Toxicologie (hors obligations réglementaires)

Jusqu'à 200 souris et 200 rats pourront être gardés en vie puis éventuellement réutilisés, à condition qu'aucun prélèvement post-mortem ne soit prévu pour eux, les autres étant tués pour prélever sang et organes. Au total, 2 800 rongeurs, 1 400 souris et 1 400 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour mesurer la tolérance de dix substances pharmacologiques. Ils reçoivent jusqu'à quatorze jours d'administrations quotidiennes par gavage ou injection, une batterie d'observations fonctionnelles pouvant durer 24 heures, et pour certains un test de force de préhension ou un test de Von Frey, où une stimulation mécanique est appliquée jusqu'au retrait de la patte. Le choix de l'espèce tient en deux phrases, qui décrivent les rongeurs comme des "modèles fréquemment décrits".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets comportementaux et physiologiques de différentes substances pharmacologiques chez le rongeur afin d’identifier des conditions d’administration bien tolérées. Jusqu’à 10 études pourront être réalisées sur la durée du projet, correspondant chacune à l’évaluation d’une substance d’intérêt. Selon les résultats obtenus, certaines études pourront comporter des évaluations complémentaires de la sensibilité mécanique, de la force de préhension ou des paramètres biologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des effets comportementaux et physiologiques de substances d’intérêt pharmacologique. Les résultats pourront orienter la sélection de molécules candidates pour un développement ultérieur, tout en améliorant la prédiction préclinique de leurs effets secondaires potentiels.

Procédures

Les animaux recevront soit une administration unique, soit des administrations quotidiennes pendant une durée maximale de 14 jours, selon la substance évaluée et l’objectif expérimental. Sur l’ensemble du projet, un maximum de 2800 animaux pourra être utilisé. Certains animaux, dans la limite de 400 maximum, pourront faire l’objet de prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse. En fin de procédure, une mise à mort pourra être réalisée lorsqu’un prélèvement de sang ou d’organes/tissus post-mortem est nécessaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement un stress lié aux manipulations et aux administrations répétées, un inconfort lors des gavages, une douleur ou gêne transitoire lors des injections intrapéritonéales ou intraveineuses, ainsi qu’un stress lors des observations comportementales. Le test de Von Frey peut également induire une douleur ou un inconfort transitoire, la stimulation mécanique étant appliquée jusqu’au seuil de retrait de la patte.

Devenir

Les animaux pour lesquels des prélèvements sanguins ou d’organes/tissus post-mortem sont nécessaires seront mis à mort à la fin de la procédure. Un nombre estimé maximal de 400 animaux, soit jusqu’à 200 souris et 200 rats, pourra être maintenu en vie et éventuellement réutilisé, sous réserve qu’aucun prélèvement post-mortem ne soit nécessaire, qu’aucun point limite n’ait été atteint et qu’aucun effet résiduel de la substance ne soit observé. Leur éligibilité à une réutilisation sera évaluée conformément à la réglementation. Aucun replacement ni aucune adoption ne sont prévus.

