Diagnostic des maladies

Jusqu'à huit séances d'imagerie de 45 minutes sous anesthésie, avec pose d'un cathéter dans la queue pour injecter l'agent de contraste : 1 092 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Leur arthrose ou leur arthrite est provoquée par une injection dans le genou ou par une chirurgie de 20 minutes, pour valider des agents de contraste censés rendre visible l'inflammation articulaire. Le porteur choisit les souris Swiss pour leurs "veines plus larges" et les C57BL/6J pour la reproductibilité de leurs lésions articulaires. Il affirme que ces procédures présentent "un caractère de stricte nécessité" et que seul un "organisme entier" permet de suivre la distribution des agents.

Objectifs

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative caractérisée par la destruction progressive du cartilage, un remodelage de l'os sous-chondral et une inflammation synoviale. Ces altérations, qui touchent l’ensemble de l’articulation, entrainent notamment des douleurs chroniques et une diminution de la mobilité. En préclinique, si l'étude de la physiopathologie arthrosique est bien établie, peu de techniques permettent un suivi longitudinal non invasif, pourtant indispensable pour évaluer l'efficacité de traitements potentiels. De plus, les techniques d’imageries actuelles en pratique clinique se limitent globalement à une évaluation de la destruction articulaire, mais ne sont pas en mesure d’évaluer la participation inflammatoire à un temps donné, ce qui limite les propositions thérapeutiques et ne permet pas de proposer une médecine personnalisée. L’objectif de ce projet est donc de valider une nouvelle approche d’imagerie moléculaire non invasive permettant de visualiser l’inflammation articulaire dans des modèles murins d’arthrose. Chez l'homme, il a été démontré que l'inflammation synoviale est marquée par une surexpression de marqueurs de l’inflammation des vaisseaux sanguins et de la membrane synoviale. Ces protéines sont impliquées dans le recrutement de cellules immunitaires induisant une inflammation de l’articulation. Les taux circulants de certaines de ces protéines sont d'ailleurs reconnus comme biomarqueurs prédictifs du risque de chirurgie de la hanche et du genou en cas d’arthrose sévère. L’imagerie permettra de visualiser l’inflammation grâce à des agents de contraste magnétiques ciblant les protéines d’adhésion cellulaire. Cette stratégie permettra de caractériser la dynamique inflammatoire au cours de différentes formes d’arthrose expérimentale, et d’évaluer la possibilité de proposer un traitement ciblé (anti-inflammatoire ou anti-arthrosique selon la prédominance ou non de l’inflammation). Collectivement, ces résultats permettraient une approche non invasive, translationnelle, permettant in fine de mieux appréhender la maladie arthrosique chez les patients pour leur proposer le traitement le plus adapté.

Bénéfices attendus

Cette étude serait la première à démontrer la possibilité d'imager l'inflammation articulaire de manière aussi précise in vivo, dans des modèles murins d’arthrose et d'arthrite. La validation de cette technique fournirait une méthode d'étude non invasive permettant un suivi longitudinal et diminuerait significativement le nombre d'animaux nécessaires aux études précliniques. De plus, les produits de contraste sont développés de manière à être biocompatible et biodégradable, afin de pouvoir être utilisés en clinique. De cette manière, cette méthode permettrait de faciliter le diagnostic de l’arthrose et d’autres maladies inflammatoires ainsi que l’évaluation de l’efficacité des traitements. L’utilisation d’agents de contraste biodégradables renforcent la possibilité de translation clinique.

Procédures

Les animaux seront exposés à des pesées 1 fois par semaine (durée inférieure à 5 minutes) ; injection dans le genou (environ 2 min) pour l’induction d’arthrite ou d’arthrose chimique et pour l’administration de traitements ; une chirurgie rapide pour l’induction de l’arthrose mécanique (environ 20min) pratiquée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie (environ 45 minutes). Les traitements anti-arthrosiques auront lieu soit par injection soit par prise orale 1 à 5 fois par semaine selon le protocole. L’ensemble des souris passeront maximum 1 fois par semaine en imagerie sur une période de 8 semaines.

Impact sur les animaux

L’induction d’arthrite ou d’arthrose (modèle chimique) n'entraîne pas de souffrance particulière à l’animal (pas de boiterie ou de douleur particulière). L’induction de l’arthrose chirurgicale peut entraîner des douleurs liées à l’ouverture des différents plans (peau et muscle). Après les différents protocoles d’induction de l’arthrose, aucune douleur n’est attendue après 24h. Les examens d’imagerie se dérouleront sous anesthésie générale des animaux. Cependant, la pose du cathéter veineux dans la queue pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir procéder à l’analyse des tissus.

Remplacement

Les tests in vitro réalisés sur des lignées de cellules ne permettent pas d’évaluer l’action des agents de contraste dans un organisme entier, leur distribution dans l’organisme, ni leur capacité à détecter une inflammation articulaire dans un contexte physiopathologique réaliste. Les modèles in vitro ne permettent pas non plus de reproduire fidèlement la complexité de l’articulation, qui repose sur des interactions entre plusieurs tissus (os, cartilage, synoviale, endothélium) et sur une composante mécanique essentielle dans l’apparition et l’évolution de l’arthrose. Le recours au modèle murin permet d’intégrer ces différents paramètres au sein d’un organisme entier. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet présentent un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives sans animaux permettant d’obtenir un niveau d’information équivalent.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide de tests statistiques de puissance afin d’utiliser un effectif suffisant pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en évitant l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux. Le recours à l’imagerie permet un suivi non invasif des mêmes animaux au cours du temps, réduisant ainsi le nombre total de souris nécessaires par rapport à des approches nécessitant des mises à mort à différents temps. De plus, la validation de l’imagerie de l’inflammation permettra sa réutilisation dans d’autres projets portant sur les maladies inflammatoires, permettant à terme une réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce domaine de recherche.

