonisation intestinale par des bactéries souvent retrouvées chez des patients hospitalisés, afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques de décolonisation. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire, la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries de l’intestin. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Le primate non-humain, étant proche de l’humain au niveau anatomique, immunitaire et physiologique, permet de reproduire la complexité de ces interactions, nécessaires pour permettre une colonisation intestinale par des bactéries retrouvées chez les patients. Cela permet ainsi d’évaluer de façon fiable tout nouveau traitement avant son utilisation chez l’être humain.
Réduction
Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Dans la phase de mise en place du modèle, les conditions optimales d’inoculation de la bactérie seront déterminées selon un procédé étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Cette méthode permet de réduire le nombre d’animaux, en évitant de multiplier les essais. Dans les études de tolérance et de distribution, seules les stratégies de décolonisation ayant déjà démontré une efficacité chez le petit animal (rongeurs) seront testées dans cette étude chez le primate non humain. Ensuite, pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter des différences statistiques entre les groupes.
Raffinement
Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire leur nombre. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. Les animaux seront hébergés en groupes puis en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales après inoculation bactérienne (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés de 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, et par renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, éviter une contamination croisée, et permettre d’associer le prélèvement d’excréments à l’animal. Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques liés au traitement afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux ainsi que leur alimentation (des points limites sont mis en place). Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, anti-douleurs localement). L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué, qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement anti-douleur sera appliqué avant la chirurgie.
Choix des espèces
Dans ce projet, le macaque a été sélectionné pour sa proximité génétique, anatomique et physiologique avec l’être humain. Son appareil digestif ressemble beaucoup à celui de l’être humain au niveau anatomique, mais aussi au niveau de l’environnement intestinal incluant le microbiote. Le macaque reproduit la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries naturellement présentes dans l’intestin. Cela en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la colonisation bactérienne par des bactéries retrouvées chez l’être humain et l’étude de la tolérance à de nouveaux traitements. Ces bactéries pouvant être retrouvées dans l’intestin de personnes de tout âge, nous envisageons de réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature et un microbiote intestinal stable.
Étude des fonctions de modifications du squelette cellulaire et leur implication dans les pathologies-MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Une souris qui montre une perte de poids, une blessure ou de "mauvaises relations sociales" est soignée, isolée ou mise à mort, sur la base d'une surveillance deux fois par semaine au minimum. 5 209 souris issues de lignées génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées pour une part sous anesthésie sans réveil, pour une autre d'un niveau de souffrance sévère. Une des lignées présente des troubles de la coordination des mouvements, l'état des lignées à créer reste inconnu selon le porteur, des souris sont gardées jusqu'à 24 mois, et leur comportement moteur est testé pendant deux jours sans que les tests soient nommés. Le résumé ne décrit comme nuisance qu'une ouverture du thorax sous anesthésie, sans réveil, et ne dit rien de ce qui vaut à une partie des souris le niveau sévère.
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du squelette cellulaire : d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Cette étude a pour ambition d’analyser les relations entre ces différents aspects et d’établir comment ils coopèrent dans la régulation de fonctions du squelette des cellules, le cytosquelette. Le cytosquelette étant impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies. A terme, ce projet permettra de développer les moyens de dépistage et de nouvelles thérapies ciblant les maladies reliées à la dérégulation du cytosquelette. Le cytosquelette est présent dans toutes les cellules, ou il exerce des rôles très divers : il donne aux cellules leur forme, participe au mouvement des cellules et au transport intracellulaire, rend possible la division cellulaire et le déplacement de spermatozoïdes lors de la fécondation. Le cytosquelette interagit avec de nombreuses protéines qui contrôlent ses fonctions. Une des hypothèses suggère que le choix des éléments utilisés pour construire le squelette cellulaire et les modification de ces éléments constituent un code, qui définit ses propriétés et influence les interactions avec les autres protéines spécifiant ainsi ses fonctions. Le présent projet est une continuation d’un projet précèdent, qui a permis de démontrer le rôle essentiel de la régulation du cytosquelette dans la survie des neurones et dans la fertilité. Nous proposons maintenant d’étendre notre analyse à d’autres modèles murins de ce code de cytosquelette.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de maladies telles que les neurodégénérescence, cancer ou infertilité. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette et de développer les moyens de dépistage et les traitements des pathologies liées à sa dérégulation. La modification proposée permettra d’acquérir des connaissances supplémentaires sur l’effet du cytosquelette sur la fonction neuronale.
Procédures
Une partie des animaux est soumise à une analyse phénotypique (analyse de l’état clinique des animaux) pendant leur vie. Le comportement moteur de certains autres animaux d’intérêt sera ensuite analysé (duré de test : 2 jours), les animaux seront ensuite mis à mort pour permettre les analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Une des souches murines utilisée dans ce projet a été décrite comme ataxique, c'est à dire qui présente des problèmes de coordination de mouvements. Pour les nouveaux modèles qui seront générés dans le cadre de cette étude, la condition des animaux n’est pas connue à l’avance. Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s'arrêteront en fin de chirurgie (procédure sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses de leurs organes
Remplacement
Après les premières étapes d'analyse des enzymes, impliquant la culture cellulaire (expression d’enzymes dans les lignées cellulaires et observation de leurs activités), le projet a pour but maintenant de comprendre la fonction de ces enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris.
Réduction
Les animaux générés lors de ce projet seront utilisés à la fois pour l’analyse phénotypique et pour l'analyse de leurs organes, permettant de réduire le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs. Les croisements seront optimisés pour produire les animaux d'intérêt. Les animaux contrôles proviendront des mêmes portées que les animaux d’intérêt.