Remplacement

Dans la mesure du possible, les substances étudiées sont préalablement évaluées à l’aide de méthodes in vitro, notamment afin d’identifier et d’écarter les molécules présentant une toxicité incompatible. Cette étape permet de limiter le recours à l’animal aux substances pour lesquelles une évaluation intégrée à l’échelle de l’organisme reste nécessaire. Toutefois, les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre les systèmes nerveux, cardiovasculaire, endocrinien et métabolique impliqués dans la réponse globale d’un organisme à une substance pharmacologique. Elles ne permettent notamment pas d’évaluer de manière complète les effets neurocomportementaux complexes. Le recours au modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire. En général, la variabilité des réponses aux effets d’un traitement administré chez le rongeur justifie une taille minimale de groupe de 10 animaux par condition expérimentale. La variabilité élevée en comportement et physiologie justifie cette taille minimale. Un effectif inférieur peut exposer à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance (ANOVA). En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté (Dunnett ou Tukey). Afin de limiter le nombre d’animaux, la procédure 1 constitue une étape de criblage initial. Les procédures 2 et 3 ne seront déclenchées qu’en seconde intention, uniquement si le test FOB met respectivement en évidence une modification de la sensibilité mécanique ou de la force de préhension. Les effectifs prévus pour ces procédures correspondent donc à un maximum théorique et ne seront pas utilisés en l’absence de signal lors de la procédure 1. Lorsque la cinétique d’action de la substance, l’état clinique des animaux et l’absence d’interférence entre tests le permettront, les évaluations complémentaires seront réalisées sur les mêmes animaux. Une nouvelle cohorte ne sera utilisée que lorsque la durée d’observation du FOB, pouvant aller jusqu’à 24 h, ou les contraintes temporelles des mesures rendent l’utilisation des mêmes animaux scientifiquement non pertinente.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies. Les substances évaluées sont sélectionnées sur la base d’une analyse préalable approfondie de la littérature scientifique et des données disponibles concernant notamment leur pharmacologie, leur pharmacocinétique et leur profil de tolérance. Les doses et voies d’administration retenues sont ainsi définies à partir de données existantes, lorsque celles-ci sont disponibles, afin de limiter le risque d’effets indésirables non anticipés. Les administrations seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté. Les administrations par voie orale seront réalisées à l’aide de sondes souples afin de limiter les irritations. Le cas échéant, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie afin de réduire l’inconfort et le stress des animaux. L’état clinique des animaux sera évalué quotidiennement selon les points limites définis dans les procédures. Tout animal atteignant un point limite sera pris en charge conformément aux critères établis, avec mise à mort si nécessaire, afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse.

Choix des espèces

Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs sont des modèles fréquemment décrits pour l’étude de la tolérance d’un produit pharmacologique. Les animaux utilisés seront adultes conformément à la littérature.

Évaluer la toxicité de plus d'une centaine de candidats médicaments avant leur premier essai chez l'humain occupe 2 340 chiens, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent le produit par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, le plus souvent chaque jour, au fil d'études qui durent d'un jour à 52 semaines, et peuvent subir jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, prélèvements sanguins compris. Certains portent un émetteur de télémétrie implanté chirurgicalement pour enregistrer leurs paramètres cardiovasculaires, et peuvent être mis à mort quand la durée de vie de cet émetteur arrive à échéance. Sur l'ensemble, 2 112 chiens sont tués, le plus souvent pour l'analyse histopathologique de leurs organes, et 228 sont réutilisés dans une autre étude quand le vétérinaire juge leur état clinique compatible avec un nouveau composé.

Objectifs

Dans un cadre réglementaire, le projet réalisé vise à permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament ainsi que l'évaluation de ses paramètres pharmacocinétiques (absorption, distribution, métabolisme et élimination), pharmacodynamiques et de biodistribution dans le cadre de son développement préclinique. Cette évaluation chez une espèce non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de démarrer les essais cliniques chez l'homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché. Ce projet permet également d’évaluer la tolérance/sécurité du candidat-médicament dans l’espèce cible dans le cadre du développement du médicament vétérinaire. Il est estimé que plus d’une 100aine de candidats médicaments seront évalués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Le développement de composés pharmaceutiques requiert des explorations in vivo chez une espèce non-rongeur ainsi que des études réglementaires à proprement parler. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, ou pour répondre à des questions de sécurité. Ces études peuvent donc servir à affiner les expériences en amont des études réglementaires qui devront être réalisées par la suite, en permettant de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. Elles peuvent aussi directement contribuer à assurer la sécurité non-clinique des médicaments en comprenant mieux leurs mécanismes. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme.