Raffinement

Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites spécifiques ont été définis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l’administration d’un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus maximum par cage, avec un accès à la nourriture et à l’eau à volonté et du matériel de nidification et un igloo.

Choix des espèces

Pour les expériences de validation des agents de contraste dans un modèle d’arthrite, des souris Swiss seront utilisées. Cette souche est particulièrement adaptée car elle présente un accès vasculaire facile facilitant la pose du cathéter (veines plus larges) et le modèle d’arthrite sur cette souche est bien décrit dans la littérature. Pour les expériences d’arthrose, des souris C57BL/6J seront utilisées, car cette souche est largement utilisée et validée dans les modèles murins d’arthrose, notamment pour tester l’efficacité de nouveaux traitements anti-arthrosiques. Elle présente une bonne reproductibilité des lésions articulaires et des réponses inflammatoires. L’ensemble des souris SWISS et C57BL/6J seront âgées de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement correspond à des animaux adultes, en fin de croissance.

3 porcs femelles de 60 à 70 kg sont mis à jeun douze heures, puis anesthésiés une heure pour qu'une capsule soit placée par endoscopie dans leur tube digestif, avant 72 heures seuls en loge. Nouveau jeûne, puis jusqu'à dix heures d'anesthésie continue : cathéter dans la veine de l'oreille, sonde urinaire posée à travers le pubis, seconde capsule, sonde de manométrie et scanners. Ces procédures, d'un niveau de souffrance modéré, préparent un capteur de transit digestif destiné à l'humain, présenté comme complémentaire d'une solution commerciale existante. Les trois porcs sont tués sous anesthésie à l'issue, sans reprise de conscience.

Objectifs

Ce projet constitue une étape dans le développement d’un dispositif autonome visant à mesurer en temps réel la vitesse du transit digestif chez le patient humain, en utilisant le porc comme modèle translationnel. Ce système est complémentaire d'une solution commerciale déjà existante, qui permet une visualisation digestive mais nécessite une interaction humaine pour définir des points de référence. L’objectif spécifique de l’étude proposée est DE DETERMINER SI LE SIGNAL ENREGISTRE PAR LA CAPSULE VARIE EN FONCTION DE SA POSITION DANS LE SYSTEME DIGESTIF (ESTOMAC, INTESTIN, COLON…). ELLE VISE EGALEMENT A DETERMINER SI CES VARIATIONS SONT LIEES AUX MOUVEMENTS NATURELS ET CYCLIQUE DU SYSTEME DIGESTIF..

Bénéfices attendus

DANS LE CADRE DE CETTE ETUDE PRELIMINAIRE, LES BENEFICES ATTENDUS EN TERMES DE CONNAISSANCES SONT DE MIEUX EVALUER LE FONCTIONNEMENT DU DISPOSITIF IN VIVO, NOTAMMENT EN DETERMINANT SI LE SIGNAL ENREGISTRE PAR LA CAPSULE VARIE EN FONCTION DE SA POSITION DANS LE SYSTEME DIGESTIF ET S’IL PEUT ETRE MIS EN RELATION AVEC LES SIGNAUX ELECTRIQUES LIES AU PERISTALTISME DIGESTIF A PLUS LONG TERME, CE DISPOSITIF, BASE SUR L’INGESTION DE CAPTEURS MINIATURES, POURRAIT PERMETTRE DE MESURER EN TEMPS REEL LE TRANSIT DIGESTIF CHEZ L’HUMAIN ET DE DETECTER DE MANIERE NON INVASIVE DES ANOMALIES DU TRANSIT SUSCEPTIBLES D’INDIQUER DES PATHOLOGIES DIGESTIVES. CE SYSTEME EST COMPLEMENTAIRE D’UNE SOLUTION COMMERCIALE DEJA EXISTANTE, QUI PERMET UNE VISUALISATION DIGESTIVE MAIS NECESSITE UNE INTERACTION HUMAINE POUR DEFINIR DES POINTS DE REFERENCE. UNE FOIS VALIDEE, CETTE TECHNOLOGIE POURRAIT EGALEMENT ETRE UTILISEE CHEZ LE PORC DANS UN CONTEXTE EXPERIMENTAL, NOTAMMENT POUR DES ETUDES DE NUTRITION, OU CLINIQUE. SON UTILISATION POURRAIT A TERME CONTRIBUER AU RAFFINEMENT DES METHODES DE MESURE DU TRANSIT DIGESTIF, EN PERMETTANT DE S’AFFRANCHIR DE L’UTILISATION D’ANIMAUX OPERES ET/OU DE MARQUEURS INDIGESTIBLES.

Procédures

Le projet prévoit l’utilisation de trois porcs femelles. Chaque animal sera soumis à une procédure unique, ORGANISEE EN DEUX ETAPES SUCCESSIVES ET S’ETALANT SUR UNE DUREE TOTALE D’ENVIRON 4 JOURS. LA PREMIERE ETAPE COMPREND UNE PERIODE DE JEUNE DE 12 HEURES (SOLIDES UNIQUEMENT), SUIVIE D’UNE ANESTHESIE GENERALE DE COURTE DUREE (ENVIRON 1 HEURE) AU COURS DE LAQUELLE UNE PREMIERE CAPSULE EST POSITIONNEE DANS LE TUBE DIGESTIF PAR VOIE ENDOSCOPIQUE. L’ANIMAL EST ENSUITE REVEILLE, REALIMENTE ET HEBERGE INDIVIDUELLEMENT PENDANT 72 HEURES. LA SECONDE ETAPE COMPREND UNE NOUVELLE PERIODE DE JEUNE DE 12 HEURES (SOLIDES UNIQUEMENT), SUIVIE D’UNE ANESTHESIE GENERALE CONTINUE D’UNE DUREE MAXIMALE DE 10 HEURES, SANS REVEIL. AU COURS DE CETTE ETAPE, UN CATHETER VEINEUX AURICULAIRE ET UN CATHETER VESICAL TRANSPUBIEN SONT MIS EN PLACE. UNE SECONDE CAPSULE EST POSITIONNEE DANS LE TUBE DIGESTIF PAR VOIE ENDOSCOPIQUE ET UNE SONDE DE MANOMETRIE EST INSEREE. DES EXAMENS D’IMAGERIE PAR SCANNER X SONT REALISES AU COURS DU SUIVI. L’ANIMAL EST MIS A MORT SOUS ANESTHESIE GENERALE PROFONDE A L’ISSUE DE LA PROCEDURE.

