Troubles immunitaires

Les souris reçoivent jusqu'à onze injections dans l'abdomen, ou une injection dans la veine située derrière le globe oculaire sous anesthésie gazeuse, et subissent jusqu'à douze prises de sang à la mâchoire. 600 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes, dont la rate, soient prélevés. Le porteur indique que la réaction immunitaire déclenchée entraîne une altération de leur état général, pour produire des lignées de cellules sécrétant des anticorps monoclonaux. Le résumé ne nomme aucune cible ni aucune application, et le porteur présente l'effectif comme "une estimation des projets à venir".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.

Bénéfices attendus

Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

[MODIFICATION] Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection, 11 INJECTIONS MAXIMUM SUR L'ENSEMBLE DU PROTOCOLE) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (12 AU MAXIMUM) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.

Une partie des souris porte un déficit immunitaire, le déficit en DOCK8, qui les expose selon le porteur à des manifestations allergiques plus fréquentes et plus sévères, et à des infections par des virus et des champignons. 1 056 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour déclencher un eczéma, leur peau rasée est arrachée en surface au ruban adhésif ou enduite de calcipotriol, puis couverte d'un patch de staphylocoque, six fois en douze jours, ce qui provoque démangeaisons, lésions de grattage et œdème. Des souriceaux sont aussi rasés et enduits chaque jour dès deux semaines d'un émollient enrichi en sucre du lait maternel avant de subir ce protocole. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour que leurs organes et fluides soient analysés.

Objectifs

La dermatite atopique est une allergie, touchant 15 % des enfants en Europe. Elle est associée à une barrière et un microbiote cutané altéré et à un dysfonctionnement du système immunitaire. 70 % des enfants guérissent naturellement et 30 % souffrent de symptômes persistants avec un risque accru d’autres allergies (asthme, rhinite ou allergies alimentaires : marche atopique). Il n’existe pas de stratégies préventives efficaces . Plusieurs essais cliniques ont appliqué des émollients sur la peau des bébés pour renforcer la barrière cutanée Ils ont observé que les émollients trilipidiques ne prévenaient pas la dermatite atopique mais amélioraient l'intégrité de la barrière cutanée en réduisant la perte d'eau à travers la peau. Même si les émollients renforcent la barrière cutanée, cette approche seule semble insuffisante pour prévenir la dermatite atopique. Les stratégies thérapeutiques qui ciblent la barrière cutanée, mais aussi le microbiote et le système immunitaire pourraient offrir des approches plus efficaces pour prévenir la dermatite atopique. Certains sucres du lait maternel (oligosaccharides), peuvent moduler le microbiote intestinal en favorisant l'émergence de bactéries bénéfiques et en réduisant l'abondance des bactéries nocives. Ils peuvent renforcer la barrière intestinale et induire un environnement immunitaire tolérogène. Nous avons démontré chez la souris gestante l’efficacité d’une supplémentation anténatale avec un sucre du lait maternel sur la disparition complète des symptômes de l'allergie alimentaire chez les petits. Notre hypothèse est que l'ajout de sucres du lait maternel aux émollients pourrait constituer une stratégie efficace pour cibler le microbiote cutané, le système immunitaire et la barrière cutanée et, par conséquent, pour prévenir l'apparition de la dermatite atopique . Enfin nous étudierons la survenue de la dermatite atopique et de l’allergie alimentaire sur un modèle de souris avec un déficit immunitaire (déficit en DOCK8). En effet ce déficit immunitaire induit la survenue encore plus fréquente et plus sévère de manifestations allergiques et est un modèle de choix pour l’étude de la marche atopique.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier un modèle de dermatite atpique induit par une combinaison d’altération de la barrière cutanée (mécanique par tape stripping ou inflammatoire par le calcipotriol) et de modification du microbiome par ajour de staphylocoque doré ou epidermidis, d’étudier l’efficacité d’un traitement préventif par l’application d’un émollient enrichi avec un oligosaccharides du lait maternel, et enfin d’étudier l’impact d’un déficit immunitaire sur la survenue de la dermatite atpique dans ce modèle.

