Troubles urogénitaux

Greffées avec des adipocytes bruns, puis exposées jusqu'à quatre fois à une température de 4 degrés pendant vingt-quatre heures, 1 238 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent des prélèvements sanguins répétés, des chirurgies sous anesthésie et un isolement pouvant durer deux semaines en cage métabolique. L'objet est de tester si une greffe de tissu adipeux brun corrige les troubles métaboliques et reproductifs du syndrome des ovaires polykystiques, que le porteur dit toucher 13 % des femmes en âge de procréer. Cent soixante femelles et cinquante-quatre mâles passent d'une procédure à l'autre et sont réutilisés pour les tests de fertilité avant d'être mis à mort, le porteur indiquant que le prélèvement des organes interdit de les garder en vie.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer les effets de la transplantation d’adipocytes bruns, obtenus à partir de tissu adipeux murin ou d'adipocytes bruns humains obtenus in vitro en 3 dimensions (BAToïdes), sur les altérations métaboliques, hormonales et reproductives associées au syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le SOPK est une pathologie fréquente, touchant environ 13 % des femmes en âge de procréer. Elle se caractérise par des troubles métaboliques, hormonaux et reproductifs, souvent associés à une altération de la qualité de vie. À ce jour, il n’existe pas de traitement curatif, et la prise en charge repose principalement sur des approches symptomatiques. L’objectif est de déterminer si cette approche de thérapie cellulaire permet de moduler les déséquilibres physiopathologiques observés dans cette pathologie, en particulier au niveau des interactions entre les systèmes métaboliques, endocrinien et reproducteur. Le recours à un modèle animal est indispensable à ce stade afin d’évaluer, dans un organisme entier, la faisabilité, la tolérance et les effets de cette approche. En effet, la complexité des interactions systémiques impliquées dans le SOPK ne peut pas être reproduite de manière fiable par des approches in vitro ou in silico. Cette étape préclinique constitue un préalable nécessaire à l’évaluation de la pertinence de cette stratégie dans une perspective translationnelle. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d’explorer une stratégie innovante visant à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués et à identifier de nouvelles pistes d’intervention thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les troubles métaboliques et endocriniens, tels que ceux observés dans le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK), représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur prévalence, de leur impact sur la qualité de vie et des coûts socio-économiques associés. Le SOPK est notamment caractérisé par des altérations métaboliques (dont la résistance à l’insuline) et des dysfonctionnements de la reproduction, pour lesquels les options thérapeutiques actuelles restent limitées et essentiellement symptomatiques. Dans ce contexte, ce projet vise à améliorer la compréhension des interactions entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur, en particulier le rôle du tissu adipeux brun dans la régulation de ces fonctions. En explorant les effets de la transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin pertinent de SOPK, ce travail permettra d’identifier de nouveaux mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette pathologie. Les connaissances générées pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles d’intervention et ouvrir des perspectives pour le développement de stratégies innovantes dans la prise en charge des troubles métaboliques et de la fertilité. Plus largement, ce projet s’inscrit dans les priorités actuelles de recherche en santé, notamment en lien avec la santé des femmes, et pourrait participer à l’amélioration de la prise en charge de pathologies chroniques ayant un impact important sur la qualité de vie et le bien-être à long terme.