Impact sur les animaux

Le projet sera réalisé en veillant à ce qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. L’ensemble du protocole se déroulera sous anesthésie générale, avec un monitoring complet garantissant l’absence de douleur et l’absence de retour à l’état de conscience. LA PREMIERE ETAPE ETANT REALISEE AVEC REVEIL DE L’ANIMAL, ELLE PEUT ENTRAINER UNE FATIGUE TRANSITOIRE ET UNE DESORIENTATION AU REVEIL. LE MAINTIEN EN LOGE INDIVIDUELLE PENDANT LES 72 HEURES SEPARANT LES DEUX ETAPES EST A L’ORIGINE D’UN STRESS MODERE. Jeûne préalable (solide uniquement) : ce jeûne peut induire une sensation de faim susceptible de générer un inconfort temporaire. Ce risque est toutefois atténué par l’absence de jeûne hydrique. CETTE NUISANCE CONCERNE LES DEUX PERIODES DE JEUNE PREOPERATOIRE. Induction et maintien de l’anesthésie générale : des effets indésirables POTENTIELS LIES A L'ANESTHESIE sont possibles (hypotension, hypothermie, bradycardie, dépression respiratoire). De plus, l’intubation trachéale comporte des risques d’irritation locale et de microtraumatismes des voies respiratoires. Position en décubitus ventral prolongé : malgré l’anesthésie et la surveillance, il existe un risque d’hypoventilation, d’hypoxie ou de compression des organes. Insertion des dispositifs (endoscope, sonde manométrique) : peut provoquer une irritation muqueuse ou une stimulation mécanique locale. Ces effets indésirables sont identifiables et surtout quantifiables avec les méthodes de monitoring proposées. Les solutions pour les combattre sont précisées dans le paragraphe "déroulé du projet".

Devenir

Le projet implique des procédures expérimentales, nécessitant une anesthésie générale continue de longue durée (jusqu'a 10 heures), sans interruption, ni reprise de conscience. Le sort prévu est donc l'euthanasie en fin de procédure, sans réveil

Remplacement

Le recours à l'animal est rendu nécessaire car il s'agit de suivre le déplacement d'une capsule à visée médicale dans le tube digestif. Le déplacement de la capsule est assurée par la mobilité du tube digestif. A ce stade des travaux, cette étude ne peut pas être reproduite in vitro ou in cilico

Réduction

Le nombre d’animaux est limité à trois porcs, défini comme strictement nécessaire pour valider la faisabilité technique du protocole (franchissement pylorique, maintien du transit, imagerie). Le protocole est conçu comme une étude exploratoire, préalable à d’éventuelles études fonctionnelles. Les données issues de cette phase permettront d’optimiser les paramètres techniques et d’éviter l’utilisation ultérieure d’animaux inutiles. Chaque animal fera l’objet d’un suivi complet multiparamétrique (capsule, manométrie, imagerie), maximisant les données récoltées par individu.

Raffinement

Dans une situation où l’un des deux points limites suivants serait atteint - échec du positionnement de la capsule en raison de l’impossibilité de la placer dans LE DUODENUM par voie naturelle, ou déséquilibre anesthésique incontrôlable entraînant des réponses incompatibles avec la stabilité physiologique nécessaire à la poursuite de la procédure-, l’essai serait immédiatement interrompu pour les animaux concernés. UNE PREMIERE ETAPE SOUS ANESTHESIE GENERALE DE COURTE DUREE SERA REALISEE AFIN DE POSITIONNER LA CAPSULE EN AVAL DU PYLOR, SUIVIE DU REVEIL COMPLET DE L’ANIMAL ET D’UNE REPRISE ALIMENTAIRE AVEC ACCES A L’EAU. CETTE ETAPE PERMET DE FAVORISER LA REPRISE DE LA MOTILITE DIGESTIVE AVANT LA SECONDE ETAPE ET DE LIMITER LES PERTURBATIONS DU TRANSIT INDUITES PAR LE JEUNE ET L’ANESTHESIE PROLONGEE.

Choix des espèces

Le porc est connu pour être une espèce modèle pour l'homme. Il reste un animal proche de l’Homme, avec de grandes similitudes anatomiques et physiologiques notamment pour le tube digestif. Nous utiliserons dans cette étude des porcs conventionnels d'un poids 60-70 kg afin que les organes présentent des tailles comprables à l'Homme et qui sont pertinentes pour les recherches humaines. Son régime omnivore fait aussi de lui un modèle idéal pour la recherche en nutrition.

Une prostration, une déshydratation sévère ou une perte de poids importante peuvent conduire à la mise à mort d'un poulet avant la fin de l'essai. 15 poulets âgés de onze semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués une fois leur réponse en anticorps obtenue. Ils sont infectés par voie orale par Salmonella Gallinarum, agent de la typhose aviaire, puis subissent jusqu'à neuf prises de sang d'environ 1 mL à la veine de l'aile, sans médication contre la douleur prévue. Leur sérum sert à fabriquer un témoin positif pour les contrôles sanitaires obligatoires des élevages, en quantité calculée, selon le porteur, "sur la base des données de production et de vente" pour couvrir cinq ans.

Objectifs

La pullorose et la typhose aviaire sont des maladies infectieuses qui peuvent être dues à certaines Salmonella, il s’agit de maladies septicémiques qui affectent principalement les poulets et qui présentent une obligation de déclaration, de surveillance et de certification. Ce projet consistera en un protocole d’infection expérimentale conduit en animalerie protégée sur poulets afin d’obtenir des sérums positifs contre Salmonella.