Raffinement
Les animaux seront surveillés deux fois par semaine minimum. Tout signe de mal-être, tel que la perte de poids, blessure, mauvaises relations sociales sera détecté et l‘animal sera soigné et soit isolé, soit mis à mort. Les soins peuvent inclure l’application d’une crème désinfectante (blessure) ou d’un complément nutritif (perte de poids). Une grille de score est mise en place pour le suivi clinique des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges : nouveau-né, 1 mois (animal jeune), 4 mois (animal adulte), 12 mois (animal âgé) et 18 et 24 mois (animaux très âgés). En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme. De plus, certains mutants devront être analysés très âgés, vu que l’on veut observer la dégénérescence liée à l’âge chez ces animaux. Les analyses de certaines lignées (à phénotype non-dommageable uniquement) nécessiteront la génération d’embryons au stade embryonnaire E14.5 ou E17.5 (soit 14,5 jours-post fécondation ou 17,5 jours post-fécondation) E14.5 ou E17.5. En effet à partir d’embryons de ces âges (en jour post-fécondation) il est possible de cultiver les cellules primaires nécessaires pour l’étude de mécanismes cellulaires impliqués.
Étude des interactions entre Horloge circadienne et Réponse au stress du réticulum endoplasmique dans l’épithélium intestinal sain et inflammatoire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Des souris reçoivent une eau de boisson qui déclenche une inflammation de l'intestin et des douleurs intestinales, et 832 d'entre elles sont privées de nourriture dix-huit heures par jour pendant douze semaines au plus. Au total, 1 434 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, une partie dès leur vie embryonnaire et pendant l'allaitement. Le porteur écrit pourtant que les "seules interventions" subies sont des injections d'une "durée de 2 secondes", une fois par jour pendant 8 ou 51 jours. Toutes sont tuées au terme des procédures ou quand les points limites sont dépassés, pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) provoquent une inflammation durable de l’intestin, avec des périodes où les symptômes s’aggravent (poussées) et d’autres où ils diminuent (rémissions). Elles apparaissent chez de jeunes adultes, mais leurs causes, en lien avec leur environnement, ne sont pas connues. On pense aujourd’hui que deux mécanismes importants pourraient jouer un rôle dans ces maladies. Le premier est l’horloge biologique interne (appelée horloge circadienne), qui régule le fonctionnement du corps tout au long de la journée. Le second est un système de défense des cellules qui aide les cellules à survivre dans un environnement difficile. Chez les patients atteints de MICI, ces deux systèmes sont perturbés, mais on ne sait pas si ces perturbations sont liées, ce qui les causent, ni si elles jouent un rôle dans l’apparition de l’inflammation intestinale. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de ces mécanismes dans l’apparition des MICI. Pour cela, des études seront réalisées chez la souris afin de : 1) observer le fonctionnement de l’horloge biologique et du sytème de défenses des cellules dans un intestin sain ou inflammé ; 2) comprendre comment ces deux systèmes interagissent et influencent l’inflammation intestinale ; 3) déterminer si des perturbations précoces (pendant le développement ou l’allaitement) de l’Horloge peuvent augmenter le risque de développer une MICI une fois adulte ; et 4) tester de nouvelles approches, notamment alimentaires ou médicamenteuses, pour rétablir le fonctionnement normal de ces mécanismes et réduire l’inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre l’origine des MICI et à ouvrir la voie à de nouveaux traitements, car les thérapies actuelles ne permettent pas de guérir les MICI, ne sont pas efficaces chez tous les patients et entraînent de lourds effets secondaires. À court terme, ce projet apportera des connaissances fondamentales nouvelles sur le (dys)fonctionnement de l’intestin, en décrivant pour la première fois la rythmicité des cellules du côlon en temps normal et durant les MICI. Il fera un lien entre la rythmicité des cellules du côlon, la sévérité de l’inflammation intestinale et la rythmicité des comportements alimentaires. À moyen et long terme, les résultats attendus pourraient améliorer la compréhension des mécanismes précoces (en particulier durant le développement embryonnaire ou l’allaitement) de prédisposition aux MICI. Le projet pourrait aussi contribuer à identifier des marqueurs biologiques prédictifs de l’activité de la maladie ou de la réponse thérapeutique. Enfin, en évaluant chez la souris l’efficacité d’une régulation de la rythmicité des cellules du côlon, il pourrait poser les bases d’une stratégie thérapeutique innovante, non immunosuppressive, combinant une intervention pharmacologique ciblée et des recommandations hygiénodiététiques. À terme, ces avancées pourraient bénéficier aux patients atteints de MICI en contribuant à réduire la fréquence ou l’intensité des poussées inflammatoires et à prolonger les phases de rémission.
Procédures
Les seules interventions auxquelles seront soumis les animaux sont des injections d’une durée de 2 secondes une fois par jours pendant 8 jours ou 51 jours. Induction de l’inflammation de l’intestin par l’eau de boisson. Restriction alimentaire, 18h par jour, pendant 12 semaines au maximum pour une partie des animaux (832)
Impact sur les animaux
Fatigue durant les premiers jours jours d’acclimatation au cycle circadien standard (12h lumière / 12h obscurité) utilisé durant la procédure. Stress lié aux manipulations répétées. Stress durant les premiers jours de restriction alimenatire lorsque les souris ne sont pas encore habituées aux heures d’accès à la nourriture. Douleurs intestinales liées à l’eau de boisson pour induire une inflammation de l’intestin. Stress physique liés aux injections des traitements (et douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille). Stress lié aux effets cumulatifs (rythme alimentaire, induction de l'inflammation de l’intestin, manipulations répétées).