Procédures

Traitements répétés : Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) le plus souvent de façon journalière, hebdomadaire ou mensuel (pour des composés biologiques), avec le candidat médicament. La durée des administrations est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 3 heures maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue (en général de 1, 3 ou 6 mois voire 52 semaines pour les études règlementaires). Des prélèvements sanguins (sur animal vigile ou sous anesthésie) et recueils urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique, pharmacocinétique/pharmacodynamie ou biodistribution ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal) en amont du démarrage de chaque étude. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse, n’excédant pas 16h, est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ou nuisances attendus correspondent essentiellement : - aux effets pharmacologiques du produit administré, - à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée), - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés, - à la sédation/anesthésie générale requises pour certaines procédures (prélèvements de biopsie, implantations chirurgicales d’émetteurs de télémétrie), - à la chirurgie (par exemple pour implanter un emetteur de télémétrie pour l’enregistrement des paramètres cardiovasculaires) et aux effets indésirables post-opératoires éventuels, - conditions d’hébergement en individuel quand requis par les procédures (ex : pour suivre la consommation alimentaire individuelle). L’hébergement individuel ne peut excéder 4h par jour. Les seules exceptions sont pour la collecte d’urine sur la nuit (sur une période de 16h maximum) et pour les enregistrements des paramètres cardiovasculaires (sur une période de 26h selon la technologie utilisée).

Devenir

Procédure 1 : études préliminaires Les animaux impliqués dans ce type d’études peuvent être ré-utilisés dans une étude si aucune analyse histopathologique n’est requise en fin d’étude, que le type de composé testé est compatible avec une réutilisation de l’animal, et que leur état clinique le permet, après évaluation par le vétérinaire. Dans ce cas, les animaux sont remis dans leur lieu d'hébergement habituel. Des animaux utilisés avec suivi de télémétrie lors de ces études peuvent être euthanasiés en fin de procédure si la durée de vie de l’émetteur implanté arrive à échéance. Procédure 2 : Étude de toxicologie subchronique (2 à 4 semaines) et chronique (13 à 52 semaines) chez le chien Les études de toxicologie règlementaire incluent généralement une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Les animaux sont euthanasiés à l’issue de la procédure. Procédure 3 : Evaluation des fonctions cardiovasculaire et respiratoire chez le chien conscient par télémétrie Les animaux de la procédure 3 sont ensuite utilisés dans les procédures 1 et 2. Leur finalité relève des procédures 1 et 2. Procédure 4 : -Les animaux impliqués dans ce type d’études peuvent être ré-utilisés dans une étude si aucune analyse histopathologique n’est requise en fin d’étude, que le type de composé testé est compatible avec une réutilisation de l’animal, et que leur état clinique le permet, après évaluation par le vétérinaire. Dans ce cas, les animaux sont remis dans leur lieu d'hébergement habituel. -En parallèle des prélèvements sanguins, réalisés au cours de l’étude, l’évaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution, peut nécessiter des euthanasies intermédiaires et/ou terminale afin d’effectuer des prélèvements tissulaires et/ou une analyse histopathologique selon les différents temps de prélèvements définis dans l’étude. Ceci pour permettre l'évaluation de l'exposition du composé ou des composés dans le tissu cible, et /ou pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus, respectivement. Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité ainsi que l’évaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie de candidats médicaments selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n'existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, et pour ce type de procédures de traitement identiques à celles utilisées chez l'homme ou chez l’animal (produit vétérinaire), en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant, et en particulier des réponses immunitaires et des différentes phases d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’élimination du/des composé(s).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est le minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, d’analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes. Le nombre d’animaux utilisés est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude. En incluant dans une même étude (i.e. sur les mêmes animaux), l’évaluation toxicologique et l’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité, le nombre d’animaux utilisés est très nettement réduit. Dans le cadre d’une évaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie en étude indépendante, le nombre d'animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude et du nombre de doses testées. En effet, des animaux des deux sexes seront utilisés uniquement pour permettre l'évaluation de l'effet du sexe sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et sur la biodistribution. Par ailleurs, il peut y avoir une comparaison avec des composés de référence, un criblage de plusieurs produits, etc… Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices (ICH S3 M2, ICH S3). Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, certains animaux peuvent être utilisés plusieurs fois pour tester différents produits à condition de respecter une période de repos et sous réserve de l'avis favorable du vétérinaire sanitaire.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement à plusieurs reprises. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. Les paramètres suivants sont contrôlés régulièrement (selon les signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux. Tout symptôme est signalé au Directeur d’étude et au vétérinaire. pour application des points limites (ex. en cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire, un antibiotique). D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation. Des points limites sont définis pour envisager les situations où il s'avère nécessaire d'arrêter le traitement ou d'euthanasier précocement un animal. Une attention est portée à l'enrichissement environnemental (ex. types de jeux, nourriture, renforcement positif, habituation suffisante aux procédures, …). L’aménagement des box avec des rampes, plateformes, une communication entre les box permet aux animaux d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel, tel que courir, grimper et sauter. Des séances de caresses et/ou de sociabilisation peuvent également être effectuées. L’hébergement est groupé permettant les interactions sociales entre congénères, mais individuel si dicté par l’objectif de l’expérimentation ou en cas d'incompatibilité sociale ou si l’état de l’animal l’exige. La justification scientifique de l'hébergement individuel doit être apportée et des éléments d'enrichissement supplémentaires sont utilisés (ex. jeux, contacts humains plus fréquents). L’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité est effectuée par télémétrie, permettant l’obtention de données fiables, sur des périodes de temps prolongées, et avec des contraintes sur l’animal minimisées. L'évaluation pharmacocinétique et pharmacodynamique d'un ou de plusieurs composés administrés se fait généralement à des doses pharmacologiques (donc faibles et similaires à celles utilisées chez l'Homme) et avec l'ensemble des voies administrations utilisées chez l'homme ou l'animal pour les produits vétérinaires.