Bénéfices attendus

Cette procédure doit permettre la production d’un sérum de référence positif vis-à-vis de Salmonella Gallinarum chez le poulet. Ce sérum (qui sera constitué de l’ensemble des différents sérums individuels obtenus par infection expérimentale sur poulets) permettra de valider (témoin positif) les tests sérologiques pour la technique d'agglutination rapide sur lame réalisés dans les contrôles sanitaires des élevages par les laboratoires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention d'une durée inférieure à 5 minutes lors de l’inoculation par voie orale de S. Gallinarum, lors des pesées des animaux ou des prises de sang. Les prises de sang, au maximum neuf, consistent en un prélèvement d’environ 1 mL au niveau de la veine alaire. Les prélèvements seront réalisés en alternance sur les deux ailes afin de limiter les sollicitations répétées d’un même site de prélèvement. Ces actes seront réalisés par des personnels expérimentés, toujours les mêmes, pour limiter au maximum le stress et la douleur chez les animaux.

Impact sur les animaux

La pullorose et la typhose aviaire sont des maladies infectieuses dues à Salmonella enterica enterica serovar Gallinarum (biovar Pullorum ou Gallinarum respectivement). Ces maladies septicémiques affectent principalement les poussins, les jeunes dindonneaux et faisandeaux et sont responsables d’une mortalité en coquille ou après l’éclosion. La maladie est moins grave chez les oiseaux plus âgés, c’est pourquoi il a été choisi des animaux agés de 11 semaines dans cette procédure. Bien que la mortalité puisse être élevée, les signes cliniques peuvent etre d'intensité variable, chez les adultes. Les animaux contaminés peuvent présenter une baisse de l'activité, une diminution de la consommation d'aliment et d'eau, un retard de croissance, un plumage ébouriffé, de la diarrhée et une déshydratation. Cet essai provoquera une phase de stress et de douleur légère qui seront générées par l’inoculation de la souche de Salmonella Gallinarum et les prélèvements réalisés chaque semaine sur les animaux (prises de sang). Cette douleur légère et passagère sera directement liée à l'acte de piqure qui est subie par l'animal : aucun protocole de médication particulière n'est prévu. L’inoculation et les prises de sang seront réalisées par des personnels expérimentés dans la réalisation de ces actes pour limiter au maximum leur stress et la douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort lorsqu'ils auront développé une réponse sérologique spécifique de Salmonella Gallinarum à la fin de l’essai.

Remplacement

La production de sérums de référence est nécessaire pour la validation des contrôles sanitaires obligatoires effectués dans les élevages. Cette production de sérum positif Salmonella Gallinarum ne peut être réalisée que sur espèces cibles (poulets) car il n’existe malheureusement pas, à ce jour, de méthodes alternatives de production de sérums expérimentaux spécifiques.

Réduction

L’expérience acquise a permis de limiter le nombre d’animaux utilisés, ainsi que le nombre d’interventions sur ces animaux. La quantité d’animaux à utiliser a été calculée au plus juste pour produire une quantité de sérum positif suffisante pour 5 ans. Nous espérons récolter entre 8 et 10 ml de sérum par animal. Toutefois, les titres en anticorps sont variables d’un animal à l’autre, et dans certains cas les titres peuvent être trop faibles, voire nuls. Ainsi, sur la base des données de production et de vente, une infection expérimentale de 15 poulets permet de récolter environ 100 ml de sérum positif, quantité utilisée par les laboratoires sur une période de 5 ans. L’objectif de l’étude étant la production et la caractérisation d’un sérum positif de référence, celle-ci ne nécessite pas d’analyse statistique.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Les 15 poulets inclus dans cette procédure expérimentale seront hébergés à l'âge de 7 semaines dans leur nouvel environnement et bénéficieront d’une période d'habituation de 4 semaines afin de favoriser leur adaptation et de limiter le stress lié au changement d'environnement. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). En plus de la litière, qui sera maintenue sèche et friable (renouvellements d’air important), il sera ajouté des cordes suspendues et des plateformes de perchage en grillage. Un suivi des animaux sera mis en place pendant toute la durée de l’essai, les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge. Les paramètres zootechniques (pesées des animaux au démarrage de l’essai, avant l’inoculation et avant chaque série de prélèvement ; suivi de la consommation d’aliment et d’eau) seront pris en compte tout au long de l’essai. Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les pesées, les prises de sang et l’inoculation individuelle des animaux seront réalisées conjointement par deux personnes habilitées dans le but de réduire la durée de la contention et de l’intervention sur l’animal afin d’en diminuer le stress induit. Les points limites sont définis afin de prévenir toute souffrance importante. Une surveillance régulière des animaux permettra de détecter une aggravation de leur état. Les signes attendus d’intensité légère à modérée et transitoire (baisse d’activité, diminution de la consommation, plumage ébouriffé, diarrhée légère, déshydratation légère) seront surveillés. Une altération importante de l’état général, une prostration, une déshydratation sévère, une incapacité à s’alimenter ou à boire, une perte de poids importante ou tout signe de souffrance sévère constitueront des points limites et entraîneront une prise en charge adaptée, pouvant aller jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les poules (Gallus gallus) constituent l'espèce la plus pertinente pour la production de sérums positifs dirigés contre Salmonella Gallinarum, car elles représentent l'hôte naturel et la principale espèce cible de ce pathogène. Les animaux mis en place auront 7 semaines d’age, et la procédure commencera lorsqu’ils seront agés de 11 semaines, afin de permettre une réponse immunitaire des animaux suffisament importante, mais également de réduire les risques de symptomes et d’effets indésirables de la maladie chez ces animaux.