Devenir
Lorsque les points limites sont dépassés ou lorsque les temps définis sur les différentes procédures sont atteints les animaux sont euthanasiés afin de prélever des organes pour analyses ultérieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour étudier les interactions entre l’horloge circadienne, la réponse au stress et la physiopathologie des maladies inflammatoires, car ces processus reposent sur une intégration complexe à l’échelle de l’organisme entier. Le fonctionnement de l’horloge circadienne repose sur une organisation intégrée à l’échelle de l’organisme, où des signaux environnementaux tels que la lumière, l’alimentation et les cycles veille/sommeil synchronisent l’horloge centrale. Cela assure la coordination temporelle des fonctions physiologiques et leur synchronicité avec l’environnement de l’organisme. Dans l’intestin, l’Horloge coordonne de manière dynamique les fonctions immunitaires, métaboliques et épithéliales qui interagissent entre elles et avec le microbiote intestinal. Il s’agit d’éléments clés des maladies inflammatoires impossible à reproduire in vitro. De plus, le stress cellulaire dépend de signaux systémiques (hormonaux, nutritionnels, inflammatoires) et de la synchronisation entre organes, qui ne peuvent être modélisés de façon adéquate dans des systèmes cellulaires isolés. Ainsi, seule l’approche in vivo permet d’appréhender la complexité spatio-temporelle des mécanismes intégrés au niveau systémique que nous étudions. Par ailleurs, le développement de notre nouvelle approche thérapeutique nécessite d’être réalisé chez le petit animal car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) permettant d’évaluer son efficacité, sa toxicité et sa pharmacocinétique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé sur la base de calculs de puissance statistique garantissant l’obtention de résultats fiables et scientifiquement interprétables, tout en limitant l’utilisation des animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en cages ouvertes, disposées en regroupement, et bénéficiant d’un enrichissement du milieu comprenant notamment du coton et des éléments de type jouets, afin de favoriser l’expression des besoins comportementaux et de réduire le stress lié à l’hébergement. Une période d’acclimatation de 15 jours sera mise en place avant le début des procédures expérimentales, afin de limiter le stress lié à la manipulation et aux conditions d’hébergement.Les mesures de prise en charge de la douleur et de la détresse seront adaptées en fonction de l’état clinique des animaux. Les protocoles expérimentaux seront adaptés, atténués ou interrompus en fonction de la tolérance des animaux aux nuisances induites et de l’apparition de signes cliniques de souffrance, conformément aux principes du raffinement.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle constitue un modèle pertinent et transposable pour étudier les interactions entre horloge circadienne, stress cellulaire et inflammation intestinale. En effet, bien que les souris soient des animaux nocturnes, elles sont largement utilisées en chronobiologie car leur système circadien est fortement conservé par rapport à celui de l’être humain, tant aux niveaux moléculaire que physiologique. La principale différence réside dans un décalage de phase de 12 heures de leur activité par rapport au cycle lumière–obscurité : les souris sont ainsi actives durant la phase obscure, tandis que les humains le sont durant la phase lumineuse. En dehors de cette inversion, l’organisation, la régulation et les sorties du système circadien, incluant les rythmes hormonaux, métaboliques et cellulaires, sont remarquablement similaires, faisant de la souris un modèle approprié et transposable pour les études circadiennes. Enfin, les mécanismes moléculaires de la réponse au stress sont similaires entre la souris et l’humain. Les animaux utilisés dans toutes les procédures (à l’exception de la procédure n°3) ont achevé leur développement et sont jeunes adultes lors de leur entrée en expérimentation, car les MICI sont généralement diagnostiquées chez de jeunes adultes. Cependant, les mécanismes physiopathologiques à l’origine des MICI se mettent vraisemblablement en place tôt au cours de la vie, et c’est la raison pour laquelle une fraction des animaux utilisés au cours de la procédure n°3 sont employés durant leur développement embryonnaire et leur période d’allaitement.
ROLE DU MICROBIOTE INTESTINAL SUR LA SENSIBILISATION CENTRALE A LA DOULEUR DANS LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Nourries par voie orale du microbiote intestinal de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, et pour une partie injectées dans la patte d'un produit inflammatoire, 380 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour analyser leur cerveau et leur intestin. Chaque semaine, elles passent des tests de sensibilité au toucher par filaments de nylon et à la température, et des tests d'anxiété et de dépression que le résumé ne nomme pas, alors que l'hypersensibilité de la patte peut durer 20 à 25 jours. Le but est d'identifier des composés du microbiote contre la douleur chronique, avant d'éventuels essais chez les patients. Le porteur exclut tout antalgique, "aucun traitement antalgique ou analgésique systématique ne peut être appliqué", et affirme dans le même résumé vouloir "assurer le bien-être des animaux".