Procédures

Pour l’ensemble des gestes décris dans les 3 procédures, nous aurons recours à l’utilisation d’anesthésiques (uniquement dans une procédure) et d’analgésiques aussi souvent que cela sera nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par voie gazeuse. Une injection d’analgésique adapté sera réalisée avant la chirurgie et/ou après si nécessaire. Les injections n’excèderont jamais 20 μl/g de poids corporel. Les animaux feront l'objet d'administration de traitements et de prélèvements selon les volumes et fréquences recommandées par la littérature et dans le respect de la réglementation en vigueur. Des prélèvements sanguins par différentes voies réalisés au cours des procédures de phénotypage seront effectués avec des fréquences et volumes inférieurs aux recommandations bibliographiques et à la réglementation en vigueur. Un isolement de maximum 2 semaines (sans rupture du lien olfactif ou visuel) sera nécessaire pour une partie des animaux afin de pouvoir mesurer des caractéristiques de manière individuelle.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations expérimentales sont susceptibles d’induire un stress, une fatigue ou un inconfort transitoire chez les animaux. Afin de limiter ces effets, l’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé et compétent, et les animaux seront préalablement habitués aux manipulations. Certaines interventions, telles que les injections, les prélèvements sanguins ou les procédures chirurgicales, peuvent entraîner des douleurs de courte durée. Celles-ci seront systématiquement limitées par l’utilisation de protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés, ainsi que par une surveillance attentive des animaux pendant et après les interventions. Dans le cadre de certaines analyses, notamment en cages métaboliques, les animaux pourront être hébergés individuellement pendant une durée limitée. Cet isolement sera restreint au strict nécessaire et réalisé dans des conditions permettant le maintien d’interactions sensorielles (contacts visuels, olfactifs et auditifs) avec les congénères, afin de réduire le stress associé. Plus généralement, une surveillance régulière de l’état général, du comportement et du poids des animaux sera mise en place tout au long du protocole, permettant d’identifier précocement tout signe de mal-être et d’adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Afin d’étudier l’influence de la température sur la réponse métabolique, les animaux seront exposés à une température de 4°C (atteinte progressivement) pour une durée maximale de 24h et sous surveillance constante. Cette exposition sera effectuée au maximum 4 fois.

Devenir

Les animaux décrits en procédure 1 seront transférés en procédure 2 ou 3 et seront mis à mort à la fin de ces dernières. Les 160 femelles et 54 mâles du projet seront réutilisés pour les tests de fertilité en procédure 3 puis seront mis à mort à l’issue de celle-ci. La nécessité de prélever les organes pour analyses ne nous permet pas de les garder en vie.

Remplacement

Dans la mesure du possible, des approches alternatives seront utilisées afin de réduire le recours à l’expérimentation animale. Celles-ci incluent notamment des cultures cellulaires, des modèles dérivés de cellules souches ainsi que des modèles tridimensionnels de type organoïdes ou adipocytes bruns différenciés in vitro. Dans le cadre de ce projet, des adipocytes bruns humains générés in vitro seront également utilisés afin de limiter le recours à des tissus animaux. Par ailleurs, certains tissus et cellules issus des animaux utilisés dans les procédures expérimentales pourront être exploités ex vivo pour la réalisation de cultures primaires et d’analyses fonctionnelles, permettant ainsi de réduire le nombre de composés et d’expérimentations complémentaires à réaliser in vivo. Cependant, l’étude des interactions complexes entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur dans le contexte du syndrome des ovaires polykystiques nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme entier. Les effets attendus de la transplantation d’adipocytes bruns sur le métabolisme, la fonction hormonale et la fertilité impliquent des communications multi-organes (tissu adipeux, cerveau, gonades, foie) qui ne peuvent actuellement pas être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro ou in silico. Bien que des modèles cellulaires et computationnels soient en cours de développement et puissent contribuer à certaines étapes exploratoires, ils ne permettent pas à ce jour de reproduire la complexité des régulations systémiques étudiées dans ce projet. Ainsi, le recours au modèle animal demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les connaissances générées pourront néanmoins contribuer au développement futur de modèles alternatifs et à la réduction progressive du recours à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à ce projet est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’effectif de chaque groupe par procédure a été calculé à l’aide d’outils statistiques spécifiquesen tenant compte de (i) la définition de la taille minimale des groupes expérimentaux à utiliser pour obtenir des résultats probants, qui seront ajustés en fonction des différentes variables, elles-mêmes évaluées dans chaque expérience et (ii) la coordination des études à leur conception afin de permettre la collecte de plusieurs échantillons / tissus chez les mêmes individus ou d'entreprendre des analyses multiples chez des animaux individuels chaque fois que possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard d’hébergement définis par la réglementation. L’eau et la nourriture sont fournies ad libitum. Un enrichissement est ajouté dans la cage (à minima des cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation). Les périodes d’isolement sont limitées, justifiées et un enrichissement adapté est apporté. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé, et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Une attention particulière est accordée au principe de raffinement, en portant l’attention aux différentes procédures expérimentales appliquées aux animaux afin de minimiser la peur, l'angoisse (ex: regroupement et enrichissement de l'environnement) ou la souffrance (ex : soins péri-opératoires, asepsie, anesthésie et analgésie) qu'ils pourraient endurer. Toutes les procédures potentiellement invasives sont réalisées sous anesthésie adaptée, associée à une analgésie préventive et postopératoire lorsque nécessaire, afin de prévenir toute douleur. Une observation continue des animaux est assurée jusqu’au réveil complet après toute intervention nécessitant une anesthésie. Par la suite, une surveillance quotidienne de l’état général et du comportement est réalisée tout au long des procédures expérimentales, incluant l’évaluation de l’activité, de la posture, de l’aspect du pelage, de la prise alimentaire et hydrique ainsi que du poids corporel. Des critères d’arrêt sont définis et appliqués. Tout animal présentant des signes de souffrance, de détresse persistante, de perte de poids excessive ou d’altération de l’état général sera immédiatement retiré de l’étude et, si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre le lien entre les différents organes afin d’identifier de nouvelles thérapies pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. La souris, modèle d’étude largement validé en physiologie intégrée, nous permet de nous appuyer sur un socle de connaissances scientifiques solide. De plus, le modèle que nous utilisons dans ce projet est un modèle établi dans le laboratoire (présentant l’avantage d’une durée de gestation courte dans le cadre de notre étude) et validé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux. Des souris mâles et femelles seront utilisées à deux stades de développement correspondant aux greffes : P21 (post sevrage) et 6 semaines (jeunes adultes), afin d’évaluer l’impact du timing de transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin de SOPK.