30 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés d'après le porteur, sauf ceux qui atteignent un point limite et sont alors tués. Pendant 314 jours, chaque lapin subit jusqu'à onze interventions : cinq séances d'injections sous la peau en dix points, parfois avec de l'adjuvant complet de Freund qui peut laisser des nodules inflammatoires et un œdème plusieurs jours, et six prises de sang de 2 à 5 mL. Les anticorps obtenus doivent servir à des tests rapides de détection de résidus d'antibiotiques, de toxines ou de polluants. Le porteur reconnaît l'existence de bibliothèques d'anticorps produites en laboratoire, qu'il juge "inadaptées aux contraintes de notre projet".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux de lapin à des fins diagnostiques et scientifiques, en réponse à des besoins environnementaux, en santé publique et en recherche. Ces anticorps constituent des outils essentiels pour la détection de petites molécules d’intérêt, telles que des contaminants environnementaux, des résidus de médicaments ou des toxines bactériennes, et permettent le développement de tests immunologiques sensibles et spécifiques, notamment sous forme de tests rapides ou de dosages de type ELISA. Les anticorps produits dans ce cadre présentent des caractéristiques d’affinité et de spécificité adaptées à leur utilisation dans des dispositifs de diagnostic à grande échelle. En l’état actuel des connaissances, la phase initiale d’immunisation chez l’animal reste nécessaire pour générer une réponse immunitaire polyclonale diversifiée et de haute affinité. Cette étape permet la production de lymphocytes B spécifiques qui ne peuvent pas encore être reproduits de manière équivalente par des approches entièrement in vitro ou synthétiques. Le recours aux animaux est donc strictement limité à cette phase d’immunisation. Les étapes ultérieures de caractérisation et de sélection des anticorps sont réalisées à partir de techniques in vitro, sans réutilisation d’animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à lever un verrou technologique majeur pour la santé publique, l'environnement et la sécurité sanitaire : la détection ultra-sensible et rapide de petites molécules d'intérêt (toxines, polluants, résidus médicamenteux). Ces cibles sont historiquement très difficiles à identifier avec des anticorps murins (souris), qui manquent d'affinité pour de si petits motifs. Le recours au modèle lapin est scientifiquement indispensable car la diversité de son répertoire immunitaire permet d'obtenir des anticorps à très haute affinité, garantissant des seuils de détection jusqu'alors inaccessibles. Les bénéfices socio-économiques et sanitaires se traduiront par le développement de tests rapides sur le terrain (bandelettes, dosages ELISA) répondant à deux enjeux critiques. D'une part, dans le cadre de la lutte contre l'antibiorésistance et les urgences infectieuses, la propagation des bactéries résistantes aux antibiotiques de dernier recours (comme les carbapénèmes) constitue une menace sanitaire mondiale. Les anticorps générés permettront de concevoir des tests de détection rapide utilisables au chevet du patient (sur urines, sang ou colonies) afin d'identifier les mécanismes de résistance en quelques minutes et d'adapter immédiatement le traitement. D'autre part, en matière de surveillance environnementale et de sécurité sanitaire, ces outils permettront le suivi d'ultra-traces de micropolluants et de toxines dans des matrices complexes comme l'eau potable ou les fluides biologiques, assurant ainsi une prévention sanitaire efficace et accessible. Enfin, ce projet s'inscrit pleinement dans une démarche éthique et d'application stricte des 3R. Les procédures sur les lapins se limitent exclusivement à des étapes d'immunisation et de prélèvements sanguins légers sous anesthésie, sans aucune mise à mort requise dans le cadre du protocole. La phase animale est par ailleurs restreinte à la réponse immunitaire initiale, car les gènes codant les anticorps d'intérêt seront directement isolés par clonage pour assurer l'ensemble de la production ultérieure exclusivement in vitro sous forme recombinante. Cela garantit la pérennité de ces outils de diagnostic sans aucun recours ultérieur à l'animal.

Procédures

Les animaux seront immunisés sous contention douce et sous anesthésie locale topique (crème EMLA appliquée 30 à 45min avant le geste), par des injections sous-cutanées multipoints brèves (durée de 2 à 3 minutes par animal pour répartir le volume en 10 points d’injection) d’une molécule appelée immunogène qui correspond à la cible d’intérêt. Chaque animal recevra au total un nombre maximal strict de 5 sessions d'injections dans le cadre du protocole : une injection initiale à J+1 suivie de quatre rappels répartis sur l'étude. Des prélèvements sanguins de 2 à 5mL chacun, également réalisés sous anesthésie locale, seront effectués à intervalles réguliers (8 à 10 jours après chaque injection ainsi qu’un prélèvement final à J+314) afin de suivre la réponse immunitaire des animaux. Ces prélèvements représentent un nombre exact de 6 interventions sur la durée globale du protocole, avec une durée très brève de 1 à 2 minutes par prélèvement. Au total, chaque animal sera soumis à un nombre maximal absolu de 11 interventions sur l'ensemble des 314 jours de l'étude.

Impact sur les animaux

Une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injection sont susceptibles de survenir, bien que limitée par l’application d’une anesthésie locale (lidocaïne) au point d’injection ou de prélèvement. En cas d'utilisation d'adjuvant complet de Freund pour l'immunisation primaire, une réaction inflammatoire nodulaire locale ou un œdème peut persister plusieurs jours sur les sites d'injection, générant une sensibilité prolongée qui fera l'objet d'un suivi quotidien strict. La douleur aiguë liée à la piqûre est donc très brève, mais une gêne locale d'intensité légère à modérée peut être ressentie les jours suivants selon l'adjuvant employé. Une douleur légère peut toutefois être ressentie lors des prélèvements sanguins. Les manipulations nécessaires peuvent entraîner un stress transitoire chez certains animaux, de l’ordre de quelques minutes, qui sera minimisé par une habituation préalable à la manipulation et à la contention douce.