Objectifs
Chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde, 20 à 30 % continuent d’avoir des douleurs même si leur maladie est bien traitée. Leur corps réagit plus facilement à la douleur que celui de personnes non malades, et elles ont aussi souvent plus d’anxiété et de dépression. La flore intestinale, c'est-à-dire les bactéries présentes dans nos intestins, joue un rôle dans la maladie, et on sait qu'un lien important existe entre l’intestin et le cerveau. Nous pensons donc que les modifications de la flore intestinale des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde favorisent la douleur chronique et la dépression, notamment chez les patients qui ont des symptômes qui persistent après traitement. Pour mieux comprendre comment tout cela fonctionne, nous allons étudier l’impact de leur flore intestinale en la transférant à des souris. Ensuite, nous observerons ces souris avec différents tests permettant d’évaluer leur sensibilité au toucher ou au froid, mais aussi des tests qui permettent d’évaluer l’anxiété ou la dépression. Nous testerons l’effet des microbiotes dans deux situations : chez des souris saines pour évaluer les effets déclencheurs des microbiotes, et en conditions inflammatoires, chez des souris avec une inflammation à la patte pour évaluer cette fois les effets aggravateurs des microbiotes. Une fois le rôle du microbiote prouvé, nous identifierons quels éléments issus du microbiote intestinal sont responsables pour pouvoir les cibler et tenter de bloquer les mécanismes qui déclenchent ou aggravent la maladie. L’objectif final est d’identifier des composés du microbiote pouvant réduire la douleur ou les troubles anxio-dépressifs, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
La douleur chronique et de la dépression restent difficiles à traiter chez certains patients, ce qui impacte fortement leur qualité de vie. Il est donc essentiel de comprendre l'origine de la douleur et de la dépression pour permettre de mieux les soigner. Une fois le rôle de la flore intestinale prouvé, nous analyserons et comparerons les différents microbiotes pour identifier quelles sont les bactéries ou quelles sont les molécules produites qui pourraient expliquer la douleur et la dépression. Ceci nous permettra ainsi de tester leur rôle protecteur chez les souris avant de les tester en clinique chez les patients. Ce projet permettra donc une véritable recherche translationnelle, du laboratoire au patient, avec pour objectif d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de douleurs chroniques ou de dépression.
Procédures
Nous réalisons des greffes de microbiote intestinal en donnant aux souris par voie orale des préparations de microbiote de patients une fois par semaine pendant 4 semaines. Suite à la greffe de microbiote, les souris seront suivies chaque semaine grâce à des tests comportementaux pour mesurer les seuils de sensibilité (réaction au toucher par filaments de Nylon ou réaction à la température) et caractériser les comportements anxieux ou dépressifs. Chaque test dure entre 5 et 20 min. Ces expériences sont menées chez des souris saines et dans un modèle d’inflammation locale de la patte, induite par l’injection de molécules inflammatoires dans la patte des souris, qui sera réalisée sous anesthésie légère par inhalation. Enfin, lorsque des molécules produites par le microbiote auront été identifiées, nous les ajouterons dans l’eau de boisson des souris pour tester leur effet bénéfique dans les modèles les plus pertinents.
Impact sur les animaux
La sensibilité tactile et thermale et les comportements anxio-dépressifs étant les paramètres étudiés dans nos procédures, aucun traitement antalgique ou analgésique systématique ne peut être appliqué car ils fausseraient nos résultats. Les principaux désagréments pour les animaux seront liés au modèle inflammatoire utilisé pour induire l’inflammation locale de la patte. L’injection d’un produit inflammatoire dans la patte provoque un gonflement et une rougeur de courte durée, visible surtout les premiers jours. La sensibilité de la patte au toucher peut durer plus longtemps (20 à 25 jours), ce qui permet d’étudier la douleur inflammatoire résiduelle. Les animaux sont surveillés et des mesures sont prises pour limiter leur inconfort. Les animaux subiront également des piqures d’aiguilles, un stress léger passager lié aux manipulations. Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie légère par inhalation, d’une durée d’environ 5 minutes, afin de réduire au maximum la douleur et l’inconfort.
Devenir
La douleur étant étudiée, et donc induite, chez certains animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement l’euthanasie afin de ne pas générer de douleur inutile. De plus, L’euthanasie permet également de réaliser les analyses post-mortem nécessaires, notamment sur le cerveau et l’intestin, afin de compléter les données comportementales et d’approfondir la compréhension des mécanismes reliant microbiote, douleur et comportements anxio-dépressifs.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le microbiote intestinal influence la douleur et les comportements associés dans la polyarthrite rhumatoïde. A ce jour, il n'existe pas de modèle de substitution permettant d'étudier les interactions complexes entre microbiote, système immunitaire, système nerveux et comportement. Par ailleurs, la perception de la douleur, ainsi que les réponses anxieuses ou dépressives, sont des phénomènes appréhendés par l’organisme conscient. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Tout sera mis en œuvre pour réduire la variabilité interindividuelle dans nos groupes et assurer qu’un nombre minimal de souris sera utilisé pour démontrer un effet (animaux du même âge, mâles et femelles, période d’habituation à l’environnement et à l’expérimentateur). Un grand soin est apporté aux animaux afin de limiter au maximum le stress qui pourrait entraîner des biais importants dans les tests comportementaux. Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations antérieures, ce qui nous a permis de déterminer qu’un nombre de 20 souris par groupe (10 males et 10 femelles) est nécessaire pour observer une différence statistique et biologiquement pertinente. Ainsi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour observer des différences statistiques entre les groupes, afin que les tests effectués soient pertinents mais sans sur-utilisation d’animaux.