Procédures

- pour la validation de nos modèles de dermatite atopique, tous les gestes seront réalisés sous anesthésie : rasage ( 2 minutes) , tape stripping (3 minutes), application du calcipotriol et patch staphylocoque ( 5 minutes). Cela sera réalisé tous les 2 jours pendant 12 jours, soit 6 fois par souris. La mesure de la perte en eau transcutanée sera réalisée au début et à la fin du protocole (1 minute), soit 2 fois par souris. - Pour l’étude de la prévention de la dermatite atopique : prise de poids tous les 4 jours pour les femelles gestantes (30 secondes par souris,5 fois par souris), pour les souriceaux : anesthésie puis rasage et application journalière d’un traitement topique dorsale (30 secondes) pendant 14 jours, soit 14 fois par souriceaux. Le protocole d’induction de la dermatite atopique sera ensuite réalisé comme décrit ci-dessus.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la gêne liée à la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages les symptômes liées à la mise en place de la dermatite atopique (démangeaisons, rougeurs, lésions de grattage, œdème), inflammation liée au staphylocoque les anesthésies gazeuses peuvent induire une baisse de temperature, une baisse de tension, une baisse de la fréquence respiratoire, ou une baisse de la concentration en oxygene. Les souris atteintes du déficit immunitaire sont susceptibles d’avoir plus de manifestations allergiques, et sont plus à risques d’infections notamment induites par les virus et les champignons.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczema atopique ou de l’allergie alimentaire et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique , il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales (peau, intestin, poumon).

Réduction

En effectuant un test de puissance sur un logiciel en ligne de statistiques, nous avons besoin de 12 animaux par groupes afin d’obtenir un score de sévérité de l'eczema atopique (three item severity score (TIS) statistique et avoir assez de matériel biologique pour effectuer des coupes histologiques et des mesures des biomarqueurs immuns de la dermatite atopique dans la peau et dans le serum. De plus, ce nombre d'animaux permettra d'obtenir des résultats exploitables pour la réalisation d'analyses statistiques

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur en détectant rapidement les signe de souffrance et les points limites afin de mettre en place les mesures adaptées. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hebergées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la dermatite atpique, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Nous souhaitons valider ce modèle murin de dermatite atopique sur deux lignées différentes (une lignée de souris noires C57BL/6 et une lignée de souris blanches Balb/C ) car ces deux lignées ont des propriétés différentes notamment concernant les réponses inflammatoires de type 2. De plus les souris avec un deficit en DOCK8 sont issues de la lignée C57BL/6 Les souris seront âgées de 4 semaines pour les procédures 1 et 3 comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la dermatite atpique chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie. Pour la procédure 2, Les souris blanches femelles reproductrices seront âgées de 6 semaines et les mâles reproducteurs seront âgés de 10 semaines car c’est à ces âges là que nous avons observé la meilleure efficacité de reproduction. L’application topique des émollients se fera chez le souriceau de 2 semaines pour reproduire les applications topiques d’émollients chez les bébés dès le plus jeune âge. La dermatite atpique sera induite chez les souriceaux âgés de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature

Porteuses de gènes humains, ces souris développent dès douze semaines une maladie rénale auto-immune, avec du sang et des protéines dans les urines, puis subissent des prises de sang à la joue deux fois par mois, des injections dans la veine de la queue, des gavages et, pour un petit groupe, une biopsie du rein sous anesthésie générale. 492 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des anticorps, des ARN messagers et des nanoparticules, dans des études sollicitées par l'industrie pharmaceutique. Le porteur affirme qu'"Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger", celle-là même qu'il décrit chez ces souris. Toutes sont tuées après chaque traitement pour analyser l'inflammation de leurs reins.