Devenir

Tous les animaux (n = 30) seront replacés, sauf avis contraire du vétérinaire ou en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole, auquel cas ils seront mis à mort.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes alternatives permettant de générer ou de sélectionner des anticorps sans recourir directement à l’immunisation d’animaux, (notamment l’utilisation de bibliothèques d’anticorps produites en laboratoire), mais elles restent inadaptées aux contraintes de notre projet pour trois raisons principales. En premier lieu, notre objectif est de détecter des molécules d'intérêt extrêmement petites (comme les carbapénèmes). Pour ces petites cibles, les banques d'anticorps artificielles manquent de sensibilité et échouent à fournir des seuils de détection suffisamment fins dans des échantillons complexes (sang, eau). En second lieu, le lapin possède un système immunitaire unique. Contrairement à d'autres espèces comme la souris, son organisme est capable d'adapter et de perfectionner naturellement la structure de ses anticorps pour épouser la forme de ces très petites molécules. Les technologies actuelles ne parviennent pas à reproduire cette maturation naturelle avec le même niveau de précision. Enfin, notre protocole repose sur l'isolement de ces cellules d'intérêt. L'immunisation initiale de l'animal est indispensable pour stimuler la production de ces lymphocytes B. Une fois ces cellules sélectionnées, nous récupérons leur matériel génétique pour produire définitivement les anticorps en laboratoire, de manière recombinante. Toutes les étapes ultérieures de sélection, de caractérisation et de production à grande échelle des anticorps sont ensuite réalisées exclusivement in vitro, sans recours supplémentaire à l’animal.

Réduction

Chaque production d’anticorps polyclonaux sera réalisée à partir de deux lapins par immunogène. Ce choix tient au fait que les animaux peuvent répondre différemment à une même substance injectée. Certains développent une réponse immunitaire plus forte ou plus adaptée que d’autres. L’utilisation de deux animaux permet donc d’identifier celui qui présente la meilleure réponse immunitaire grâce à une analyse réalisée sur des prélèvements sanguins, sans procédure supplémentaire sur l’animal. Le lapin présentant la réponse la plus adaptée est ensuite utilisé pour la production des anticorps. Le second animal permet de sécuriser la production : il peut être utilisé uniquement si la réponse du premier animal s’avère insuffisante en termes de qualité ou de performance des anticorps obtenus.

Raffinement

Les lapins seront hébergés par paire dans des cages communicantes afin de limiter l’isolement social tout en permettant le suivi individuel des animaux. Les cages seront aménagées pour favoriser le bien-être des animaux : elles comprendront un milieu enrichi avec une tablette, des haltères, des balles, des bâtonnets en bois à ronger et du foin. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des procédures par du personnel qualifié. Afin de réduire le stress et la douleur liés aux expérimentations, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale à l’isoflurane et/ou avec anesthésie locale lorsque cela est compatible avec les procédures. Le niveau de douleur attendu ne doit pas dépasser celui ressenti lors d’une injection chez l’humain. Tout animal présentant des signes de souffrance ne pouvant être atténués par des mesures compensatoires (surveillance rapprochée, enrichissement, ajout de nourriture liquide, etc.) sera euthanasié.

Choix des espèces

Le lapin (Oryctolagus cuniculus) a été choisi comme modèle pour la production d’anticorps polyclonaux, en raison de son répertoire immunitaire diversifié et de sa capacité à générer des anticorps de haute affinité et spécificité, particulièrement adaptés à des cibles difficiles à adresser avec les anticorps murins, notamment les petites molécules. Les animaux utilisés seront des lapins adultes, car à ce stade le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour obtenir une réponse immunitaire robuste et reproductible, garantissant la qualité et la diversité des anticorps produits. De plus, les lapins sont des animaux de taille moyenne permettant de réaliser les injections multiples et prélèvements sanguins répétés dans des conditions de confort et de sécurité optimales, tout en limitant le stress et l’inconfort. Leur utilisation répond ainsi à des critères éthiques et pratiques, tout en assurant la fiabilité scientifique des résultats. Nous utiliserons des lapins âgés de minimum 12 semaines au démarrage des immunisations. Les animaux adultes ont la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses humorales lors des immunisations successives.

Les dindes qui développent des signes respiratoires sévères sont mises à mort immédiatement. 40 dindes âgées de 4 à 6 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour récolter leur sang. Elles reçoivent deux inoculations de métapneumovirus aviaire et subissent jusqu'à six prises de sang espacées d'une semaine, afin de produire quatre antisérums de référence qui serviront à identifier le sous-type en cause dans les élevages de dindes malades. Le porteur reconnaît qu'un groupe plus petit pourrait être proposé, et en retient 40 pour constituer un stock utilisable au moins trois ans.

Objectifs

Nous travaillons dans les moyens de surveillance et de diagnostique de maladies infectieuses des élevages de volailles. Les métapneumovirus aviaires provoquent la rhinotrachéite chez la dinde. Ce projet a pour objectif de produire des sérums de dinde contenant des anticorps dirigés contre les 4 sous-types de métapneumovirus aviaires nommés A, B, C et D. Ces sérums seront produits par infection des dindes avec l’un des sous-types de métapneumovirus aviaire. Ceci sera effectué pour tous les sous-types. Ces sérums nous servirons ensuite de sérums de référence afin de déterminer par quel sous-type de métapneumovirus aviaire est infecté un élevage de dinde malade et si les anticorps produits par ces dindes sont protecteurs vis-à-vis du virus. Cette étude ne nécessite pas d'analyses statistiques.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de poursuivre nos activités de diagnostique et de recherche dans le cadre des infections de dindes par les virus métapneumovirus aviaires.

Procédures

Tous les animaux de la procédure seront soumis aux interventions suivantes : manipulation des animaux pour les prises de sang, l’inoculation du virus et la mise à mort. Il y aura au maximum 6 prises de sang espacées d’une semaine et 2 inoculations de virus. Chaque intervention durera autour de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que des symptômes respiratoires légers surviennent dans nos conditions expérimentales. Cependant, nous ne pouvons pas exclure formellement l’apparition de symptômes plus importants. Ces pourquoi les dindes seront surveillées cliniquement. Si des signes respiratoires sévères sont observées, les dindes concernées seront mises à mort immédiatement afin de limiter leur souffrance. D'autres nuisances liées aux interventions humaines sont également attendues, comme le stress passager des animaux lors des manipulations par les personnes impliquées dans l’essai et lors du nettoyage des animaleries.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récolter le sang et ainsi produire un nouveau stock d’antisérum anti-aMPV-A, anti-aMPV-B, anti-aMPV-C ou anti-aMPV-D.