Le choix entre le rat et la souris dépend des demandes des clients de l'entreprise : 3 140 souris et 3 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des prélèvements post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un inducteur chimique ou une exposition hormonale déclenche chez les femelles un syndrome des ovaires polykystiques, avec des administrations jusqu'à deux fois par jour pendant dix-huit semaines, un régime gras pendant dix semaines, des frottis vaginaux quotidiens et des chirurgies de trente minutes, ovariectomies, implantation de pellets, injections intra-ovariennes ou intracérébroventriculaires. Le porteur indique que ces dernières peuvent entraîner des lésions, que des composés sont administrés à des nouveau-nés non sevrés au risque que la mère les rejette, et que le syndrome induit peut faire apparaître insulinorésistance, diabète et hypertension artérielle. Rien ne fonde l'effectif de ces 6 280 souris et rats, il écrit : "Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n'a été fait".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patientes atteintes du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique. L’UTILISATION DE DIFFÉRENTS INDUCTEURS DANS LES MODÈLES EXPÉRIMENTAUX DE SYNDROME DES OVAIRES POLYKYSTIQUES (SOPK) CHEZ LE RONGEUR PRÉSENTE UN INTÉRÊT MAJEUR, CAR AUCUN MODÈLE NE REPRODUIT À LUI SEUL L’ENSEMBLE DES COMPOSANTES ENDOCRINIENNES, REPRODUCTIVES, OVARIENNES ET MÉTABOLIQUES DU SYNDROME HUMAIN. LE PHÉNOTYPE OBTENU DÉPEND NOTAMMENT DE LA NATURE ET DE LA DOSE DE L’INDUCTEUR, DE SA VOIE D’ADMINISTRATION, DE L’ÂGE AUQUEL DÉBUTE L’EXPOSITION, DE LA DURÉE DU TRAITEMENT, AINSI QUE DE L’ESPÈCE, DE LA SOUCHE ET DU RÉGIME ALIMENTAIRE UTILISÉS. CES PARAMÈTRES DOIVENT DONC ÊTRE PRIS EN COMPTE LORS DE LA SÉLECTION ET DE L’INTERPRÉTATION D’UN MODÈLE EXPÉRIMENTAL.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et/ou D’INDUCTEUR DE LA PATHOLOGIE par différentes voies d’administration pendant maximum 18 semaines de façon biquotidienne AU MAXIMUM POUR LES VOIES D’ADMINISTRATION CLASSIQUES. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. CERTAINES ADMINISTRATIONS NECESSITERONT UNE CHIRURGIE SOUS COUVERTURE ANESTHESIQUE ET ANALGESIQUE ADAPTEE (ENVIRON 30 MIN DE CHIRURGIE). Les animaux seront pesés régulièrement (à chaque administration à minima, 30 SEC POUR REALISER CE GESTE) et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir DES CHIRURGIES selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 GOUTTE POUR DES ANALYSES BIOLOGIQUES) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique PAR EXEMPLE OU AUTRE. Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Ce modèle agit essentiellement sur le système endocrinien des animaux pouvant provoquer un dérèglement hormonal influençant leur comportement. De plus, dans ce modèle, une insulinorésistance, du diabète ainsi qu’une hypertension artérielle peuvent apparaître, augmentant ainsi le risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires. Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies (implantation de pellets, ADMINISTRATIONS INTRA-OVARIENNE OU INTRACEREBROVENTRICULAIRE, ovariectomie). L’ADMINISTRATION DE COMPOSES CHEZ DES NOUVEAU-NES NON SEVRES PEUT INDUIRE UN STRESS AUX ANIMAUX, UN MAL-ETRE POUR LA FEMELLE ALLAITANTE QUI PEUT REJETER LES NOUVEAU-NES. L’ADMINISTRATION INTRACEREBROVENTRICULAIRE PEUT ENTRAINER DES LESIONS SUR LES ANIMAUX. UNE OBSERVATION RENFORCEE DU COMPORTEMENT DES ANIMAUX SERA REALISEE POUR DETECTER TOUT SIGNE D’ATTEINTE NEUROLOGIQUE.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8-10 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet nécessite l’utilisation de femelles gestantes et seuls les nouveau-nés femelles seront gardés pour la suite des procédures expérimentales. Les nouveau-nés mâles pourront être utilisés pour d’autres dap (formation aux gestes techniques par exemple), permettant ainsi de diminuer l’utilisation du nombre d’animaux. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. L’ADMINISTRATION DE COMPOSES CHEZ DES NOUVEAU-NES NON SEVRES PEUT INDUIRE UN STRESS AUX ANIMAUX, UN MAL-ETRE POUR LA FEMELLE ALLAITANTE QUI PEUT REJETER LES NOUVEAU-NES. UNE MANIPULATION PARTICULIERE DES NOUVEAU-NES SERA REALISEE AFIN DE LIMITER AU MAXIMUM UN REJET POSSIBLE DE LA MERE (CHANGEMENT DE GANTS ENTRE CHAQUE CAGE, FROTTER LES GANTS SUR LA LITIERE AVANT DE MANIPULER LE PETIT POUR CONSERVER L’ODEUR, REMETTRE LE PETIT CONTRE SA MERE, GESTE RAPIDE, ATTENTION PARTICULIERE POUR MAINTENIR LE PETIT AU CHAUD…). AUGMENTATION DE L’OBSERVATION DES ANIMAUX SUITE A UNE ADMINISTRATION INTRACEREBROVENTRICULAIRE POUR VOIR SI DES TROUBLES NEUROLOGIQUES APPARAISSENT.