Objectifs

Nous disposons d'un modèle unique dans le monde, le modèle de souris avec des gènes humains exprimant des anticorps spécifiques et un récepteur pour les anticorps spécifiques. Ces souris développent une maladie auto-immune rénale (c'est à dire qui résulte d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s'attaquer à l'organisme) et ainsi cause l'accumulation anormale des anticorps dans les reins avec de la protéinurie (présence de protéines dans les urines) et d'hématurie (présence de sang dans les urines) à partir de 12 semaines. Comme il n'existe pas de traitement curatif pour cette maladie, notre laboratoire cherche à développer des nouveaux traitements. Nous avons généré cinq anticorps anti-inflammatoires et l'industrie pharmaceutique nous a sollicité pour des études sur l'animal basées sur nos recherches précèdentes . En effet, nous avons démontré une belle efficacité d'une enzyme, une protéine capable de couper les anticorps et ainsi réduire l'inflammation liée à la maladie. Le problème était que comme il s'agit d'une protéine d'origine bactérienne, il y a une réponse immunitaire contre cette enzyme , des anticorps anti-enzymes bloquant son activité. L'objectif de notre étude est de traiter les souris exprimant la maladie avec les anticorps anti-inflammatoires, des ARN messagers (molécule capable d'induire la production d'une protéase qui est une enzyme (=protéine) capable de cliver les anticorps responsable de la maladie) ou avec des nanoparticules (particules de petite taille) permettant d'induire une tolérance au traitement avec la protéase recombinante d'origine bactérienne. Ces traitements sont bien tolérés sans aucun dommage chez la souris (résultats obtenus au laboratoire). L'objectif est d'évaluer l'action de ces traitements sur les anticorps circulants, sur les dépôts rénauxd'anticorps, l'inflammation tissulaire rénale et sur la protéinurie.

Bénéfices attendus

La néphropathie (ou maladie de Berger) est l'une des premières causes d'insuffisance rénale en France et dans le monde. Cette maladie est causée par une accumulation anormale d'anticorps dans les reins. Il n'existe actuellement pas de traitement spécifique de cette maladie, les patients n'ont que des traitements de suppléance (dialyse, greffe). Le développement d'un traitement pourrait éliminer la cause de la maladie et ainsi pouvoir proposer un traitement curatif. Les traitements proposés chez les souris qui développent la maladie seront une étape pré-clinique cruciale avant le passage à l'homme pour des essais cliniques.

Procédures

Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les anticorps anti-inflammatoires : les souris seront soumises à des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (deux fois par mois). Des prélèvements d'urines (2 fois par mois) les prélèvements seront faits sur animaux non anesthésiés, lors de l'immobilisation de la souris, le jet d'urine est en général spontanée . Des injections d'anticorps par voie intraveineuse (une fois par semaine pendant 1 mois) seront faites principalement par la veine caudale qui est située sur la queue de l'animal. Le gavage par une sonde gastrique (1 fois par mois pendant 1 mois). Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les ARNmessagers (ARNm) : les souris seront soumises à des injections d'ARNm (une molécule retrouvée dans toutes les cellules qui sera traduite en protéine) principalement par la veine caudale (veine sur la queue) une fois par semaine pendant un mois puis une fois par mois pendant 6 mois. Les prélèvements de sang (au niveau de la veine de la joue) se feront à J0 puis une fois par mois pendant 6 mois, en même temps que les urines. Afin d'évaluer la traitement de la maladie par les nanoparticules : les souris seront soumises à des injections par voie intraveineuse (veine de la queue) 3 fois pendant 1 mois puis à des prélèvements sanguins et d'urines à J0, J1 et J7. De plus, une fois la dose et la voie optimale de traitement déterminée pour les anticorps et l'ARNm, une biopsie rénale sera faite, ce qui consite à prelever un petit fragment de tissu rénal (1mm) sous anesthésie générale avant traitement sur un petit groupe de souris afin de confirmer définitivement l'efficacité du traitement à la dose optimale.

Impact sur les animaux

Les traitements donnés sont très bien tolérés et bénéfiques pour cette maladie de Berger. Les seules nuisances attendues sont celles liées à la biopsie rénale, aux injections intraveineuse des produits, au gavage et aux prélèvements de sanguins et d'urines. Ceux-ci pourraient occasionner un stress et un inconfort pour la souris de courte durée lors de la contention et de l'injection et de quelques jours pour la biopsie. Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger.

Devenir

A l'issue de chaque traitement, les animaux seront euthanasiés et des analyses complementaires post mortem seront réalisées au niveau des reins afin d'évaluer l'inflammation rénale.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un organe en entier dans le cas du developpement de la nephropathie. Le travail à l'échelle de l'organisme en entier est nécessaire, compte tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire et de la fonction rénale. Il est indispensable de travailler sur l'organisme entier, vivant et proche de l'homme pour pouvoir ensuite envisager un traitement curatif chez l'homme.

