Troubles sensoriels

36 souris diabétiques db/db vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sous anesthésie deux prélèvements de peau au dos, trois injections sous-cutanées, six anesthésies avec pesée et deux prises de sang pour la glycémie, les plaies pouvant s'enflammer et entraîner perte d'appétit, déshydratation et perte de poids. L'objet est une preuve de concept pour trois principes actifs naturels destinés à un futur pansement, présentée comme la "première étape" d'un développement. Le porteur écrit que l'utilisation de ces souris est "indispensable" et affirme que les résultats "garantiront le développement d'outils thérapeutiques applicables en médecine humaine".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour objet principal d’évaluer le potentiel cicatrisant de principes actifs naturels ayant présenté des propriétés intéressantes durant les phases de tests in vitro. Ce test in vivo représente une preuve de concept, première étape d’uné étude globale visant la validation d’un pansement actif, constitué d’un subsitut dermique évolutif libérant progressivement des principes actifs naturels dans la plaie.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 2 est une maladie métabolique chronique associée à une altération des mécanismes de réparation tissulaire, entraînant un retard de cicatrisation et une dégradation de la qualité de vie des patients. À ce jour, les options thérapeutiques visant à améliorer efficacement la cicatrisation des plaies chez les personnes diabétiques demeurent limitées. La présente étude a pour objectif de caractériser les effets cicatrisants de 3 éléments d’essai en contexte diabétique. Les résultats obtenus permettront d’évaluer leur potentiel respectif, et d’apporter une preuve de concept à la suite du développement d’une solution innovante de pansement, combiné à l’un de ces éléments d’origine naturelle, afin d’améliorer la prise en charge des plaies chroniques.

Procédures

- Suivi de la glycémie : 2 fois par souris - Procédure chirurgicale (récupération d'une zone de peau d'une circonférence de 6mm) : 2 par souris - Injections sous-cutanées : 3 injections par souris - Anesthésie volatile et pesée : 6 par souris - Suivi journalier des souris : une fois par jour - Mise à mort et récupération des échantillons cutanés : Une fois à la fin de l'étude pour chaque souris

Impact sur les animaux

Au cours de cette étude, les souris seront maintenues sous anesthésied volatile, au moyen d’un système dédié. Afin d’assurer une prise en charge adéquate de la douleur liée à la procédure expérimentale, une injection sous-cutanée d'analgésique sera également administrée. Celle-ci pourra être renouvelée à 6h ou 24h post-chirurgie selon l’état de douleur de l’animal. L’anesthésie générale ainsi que les manipulations associées sont susceptibles d’induire une hypothermie transitoire et un état de stress chez les animaux. Les deux plaies qui vont être réalisées au dos des souris vont inévitablement conduire à une inflammatioin (douleur, rougeur, chaleur, gonflement) que nous allons minitieusement suivre à l’aide d’une grille de scoring. Ces premières nuisances peuvent conduire à une diminution de la prise alimentaire menant alors à une deshydration, une perte de poids et un possible changement de comportement envers congénères ou manipulateurs. Enfin, deux mesures de la glycémie seront réalisées sur chaque souris, nécessitant la récupération d’une goutte de sang à chaque mesure et entrainant ainsi une douleur localisée au site de prélèvement.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort en fin d'étude pour la récupération des échantillons à traiter en histologie.

Remplacement

Cette étude s’articule autour des effets cicatrisants de 3 éléments d’essai en conditions diabétiques. Les premiers tests in vitro ont permis de valider l’intérêt de ces éléments sur la cicatrisation cutanée. Cependent, nos résultats comme ceux de la littérature scientifique restent limités. En effet, ces études ne permettent pas d’étudier le recouvrement tri-dimentionnel de la lésion et ne reproduisent pas les tensions mécaniques qui s’exercent sur les plaies cutanées au cours de la cicatrisation. Par ailleurs, ces études in vitro présentent des limites intrinséques et ne reflètent qu’imparfaitement la complexité des processus inflammatoires se déroulant dans un organisme vivant. Ainsi, l’utilisation des souris diabétiques db/db comme modèle animal est alors indispensable dans l’étude des effets cicatrisants dans un contexte hyperglycémique. La robustesse et la transposabilité des résultats attendus garantiront le développement d’outils thérapeutiques applicables en médecine humaine.

Réduction

Le design expérimental de cette étude in vivo a été raffinée afin d’utiliser le minimum de souris pour déterminer les effets thérapeutiques de nos traitements sur la cicatrisation cutanée. Cette optimisation a été confirmée par l'utilisation d'outils statistiques.

Raffinement

Les chirurgies à réaliser sont maîtrisées par le personnel de l’animalerie, permettant de réduire au maximum leurs durées et donc les temps d'anesthésie. Les souris seront maintenus sous anesthésie volatiledurant toute la chirurgie, sur un plateau chauffant permettant de limiter leur hypothermie. Afin d’assurer une prise en charge adéquate de la douleur liée aux procédures expérimentales, une injection sous-cutanée d'analgésique sera également administrée, associée à l’application d'un analgésique local aux zones de biopsie. Le réveil et retour à l’état vigil des souris après chirurgie sera réalisé dans une chambre de réveil. Post-chirurgie, de l’hydrogel sera présent dans chacune des cages dans le but de faciliter l’hydratation des rongeurs. Dans les premières heures qui suivront la chirurgie, une surveillance accrue de chacun des rongeurs sera réalisée. Cette surveillance sera renforcée au cours des premiers jours post-opératoirs par notre zootéchnicienne afin de permettre une prise en charge rapide et adaptée dès les premiers signes de souffrance. Nous prévoyons une administration supplémentaire d'analgésique en cas de souffrance avérée. A cela, s’ajoutera la réalisation d’un scoring pour aider à la détection des signes de douleur. L’ensemble des changements de pansements seront réalisés sous anesthésie et analgésie. La mise à mort sera également réalisée sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Les souris génétiquements diabétiques db/db sont classiquement utilisées dans la littérature scientifique en raison des grandes similitudes dans le développement de la pathologie du diabète de type II chez l’Homme. Elles nous permettront ici d’apporter des éléments de réponse à l’intérêt thérapeutique de ces 3 éléments d’essai, sur un modèle pathologique. Les études in vivo seront réalisées avec des souris mâles âgées de 8 semaines.

Une amputation de la phalange distale dans les huit premiers jours de vie, pratiquée sur toutes les souris pour les identifier et les génotyper, ouvre le protocole. 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exposées à des sons de deux heures et pouvant aller jusqu'à huit heures, puis suivies par des séances d'audition d'une heure toutes les une à deux semaines, une partie subissant en plus une chirurgie d'une heure suivie de deux heures de mesures. L'objet est de mesurer ce que le bruit abîme dans le système auditif et ses relais cérébraux, chez des souris dont beaucoup portent des mutations de gènes de surdité. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés", et que leurs corps servent ensuite, quand c'est possible, à des entraînements à la dissection au sein du centre de recherche.

Objectifs

Objectif : Etudier les conséquences d’un son d’intensité moyenne à forte et ce dans la durée sur les réseaux neuronaux auditifs et la santé des individus. LE SYSTEME AUDITIF Le système auditif humain comprend l’oreille externe, l’oreille moyenne, l’oreille interne, ainsi que les centres neuronaux de traitement des stimuli auditifs. La cochlée comporte l’organe de Corti, qui abrite les cellules sensorielles, dites cellules ciliées. Il repose sur une membrane basilaire, qui contribue à l’analyse fréquentielle du son. Il y a quelques 14 000 cellules ciliées chez l’homme. Sous l’effet de la stimulation sonore, leur dépolarisation conduit à la libération de neurotransmetteur. Au total, ces 30 000 neurones chez l’homme forment le nerf auditif, qui lie la cochlée au noyau cochléaire, premier relais auditif du cerveau. Ensuite, l’information chemine à travers les divers autres noyaux du cerveau jusqu’au centre auditif. LE BRUIT ENVIRONNEMENTAL L’exposition à un bruit excessif est la première cause environnementale de troubles de l’audition. La surexposition sonore dans les mégapoles dont la densité de population ne cesse de croître ainsi que dans de nombreuses activités de loisirs pour lesquelles l’exposition sonore est peu ou mal contrôlée constitue une menace grandissante pour l’audition à l’échelle planétaire. Les conséquences au niveau central, aussi bien du point de vue des réseaux neuronaux que du point de vue des performances de l’individu dans des tâches auditives sont en outre peu étudiées. A un niveau plus intégratif encore, les conséquences du bruit sur la santé des individus et leurs interactions sociales restent également un sujet de recherche actif. Des résultats suggèrent en outre que les lésions cochléaires dues à une surexposition au bruit sont à l’origine d’une exacerbation de la progression de la perte auditive liée à l'âge (presbyacousie).