Choix des espèces

LE SOPK DEBUTANT A L’ADOLESCENCE LORS DE LA PUBERTE, LE MODELE INDUIT PAR UN INDUCTEUR CHIMIQUE SERA REALISE SUR DES ANIMAUX ADULTES OU PREPUBERES (3 SEMAINES). DE CE FAIT, NOUS UTILISERONS DES ANIMAUX AGES D’AU MOINS 3 SEMAINES (ANIMAUX LIVRES AVEC LEUR MERE CAR LE SEVRAGE NE SERA PAS TERMINE). POUR LE MODELE D’EXPOSITION AUX HORMONES, NOUS UTILISERONS DES FEMELLES GESTANTES DE 2-3 MOIS OU NON GESTANTES AGEES DE 4 SEMAINES MINIMUM (FEMELLES PREBUBERES OU ADULTES SELON LES MODELES), ET DES NOUVEAU-NES FEMELLES AGES DE 10 JOURS MINIMUM. SELON LE MECANISME D’ACTION ET LA CIBLE DU CANDIDAT MEDICAMENT, LE RAT ET/OU LA SOURIS POURRONT ETRE UTILISES. LE CHOIX DU MODELE UTILISE SERA DEPENDANT DES DEMANDES CLIENTS CAR LES MODELES SOPK INDUITS PAR UN INDUCTEUR CHIMIQUE OU PAR EXPOSITION HORMONALE SONT BIEN DECRITS DANS LA LITTERATURE CHEZ LES DEUX ESPECES. LE CHOIX DES MODELES DEPEND DE L’OBJECTIF DE L’ETUDE.