Réduction

Nous avons estimé qu'il faudra 6 animaux par groupe afin obtenir des résultats statistiquement exploitables et mener à bien notre projet. En effet, nos expériences précèdentes nous ont permis de préciser ce nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Dans le but de répondre à la loi des 3R (Raffiner) et dans un souci de bien-être animal de l'enrichissement (coton, Kraft, tunnels) sera mis en place pour les animaux tout au long de l'expérience pour que les animaux puissent faire des nids. Les souris sont placées sur des portoirs ventilés par groupe de 5 individus. L'environnement , la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours par le personnel technique. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour anticiper toute douleur ou angoisse infligée aux animaux. Les gestes experimentaux seront effectués par une personne compétente. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés 1 fois par semaine par l'expérimentateur ( état général, comportement et pesées). Un analgésique sera administré si l'état de l'animal le nécessite et toutes les 12heures et de façon systématique pendant 3 jours après chirurgie. Si l'animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour développer la maladie de Berger car elle n'exprime pas la maladie, ce qui permet après transgénese c'est à dire la fait d'incorporer des gènes humains dans son génome d'induire et d'exprimer cette maladie en question chez ces souris transgéniques. De plus, son comportement et sa génétique sont largement connus ce qui nous permet une meilleure évaluation et prise en charge de son bien-être tout au long du projet. Il est donc indispensable pour nous d'utiliser ce modèle de souris transgéniques exprimant la maladie pour évaluer l'action et l'efficacité des traitements que nous proposons. A 12 semaines d'âge car c'est à cet âge là que les souris développent la maladie rénale.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, leur dos est épilé à la crème dépilatoire puis irrité par une série de collages et décollages de ruban adhésif, pendant une quinzaine de minutes, avant des injections de molécules et jusqu'à un prélèvement sanguin par semaine. L'inflammation cutanée ainsi provoquée entraîne des démangeaisons qui se traduisent par un grattage plus fréquent, et le résumé prévoit de surveiller l'apparition d'automutilation. La rubrique sur le remplacement décrit des cultures cellulaires et des peaux reconstruites déjà employées en amont, pour conclure qu'aucune méthode alternative validée ne reproduit l'ensemble des mécanismes recherchés.

Objectifs

L'inflammation cutanée est impliquée dans de nombreuses pathologies dermatologiques aiguës et chroniques. Malgré les progrès réalisés dans leur prise en charge, ces maladies restent responsables d'une morbidité importante et nécessitent le développement de nouvelles approches thérapeutiques capables de contrôler efficacement la réponse inflammatoire tout en favorisant la restauration de la fonction barrière de la peau. Le modèle d' « irritation de la peau » est un modèle expérimental reconnu permettant d'induire une altération contrôlée et reproductible de la barrière cutanée par l'application répétée d'un adhésif sur la peau. Cette procédure provoque une augmentation transitoire de la perméabilité épidermique et déclenche une réponse inflammatoire locale. Ce modèle reproduit plusieurs mécanismes physiopathologiques observés au cours des maladies inflammatoires cutanées associées à une altération de la fonction barrière. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer l'efficacité de molécules candidates susceptibles de moduler la réponse inflammatoire induite par l'altération de la barrière cutanée. Les effets des traitements seront évalués par des observations cliniques, des analyses histologiques, des dosages de molécules inflammatoires ainsi que par la caractérisation des populations cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire locale. Ce modèle permettra de déterminer si les molécules étudiées sont capables de limiter l'inflammation cutanée, d'accélérer la restauration de la barrière épidermique et de favoriser le retour à un état tissulaire normal. Les résultats obtenus contribueront à l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires de la peau. L'utilisation de ce modèle est justifiée par l'absence de méthodes alternatives permettant de reproduire l'ensemble des interactions complexes entre la barrière cutanée, les cellules immunitaires, les cellules résidentes de la peau et la circulation sanguine au sein d'un organisme vivant. Toutes les procédures expérimentales seront conçues conformément au principe des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement), afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de minimiser leur douleur, leur stress et leur inconfort.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse inflammatoire cutanée consécutive à une altération de la fonction barrière de la peau. Il contribuera à identifier les voies biologiques modulées par les molécules étudiées et à mieux caractériser leur mode d'action dans un contexte d'inflammation cutanée. Le modèle expérimental utilisé constitue un outil pertinent pour évaluer, dans un organisme vivant, l'efficacité de nouvelles molécules capables de limiter l'inflammation, de favoriser la restauration de la barrière cutanée et de promouvoir le retour à une peau normale. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les candidats thérapeutiques les plus prometteurs en vue de leur développement préclinique. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques destinées au traitement de maladies inflammatoires cutanées caractérisées par une altération de la barrière épidermique, telles que la dermatite atopique, les dermatites de contact ou d'autres affections inflammatoires de la peau. Les connaissances acquises pourront également améliorer la compréhension des mécanismes de résolution de l'inflammation et être utiles au développement de traitements ciblant d'autres pathologies inflammatoires. Enfin, les données générées permettront d'enrichir les connaissances fondamentales sur les interactions entre la barrière cutanée, les cellules et pourront servir de base à de futurs projets de recherche visant à développer des approches thérapeutiques plus efficaces et mieux ciblées.