Bénéfices attendus

En caractérisant les atteintes auditives liées à la surexposition sonore et également dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : - Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les modèles porteurs des mutations des gènes étudiées. - Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à des expositions sonores répétées d’intensités moyennes. - Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients exposés ou porteurs de mutations spécifiques dans des gènes de surdité en testant de nouvelles molécules aux effets protecteurs face à une exposition traumatique sonore.

Procédures

Les interventions seront : - Un prélèvement de phalange sera effectué sur tous les animaux pour l’identification des souris, dans les 8 premiers jours de vie du projet afin de déterminer s’ils sont porteurs ou non de mutations du gène étudié et pour pouvoir commencer les expérimentations à partir du stade P12. Cette procédure dure une dizaine de secondes. Les prélèvements seront utilisés pour le génotypage. De plus cela permettra de constituer les cohortes avant le sevrage et de ne pas maintenir en vie des animaux non nécessaires à la reproduction ou aux expérimentations. Pour les expérimentations sur l’adulte, les animaux seront identifiés soit par prélèvement auriculaire soit par une puce implantée en sous-cutané. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de de l’exposition sonore et dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu à la suite de l’exposition et au cours du temps, approximativement toutes les unes à deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par le bruit. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie soit terminale soit pour permettre des enregistrements électrophysiologiques sur l’animal éveillé ensuite. Chaque chirurgie aura une durée de 1h et suivi de 2h de mesures fonctionnelles.

Impact sur les animaux

La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou modérées ou une succession d’expérimentations légères. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner des nuisances : - L'identification se fait par amputation de la phalange distale dans les 8 premiers jours de vie, douleur au moment de l’amputation. - Certaines expositions sonores d’une durée de 2h et pouvant aller jusqu’à 8h pourraient induire un stress temporaire sur l’animal, n’excédant pas quelques heures. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. - En ce qui concerne les chirurgies : Si celles-ci sont terminales, un protocole de médication antidouleur sera appliqué à l’animal en début de procédure. Pour les chirurgies de préparation aux enregistrements neuronaux sur animal éveillé, la douleur et l’inconfort modérée seront contrôlés par des antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant impossible leur réutilisation par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

La réduction a pour objectif d’utiliser le nombre suffisant d’animaux pour avoir des résultats scientifiques significatifs. Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons des tests classiques pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous appliquons plusieurs mesures sur le même animal dès que possible.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des chirurgies, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Un renforcement des enrichissements (igloo, coton, tunnel, roue…) est utilisé dans les cages d’hébergements. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratations sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel nutritif ou de croquettes mouillées. Plusieurs points limites spécifiques et précoces pendant la chirurgie (hémorragies, baisse des constantes vitales etc…), post-chirurgie (infections, douleurs persistantes) ou post-stimulation sonore basés sur une grille de scorage incluant aspect extérieur, activité de déplacement, capacité à boire et s’alimenter, réactivité à la préhension, isolement du groupe, sont établis pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de P10-P12. Le projet impliquera principalement donc des animaux âgés d’au moins P10 afin de pouvoir étudier les effets du bruit sur le système auditif au cours de la vie de l’animal.

Les points limites reposent sur la Rabbit Grimace Scale, une lecture des joues, des yeux, des oreilles et des moustaches pour repérer la douleur. 20 lapins New Zealand sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, gardés trois mois en observation puis tués pour analyse histologique. Chacun subit l'ablation du cristallin d'un œil et la pose d'un sac capsulaire artificiel sous anesthésie générale, puis des collyres quotidiens pendant deux semaines, avec une irritation de la cornée annoncée pour sept à dix jours et une gêne visuelle d'une quinzaine de jours. Le résumé décrit une anesthésie unique d'une heure trente couvrant les deux interventions, et annonce ailleurs que les lapins seront implantés deux semaines après le retrait du cristallin.

Objectifs

La perte du cristallin chez les patients à deux origines majeures : *La cataracte qui est une opacification partielle ou totale du cristallin qui menace la vue à long terme. Elle touche plus d’une personne sur cinq à partir de 65 ans et près de deux sur trois après 85 ans. L’opération de la cataracte consiste à inciser le cristallin, puis à y injecter une lentille intraoculaire IOL (Intraoculaire Lens) afin de restituer l’acuité visuelle du patient. Certaines complications de l’opération peuvent amener à une rupture du sac capsulaire entraînant un déplacement de l’IOL dans la cavité vitréenne. L’IOL sélectionné ne peut plus être utilisé et le chirurgien doit alors envisager une opération secondaire pour le remplacer. *L’aphaquie congénitale ou traumatique : La luxation ou l’absence totale de cristallin peut aussi intervenir : • Suite à des maladies du tissu élastique ou certaines pathologies oculaires, qui fragilisent le complexe cristallin-sac capsulaire-zonule • Suite à un traumatisme contusif violent • Suite à de la radiothérapie pour des traitements ophtalmiques oncologiques Notre équipe en collaboration avec un laboratoire spécialisé dans les implants oculaires a développé un sac capsulaire artificiel, remplaçant totalement le cristallin et permettant de : • Eviter les opérations secondaires de la cataracte suite à des complications • Apporter une alternative facilement implantable suite au cas de luxation ou d’absence naturelle totale de cristallin. Après de multiples tests d’implantations dans des yeux artificiels, une étude préclinique chez l’animal est indispensable avant le passage chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’implantation de ce sac capsulaire artificiel appelé MIOS remplacera totalement le cristallin et permettra d’éviter les opérations secondaires de la cataracte suite à des complications des anciennes génération d’implants (IOL) et apportera une alternative facilement implantable suite au cas de luxation ou d’absence naturelle totale de cristallin de plus il peut permettre d’intégrer des inserts cosmétiques permettant de traiter les défauts d’IRIS (Aniridie). L’opération de la cataracte est l’intervention chirurgicale la plus fréquente au monde. Près de 4.700.000 personnes sont opérées en Europe chaque année (INSERM 2017) et 800.000 opérés en France en 2020

Procédures

Une anesthésie générale de 1h30 avec deux interventions chirurgicales ophtalmologiques: Exérèse du cristallin (20 min) puis pose d'un implant oculaire (sac capsulaire artificiel) (15 min). Des soins post opératoires quotidien de 5 minutes (instillation de collyre) pendant 2 semaines. Une anesthésie pour la mise à mort de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une gêne dans l’acclimatation de la vue pendant environs 15 jours après l’opération. Ils ressentiront une irritation de la cornée au niveau du site opératoire pendant une période de 7 à 10 jours.

Devenir

Tout les animaux ayant subit la procédure seront gardés en observation pendant 3 mois puis ils seront mise à mort pour évaluation histologique.

Remplacement

Pour répondre au principe de remplacement la mise au point de la technique de greffe du sac capsulaire artificiel a été réalisée sur des yeux artificiels malgré tout il est indispensable de passer sur un modèle animal pour suivre l’intégration et la fonctionnalité de l’implant au court du temps.

Réduction

Ce projet a pour but une application direct en médecine humaine de cette nouvelle forme d’implant. Il est donc important de prouver la bonne intégration et le bon fonctionnement de ce nouveau dispositif médical intraoculaire. En nous basant sur des études antérieures ayant permis la mise en application de prothèses intraoculaires nous avons pu déterminer que 20 lapins seraient suffisant. Dans un premier temps 10 lapins seront opérés d’un œil (retrait du cristallin) puis implantés deux semaines plus tard. Au terme des 3 mois d’évaluation sans complication majeure et avec une parfaite récupération de la vue le projet sera arrêté et l’étude validée. Dans le cas de complications lors de l’implantation, de rejet de l’implant par défaut de d’intégration ou de problèmes de récupération de la vue, 10 nouveaux lapins seront opérés en concertation avec le SBEA de notre établissement afin d’apporter des mesures correctives. Le minimum d’animaux utilisés sera donc de 10 et le maximum 20.