Remplacement

L’intérêt de l’antisérum anti-aMPV est qu’il soit produit par les mêmes animaux qui seraient naturellement infectés par ce virus, c’est-à-dire les dindes. A ce jour il n’existe pas de méthode alternative pouvant mimer le système immunitaire de dinde pour produire ce type d’antisérum de référence. Le recours à l’expérimentation sur dinde est donc indispensable.

Réduction

La quantité d’animaux prévus, à savoir 40 (10 par sous-type d’antisérum anti-aMPV), permettra de produire un stock utilisable sur au moins 3 ans. Un plus petit groupe d’animaux pourrait être proposé, mais cela réduirait d’autant de temps le stock utilisable. Etant donné que chaque stock d’antisérum subit divers tests de contrôle d’activité et de spécificité entre autres, il est préférable de constituer un plus gros stock de manière à limiter la quantité d’antisérums utilisée uniquement pour ces tests.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à une densité respectueuse de la réglementation en vigueur. Ils seront nourris et abreuvés à volonté. Leur environnement sera également enrichi par l’ajout d’un perchoir. Ceci afin de leur permettre d’exprimer certains comportements naturels et importants pour leur bien-être. Les stratégies appliquées pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse en cours de procédure sont la surveillance quotidienne des animaux, la définition d’un point limite à partir duquel il est impératif de mettre à mort l’animal afin de limiter au maximum le temps de souffrance ainsi que l’organisation des interventions sur animal afin de limiter les manipulations de chaque animal.

Choix des espèces

Les métapneumovirus aviaires infectent et rendent malades les dindes. Afin de disposer d’antisérums de référence qui serviront par la suite au diagnostic de la maladie, il est impératif que ces antisérums soient produits par des dindes. Les dindes utilisées ici auront leur système immunitaire parfaitement mature car elles seront âgées de 4 à 6 semaines.

Une séance d'imagerie par semaine, chacune sous anesthésie gazeuse pendant quarante minutes, avec injection d'un agent de contraste dans la veine de la queue : 180 souris transgéniques qui développent spontanément des tumeurs mammaires vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une semaine sur deux s'y ajoutent trois prélèvements de sang à la queue en trente minutes. Le porteur liste les conséquences des anesthésies répétées, affaiblissement, perte de poids, déshydratation, hypothermie, et celles des ponctions répétées à la queue, lésions locales, risque d'infection, gêne pour se déplacer. Chaque semaine, quelques souris sont tuées après leur séance pour que leur tumeur soit analysée au microscope, et aucune ne reste en vie à la fin du projet.

Objectifs

Le cancer du sein est l’une des principales causes de mortalité chez les femmes, et son incidence continue d’augmenter. Aujourd’hui, son diagnostic et son suivi reposent en grande partie sur des examens utilisant des rayons X ainsi que sur des biopsies (prélèvements de tissu), qui sont invasives, parfois douloureuses et sources de stress pour les patientes. Ce projet vise à développer une alternative basée sur l’échographie, une technique : non invasive (sans chirurgie), sans rayonnement, plus confortable pour les patientes, et moins coûteuse. À terme, cela pourrait permettre de réduire le recours aux biopsies et d’améliorer significativement le confort et la prise en charge des patientes. Aujourd’hui, des informations essentielles pour évaluer une tumeur (comme sa rigidité, son réseau de vaisseaux sanguins ou l’organisation de ses fibres tissulaires) ne peuvent être obtenues qu’après prélèvement et analyse au microscope. L’IRM permet d’accéder partiellement à ces informations sans intervention, mais cette technique reste coûteuse, peu accessible, et contraignante pour certaines patientes. L’échographie ultrarapide, en revanche, est une technologie : plus accessible, portable, et adaptable à un usage à grande échelle. Elle pourrait donc permettre d’obtenir ces informations de manière simple et non invasive. Les avancées développées dans ce projet pourraient avoir plusieurs impacts majeurs : Améliorer le diagnostic en distinguant plus facilement les tumeurs bénignes des tumeurs malignes, Mieux caractériser les tumeurs pour choisir un traitement adapté, • Suivre plus rapidement l’efficacité des traitements, et éviter des thérapies inutiles ou inefficaces, • Réduire les contraintes pour les patientes, en limitant les examens lourds, invasifs ou stressants.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein représente un enjeu majeur de santé publique. Les méthodes actuelles de diagnostic reposent sur des examens contraignants, incluant des biopsies invasives et des techniques d’imagerie coûteuses ou irradiantes. Ce projet vise à développer une approche d’imagerie par ultrasons non invasive, sans rayonnement et accessible, permettant de mieux caractériser les tumeurs. À terme, cette technologie pourrait réduire le recours aux biopsies, améliorer le confort des patientes et faciliter un diagnostic plus précoce et plus précis. Elle permettrait également d’adapter plus rapidement les traitements en identifiant précocement les thérapies inefficaces, contribuant ainsi à une médecine plus personnalisée. Enfin, grâce à son faible coût et à sa portabilité, cette approche pourrait être déployée à grande échelle, améliorant l’accès au diagnostic et la prise en charge des patientes.