Procédures

Au cours des expérimentations les animaux subiront une épilation avec une crème dépilatoire suivi d'une irritaion de la peau grace à une serie de collage et decollage de ruban adhésif, tout ceci sous anesthésie durant une quinzaine de minutes. Les animaux subiront des injections de substance. Les animaux, au cours de la procédure pourront subir des prélèvement de sang après anesthésie gazeuse à l’isoflurane au maximum une fois par semaine.

Impact sur les animaux

L'irritation de la peau induit une altération localisée et transitoire de la barrière cutanée. Cette procédure entraîne le développement d'une réaction inflammatoire locale. Les animaux peuvent présenter un inconfort modéré ainsi qu'un prurit pouvant se traduire par un toilettage ou un grattage plus fréquent de la zone concernée. Les administrations des molécules expérimentales pourront entraîner un stress transitoire lié à la contention ainsi qu'une gêne ponctuelle au site d'administration, en fonction de la voie utilisée (application cutanée, injection ou gavage). Les prélèvements biologiques, lorsqu'ils sont réalisés sur animal vivant, pourront provoquer un inconfort bref et limité. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique régulière comprenant l'évaluation de l'état général, du comportement, du poids corporel et de l'évolution des lésions cutanées. Une attention particulière sera portée à l'apparition de signes d'inconfort, d'automutilation ou de lésions cutanées excessives. En cas d'aggravation des lésions ou d'altération de l'état général répondant aux critères d'arrêt définis dans le protocole, l'animal sera retiré de l'étude et euthanasié selon les procédures réglementaires. Compte tenu du caractère localisé et réversible de l'inflammation induite ainsi que des mesures de surveillance et de raffinement mises en œuvre, les nuisances attendues sont limitées dans le temps et compatibles avec une procédure de gravité modérée.

Devenir

A l'issu de la procédure c'est à dire entre 2 et 10 jours après l'induction de la pathologie, tous les animaux seront mis à mort. Après vérification du décès des animaux (coeur non battant), certains organes tels que la rate, les ganglions et la peau lésée seront prélevés afin de réaliser des études complémentaires et définir les mécanismes cellulaires mis en jeu.