Raffinement

L’ensemble des procédures seront effectuées sous sédation profonde monitorée, couplée à une anesthésie locale médiée par un collyre ophtalmique. Le temps opératoire sera très courts maximum 30 minutes par œil et pratiqué par un chirurgien qualifié. Afin de garantir une parfaite transposition chez l’humain les soins post opératoires seront les mêmes qu’en médecine traditionnelle : -Injection sous conjonctivale d’anti-inflammatoire en fin d’intervention, ainsi qu'un collyre anti-rejet. -Pommade ophtalmique deux fois par jour jusqu’à cicatrisation totale soit 7 à 10 jours. Chaque jour, un examen ophtalmologique sera pratiqué ainsi que des photos seront réalisées afin de suivre la bonne intégration de l'implant. A 3 mois post-greffe les cornées seront prélevées pour analyses histologiques. La manipulation des lapins sera facilitée par des séances d’entrainement récompensée (Fruity bites) durant les deux semaines d’acclimatation pré-opératoire. Des Bunny Block, des briquettes de bois et de luzerne seront disposés dans la cage de façon alterné afin d'assurer l'enrichissement du milieu et de la musique douce sera diffusée quotidiennement. Les lapins seront hébergés par deux dans de grandes cage aux normes européennes. Les points limites seront déterminés en se basant sur le Rabbit Grimace Scale. Cette évaluation consiste à observer attentivement les joues, les yeux, les oreilles, le museau et les moustaches de l'animal en tenant compte d'une échelle d’évaluation des expressions faciales du lapin. Dans cette étude nous porterons une attention toute particulière aux yeux et au regarde.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le lapin new zealand. L’expérimentation proposée est relativement facile chez le lapin car la taille de l’œil est proche de celle de l’homme. Les lapins peuvent sous sédation être facilement examinés au biomicroscope pour la réalisation de photos post-opératoires et sont de très bons candidats pour cette mise au point. Stade adulte afin que l'oeil de l'animale ait atteint sa taille maximale. Soit 2kg à 2.5 kg

Exposées chaque jour à une source de lumière bleue pendant six à douze heures sur une période de 28 jours, les mouvements restreints pour optimiser l'exposition, 900 souris et 900 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent jusqu'à six à huit instillations oculaires par jour, des administrations systémiques quotidiennes, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des examens de la cornée sous sédation. Le porteur décrit les trois protocoles d'induction retenus comme "les moins contraignants pour les animaux", et annonce des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure et de corps étranger dans les yeux. Sur les 1 800 rongeurs, 180 sortiront de l'étude après les examens d'inclusion et pourront être réutilisés dans d'autres procédures, les 1 620 autres étant tués pour les analyses histologiques.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de développer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat et la souris afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. Le syndrome de l'œil sec est une maladie multifactorielle affectant les larmes et la surface oculaire, plus fréquente chez les femmes et les personnes âgées, et touchant entre 5% et 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs sont bien documentés dans la littérature. Nous avons sélectionné trois modèles parmi les plus référencés, les plus efficaces en termes d'impact sur la surface oculaire et de réduction de la sécrétion de larmes, et les moins contraignants pour les animaux. Nous utilisons déjà ces modèles et souhaitons continuer à les proposer.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer des modèles expérimentaux performants permettant d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements. Dans un contexte où la recherche thérapeutique évolue constamment, il est essentiel de disposer d’outils fiables et adaptés pour tester ces innovations dans des conditions optimales. Ces travaux contribueront ainsi à améliorer la pertinence des résultats tout en veillant strictement au respect des principes de bien-être animal.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à différents types d’interventions tout au long des 28 jours d’étude : 1. Exposition à la lumière bleue Afin d’induire et de favoriser l’apparition des signes de la maladie, les animaux seront exposés quotidiennement à une source de lumière bleue pendant une durée de 6 à 12 heures, sur une période maximale de 28 jours. 2. Examens Les animaux feront l’objet de plusieurs examens visant à suivre l’installation de la maladie, évaluer l’efficacité des traitements ainsi que leur état général et leur bien-être. La mesure de la production lacrymale et l’évaluation de l’intégrité du film lacrymal et de la surface oculaire sont des examens rapides, réalisés en quelques secondes, à raison de 1 à 2 fois par semaine. L’observation in vivo des couches cellulaires de la cornée constitue l’examen le plus long, sans dépasser 5 minutes, et sera réalisée une fois par semaine. L’évaluation des cellules à mucus, effectuée 1 à 2 fois sur les 28 jours, est également très rapide et ne dure que quelques secondes. 3. Administration des traitements Les traitements pourront être administrés par instillation oculaire chez des animaux vigiles, avec une fréquence variable pouvant atteindre plusieurs administrations quotidiennes (en moyenne 3, jusqu’à un maximum de 6 à 8 par jour). Les administrations systémiques (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou orale) pourront être réalisées quotidiennement. L’ensemble des traitements sera administré pendant toute la durée de l’étude (maximum 28 jours) et chaque administration dure seulement quelques secondes. Certains examens ou administrations pourront nécessiter une sédation ou une anesthésie, qui resteront de courte durée et limitées afin de minimiser les effets secondaires. 4. Prélèvements sanguins Des prélèvements sanguins pourront être réalisés afin d’évaluer l’efficacité des traitements. Ces procédures sont rapides (quelques secondes) et leur fréquence sera limitée à une fois par semaine. 5. Suivi sanitaire et comportemental Un suivi quotidien de l’état sanitaire et du comportement des animaux sera assuré, complété par une pesée hebdomadaire. Les manipulations associées sont très brèves et les animaux seront immédiatement replacés dans leur environnement habituel.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux devraient principalement refléter celles observées dans la sécheresse oculaire chez l’homme, notamment des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de sable ou de corps étranger dans les yeux. Ces manifestations sont liées à la composante inflammatoire de la pathologie. Le modèle expérimental inclura une exposition quotidienne répétée à la lumière bleue sur une période allant jusqu'à 28 jours, pouvant atteindre jusqu’à 12 heures par jour. Cette exposition, susceptible d’accentuer les signes d’inconfort oculaire en induisant ou en aggravant les altérations de la surface oculaire, notamment un dégagement de chaleur produit par les sources lumineuses, nécessitera de restreindre les mouvements de l'animal afin d'optimiser l'exposition Par ailleurs, les animaux seront soumis à un stress lié aux manipulations nécessaires à l’évaluation de la sécheresse oculaire. Ces manipulations incluent notamment le maintien de l’animal, l’instillation de solutions ou de colorants (fluorescéine, vert de lissamine), la réalisation du test de Schirmer pour mesurer la production lacrymale, l’évaluation du temps de rupture du film lacrymal (TBUT), ainsi que des examens cliniques répétés de la surface oculaire. Ces interventions, bien que brèves, peuvent engendrer un stress transitoire. L’administration des produits testés devrait entraîner, au maximum, une gêne locale de courte durée, potentiellement associée à une hyperémie conjonctivale, comme observé chez l’homme. De plus, l’administration sous-cutanée ou transdermique pourrait occasionner une légère réaction inflammatoire locale, se manifestant par une rougeur au point d’administration, sans conséquence majeure. Dans l’ensemble, ces nuisances sont attendues comme modérées et transitoires, et feront l’objet d’une surveillance attentive afin de garantir le respect du bien-être animal.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale : examens, induction de la pathologie et traitements, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Mais nous est estimons qu’une proportion de 10% animaux ne suivra pas la totalité de la procédure. Ces animaux seront potentiellement exclus de l’étude après les examens d'inclusion pratiqués en baseline qui servent à révéler un défaut anatomique ou physiologique. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie. Ils pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire

Remplacement

L'œil est un organe complexe, composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à des interactions biologiques significatives avec les tissus et organes voisins. À ce jour, bien que des méthodes alternatives telles que les tests in vitro (sur cellules ou tissus) et les simulations in silico existent, aucune ne permet de reproduire l'œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux vivants dans ces procédures expérimentales reste encore nécessaire pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d'animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction des distributions théoriques rencontrées dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées, et en tenant compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l'effectif sera réalisé avant chaque étape afin d'ajuster et de revoir à la baisse, si possible, le nombre d'animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera réalisé afin de limiter autant que possible l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront hébergés en groupe dans des cages équipées de nourriture et d’eau disponibles ad libitum, ainsi que d’éléments d’enrichissement à ronger. En fonction de leur comportement et des premiers résultats obtenus, cet enrichissement pourra être complété par des équipements supplémentaires, tels que des balançoires. Il pourra également être nécessaire de placer la nourriture à l’intérieur de la cage afin de ne pas réduire l’exposition à la lumière. Les examens non invasifs sélectionnés pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont comparables à ceux réalisés chez l’homme en cabinet d’ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Les examens oculaires nécessitant l’immobilité de l’animal pourront être effectués sous anesthésie afin d’assurer son confort. Des points limites adaptés, précoces et suffisamment prédictifs seront définis afin de minimiser toute douleur. Ce projet a été soumis à un comité d’éthique pour évaluation et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l’établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la littérature scientifique, facilitant ainsi l'extrapolation des effets sur l'œil à l'homme. De plus, les modèles expérimentaux de cette pathologie sont largement utilisés et bien documentés pour ces espèces, sur lesquelles le projet est basé. Pour ce projet, des souris et des rats ont été retenus afin de tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce, augmentant ainsi les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les rongeurs inclus dans ce projet auront entre 6 et 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles.

Jusqu'à deux injections sous-cutanées par jour, trois injections intraveineuses par semaine, et selon les protocoles une injection dans l'œil sous microscope chirurgical une à deux fois par semaine : 1 185 souris et 1 185 rats, soit 2 370 rongeurs, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une maladie auto-immune leur est provoquée par immunisation, avec des atteintes motrices progressives allant de la faiblesse de la queue à une paralysie partielle, une perte de poids et une baisse de la vision. Il s'agit de tester des candidats médicaments contre la sclérose en plaques et la névrite optique qui l'accompagne. Le porteur donne d'abord des raisons anatomiques et physiologiques au recours aux rongeurs, puis indique que "les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat".

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place un modèle de névrite optique chez le rongeur dans le but de tester des traitements potentiels. La névrite optique (NO) est une inflammation aiguë du nerf optique qui entraîne une altération de la transmission des signaux visuels entre la rétine et le cerveau, elle survient essentiellement chez les jeunes adultes. Les symptômes sont une perte visuelle chez le jeune adulte, des douleurs optiques modérées qui sont amplifiées par des mouvement oculaires, chez l’homme les symptômes ne touchent généralement qu’un seul œil. Dans la majorité des cas la névrite optique est une manifestation de la sclérose en plaque. C'est une maladie auto-immune inflammatoire du SNC, dans laquelle des lymphocytes T et B auto-réactifs dirigés contre des antigènes de la myéline sont activés, traversent la barrière hémato-encéphalique, et produisent une inflammation du nerf optique avec une démyélinisation prédominante. D’autres causes sont possibles comme des maladies infectieuses (virales ou bactériennes), maladies auto-immunes (lupus, sarcoïdoses), toxiques ou médicamenteuses (plomb, tabac, antibiotiques). L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour le développement préclinique de candidats médicaments destinés au traitement de la sclérose en plaques (SEP) et de la névrite optique associée en reproduisant de manière concomitante l’activation immune systémique, l’inflammation du SNC, la démyélinisation et la dégénérescence axonale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer au développement de traitements thérapeutiques destinés aux maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et les névrites optiques associées, en évaluant l’efficacité de candidats dans un contexte physiopathologique complexe intégrant inflammation, démyélinisation et atteinte neuro‑axonale.

Procédures

L'induction de la pathologie se fait par injection sous-cutanée en début d'étude, accompagnée de 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile pour stimuler le système immunitaire et déclencher la maladie auto-immune. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Le nombre d’administration varie en fonction du traitement à tester et du mode d’injection, avec un maximum de 2 injections par jour en sous cutané, une administration orale ou intrapéritonéale par jour ou de 3 injections intraveineuses par semaine. Si le produit doit être administré par injection au niveau de l’œil, l’animal sera anesthésié de façon générale et locale. La fréquence sera plus limitée, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle d’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale (EAE) et à l’évolution de la maladie. L’induction par immunisation induit un inconfort transitoire lié aux injections avec une réaction inflammatoire locale modérée au site d’injection. Au cours du développement de l’EAE, les animaux vont présenter des altérations motrices progressives, pouvant aller d’une faiblesse de la queue ou des membres postérieurs à une paralysie partielle, évaluée quotidiennement par un score clinique standardisé. Une diminution de l’activité spontanée et de la mobilité est observée, ainsi qu’une perte de poids liée à l’inflammation systémique et à la diminution de l’activité. La sévérité du projet est classée modérée, des points limites (score moteur, altération de l’état général, perte de poids excessive) permettront d’éviter l’apparition de cas sévères. Les animaux auront également une altération de la vision, d'après notre expérience pour d'autres modèles expérimentaux, les rongeurs qui ont une baisse de la vision, ont un comportement comparable aux animaux naifs, en terme de mobilité dans la cage, acces à la nourriture et l'eau.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procedure pour réaliser des évaluation ex vivo des tissus, histologie, immuno marquage, dosage de biomarqueurs.

Remplacement

L’étude de la pathologie et des effets de potentiels traitements nécessitent l’analyse intégrée et dynamique des interactions entre le système immunitaire, le système nerveux central, la barrière hémato‑encéphalique et les cellules gliales, ainsi que l’évaluation de conséquences fonctionnelles et structurelles au niveau du nerf optique et de la rétine. À ce jour, aucune méthode alternative non animale (modèles in vitro, ex vivo, organoïdes, approches in silico) ne permet de reproduire la complexité de la réponse auto‑immune systémique impliquée dans l’EAE, la migration des cellules immunitaires vers le système nerveux central, la démyélinisation inflammatoire in vivo, ni l’évolution temporelle des atteintes neuro‑axonales et visuelles. Les approches in vitro et ex vivo disponibles sont utiles pour l’étude de mécanismes cellulaires isolés ou pour le criblage préliminaire de composés, mais ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale et la tolérance d’un candidat médicament dans un contexte physiopathologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats. Une analyse de puissance, sera systématiquement réalisée en amont de chaque série expérimentale, afin de déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Un test statistique sera utilisé pour conclure sur la significativité des résultats. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum) dans des cages incluant des abris et des objets à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Si l’immobilité est requise pour un examen (confocal) une anesthésié légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. L’induction de l’EAE repose sur un protocole standardisé et maîtrisé, largement validé dans la littérature et par l’expérience de l’équipe, afin de limiter la variabilité et la sévérité excessive du modèle. L’accès facilité à l’eau et à la nourriture sera facilité pour les animaux présentant des troubles moteurs (abreuvoirs et nourriture placés à hauteur accessible). La durée d’exposition à la maladie est strictement limitée aux temps nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques. Des points limites précoces et clairement définis sont appliqués (score moteur élevé, perte de poids excessive, altération marquée de l’état général). En cas d’atteinte sévère ou de dépassement des points limites, une mise à mort anticipée est réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs qui seront dejà formés aux techniques de manipulations, d'injections ou d'administration de substances avant d'intervenir sur le projet, ainsi qu' à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, dans le contexte de l’étude de névrite optique. Les rongeurs sont bien caractérisés pour l’étude de l’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale modèle de référence des maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central. Les mécanismes d’inflammation du système nerveux central, la démyélinisation et l’atteinte axonale secondaire du nerf optique est bien documentée. Les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat. Les rongeurs sont adaptés aux administrations systémiques, péri-oculaires et intra-oculaires, potentiellement utilisées dans les tests d’efficacité de traitement. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes. Les publications indiquent un âge de 8 à 10 semaines pour les souris et 8 à 12 semaines pour les rats au moment de l’induction. Le système immunitaire est alors pleinement mature pour obtenir une induction fiable et reproductible. Le système nerveux central est complètement développé et permet d’étudier la démyélinisation, d’inflammation et d’atteinte neuro‑axonale au niveau du nerf optique, de la rétine et de la moelle épinière. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.