L'implant testé ici vise d'abord l'incontinence urinaire d'effort, puis le marché de la chirurgie esthétique, où le porteur chiffre à plusieurs millions les injections d'implants dermiques posées chaque année dans le monde. 72 rats femelles immunodéficients vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est opéré une fois sous anesthésie générale, reçoit quatre implants sous la peau, puis passe un scanner 3D sous anesthésie chaque semaine, le porteur annonçant une douleur de deux à trois jours et un risque accru de contamination lié à leur immunodéficience. Il attend de cet implant qu'il devienne "un leader sur ces marchés internationaux".

Objectifs

Les implants injectables sont utilisés pour traiter diverses pathologies, comme l'incontinence urinaire d'effort, qui touche 1 femme sur 5. Ils représentent également une part importante des interventions de chirurgie esthétiques (Ex : correction des rides, de cicatrices, etc.), et, dans une moindre mesure, de chirurgie oto-rhino-laryngologique (Ex : correction des cordes vocales) et de chirurgie dentaire (Ex : correction des gencives). Les implants injectables actuels provoquent une "réaction à corps étranger", c'est-à-dire une réaction inflammatoire chronique qui limite leur efficacité. De ce fait, les implants actuels ont une durabilité limitée, nécessitent des interventions chirurgicales répétées et sont associés à des complications telles que des douleurs chroniques, une migration et une érosion tissulaire. Nous proposons un nouvel implant injectable entièrement biologique qui évite la réaction à corps étranger. Cet implant est produit par des cellules humaines normales en laboratoire et n’est pas traité chimiquement, pour favoriser son intégration tissulaire. Notre hypothèse est que ce produit non vivant permettra la création d'un tissu vivant durable, sans inflammation chronique. Notre stratégie repose sur un matériau unique, entièrement biologique et d’origine humaine. Le but général de ce projet est d’apporter des preuves expérimentales qu’un implant injectable à base de ce matériau a le potentiel de devenir une solution chirurgicale alternative pertinente au traitement des diverses pathologies exposées précédemment.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à long terme du projet est un impact sociétal positif, en particulier pour la santé des femmes. Un implant injectable durable, évitant les complications et peu invasifs pour traiter, par exemple, l’incontinence urinaire d’effort améliorera la qualité de vie de millions de femmes. Cela entraînera également une réduction des coûts pour la société en limitant les complications et les réopérations. De plus, cet implant injectable entièrement biologique possède un fort potentiel commercial en ce qui concerne les applications en chirurgie esthétiques. Chaque année, des millions d’injections d’implants dermiques sont administrés dans le monde. Notre innovation a le potentiel de devenir un leader sur ces marchés internationaux car elle devrait fournir de meilleurs résultats (moins de complications et une efficacité plus durable) avec un changement minimal des pratiques chirurgicales.

Procédures

L’intervention est une chirurgie implantatoire. Chaque animal sera opéré une seule fois sous anesthésie générale (30 min maximum) et recevra 4 injections sous la peau. Après l’opération, une mesure du volume des implants par scanner 3D portable sous anesthésie générale est prévue de façon hebdomadaire. Cette expérimentation pourra être répétée (jusqu’à 3 fois), si nécessaire. C’est pourquoi, au total 72 animaux (3 x 24) sont impliqués dans ce projet.