Raffinement
Notre objectif étant d’étudier l’hypersensibilité à la douleur, nous n’interviendrons pas tant que les niveaux de douleur observés restent dans les seuils attendus pour les modèles utilisés. En revanche, toutes les procédures sont conçues dans le respect de l’animal et avec pour objectif constant de réduire au maximum le stress et l’anxiété, afin de limiter l’inconfort à ce qui est strictement nécessaire au protocole et d’assurer le bien-être des animaux. Cela passe par une étape d’habituation progressives des animaux (1 semaine à l’arrivée pour les locaux, puis 1 semaine pour les pièces d’expérimentation) et une manipulation douce par du personnel formé, avec là aussi une période d’habituation quotidienne des animaux aux expérimentateurs. L’enrichissement fourni comprend les matériaux réglementaires de nidification, auxquels est ajouté un igloo rouge, contribuant à améliorer leur confort et leur sentiment de sécurité. Tout au long du projet, l’objectif reste de limiter l’angoisse et la souffrance. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi clinique régulier, plusieurs fois par semaine (et chaque jour en période inflammatoire), pour identifier rapidement toute douleur excessive, perte de poids, difficulté locomotrice ou comportement anormal. Une grille d’évaluation clinique, accompagnée des actions à mettre en œuvre, permettra une prise en charge immédiate et adaptée, afin d’éviter toute douleur inutile. De plus, la durée des expériences est volontairement limitée.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de greffe de microbiote chez l’animal. Elle permet d’évaluer les effets d’un microbiote donné sur le comportement, la douleur, l’inflammation et les interactions neuro-immunes de manière intégrée, ce qui n’est pas possible chez des espèces plus simples. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 8 et 21 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
Rôle de la néoglucogenèse intestinale sur les conséquences métaboliques induites par l’absence de microbiote maternel EU1/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit une biopsie pour génotypage, et 144 d'entre elles passent 72 heures isolées en cage de mesure, subissent deux tests de glycémie avec sept prélèvements de sang chacun et suivent onze semaines de régime hypercalorique à partir de six semaines d'âge. Les 48 mères reçoivent un gavage les trois premiers jours après l'accouplement, et 32 d'entre elles des antibiotiques pendant 21 ou 36 jours pour supprimer leur microbiote intestinal, l'enjeu étant de mesurer ce que cette suppression fait au métabolisme de leur descendance. Les 48 mères et les 384 souriceaux sont tués pour prélèvement d'organes, tandis que les mâles ayant servi à la reproduction, des souris de réforme d'élevage, sont réutilisés dans l'établissement sans figurer au décompte des 432.
Objectifs
La forte prévalence de l'obésité et du diabète, en particulier chez les enfants, souligne la nécessité de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de ces pathologies. Des études antérieures ont montré qu’une modification de l’environnement maternel contribue aux maladies métaboliques tout au long de la vie. Le microbiote intestinal constitue une communauté complexe et dynamique de bactéries vivant dans le système digestif. Des changements dans la composition ou la fonction du microbiote intestinal ont été associés au développement de maladies métaboliques. Des données récentes suggèrent que le microbiote intestinal maternel influence le métabolisme, le comportement, le développement du cerveau chez la progéniture. Cependant, il reste à déterminer comment le microbiote maternel exerce ces effets sur la descendance. Chez l’individu adulte, il est connu que le microbiote intestinal exerce des effets anti-obésité et anti-diabète en activant la production de glucose par l’intestin appelée la néoglucogenèse intestinale. Nos résultats récents montrent que l’activation de la néoglucogenèse intestinale pendant la période de gestation ou de lactation améliore durablement la santé de l’individu une fois adulte. Une absence de microbiote maternel pourrait donc bloquer la stimulation de la néoglucogenèse intestinale lors du développement et altérer la santé de l’individu à l’âge adulte. Dans cette étude, réalisée dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2), nous déterminerons si la stimulation génétique de la néoglucogenèse intestinale dès la gestation contrecarre les effets métaboliques induits par l’absence du microbiote maternel.
Bénéfices attendus
Cette étude fait partie d’un projet qui étudie le rôle du microbiote maternel sur le métabolisme de la descendance. L’objectif du projet est de moduler le microbiote uniquement pendant la période de gestation et de lactation. Chez l’homme, l’alimentation maternelle est associée à une stimulation de la néoglucogenèse intestinale en comparaison avec une alimentation utilisant du lait infantile. Si nos résultats démontrent que la stimulation de la néoglucogenèse intestinale dès la gestation programme de manière positive la santé de l’individu adulte, nous pourrons proposer des perspectives efficaces pour contrecarrer le développement des maladies métaboliques. Ces perspectives pourront par exemple se traduire par des modifications de l’alimentation des mamans et de leurs nourrissons destinées à induire la néoglucogenèse intestinale.
Procédures
Pour sélectionner les souris transgéniques, un petit morceau de tissu (biopsie) sera prélevé à toutes les souris du projet pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes (EU1). Les 48 femelles subiront un gavage les trois premiers jours après l’accouplement (30 secondes) et un prélèvement de sang (30 secondes) 21 jours après la mise bas (EU1). Parmi ces femelles, 32 recevront un traitement d’antibiotiques : 16 pendant 21 jours et 16 pendant 36 jours. Parmi les 384 descendants, 144 : - seront soumis à un régime hypercalorique dès l’âge de 6 semaines et pendant 11 semaines (EU1 + EU2). - subiront 2 tests pour analyser la régulation de leur glycémie pendant 2h après l’injection de glucose ou d’insuline (injections réalisées en 20 à 30 secondes chez la souris maintenue en contention) chez des animaux mis à jeun pendant 6h (EU1). Pour chaque test, 7 prélèvements de sang seront réalisés à l’extrémité de la queue en 15 secondes maximum sur des souris libres de mouvement. Une seule incision de l’extrémité de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement de sang (EU1). - seront soumises à mesure de la composition corporelle par un analyseur dédié (EU2). Cette mesure sera réalisée chez l’animal éveillé mais maintenu immobile. Elle est rapide (2 minutes) et non invasive - seront isolées pendant 72h dans des cages spécifiques pour mesurer leur dépense énergétique (EU2). On mesurera leurs échanges gazeux (respiration), leur prise alimentaire et hydrique et leur activité physique. Cette mesure se fait de manière non-invasive. En fin d’expérience, une prise de sang terminale sera faite rapidement (en moins de 15-20 secondes) après une mise à jeun pendant 6h (EU1). L’animal sera mis à mort immédiatement après la prise de sang pour permettre le prélèvement de certains organes, qui seront ensuite étudiés en laboratoire (EU1).