Tous tués à l'issue pour que leurs yeux soient prélevés et analysés, 9 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une injection de vecteur lentiviral sous la rétine, sur un œil ou sur les deux, puis quatre à seize séances d'anesthésie de une à quatre heures, espacées de une à deux semaines. Le porteur indique que l'injection devrait provoquer un léger traumatisme de l'œil et peut entraîner une hémorragie localisée, et que des effets plus graves, décollement rétinien ou endophtalmie, peuvent être attendus, avec douleur, photophobie, hausse de la pression intraoculaire et baisse de l'acuité visuelle. Il écrit s'entraîner à l'injection sur des ouistitis mis à mort dans d'autres projets, et affirme qu'aucun dispositif in vitro ne reproduit la fovéa et la macula, structures absentes chez les rongeurs.

Objectifs

Les dystrophies rétiniennes génétiques sont des maladies des yeux qui font perdre la vue précocement et ont un impact socio-économique important. La thérapie génique est la solution la plus prometteuse pour soigner ces maladies. Elle consiste à remplacer un gène défectueux par un nouveau gène. Pour cela, on utilise un « vecteur » qui transporte le nouveau gène jusqu'aux cellules de la rétine. L'objectif de cette étude est de tester un nouveau type de vecteur pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique de la rétine. Actuellement, il n'y a qu'une thérapie génique pour une maladie des yeux concernant un gène unique (nommé « RPE65 »). Mais il n’est pas possible d’utiliser cette thérapie pour toutes les maladies des yeux d'origine génétique, car les méthodes actuelles ne peuvent pas manipuler des gènes de trop grande taille. La technologie utilisée ici permet de transférer des gènes de toute taille, et serait donc applicable à toutes les maladies rétiniennes. Le gène qui sera utilisé dans cette expérience est de grande taille et ses mutations sont responsables de la plus fréquente maladie génétique de la rétine : la maladie de Stargardt. Des essais cliniques sont en cours concernant cette maladie, cependant les vecteurs utilisés sont inefficaces. Notre projet vise donc à utiliser une nouvelle technologie pour augmenter significativement l’efficacité de la thérapie. Des tests sur la souris avec ce vecteur ont montré une augmentation d’efficacité de ~5 % à ~90 % dans les photorécepteurs, comparé aux thérapies géniques préexistantes. Nous voulons maintenant vérifier si le système fonctionne de la même manière chez les primates non-humain. Nous allons d'abord regarder le taux d’intégration du gène dans les cellules de la rétine, puis nous vérifierons si le fonctionnement de la rétine est modifié après l’intervention.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sur les primates non humains sont aussi concluants que ceux observés sur les souris, cela pourrait représenter une avancée majeure pour l’utilisation de ce vecteur chez l’homme, notamment pour les mutations du gène testé dans cette étude, mais aussi pour d’autres gènes responsables des maladies rétiniennes génétiques. Les vecteurs classiquement utilisés, appelés adenoassociated virus (AAV) sont couramment utilisés pour cibler la rétine en raison de leur affinité naturelle pour l'œil. Toutefois, un inconvénient majeur des AAV réside dans leur capacité de charge limitée (taille du matériel génétique), ce qui restreint leur application aux gènes de petite taille. Cette contrainte empêche le développement de traitements pour les nombreuses maladies rétiniennes génétiques causées par des gènes volumineux. Les vecteurs lentiviraux (lentivirus, LV), en raison de leur capacité de charge nettement plus grande, représentent une solution prometteuse. Un autre avantage des lentivirus réside dans la faible réaction inflammatoire qu’ils induisent. Ainsi, ils constituent une option prometteuse pour les thérapies géniques rétiniennes, surmontant les limitations des AAV et offrant de nouvelles perspectives pour traiter de nombreuses maladies rétiniennes génétiques.

Procédures

1 intervention pour des injections sous-rétiniennes de 1 à 4 heures, 4 à 16 sessions d'anesthésie de 1 à 4 heures: il s'agira donc d'anesthésies répétées à 1-2 semaines d'intervalles.

Impact sur les animaux

Le gène lié à cette étude code pour une protéine qui intervient dans le transport de dérivés de la vitamine A au travers la rétine. Une surexpression temporaire de cette protéine chez un animal sain ne causera donc aucun phénotype dommageable mais cette protéine non native pourrait créer une réponse immunitaire inflammatoire. L'injection sous-rétinienne sera effectuée par un chirurgien ophtalmologue. Elle devrait provoquer un léger traumatisme localisé de l'œil, potentiellement une hémorragie localisée. Des effets indésirables plus graves, tels qu’un décollement rétinien ou une endophtalmie, peuvent être attendus, entraînant douleur, photophobie, rougeur, augmentation de la pression intraoculaire et une baisse de l'acuité visuelle. Réponse inflammatoire au vecteur viral : ils sont connus pour déclencher une réponse immune innée et adaptative. Une inflammation locale peut être attendue, généralement transitoire entre ~24-72 heures après la dose. Les signes cliniques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, une fermeture persistante des yeux, une difficulté avec les mouvements oculaires et une augmentation de la pression intraoculaire. Réponse inflammatoire au transgène : L'expression du gène d'intérêt est attendue environ 2 à 3 semaines après l'administration. Cette expression pourrait entraîner une réponse immunitaire anti-transgène. Notre vecteur codera pour le gène natif du tamarin. La production de la protéine transgénique pourrait entraîner une inflammation locale. Les signes cliniques typiques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, la fermeture des yeux, des difficultés avec les mouvements oculaires (de façon similaire à la réponse immunitaire au vecteur viral). Enfin il nous faut mentionner le stress lié à la préhension et aux anesthésies répétées que subiront les animaux.

Devenir

Pour la seule procédure, tous les animaux seront euthanasiés à la fin car les yeux doivent être extraits pour l'analyse physiopathologique.

Remplacement

Les aspects de la technologie qui ne nécessitent pas de modèles de primates non-humains (PNH) in vivo ont été développés à l'aide de méthodes in vitro (organoïdes rétiniens humains) et testés par administration chez la souris. Cependant, il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de simuler l'impact de l'efficacité de la transduction sur l'architecture de l'œil, les mécanismes d'élimination de cette voie d'administration, et la réponse immune innée et adaptative au vecteur. En particulier, la technologie vise à traiter des maladies rétiniennes affectant la fovéa et la macula, des structures oculaires qui ne peuvent pas être modélisées avec précision chez d'autres espèces (sans fovéa, ex : les rongeurs). C'est pourquoi les vecteurs doivent encore être évalués pour leur efficacité et leur sécurité dans des modèles animaux de grande taille avant d'être testés chez des patients humains.

Réduction

Des données préliminaires obtenues sur des organoïdes rétiniens et dans des modèles murins permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir la preuve du concept chez le ouistiti. Les doses utilisées par animal seront étalées de façon à permettre une analyse intermédiaire du tropisme du vecteur. Si la transduction du vecteur s'avère moins variable que prévu, cela pourrait permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre les objectifs de cette étude. Toutefois, ces injections n'ayant jamais été testées chez les primates non humains, un risque de perte animale et/ou de problèmes liés à l'injection est à prévoir. Pour quantifier les conséquences de l’administration du composé sur le bien-être animal, nous commencerons par injecter un œil à la plus faible dose du protocole à un premier animal. Trois doses seront ensuite testées sur les deux yeux de groupes de deux animaux (n = 6). Nous estimons les risques de sortir du protocole à 20 %, ce qui correspond à 7 animaux, soit 8,4 animaux au total, arrondi à la hausse pour tenir compte de la marge d'erreur. Pour limiter encore ce nombre, nous nous entraînerons à l’injection sur des animaux mis à mort dans le cadre d'autres projets. L’approche statistique consistera à comparer, sur des tranches histologiques, le nombre de photorécepteurs présentant le transgène, en comparant « œil sain vs œil injecté » sur le premier animal, puis à comparer ce nombre en fonction des deux constructions virales chez les animaux injectés bilatéralement, et ceci en fonction des trois doses utilisées sur des groupes de deux animaux. Dans ce contexte, une simple analyse de variance permettra d’évaluer la significativité de l’augmentation de la transduction. À noter que si les premières doses s’avèrent efficaces pour prouver l’amélioration de la transduction (> 80 %), les animaux des doses supérieures ne seront pas utilisés.