Impact sur les animaux

Une douleur légère et de courte durée (2 à 3 jours maximum) est attendue suite à l’injection sous-cutanée des implants. Le risque d’infection au site d’implantation est très faible ainsi que la dégradation de l’état général de l’animal. L’immunodéficience des animaux augmente le risque de contamination de l’animal par un pathogène opportuniste. La manipulation (gestes de contention) de l’animal au cours de ce projet (changement des cages, injection sous-cutanée d’analgésique, imagerie sous anesthésie générale…) est également une source de stress pour l’animal (augmentation du rythme cardiaque, pression artérielle et niveau de cortisol).

Devenir

À l'issue de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés car les tissus doivent être récupérés et analysés pour étudier la réponse immunitaire.

Remplacement

Un des objectifs de ce projet est d’étudier la réponse immunitaire de l’hôte envers les différentes conditions expérimentales. À ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire.

Réduction

Avant l’expérimentation, des tests seront réalisés sur rats post-mortem (provenant de projets précédents) pour déterminer le volume d’implants à injecter pour suivre le changement de volume des tissus à l’aide d’une reconstitution 3D de la peau par scanner portable. Cette étape permet de réduire le nombre d’animaux utilisés pour la mise au point de cette étude. Par ailleurs, l’animal possède une taille suffisante pour permettre l’injection de plusieurs implants dans le même animal permettant de réduire le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de cette étude. Une étude pilote sera réalisée pour déterminer la variabilité des conditions expérimentales. À partir des résultats de cette étude pilote, une méthode statistique à l’aide d’un logiciel sera utilisée pour calculer le nombre minimal optimal d’animaux à utiliser pour obtenir des résultats statistiquement différents.

Raffinement

Pour tous les animaux, une période d’acclimatation (minimum 7 jours) est appliquée avant l’initiation de tout protocole. Une analgésie adaptée est réalisée en pré- et post-opératoire. L’intervention est réalisée en condition stérile, dans une salle fermée par du personnel formé. Lors de l’intervention, les animaux sont placés sous anesthésie générale gazeuse (avec tapis chauffant). Après l’intervention, l’animal est placé dans une cage individuelle dédiée au réveil, avant d’être replacé dans la cage initiale (par groupe de 2 à 4). Les animaux étant immunodéficients, l’environnement auquel ils sont exposés est stérile (cage, nourriture, eau, milieu d’enrichissement adaptés favorables au bien-être de l’animal, personnel, matériel de chirurgie…). Des soins post-opératoires adaptés ont été définis ainsi que des points limites et un arbre décisionnel. Les animaux sont surveillés quotidiennement suite à l’intervention (surveillance accrue) pour détecter des signes de souffrance et traités pour corriger la situation (par exemple : antiseptique local en cas d’infection).

Choix des espèces

Le recours à un modèle animal génétiquement modifié est nécessaire pour éviter le rejet de greffe car les implants injectables à tester sont d’origine humaine. Le modèle rongeur, le rat immunodéficient, a donc été sélectionné pour cette première étude. De plus, le rat est plus grand que la souris ce qui permet d’implanter plusieurs implants dans le même animal et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à cette expérimentation. À ce stade précoce du développement d’implants injectables biologiques et humains, ces expérimentations chez le rongeur permettront de valider un premier cahier des charges de l’implant injectable et d’éviter le recours à d’autres espèces de plus gros animaux. Des rats adultes (âgés de 6 semaines ou plus), femelles, seront utilisés dans ce projet car l’objectif à long terme de ce projet est le développement d’implants pour traiter, notamment, l’incontinence urinaire d’effort qui touche les femmes adultes.

7 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour que leurs organes soient collectés. Chacune peut subir jusqu'à quarante-sept prélèvements d'urine, vingt-trois prélèvements sanguins et six injections, avec un suivi allant jusqu'à douze mois. Le projet teste des transporteurs naturels censés délivrer un traitement à une population précise de cellules rénales, sur deux lignées de souris génétiquement modifiées. De ces dizaines de manipulations répétées, le porteur ne retient qu'une "douleur légère de courte durée" et un "stress léger de courte durée", et écrit que la souris en fait un "modèle de choix".