Impact sur les animaux
Le traitement aux antibiotiques n’entraine pas de modification du comportement maternel, de perte de poids et de mal-être. Le gavage pourrait provoquer une légère irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins peuvent engendrer une légère douleur de très courte durée au moment de la piqure. La réalisation de certains gestes (biopsie, injections, mesure de la composition corporelle) peut entrainer un léger stress lors de l’immobilisation nécessaire. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont également : - une douleur lors de la biopsie. - les symptômes liés à une hypoglycémie liée à l’injection d’insuline, c’est-à-dire une baisse de leur activation jusqu’à leur prostration, un mal-être, voir des convulsions et un coma si l’hypoglycémie est sévère. - un stress léger dû à la privation de nourriture pendant 6h. - un stress pendant l’isolement de 72h pour la dépense énergétique.
Devenir
Les 48 femelles et 384 souriceaux issus des croisements seront mis à mort pour prélèvements d’organes. Les mâles utilisés pour la reproduction seront réutilisés dans l’EU1.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur des cellules ou organoïdes car elle concerne l’influence de l’environnement maternel sur un paramètre d’un descendant. Les connaissances actuelles ne permettent pas de reproduire la complexité de l’environnement maternel sur un modèle cellulaire représentant l’organe du descendant.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans la procédure d’étude a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et des connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, 8 descendants par condition seront utilisés pour étudier les conséquences de l’absence de microbiote intestinal maternel sur les souriceaux et 12 descendants par condition pour étudier les conséquences sur les descendants adultes. Au total, ce projet réalisé sur 5 ans nécessitera 432 souris transgéniques. Les mâles utilisés pour l’obtention des portées sont des souris de réforme d’élevage.
Raffinement
Pour favoriser l’accouplement, le soir précédent l’accouplement, de la litière des mâles sera introduite dans la cage des femelles et vice et versa. Les portées seront équilibrées à 8 bébés par portées en réalisant des adoptions de souriceaux issus de grandes portées par des mères de petites portées. Pour limiter le stress de séparation des nouveau-nés de leur mère en cas d’adoption, l’expérimentateur se frottera les mains avec la litière et les souriceaux à adopter seront déplacés avec de la litière et une partie du nid. Pour limiter l’irritation, le gavage sera réalisé avec une sonde de gavage souple préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision pour l’ensemble des prélèvements Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. Les souris seront transportées entre l’EU1 et l’EU2 dans des cages permettant de conserver le confinement, selon les conditions règlementaires. La durée du trajet n’excède pas 10 minutes. Le stress lié à l’isolement pour la mesure du métabolisme énergétique sera atténué en plaçant de la litière souillée de la cage d’origine des souris et par l’ajout d’un tube leur permettant de se cacher. Une période de découverte de ce nouvel environnement sera réalisée pendant 3 h, puis une période d’acclimatation de 24h précédera les mesures. Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Ces points sont spécifiques au projet et adaptés à l’âge des animaux et aux interventions réalisées.
Choix des espèces
Le rôle de la production endogène de glucose par l’intestin pendant la période néonatale a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Nous étudions l’importance du microbiote intestinal maternel sur la descendance donc cette étude concerne des femelles adultes âgées de 14 semaines. Leurs descendants seront étudiés à 10 jours et à l’âge adulte (entre 6 et 17 semaines).
Interactions tumeur–ganglion lymphatique drainant et immunotolérance dans les cancers primitifs du foie : mécanismes immunologiques et stratégies thérapeutiques ciblant l’axe tumoral et ganglionnaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire, 640 souris reçoivent une injection de cellules tumorales, parfois au cours d'une chirurgie de quinze à vingt minutes sous anesthésie générale. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour prélever la tumeur, les ganglions lymphatiques drainants, le foie, la rate et le sang. Entre-temps, elles reçoivent des injections de traitements expérimentaux une à deux fois par semaine pendant deux à quatre semaines, leur tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur indique que les souris dont la perte de poids devient importante, dont le comportement s'altère ou dont la tumeur grossit trop seront mises à mort immédiatement.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire. Dans certains cas, les défenses de l’organisme ne reconnaissent pas ou n’attaquent pas efficacement les cellules cancéreuses. L’objectif est de comprendre les mécanismes responsables de cette perte d’efficacité du système immunitaire et d’identifier des moyens de le réactiver. À terme, ce projet vise à améliorer l’efficacité des traitements existants, notamment l’immunothérapie, et à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cancers du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire et le rôle des ganglions lymphatiques proches de la tumeur dans ce phénomène. Les résultats devraient : • identifier les mécanismes qui empêchent le système immunitaire d’attaquer efficacement les cellules tumorales ; • comprendre comment les tumeurs modifient leur environnement pour favoriser leur développement ; • déterminer si certaines approches thérapeutiques peuvent améliorer l’efficacité des immunothérapies en réactivant les défenses immunitaires. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des principaux cancers du foie.
Procédures
Les animaux recevront une injection de cellules tumorales afin de provoquer le développement d’une tumeur. Dans certains cas, cette injection pourra être réalisée lors d’une intervention chirurgicale courte sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite suivis régulièrement, avec des mesures de la taille de la tumeur deux fois par semaine lorsque cela est possible. Ils recevront également des injections de traitements expérimentaux, généralement 1 à 2 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume pourront être réalisés, au maximum une fois par semaine. Chaque injection dure quelques minutes. Les interventions chirurgicales durent environ 15 à 20 minutes et sont réalisées sous anesthésie avec prise en charge de la douleur. À la fin de l’expérience, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus.