Raffinement

Les doses du vecteur ont été adaptées à partir de doses bien tolérées chez d'autres modèles mammifères (souris et rats) et ne dépasseront pas celles bien tolérées lors des essais cliniques chez l’homme. Des méthodes de dosage cliniques modifiées seront utilisées pour l'administration du vecteur. Pour l’administration, la vitrectomie sera évitée afin de minimiser le risque de traumatisme rétinien. Des médicaments pour réduire la réponse immunitaire et soulager la douleur seront donnés avant, pendant et après la chirurgie afin de minimiser les risques d'inflammation et de douleur. L'administration sous-rétinienne, réalisée par un chirurgien ophtalmologue, minimise considérablement la bio-distribution du vecteur et limite la probabilité de déclencher une forte réponse immunitaire. Cette réponse ne devrait pas causer de douleur ou de détresse et se résorbera en quelques jour. La protéine générée par le transgène administré ne sera pas secrétée par les cellules rétiniennes et restera liée à la membrane interne des cellules. Ces caractéristiques devraient minimiser le risque de réponse anti-transgène. Le dosage des animaux individuels sera étalé pour surveiller les événements indésirables liés au vecteur ou au transgène, permettant ainsi des modifications des protocoles, des procédures ou des doses si besoin et si ces changements ne modifient pas les objectifs scientifiques de l'étude. En particulier, avant de l’appliquer à tous les animaux, un premier animal sera injecté sur un seul œil pour vérifier par une observation (photophobie, œil fermé, position prostré) et/ou auscultation (œil rouge et inflammé) quotidienne que le protocole ne génère pas d’impact sur le bien-être de l’animal. En cas contraire, qui reste peu probable compte tenu des mesures déjà prises, nous ajusterons la dose pour les prochains et continueront ainsi animal par animal jusqu’à trouver la bonne dose. Cette approche minimisera la douleur ou les dommages potentiels. Tous les tests ophtalmologiques et de santé seront réalisés sous anesthésie afin d'éviter le stress que cela provoquerait si l'on les réalisait à l'état éveillé. Les procédures de surveillance réalisées sous anesthésie seront exécutées de manière séquentielle pour minimiser le nombre total d'inductions requises. Les animaux seront logés par paires dans des volières adaptées enrichies de divers éléments (hamacs, tunnels, nids suspendus, perchoirs, etc.).

Choix des espèces

L'objectif principal de l'étude est d'examiner l'efficacité de transduction d'un nouveau système vectoriel destiné à des applications cliniques en thérapie génique. L'efficacité prédite de la transduction déterminera la probabilité que

Exposition à un bruit fort pendant une à deux heures, tests auditifs sous anesthésie avec électrodes placées sous la peau, prélèvements de sang répétés jusqu'à six semaines : ces actes sont déclarés dans le premier des deux établissements, le résumé précisant qu'aucune intervention ne sera effectuée dans le second. 4 590 souris sont pourtant déclarées ici aussi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce second résumé reprenant mot pour mot le texte du premier, publié sous le même titre suivi de 2/2. Les 1 530 souris transférées dans ce second établissement y sont mises à mort pour analyser les mêmes tissus de l'oreille interne que les 3 060 autres. Le passage consacré au raffinement reprend lui aussi, mot pour mot, celui qui porte sur la réduction du nombre d'animaux non-humains, si bien que rien n'est dit des conditions faites aux souris.

Objectifs

Le projet se réalise dans deux établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2). La perte auditive présente dès la naissance, touche 26 millions de personnes dans le monde, dont 60 % (environ 15 millions) sont dues à des facteurs génétiques. Cependant, plus de 440 millions de personnes souffrent d’une surdité acquise ou progressive après la naissance, qu’elle soit liée à l’âge, au bruit ou à d’autres facteurs. La perte auditive liée à l'âge (ou presbyacousie) a un impact significatif sur la qualité de vie : 1 adulte sur 3 âgé de plus de 65 ans souffre d'un certain degré de perte auditive. Bien que les mécanismes sous-jacents à ces déficiences auditives restent à élucider, il est de plus en plus reconnu que l'inflammation joue un rôle crucial dans le développement et la progression des troubles auditifs, qu’ils soient d’origine génétique, environnementale (exposition au bruit) ou lié à l’âge. En étudiant des modèles de souris présentant une surdité progressive ou liée au bruit, ciblant des gènes clés liés à l'immunité et ses voies de régulation, nos objectifs sont de : - caractériser les voies moléculaires, découvrir des marqueurs précoces, précis, et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive - Étudier les liens entre l’inflammation, les marqueurs immunitaires et la perte auditive, en conditions normales et après exposition à des bruits. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à des traitements ciblant l’inflammation dans l’oreille interne, réduisant ainsi les dommages auditifs et améliorant la fonction auditive.

Bénéfices attendus

Les données obtenues de ce projet nous permettront de mieux comprendre la relation entre la surdité progressive ou liée au bruit et la dérégulation des voies immunitaires. Nous identifierons également des biomarqueurs précoces, précis et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive. Cela nous permettra de développer des thérapies ciblées pour atténuer les lésions auditives, applicables aux patients. À court terme, nous identifierons des marqueurs biologiques et des mécanismes physiopathologiques. À long terme, ces connaissances permettront de concevoir des traitements innovants pour préserver l'audition, avec des applications potentielles pour les humains et les animaux. Les résultats pourraient également contribuer à la prévention de la surdité induite par le bruit, un problème de santé publique majeur. Ce travail fondamental aura ainsi un impact significatif sur la recherche médicale et les applications cliniques futures.

Procédures

Dans l’EU1/2 : Exposition sonore : Les souris âgées de 3 semaines seront exposées pendant 1 ou 2 heures à un bruit d’un niveau sonore comparable à celui d’une discothèque ou une circulation urbaine dense. Tests auditifs : Des tests auditifs seront effectués dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Prélèvements de sang : Un petit échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes par prélèvement) avant l’exposition sonore, puis à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Aucune intervention ne sera effectuée dans l’EU2/2. Toutes les souris transférées dans l’EU2/2 seront mis à mort afin d’analyser des tissus.

Impact sur les animaux

Dans l’EU1/2 et l’EU2/2, certaines souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort à l’âge de 60 jours. Les autres modèles murins, bien que sourds, ne présentent aucun autre symptôme et conservent un phénotype identique à celui des souris sauvages. Dans l’EU1/2, quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : L’exposition sonore peut potentiellement induire un stress temporaire sur l’animal. Les études scientifiques sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. Aucune dégradation durable de leur état de santé n’est anticipée, et aucun effet indésirable majeur (perte de poids, inactivité prolongée, comportement anormal) n’est attendu. Les tests auditifs nécessitent une contention de courte durée des souris, associée à une anesthésie générale légère pour les immobiliser. Bien que cette procédure puisse provoquer une angoisse passagère lors de la mise sous anesthésie, ses effets sont atténués par la courte durée du test (quelques minutes) et la réversibilité rapide de l'anesthésie. Aucun effet indésirable durable n'est attendu.

Devenir

À l'issue de cette procédure expérimentale, 3060 souris seront mises à mort dans l’EU1/2 pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques. Les autres animaux (soit 1530 souris) seront transférées à un collaborateur dans l’EU2/2 où ils seront mis à mort pour une analyse complémentaire des mêmes tissus.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous utiliserons des souris dans notre projet pour étudier les effets pathologiques de l’inflammation dans les surdités progressives ou liées au bruit, afin d’identifier des marqueurs biologiques, avec des applications potentielles pour les humains.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’homme, ces modèles vont nous permettre d’explorer la relation entre la dérégulation des voies immunitaires et la surdité progressive ou liée à l'âge, et fournir ainsi de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. Le projet impliquera principalement des souris adultes âgées de 3 semaines, correspondant au stade jeune adulte, afin d'étudier l'effet du bruit sur la réponse immunitaire dans l'oreille interne. Ce stade de développement a été choisi car l'oreille interne est complètement mature à ce stade, la réponse immunitaire est pleinement fonctionnelle, et cela permet d'étudier les effets du bruit sur un système auditif développé. La mise à mort se fera à 22 jours (soit 1 jour après exposition sonore) pour évaluer les effets immédiats, et entre 1 et 2 mois post-exposition pour évaluer les effets à long terme. Ces stades permettent d'étudier les réponses immunitaires aiguës à 22 jours, les changements chroniques entre 1 et 2 mois, et la progression potentielle de la perte auditive.