Choix des espèces

L’évaluation de la toxicité et la sécurité de candidats médicaments (pour la santé humaine et animale), selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, une espèce rongeur et une espèce non-rongeur. Ce projet décrit ces études pour l’espèce chien. Les études sont menées en fonction de ce qui est prévu ensuite chez l’Homme (mode d’administration, durées de traitement…). Pour les médicaments vétérinaires, les études sont généralement à réaliser dans l’espèce cible, telle que le chien, compte tenu de la spécificité de chaque espèce animale. L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédures de traitement identiques à celles utilisées chez l'homme (ou chez le chien pour les produits vétérinaires destinés à cette espèce), en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Les chiens sont usuellement âgés de 4 à 9 mois au début de l'étude. Des animaux plus jeunes, mais sevrés (à partir de 8 semaines), de même que des animaux adultes plus âgés (12 à 24 mois) peuvent être utilisés, pour que les animaux d’études soient représentatifs de la population cible.

Un gavage unique de tramadol, à dose thérapeutique ou supérieure, est le seul geste pratiqué sur les 84 rats vivants de ce projet. Tout le reste vient après leur mise à mort, les organes étant prélevés à différents délais pour suivre la répartition du médicament et de ses produits de transformation dans le corps. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur signale comme nuisances le stress du gavage et d'éventuels effets indésirables du tramadol, suivis par une grille quotidienne. L'objet réel est de fixer le délai le plus utile entre la prise et la mort, pour préparer un second projet sur les prises répétées, à l'usage des expertises toxicologiques demandées par la justice.

Objectifs

Le tramadol est un médicament utilisé pour soulager les douleurs modérées à importantes. Bien qu'efficace, il peut entraîner un risque de dépendance, de mauvaise utilisation et, dans certains cas, d'intoxication grave. Lorsqu'un décès survient, les médecins légistes analysent souvent les concentrations de tramadol dans l'organisme pour déterminer si ce médicament a pu jouer un rôle. Cependant, après la mort, les substances présentes dans le corps peuvent se déplacer entre les différents organes et le sang, ce qui complique l'interprétation des résultats. À ce jour, on connaît encore mal l'évolution du tramadol et de ses principaux produits de transformation après le décès, en particulier chez les personnes qui prennent ce médicament de façon régulière. Ce manque de connaissances peut rendre plus difficile la détermination des causes d'un décès. Cette étude utilisera le rat, dont le devenir du tramadol dans l'organisme est proche de celui de l'Homme et le but est d'étudier comment le médicament et ses principaux produits de gradation se répartissent dans différents organes. L'objectif final est d'améliorer l'interprétation des analyses toxicologiques réalisées en médecine légale et de contribuer à une détermination plus fiable des causes de décès impliquant le tramadol.