Remplacement

Le projet s'inscrit dans une démarche visant à appliquer le principe de Remplacement en recourant aux méthodes alternatives chaque fois qu'elles permettent de répondre aux objectifs scientifiques. En amont des expérimentations in vivo, les molécules candidates sont sélectionnées et caractérisées à l'aide d'approches in vitro, notamment sur des cultures cellulaires et, lorsque cela est pertinent, sur des modèles reconstruits de peau. Ces modèles permettent d'évaluer leur cytotoxicité, leurs effets sur certaines voies de signalisation inflammatoires et leurs propriétés biologiques. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les différentes cellules de la peau, les cellules immunitaires circulantes, le système lymphatique et la circulation sanguine. Elles ne permettent pas non plus d'étudier le recrutement des cellules immunitaires, la dynamique de la réponse inflammatoire, la restauration de la barrière cutanée ni les effets pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des molécules administrées. À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative validée permettant de reproduire l'ensemble de ces mécanismes physiologiques dans un système non animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet sera limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques tout en garantissant la robustesse et la validité statistique des résultats. Les effectifs par groupe expérimental seront déterminés sur la base de l'expérience acquise par l'équipe avec ce type de modèle, des données de la littérature et, lorsque cela est possible, de calculs de puissance statistique prenant en compte la variabilité des paramètres étudiés. Le modèle d'irritation de la peau est un modèle reproductible, permettant de limiter la variabilité expérimentale et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour mettre en évidence un effet biologique des traitements évalués. La randomisation des animaux entre les groupes expérimentaux et l'utilisation de protocoles standardisés contribueront également à améliorer la qualité des données obtenues. Plusieurs paramètres (évaluation clinique, analyses histologiques, dosages de biomarqueurs et analyses immunologiques ou moléculaires) seront mesurés à partir des mêmes animaux, afin de maximiser les informations obtenues pour chaque individu et d'éviter la constitution de cohortes supplémentaires. Lorsque cela sera scientifiquement justifié, des groupes témoins communs seront utilisés entre différentes séries expérimentales réalisées dans des conditions identiques, afin d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Les expériences seront planifiées de manière à limiter les répétitions inutiles et seules les molécules ayant démontré un potentiel lors des études préalables seront évaluées in vivo. L'ensemble de ces mesures permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés tout en assurant la qualité scientifique et la reproductibilité des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages stériles avec de la nourriture de la litière et de l’eau stérile dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec un enrichissement du milieu adapté à leurs besoins physiologiques et comportementaux (matériel de nidification, abri et objets d'enrichissement). Une période d'acclimatation d'au moins une semaine sera respectée avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié au changement d'environnement. Les animaux seront manipulés par un personnel formé et compétent, selon des techniques visant à réduire le stress associé à la contention. Les procédures expérimentales seront réalisées dans un environnement calme et selon des protocoles standardisés afin de limiter leur durée et leur variabilité. L'altération de la barrière cutanée sera réalisée sous anesthésie à l’isoflurane et limitée à une zone restreinte du dos et réalisée selon une procédure reproductible, en utilisant le nombre minimal de tape strips nécessaire pour obtenir le niveau d'inflammation recherché. Les traitements administrés respecteront les volumes maximaux recommandés et les bonnes pratiques d'expérimentation animale. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique régulière tout au long de l'étude. Seront notamment évalués l'état général, le comportement, le poids corporel, l'aspect du pelage ainsi que l'évolution des lésions cutanées (érythème, desquamation, œdème). Une attention particulière sera portée aux signes de prurit important, de grattage excessif ou d'automutilation. Tout animal présentant une altération importante de son état général, une perte de poids supérieure aux seuils définis dans le protocole, des lésions cutanées sévères, des signes de douleur ou de détresse persistants, ou toute autre atteinte incompatible avec la poursuite de l'étude, sera retiré de l'expérimentation et mis à mort selon une méthode réglementaire. Les expérimentateurs seront formés à la reconnaissance des signes précoces de douleur et de mal-être afin d'assurer une prise en charge rapide des animaux. L'ensemble de ces mesures de raffinement permettra de limiter les nuisances induites par les procédures expérimentales tout en garantissant l'obtention de données scientifiques de qualité.

Choix des espèces

La souris est le modèle expérimental de référence pour l'étude des mécanismes de l'inflammation cutanée et l'évaluation préclinique de nouvelles stratégies thérapeutiques. Son système immunitaire est largement caractérisé et présente de nombreuses similitudes fonctionnelles avec celui de l'Homme, permettant l'étude des interactions complexes entre les cellules immunitaires et les cellules résidentes de la peau au cours de la réponse inflammatoire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris jeunes adultes, âgées de 6 à 12 semaines au début de la procédure expérimentale. Ce stade de développement a été retenu car le système immunitaire est pleinement mature et la structure de la peau est stabilisée, permettant d'obtenir une réponse inflammatoire reproductible après altération de la barrière cutanée. L'utilisation d'animaux adultes limite également les variations physiologiques observées au cours de la croissance ou liées au vieillissement, susceptibles d'influencer les paramètres étudiés.