4 590 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 3 060 tuées dans le premier établissement pour prélever l'oreille interne, les 1 530 autres transférées chez un collaborateur où elles sont tuées pour les mêmes analyses. Dès l'âge de trois semaines, elles sont exposées une à deux heures à un bruit que le porteur compare à celui d'une discothèque, puis anesthésiées pour des tests auditifs avec électrodes sous la peau, répétés jusqu'à six semaines après l'exposition, et prélevées de sang à chaque échéance. Une partie d'entre elles, privées d'une protéine de l'audition, présentent des troubles de l'équilibre dès la deuxième semaine de vie, qui durent jusqu'à leur mise à mort à 60 jours. Le porteur écrit pourtant n'anticiper aucune "dégradation durable de leur état de santé".

Objectifs

Le projet se réalise dans deux établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2). La perte auditive présente dès la naissance, touche 26 millions de personnes dans le monde, dont 60 % (environ 15 millions) sont dues à des facteurs génétiques. Cependant, plus de 440 millions de personnes souffrent d’une surdité acquise ou progressive après la naissance, qu’elle soit liée à l’âge, au bruit ou à d’autres facteurs. La perte auditive liée à l'âge (ou presbyacousie) a un impact significatif sur la qualité de vie : 1 adulte sur 3 âgé de plus de 65 ans souffre d'un certain degré de perte auditive. Bien que les mécanismes sous-jacents à ces déficiences auditives restent à élucider, il est de plus en plus reconnu que l'inflammation joue un rôle crucial dans le développement et la progression des troubles auditifs, qu’ils soient d’origine génétique, environnementale (exposition au bruit) ou lié à l’âge. En étudiant des modèles de souris présentant une surdité progressive ou liée au bruit, ciblant des gènes clés liés à l'immunité et ses voies de régulation, nos objectifs sont de : - caractériser les voies moléculaires, découvrir des marqueurs précoces, précis, et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive - Étudier les liens entre l’inflammation, les marqueurs immunitaires et la perte auditive, en conditions normales et après exposition à des bruits. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à des traitements ciblant l’inflammation dans l’oreille interne, réduisant ainsi les dommages auditifs et améliorant la fonction auditive.

Bénéfices attendus

Les données obtenues de ce projet nous permettront de mieux comprendre la relation entre la surdité progressive ou liée au bruit et la dérégulation des voies immunitaires. Nous identifierons également des biomarqueurs précoces, précis et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive. Cela nous permettra de développer des thérapies ciblées pour atténuer les lésions auditives, applicables aux patients. À court terme, nous identifierons des marqueurs biologiques et des mécanismes physiopathologiques. À long terme, ces connaissances permettront de concevoir des traitements innovants pour préserver l'audition, avec des applications potentielles pour les humains et les animaux. Les résultats pourraient également contribuer à la prévention de la surdité induite par le bruit, un problème de santé publique majeur. Ce travail fondamental aura ainsi un impact significatif sur la recherche médicale et les applications cliniques futures.

Procédures

Dans l’EU1/2 : Exposition sonore : Les souris âgées de 3 semaines seront exposées pendant 1 ou 2 heures à un bruit d’un niveau sonore comparable à celui d’une discothèque ou une circulation urbaine dense. Tests auditifs : Des tests auditifs seront effectués dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Prélèvements de sang : Un petit échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes par prélèvement) avant l’exposition sonore, puis à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Aucune intervention ne sera effectuée dans l’EU2/2. Toutes les souris transférées dans l’EU2/2 seront mis à mort afin d’analyser des tissus.

Impact sur les animaux

Dans l’EU1/2 et l’EU2/2, certaines souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort à l’âge de 60 jours. Les autres modèles murins, bien que sourds, ne présentent aucun autre symptôme et conservent un phénotype identique à celui des souris sauvages. Dans l’EU1/2, quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : L’exposition sonore peut potentiellement induire un stress temporaire sur l’animal. Les études scientifiques sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. Aucune dégradation durable de leur état de santé n’est anticipée, et aucun effet indésirable majeur (perte de poids, inactivité prolongée, comportement anormal) n’est attendu. Les tests auditifs nécessitent une contention de courte durée des souris, associée à une anesthésie générale légère pour les immobiliser. Bien que cette procédure puisse provoquer une angoisse passagère lors de la mise sous anesthésie, ses effets sont atténués par la courte durée du test (quelques minutes) et la réversibilité rapide de l'anesthésie. Aucun effet indésirable durable n'est attendu.

Devenir

À l'issue de cette procédure expérimentale, 3060 souris seront mises à mort dans l’EU1/2 pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques. Les autres animaux (soit 1530 souris) seront transférées à un collaborateur dans l’EU2/2 où ils seront mis à mort pour une analyse complémentaire des mêmes tissus.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous utiliserons des souris dans notre projet pour étudier les effets pathologiques de l’inflammation dans les surdités progressives ou liées au bruit, afin d’identifier des marqueurs biologiques, avec des applications potentielles pour les humains.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’homme, ces modèles vont nous permettre d’explorer la relation entre la dérégulation des voies immunitaires et la surdité progressive ou liée à l'âge, et fournir ainsi de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. Le projet impliquera principalement des souris adultes âgées de 3 semaines, correspondant au stade jeune adulte, afin d'étudier l'effet du bruit sur la réponse immunitaire dans l'oreille interne. Ce stade de développement a été choisi car l'oreille interne est complètement mature à ce stade, la réponse immunitaire est pleinement fonctionnelle, et cela permet d'étudier les effets du bruit sur un système auditif développé. La mise à mort se fera à 22 jours (soit 1 jour après exposition sonore) pour évaluer les effets immédiats, et entre 1 et 2 mois post-exposition pour évaluer les effets à long terme. Ces stades permettent d'étudier les réponses immunitaires aiguës à 22 jours, les changements chroniques entre 1 et 2 mois, et la progression potentielle de la perte auditive.

Former des professionnels de santé à la pose de dispositifs implantables : 1125 animaux non-humains vont être utilisés, 600 moutons, 400 cochons, 100 bovins et 25 chiens, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal subit des prélèvements sanguins hebdomadaires sur animal vigile ou légèrement sédaté, un jeûne de six à seize heures selon l'espèce, puis une chirurgie de formation sans réveil qui peut durer plusieurs heures. Certains sont transportés sur trente-cinq kilomètres entre deux établissements pour des séances d'imagerie. Le porteur indique que la mise à mort de tous ces animaux non-humains sert à parachever la formation, en permettant aux stagiaires d'évaluer à l'œil nu l'organe et le dispositif qui vient d'y être implanté.

Objectifs

Chaque ann?e de nouveaux dispositifs implantables issus de la recherche sont disponibles pour les professionnels de sant? (en cardiologie, en gastro-ent?rologie, en neurologie, en ophtalmologie et en urologie par exemple) et permettent de soutenir les fonctions d?un organe d?faillant, surveiller les activit?s physiologiques ou administrer des m?dicaments afin de prolonger la survie, traiter une pathologie et am?liorer le confort de vie des patients. On entend par dispositif implantable tout dispositif destin? ? ?tre implant? de fa?on invasive en totalit? dans le corps humain ou ? remplacer une surface ?pith?liale gr?ce ? une intervention chirurgicale et ? demeurer apr?s l'intervention de fa?on temporaire ou d?finitive. Les professionnels de sant? ont l?obligation de se former ? l?utilisation de ces nouveaux dispositifs. L?utilisation d?un dispositif m?dical par un professionnel de sant? ou un patient ne peut se faire sans une information de l?utilisateur, voire une formation pr?alable, elle requiert un apprentissage permettant d?utiliser le mat?riel afin d?optimiser ses performances et de s?approprier les gestes permettant d?assurer ? l?utilisateur une s?curit? maximale d?utilisation. Un m?me produit, s?il est utilis? ou non conform?ment aux recommandations du fabricant, aura ou non la performance valid?e lors de son ?valuation. Les dispositifs m?dicaux sont d?finis comme des produits ?utilisateur-d?pendant?. La directive 93/42/CE modifi?e relative ? l??valuation de ces dispositifs en vue de leur acc?s au march? europ?en qui soumet les industriels ? des obligations en mati?re de gestion des risques pour le produit mais ?galement son environnement, prend en compte ce caract?re ?utilisateur-d?pendant?. Les industriels sont ? ce titre, responsables du recueil, de l??valuation, de la mesure et du d?veloppement de tout ?l?ment susceptible de permettre une utilisation optimale des produits qu?ils commercialisent et d?assurer leur s?curit?. Performances et s?curit? des dispositifs m?dicaux sont corr?l?es ? la formation et ? l?exp?rience de l?utilisateur. De plus, les conditions d?utilisation des dispositifs ne peuvent se r?duire ? des questions d?observance. Ce projet vise ? former les professionnels de sant? ? l?utilisation des dispositifs m?dicaux innovants en situation r?elle sur un animal anesth?si?. Ce projet de recherche se d?roulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1/2 et 2/2).