Objectifs

La maladie rénale chronique est une maladie où les reins, dont le rôle est de filtrer le sang, s’abîment lentement et silencieusement, entrainant une insuffisance rénale grave et obligeant les patients à suivre des traitements lourds et coûteux (dialyse, greffe de rein). En l’absence de traitement curatif, il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour empêcher/ralentir l’évolution vers l’insuffisance rénale. Des défauts dans différentes populations de cellules rénales sont à l’origine de ces maladies. Ce projet vise à tester de nouveaux transporteurs naturels capables de délivrer un traitement directement à une population spécifique de cellules rénales défaillantes, afin de restaurer leur fonctionnement et ralentir, voire d’empêcher, la progression de la maladie. Ces transporteurs seront d’abord validés sur des cellules rénales en laboratoire, puis testés sur deux modèles de souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie rénale humaine. Ces souris recevront une injection de transporteurs ou du placebo à différents stades de leur vie pour évaluer l’efficacité d’un traitement préventif, précoce et tardif. L’objectif est de découvrir de nouveaux transporteurs capables d’aider à protéger, voire réparer, la population de cellules rénales malades et d’empêcher la progression vers l’insuffisance rénale grave, évitant aux patients d’avoir recours à une greffe de rein.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est d’identifier des transporteurs ayant une plus grande spécificité pour les cellules défaillantes ciblées permettant de prévenir/retarder l’évolution de la maladie dans deux modèles de souris. Les résultats obtenus valideront l’utilisation de ces transporteurs comme nouvelle approche thérapeutique pour certaines maladies rénales chroniques, permettant sur le long terme d’éviter la greffe rénale aux patients et d’espérer étendre cette approche thérapeutique à d’autres maladies rénales chroniques impliquant d’autres populations de cellules rénales.

Procédures

Prélèvement de tissu caudal (animal vigile, 1 fois, 10 secondes), prélèvements d’urines (animal vigile, 47 fois au maximum, 30 secondes), prélèvements sanguins (animal vigile ou sous anesthésie générale, 23 fois au maximum, 30 secondes), injections (animal vigile ou sous anesthésie générale, 6 fois au maximum,

Impact sur les animaux

Pour le prélèvement de tissu caudal: douleur légère et localisée de courte durée. Pour la contention : stress léger de courte durée lié à la contention manuelle ou au tube de contention. Pour les injections: douleur légère de courte durée liée à la piqûre. Pour les prélèvements sanguins: douleur légère de courte durée liée à la piqûre. Pour le prélèvement d’urines: stress léger et de courte durée lié à la préhension.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et les organes seront collectés en post-mortem pour les analyses biologiques et moléculaires.

Remplacement

Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des souris. Le rein des mammifères et son fonctionnement en conditions normales et pathologiques (maladie rénale) sont bien caractérisés chez la souris avec de nombreux modèles génétiques, et de nombreuses études ont été publiées utilisant une approche similaire avec des transporteurs naturels sur des modèles murins, ce qui en fait un modèle de choix. Ce projet s’intéresse particulièrement à une population de cellules pour laquelle il n’existe à ce jour aucun équivalent in vitro (cultures de cellules rénales). Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire adéquat, il n’est pas possible de remplacer les modèles de souris utilisés dans ce projet par des modèles cellulaires rénaux in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour les lots expérimentaux a été ajusté en prenant en compte l’expérience acquise au laboratoire sur différents modèles de souris similaires et en intégrant les données de la littérature utilisant ces transporteurs. Ce nombre correspond au nombre minimal nécessaire pour chaque expérience, qui permet à la fois d'être assuré de la reproductibilité des phénomènes observés et d’avoir la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale des modèles employés et des protocoles . Les réponses aux traitements seront étudiés à la fois sur les mâles et les femelles et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués. L’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être animal tout au long de l’étude permet de surveiller l’état général de l’animal. Ainsi, les souris seront surveillées plusieurs fois par semaine lors des pesées par les personnes en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans un environnement enrichi adapté afin de diminuer leur stress.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés pour cette espèce animale. Enfin, la souris développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Pour le premier modèle (défaut rénal à la naissance), l’injection des transporteurs et du placebo sera effectuée dans les premiers jours de vie du souriceau (traitement à un stade précoce de la maladie) et les souris seront suivies jusqu’à l’âge adulte (6 mois), temps déjà étudié dans d’autres maladies rénales chroniques. Pour le second modèle (maladie rénale induite), l’induction de la maladie et l’injection des transporteurs et du placebo seront réalisées à l’âge adulte (entre 4 et 10 semaines) (traitement à des stades précoces et modérés de la maladie) et les souris suivies jusqu’à 12 mois.