Procédures

Les procédures réalisées dans ce projet impliquent des manipulations limitées et sont effectuées sous anesthésie ; Pour les acquisitions hebdomadaires d’imagerie de 40min environ, une injection intraveineuse sera réalisée au niveau de la queue de l’animal anesthésié. Cette injection concernera un agent de contraste utilisé en imagerie, ainsi qu’une solution de glucose, suivie d’une petite quantité de solution saline. Ces injections peuvent entraîner une gêne légère et transitoire liée à la manipulation et à l’injection. Dans le cadre de l’étude du métabolisme, 3 prélèvements d’une goutte de sang seront réalisés toutes les 10min sur une courte période (30 minutes). Ces prélèvements sont effectués à partir de la queue et représentent un volume total limité. Ils peuvent entraîner une gêne modérée liée aux manipulations répétées. Ils ne seront réalisés qu’une fois sur deux afin de permettre à l’animal de récupérer deux semaines entre deux séries de prélèvements.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables peuvent survenir au cours de ce projet. Le transport pour faire venir les animaux, le changement d’environnement et les manipulations répétées peuvent être source de stress pour les animaux, pouvant se traduire par des modifications de comportement. Les séances d’imagerie nécessitent une anesthésie générale par voie gazeuse. Bien que maîtrisée, cette anesthésie peut entraîner : • un affaiblissement transitoire, • une perte de poids au fil des séances, • un risque de déshydratation, • ainsi qu’un risque d’hypothermie, en particulier lors d’anesthésies prolongées. Les injections intraveineuses et prélèvements répétés au niveau de la queue peuvent également entraîner : • des lésions locales, • un risque infectieux au site d’injection, • et une gêne pouvant affecter la mobilité de l’animal, • une difficulté à récupérer entre les séances. Un risque exceptionnel mais grave d’embolie gazeuse existe en cas d’injection accidentelle d’air dans la circulation sanguine, pouvant entraîner la mort de l’animal. Enfin, le modèle animal utilisé développe des tumeurs mammaires, ce qui peut induire : • une douleur liée au développement tumoral, • une gêne locomotrice, • une altération de l’état général (perte de poids, diminution de l’activité), • et des modifications du comportement (isolement, agressivité, diminution de la prise alimentaire ou hydrique).

Devenir

Les animaux seront réutilisés chaque semaine pour imagerie, la procédure d’imagerie étant peu sévère et l’anesthésie limitée à 40min. Un petit nombre d’animaux sera euthanasié à l’issue de la séance d’imagerie chaque semaine pour prélèvement de la tumeur et analyse histologique. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.

Remplacement

Dans le cadre du développement de ces techniques d’imagerie, des méthodes alternatives à l’expérimentation animale sont utilisées autant que possible. Des modèles in vitro sont notamment mis en œuvre, tels que des gels (agar ou gélatine) dont les propriétés (rigidité, organisation interne) peuvent être contrôlées. Ces modèles permettent de tester et d’optimiser les techniques d’imagerie dans des conditions maîtrisées. Des simulations numériques peuvent également être utilisées dans certains cas. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas de représenter fidèlement : • l’organisation et le fonctionnement des vaisseaux sanguins, • les interactions entre la tumeur et les tissus environnants, • ni l’évolution dynamique de la tumeur dans le temps. Or, ces éléments sont essentiels pour répondre aux objectifs du projet, qui visent à caractériser les tumeurs dans des conditions proches de la réalité physiologique.

Réduction

Le projet est conçu de manière à utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. L’imagerie ultrasonore utilisée est peu invasive, ce qui permet de réaliser des mesures répétées chez les mêmes animaux au cours du temps. Cette approche longitudinale (une séance d’imagerie par semaine) permet de suivre l’évolution des tumeurs sans multiplier les groupes expérimentaux, et donc de réduire significativement le nombre total d’animaux. Une phase initiale de mise au point sera réalisée afin d’optimiser les paramètres d’imagerie et d’éviter la réalisation d’expériences non exploitables. Cette étape permettra de garantir la fiabilité et la reproductibilité des mesures, en particulier pour l’étude de nouveaux biomarqueurs. Par ailleurs, l’expérience acquise lors de projets précédents utilisant le même modèle animal permet de limiter les ajustements nécessaires, notamment concernant le modèle biologique, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés pour les phases préliminaires. Enfin, le nombre d’animaux prévu est volontairement estimé de manière prudente. Toutefois, une adaptation en cours d’étude sera mise en place : si les résultats obtenus sont suffisants avant d’atteindre l’effectif initialement prévu, les expériences seront arrêtées de manière anticipée, permettant de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux sont acclimatés à leur environnement, manipulés de manière douce (tunnels, prise à la main) et hébergés en groupe dans des cages enrichies. Les souris développant des tumeurs font l’objet d’une surveillance quotidienne, avec des points limites définis entraînant l’arrêt de l’expérimentation si nécessaire. Les procédures sont réalisées sous anesthésie, avec maintien de la température corporelle et surveillance des paramètres physiologiques. Les sites d’injection sont désinfectés et traités pour limiter la douleur. Après les séances, les animaux bénéficient d’un réveil encadré en environnement chauffé et sont remis avec leurs congénères après récupération complète. Une évaluation régulière de l’état de l’animal est réalisée : administration de substances à effet analgésique (Meloxicam) si nécessaire, et euthanasie anticipée en cas de douleur persistante ou importante.

Choix des espèces

L’étude nécessite un modèle in vivo, car les caractéristiques des tumeurs (vascularisation, structure et interactions avec les tissus environnants) ne peuvent être reproduites en dehors d’un organisme vivant. La souris est choisie comme modèle expérimental car elle permet : • la mise en œuvre de modèles tumoraux pertinents, incluant des tumeurs apparaissant dans un environnement physiologique, • la possibilité d’études longitudinales, • et l’utilisation de modèles génétiques bien caractérisés. Ce modèle transgénique est particulièrement adapté à l’étude du microenvironnement tumoral, qui est central dans ce projet, car il permet d’étudier le développement spontané d’une tumeur dans son environnement. Par ailleurs, le laboratoire dispose d’une expertise solide sur ce modèle, ainsi que de l’ensemble des équipements adaptés à l’imagerie du rongeur. Nous avons choisi d’accueillir les souris au stade pré-pubère pour avoir le temps de les acclimater et de réaliser l’imagerie sur des petites tumeurs, avant qu’elles deviennent palpables.