Bénéfices attendus

R?pondre ? l?obligation de formation des professionnels de sant? ? la technique d?implantation d?un nouveau dispositif m?dical, ? sa bonne utilisation et ? son ?valuation fonctionnelle pour la s?curit? pour les futurs patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des pr?l?vements sanguins sur animaux vigiles ou l?g?rement s?dat?s, pour tous les animaux du projet. La fr?quence des pr?l?vements pouvant ?tre couramment d?un pr?l?vement par semaine et d'une dur?e de moins de cinq minutes - Des pr?parations ? l?anesth?sie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cath?ter et en l'injection des produits utilis?s pour la pr?m?dication et l'anesth?sie. Dur?e de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale (?vitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'? plusieurs heures en cas d?intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront ?tre r?alis?s dans les EU 1/2 et 2/2. La p?riode d'acclimatation d'une dur?e de 7 jours se fera dans l'EU 2/2. Les proc?dures chirurgicales sans r?veil de formation des professionnels de sant? ? l'utilisation des dispositifs m?dicaux innovants pourront ?tre r?alis?s dans l'EU 1/2 ou 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets ind?sirables attendus sur les animaux sont exactement les m?mes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise ? jeun (12 heures pour les porcs, 12 ? 16 heures pour les ovins et les bovins, 6 ? 12 heures pour les chiens) de l?animal pr?alablement ? l?anesth?sie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cath?ter au moment de la pr?paration de l?anesth?sie, - La phase de r?veil anesth?sique apr?s la proc?dure d'imagerie non invasive, la douleur en phase per-op?ratoire : pour ces dernier point, des mesures de raffinement sont mises syst?matiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours syst?matique ? l'anesth?sie g?n?rale pour les proc?dures d'imagerie non-invasive et chirurgicales avec surveillance du r?veil anesth?sique dans des espaces calmes et sp?cialement am?nag?s, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens sp?cialement form?s supervis?s par des V?terinaires et la prise en charge multimodale de l'analg?sie per-op?ratoire avec l'usage syst?matique de traitements anti-inflammatoire et anti-douleur opiac?s y compris de traitements permettant une analg?sie par voie locale).

Devenir

Pour r?pondre ? l?obligation de formation des professionnels de sant? ? la technique d?implantation d?un nouveau dispositif m?dical, ? sa bonne utilisation et ? son ?valuation fonctionnelle pour la s?curit? des futurs patients, il est n?cessaire de proc?der ? l'euthanasie de tous les animaux du projet en fin de proc?dure pour parachever la formation en r?alisant les pr?l?vements et analyses ex-vivo et permettre aux professionnels d??valuer macroscopiquement l?organe et le dispositif juste implant?s.

Remplacement

La formation des professionnels de sant? aux m?thodes d?implantation des dispositifs m?dicaux regroupe les notions de ma?trise du geste chirurgical mais aussi d??valuation fonctionnelle en temps r?el au moment de l?implantation gr?ce ? l?imagerie. La r?ponse de l?organisme lors des diff?rentes phases de l?implantation du dispositif et son suivi simultan? par des m?thodes d?imagerie pour en assurer l??valuation fonctionnelle n?cessite une formation sur un animal vivant. Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l?homme dans des conditions fonctionnelles qui reproduisent la fonction de l?organe vivant dans l?organisme afin de mimer au mieux la r?alit? d?une intervention.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? ?valu? prospectivement en prenant en compte l'exp?rience du laboratoire sur d'autres projets avec ce m?me type d'approche, et r?duit au minimum n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques et aux besoins en formations du projet, aucune approche statistique n'a ?t? r?alis?e. Pour r?duire le nombre d?animaux, des s?lections par m?thodes d?imagerie peu invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX ?), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d?int?r?t. Les professionnels de sant? en formation re?oivent une formation pr?paratoire th?orique sur site ou de type visio / webinaire en amont de la formation pratique de fa?on ? minimiser le nombre d'animaux utilis?s. Pour r?pondre ? ce m?me objectif de r?duction, les partenaires qui d?veloppent les dispositifs m?dicaux ont ?galement d?velopp?s des outils d?apprentissage avec simulateurs ainsi que des proc?dures permettant de travailler sur des organes explant?s. La pr?cision croissante des outils d?imagerie fonctionnelle permet ?galement de gagner en pr?cision dans les techniques d?implantation et d??valuation des dispositifs et tend ? r?duire le nombre d?animaux n?cessaires.

Raffinement

Les mod?les animaux suivront exactement le cheminement d?un futur patient avec les m?mes exigences et techniques m?dicales mises en oeuvre pour la r?alisation des interventions (personnel hautement qualifi?, plateaux techniques op?ratoires et d?imagerie de pointe). L?ensemble des proc?dures est con?u pour r?duire au maximum le stress, l?angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours syst?matique ? l?anesth?sie g?n?rale durant les interventions d?imagerie et les proc?dures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site m?me des animaleries permet de r?aliser ces examens sur place, r?duisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associ?. Les param?tres vitaux sont enregistr?s et contr?l?s par des techniciens sp?cialis?s en anesth?sie afin d?adapter les perfusions, l?assistance respiratoire et les dosages d?anesth?siques et d?antalgiques. Un suivi de la temp?rature est r?alis? pendant toute la proc?dure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le syst?me de couverture de r?chauffement Bair Hugger? ou des tapis chauffants sont utilis?s. Les protocoles de r?animation sont standardis?s et r?alis?s par des v?t?rinaires chirurgiens sp?cialis?s. Pendant ces proc?dures, des protocoles de prise en charge multimodale de la douleur sont syst?matiquement appliqu?s. En amont des proc?dures, les animaux sont h?berg?s syst?matiquement en groupe sociaux, ils ont acc?s ? un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'h?bergement contr?l?es et ma?tris?es (temp?rature, hygrom?trie et ventilation). Des points limites stricts et sp?cifiques sont appliqu?s tout au long du projet. Les transports d'animaux entre les 2 EU (35 km) seront r?alis?s ? l'aide de v?hicules de types camionnettes ferm?es ayant re?u une autorisation AT1 d?livr?e par la DDPP, ventil?s, climatis?s et sp?cialement ?quip?s pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antid?rapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des temp?ratures lors des trajets, syst?me de surveillance vid?o des animaux). Les personnels en charge sont form?s et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est valid? par un V?t?rinaire.

Choix des espèces

Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l?Homme dans les conditions fonctionnelles de l?organe dans l?organisme vivant pour mimer au mieux la r?alit? d?une intervention, avec l'utilisation d'?quipements de chirurgie et d'imagerie standards utilis?s chez l'Homme. Les diff?rences intersp?cifiques de nature tissulaire, de forme, de taille anatomique et de fonction requi?rent l?emploi de diff?rentes esp?ces de grande taille. Pour chaque formation, le mod?le animal retenu sera identifi? pr?alablement en fonction du dispositif, de ses indications et des sp?cificit?s et des similitudes anatomiques avec l?Homme: les ovins pour les formations int?ressant les domaines de la cardiologie, de la chirurgie vasculaire et de la neurologie principalement, les porcins pour les formations int?ressant les domaines de la gastro-ent?rologie, de l'ophtalmologie et de la cardiologie principalement, plus sp?cifiquement les canins pour la chirurgie des auricules cardiaques et les bovins pour les dispositifs d'assistance cardiaque. Les animaux utilis?s pourront ?tre des juv?niles ou des adultes. L?objectif scientifique est d?avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable ? celle observ?e chez l?Homme.