Injectées dans l'abdomen à répétition, soumises à des frottis vaginaux et à des prises de sang hebdomadaires, 120 rattes Wistar subissent une stimulation ovarienne destinée à tester un anticorps censé augmenter le nombre d'ovocytes récoltés. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, et toutes les rattes seront tuées pour des prélèvements d'organes destinés à des analyses morphologiques, histologiques et endocriniennes. Le porteur signale un risque de passage de liquide vers la cavité abdominale, suivi par dosage de l'hématocrite, et un point limite fixé à 15 % de perte de poids qui déclenche la mise à mort. Il écrit par ailleurs que "La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés".

Objectifs

L’objectif du projet est d’améliorer la réponse à la stimulation ovarienne. En effet, les échecs de procréation in vitro sont souvent dus à une mauvaise réponse des patientes à la stimulation ovarienne lors de leur prise en charge en assistance médicale à la procréation. L'hormone anti-Müllérienne est un des principaux régulateur des différentes étapes de la folliculogénèse. C'est pourquoi, nous avons développé un anticorps bloquant anti AMH et nous avons montré qu’un traitement avec cet anticorps est capable d’induire une ovulation chez des rattes anovulantes. Nous prévoyons maintenant de tester si cet anticorps pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récoltés après une stimulation ovarienne chez des rates Wistar ovulantes.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patientes répondant mal à la stimulation ovarienne en procréation médicalement assistée. Actuellement, en cas de mauvaise réponse à la stimulation ovarienne, les doses de gonadotropines sont augmentées ainsi que le nombre de stimulations ovariennes mais souvent sans qu'une amélioration du nombre d’ovocytes récoltés soit observée. La seule alternative pour ces patientes est alors le don ovocytes.

Procédures

Les animaux subiront au maximum un prélèvement de sang par semaine d’un volume inférieur à 5 % du volume sanguin total soit 2 à 4 prélèvements en fonction du protocole. Les animaux seront traités par des injections intra-péritonéale d’anticorps. Nous privilégions cette voie d'administration car nos tests précédent avec des injections en sous cutanée donnaient de moins bons résultats. Ce type de traitement avec des injections répétées d’anticorps anti-AMH a déjà été réalisé sur une durée plus longue (1 mois) sans effet secondaire. La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés.

Impact sur les animaux

Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection intra péritonéale et les prélèvements sanguins, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins, le volume de sang prélevé à chaque prise de sang (2 maximum, 1 par semaine) sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).

Devenir

Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux analyses morphologiques, histologiques, endocriniennes ...

Remplacement

Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d'ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l'avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n'a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d'injection ce qui augmenterait le nombre d'animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.

Réduction

Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d'anomalies biologiques, les animaux concernés feront l'objet d'une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.

Choix des espèces

La rate Wistar est un modèle validé pour l’étude de la physiologie de la reproduction et de la stimulation ovarienne. Son cycle œstral court (4–5 jours), bien caractérisé et reproductible, permet une analyse fine des mécanismes hormonaux et folliculaires. Les profils endocriniens présentent des similitudes fonctionnelles avec ceux observés chez l’humain, conférant à ce modèle une bonne pertinence biologique. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et l’environnement systémique nécessaires à l’étude de la réponse à une stimulation hormonale. L’anticorps anti-AMH utilisé a été développé et validé chez le rat. Son utilisation chez la souris exposerait à un risque de réponse immunitaire et nécessiterait des études de validation supplémentaires, impliquant l’utilisation d’animaux additionnels, ce qui serait contraire au principe de Réduction. Femelles adultes de 2 à 4 mois, correspondant au début de l’âge adulte lorsque le stock d’ovocyte est encore important.