Impact sur les animaux
Les animaux développeront des tumeurs au cours de l’étude, pouvant entraîner une gêne progressive et une altération de leur état général. Les principales nuisances attendues sont : - le développement de la tumeur, - le stress lié aux manipulations, - les injections répétées, - et, dans certains cas, les suites d’une intervention chirurgicale. L’état des animaux sera surveillé régulièrement. Des critères stricts d’arrêt seront appliqués afin d’éviter toute souffrance, notamment en cas de perte de poids importante, d’altération du comportement ou d’augmentation excessive de la taille tumorale. Dans ces situations, les animaux seront euthanasiés immédiatement.
Devenir
La mise à mort de l’ensemble des animaux est nécessaire afin de réaliser les prélèvements terminaux indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Les analyses nécessitent notamment le prélèvement de la tumeur, des ganglions lymphatiques drainants et d’autres tissus et organes impliqués dans la réponse immunitaire, tels que le foie, la rate et le sang. Ces prélèvements permettent de caractériser conjointement la tumeur et la réponse immunitaire locale, ganglionnaire et systémique et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés à l’issue des procédures.
Remplacement
Avant d’utiliser des animaux, nous avons recours autant que possible à des méthodes alternatives, comme des études sur des cellules en laboratoire ou l’analyse de données humaines. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre une tumeur et le système immunitaire dans un organisme vivant. L’utilisation de modèles animaux reste donc nécessaire pour répondre aux questions posées dans ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les expériences sont soigneusement planifiées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant la validité scientifique. Plusieurs analyses sont réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les informations obtenues. De plus, certaines expériences ne sont réalisées que lorsque cela est nécessaire, ce qui permet d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Toutes les mesures sont prises pour limiter la douleur et le stress des animaux. Ils sont hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Leur état de santé est surveillé régulièrement tout au long de l’étude. Les interventions sont réalisées par du personnel formé, sous anesthésie lorsque cela est nécessaire, avec une prise en charge de la douleur. Des critères stricts sont définis pour arrêter l’expérience dès qu’un animal présente des signes de souffrance.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été retenue comme espèce modèle pour ce projet en raison de sa pertinence largement démontrée dans l’étude de l’immunologie tumorale et des cancers du foie. Les modèles murins permettent d’étudier dans un organisme immunocompétent les interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et les organes lymphoïdes secondaires, notamment les ganglions lymphatiques drainants, qui ne peuvent être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro. Les lignées tumorales murines utilisées sont bien caractérisées et permettent de reproduire différents phénotypes immunitaires observés chez l’homme, notamment des tumeurs pauvrement infiltrées par les cellules immunitaires. Par ailleurs, la disponibilité d’outils génétiques, immunologiques et thérapeutiques adaptés chez la souris permet d’explorer de manière contrôlée les mécanismes d’immunotolérance et d’évaluer des stratégies immunothérapeutiques pertinentes pour les cancers primitifs du foie. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux présentent une physiologie stable et un système immunitaire mature, ce qui est nécessaire pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales.
Cibler les structures lymphoïdes tertiaires par IRM et IPM moléculaire dans des modèles murins d’inflammation chronique – Modification
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une injection unique dans l'abdomen déclenche le lupus, deux injections intradermiques sous anesthésie profonde déclenchent l'arthrite, d'autres souris ingèrent du DSS pour développer une colite, avant la pose d'un cathéter et une trentaine de minutes d'imagerie sous agent de contraste. 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue, certaines subissant en plus une heure de clampage de l'artère rénale gauche. Le porteur annonce pour la colite une perte de poids de 20 à 25 %, une diarrhée avec rectorragies et une souffrance de plusieurs jours, et rapporte pour le lupus une hémorragie intra-alvéolaire mortelle dans la moitié des cas selon la littérature, tout en indiquant que la souche BALB/c ne présente pas cet évènement. La douleur est cotée par la mouse grimace scale, et la mise à mort intervient au-delà d'un score moyen de 1,5, d'une perte de poids de 20 %, ou d'une respiration abdominale.
Objectifs
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats lymphocytaires de quelques centaines de micromètres qui se développent dans les tissus sous l'effet d'une inflammation chronique. En temps normal, ces TLS possèdent probablement de nombreux avantages en permettant de générer une réponse adaptative in situ. Néanmoins, dans des situations d'inflammation chronique ces structures se comportent comme une niche pour les lymphocytes auto-réactifs et entretiennent de ce fait la pathologie présentée. Il a ainsi pu être démontré chez l'homme que la présence de TLS était associé à un mauvais contrôle de la pathologie au cours de rhumatismes inflammatoires chroniques, de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou de pathologies auto-immunes. Afin de visualiser l'inflammation en imagerie, il est possible d'utiliser des agents de contraste magnétiques pouvant être détectés par des techniques d'IRM ou d'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite qui repose sur la détection du signal émis uniquement par les microparticules d'oxyde de fer, et qui permet la réalisation d'une étude corps entier, contrairement à l'IRM) et sélectivement dirigées contre un marqueur inflammatoire spécifique de la structure d'intérêt. Les TLS sont entourées de cellules endothéliales très spécialisées, qui expriment à leur pôle luminal un motif glycoprotéique appelé PNAd. Ce motif glycoprotéique est en pratique histologique reconnu par un anticorps spécifique, qu'il est alors possible de coupler à l'agent de contraste afin de permettre la visualisation des TLS par une approche d'imagerie non invasive. Un nouvel agent de contraste submicrométrique et biocompatible a récemment pu être développé, ouvrant ainsi la voie à une translation à l'homme. Nous souhaitons donc valider cette approche d'imagerie moléculaire des TLS en utilisant ce nouvel agent de contraste couplé à un anticorps dirigé spécifiquement contre PNAd dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Ceci permettrait de valider la possibilité d'une imagerie moléculaire de l'inflammation chez l'homme, par l'utilisation de ce nouvel agent de contraste.
Bénéfices attendus
La présence de TLS au sein des sites inflammatoire a pu être démontrée comme associée à un mauvais pronostic, y compris sous traitement immunomodulateur. L'évolution de la présence et du nombre de TLS a également pu être associée à la réponse thérapeutique. Actuellement, l'identification des TLS au sein d'un organe d'intérêt repose sur l'analyse histologique du tissu après réalisation d'une biopsie. Cette technique présente de nombreuses limites. Il s'agit en effet d'un examen invasif, avec un risque de complication (hémorragie du site de ponction, perforation...) non négligeable, ce d'autant plus si l'on souhaite évaluer l'évolution des TLS au cours du temps et donc répéter les examens. De plus, l'analyse d'une biopsie n'apporte qu'une information parcellaire et ne permet pas une analyse complète de l'organe d'intérêt. Outre l'absence de vision d'ensemble, le risque de faux négatif est donc important. Enfin, la réalisation d'une biopsie est un examen destructeur, qui empêche donc le suivi d'une structure donnée au cours du temps. Pour toutes ces limites, il apparaît aujourd'hui nécessaire de développer une technique non invasive permettant l'étude, le suivi et la caractérisation des structures lymphoïdes tertiaires. Le développement et la validation de notre agent de contraste utilisable en IRM dans différents modèles de pathologies inflammatoires permettrait ainsi d'ouvrir la voie de l'imagerie non invasive de l'inflammation en pratique clinique humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : induction d'un modèle de lupus par injection intra-péritonéale unique (30 secondes) ou induction d'un modèle d'arthrite par deux injections intradermiques sous anesthésie profonde (5 minutes chaque) ; clampage transitoire de l’artère rénale gauche (une heure) ; pesées quotidiennes (durée inférieure à 5 minutes) ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie avec injection de l'agent de contraste (environ 30 minutes) ; injection d'un traitement par voie intra-péritonéale (30 secondes).
Impact sur les animaux
Les modèles de colite utilisés sont susceptibles d'occasionner des effets indésirables chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience dans l'utilisation de ce modèle et des données de la littérature, nous savons que le modèle de colite par ingestion de DSS est susceptible de produire une diarrhée et des rectorragies. Il est susceptible d'entraîner une perte de poids chez les animaux (jusqu'à 20 à 25% selon les séries), un inconfort physique et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours). Le modèle de lupus induit par pristane est susceptible d'entraîner une ascite, puis l'apparition d'arthralgies inflammatoires. L'effet le plus sévère de ce modèle rapporté dans la littérature est la survenue d'une hémorragie intra-alvéolaire pouvant induire une mortalité jusqu'à 50%. Néanmoins, les souris de souche BALB/c, ne présentant pas ce type d'évènement. Le modèle de polyarthrite par sensibilisation au collagène est susceptible de produire des arthralgies inflammatoires. Le modèle de clampage transitoire de l'artère rénale gauche peut entraîner une perte de poids jusqu'à 10%, et n'entraîne pas d'insuffisance rénale chronique.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant PNAd sur des cultures de cellules endothéliales. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier l'affinité de l'agent de contraste pour sa cible moléculaire à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites ci-après sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles de colite, ainsi que selon les données de la littérature et la sensibilité/spécificité des méthodes utilisées. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu (notamment pour les modèles de colite), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps. Pour le modèle de colite, un calcul du nombre de sujets nécessaire a pu être réalisé à partir des données antérieures de l'équipe (8 sujets par groupe, inflaté à 12 pour tenir compte de pertes potentielles ; 16 sujets pour la modulation par un traitement) pour une puissance de 80% et un risque de première espèce de 5%. Concernant les autres modèles, l'utilisation d'une telle modalité d'imagerie n'y a jamais été réalisée. Nous considérons donc qu'il s'agit d'une étude pilote, et qu'il n'est pas possible de réaliser un calcul du nombre de sujets nécessaires.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel PVC ou igloo PVC, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge (points limites cités plus loin). La douleur sera évaluée par utilisation de la par l'utilisation de la mouse grimace scale. Les animaux seront pesés quotidiennement (points limites cités plus loin). Les animaux des groupes colites ou présentant des arthrites bénéficieront d'une coupelle de croquettes humidifiées pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture ad libitum. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort (dislocation cervicale après anesthésie générale par isoflurane 5% et N2O/O2 70/30%) si : perte de poids > 20% ; le score moyen de la mouse grimace scale est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant la pose du cathéter, l'injection des particules ou la perfusion intracardiaque, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une souffrance ne correspondant pas à un point limite recevront une antalgie par buprénorphine. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie par buprénorphine ou fentanyl, une anesthésie générale par isoflurane, une anesthésie locale par lidocaïne.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude des TLS en conditions inflammatoires. Il faut également noter que la cible antigénique de notre traceur (PNAd) est un motif conservé entres espèces, autorisant une translation rapide des résultats obtenus de la souris à l'homme. Dans les modèles de colite au DSS et TNBS, les souris utilisées seront des souris mâles âgées de 8 semaines, stade optimal pour l'induction du modèle. Le modèle de lupus induit par l'injection de pristane utilisera des souris femelles de souche BALB/c ou C57BL6/J âgées de 8 semaines. En effet, les souris mâles ne présentent pas de phénotype lupique. Le modèle d'arthrite au collagène fera appel à des souris DBA/1 de 8 semaines, selon les données de la littérature. Le modèle de TLS intravésicales fera appel à des souris Swiss âgées de 68 semaines, et de 8 semaines pour les contrôles. Le modèle d'ischémie-reperfusion rénale fera appel à des souris C57BL6 mâles de 10 à 12 semaines selon les données de la littérature.