Bénéfices attendus

Le tramadol est un médicament très prescrit. Sa mauvaise utilisation et le risque de dépendance qu’il entraîne en fait un problème de santé publique, et ce médicament est retrouvé lors des décès par intoxication. Comprendre comment le tramadol et ses produits de transformation dans l’organisme se répartissent dans l’organisme est essentiel pour interpréter les concentrations mesurées lors des autopsies. Ce projet permettra de déterminer le délai le plus pertinent entre la prise du médicament et le décès de l’animal, afin de préparer un second projet qui étudiera comment ces concentrations évoluent après la mort en cas de prises répétées. Ces travaux apporteront des informations utiles à la recherche des causes de décès, attendues à la fois par la justice et par les familles.

Procédures

La seule intervention réalisée sur l’animal vivant sera sa prise en main et l’administration unique du médicament directement dans l’estomac, au moyen d’une sonde. Le médicament est administré soit à une dose comparable à celle utilisée en traitement, soit à une dose supérieure à celle habituellement prescrite. Ce geste dure moins d’une minute et n’est pas douloureux pour l’animal. Tous les prélèvements sont réalisés après la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

La première nuisance d’ordre légère, est liée au mode d’administration par gavage, pouvant engendrer un stress à l’animal. La deuxième nuisance concernera l’apparition d’éventuels effets indésirables du tramadol (pour cela une grille de surveillance quotidienne a été établie).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure par une technique réglementaire à chaque temps mais également si nécessaire en cas d'atteinte de point limite.

Remplacement

La mauvaise utilisation et le détournement du tramadol sont à l’origine de décès, ce qui conduit la justice à demander des expertises sur l’origine de ces décès. Pour progresser, il est nécessaire d’étudier comment le médicament et ses produits de transformation dans l’organisme se répartissent dans l’organisme, puis se déplacent entre les organes après la mort. Il n’existe aucune méthode de simulation informatique ni de modèle en laboratoire permettant de reproduire ces phénomènes, qui font intervenir l’organisme entier. Le recours au modèle animal est donc indispensable, et le rat a été choisi parce que le devenir du tramadol dans son organisme est très proche de celui observé chez l’être humain.

Réduction

Il s’agit d’une étude exploratoire. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire : six animaux pour chaque délai étudié, dans chacun des deux groupes. Cet effectif est le plus petit permettant une description fiable des résultats. Les mâles et les femelles sont utilisés en nombre égal, la littérature ne rapportant pas de différence attendue entre les deux sexes pour les éléments étudiés.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux bénéficient d’une période d’adaptation de sept jours. Ils sont habitués progressivement à être pris en main, afin de limiter le stress lié à l’administration du médicament. Ils sont surveillés quotidiennement et pesés avant l’administration. Une grille de surveillance comportant des critères d’arrêt précis a été établie : si l’un de ces critères est atteint, notamment en cas de douleur importante ou de difficulté d’accès à l’eau, à la nourriture, ou de perte de mobilité, l’animal est mis à mort par une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Le métabolisme du tramadol chez le rat présente des similitudes majeures avec celui observé chez l’humain. Les profils pharmacocinétiques (absorption, métabolisme hépatique, élimination rénale), ainsi que les principaux métabolites (M1, M2, M5), sont comparables.

Le projet alimente les dossiers réglementaires de substances phytosanitaires, à raison d'environ cinquante études par an sur les produits retenus après criblage en laboratoire. 17 280 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent les substances par la bouche jusqu'à trois fois par jour pendant quatorze jours, par voie intraveineuse jusqu'à six fois en vingt-quatre heures, sur la peau, ou par inhalation pendant une heure vigiles et jusqu'à quatre heures sous anesthésie. Le porteur écrit qu'"aucune altération de l'état de santé des animaux n'est attendue", et justifie le recours aux souris par le fait que les tests sur cellules ne sont pas "pleinement reconnues" pour les produits phytosanitaires.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains produits utilisés pour protéger les plantes (comme les pesticides ou produits phytosanitaires) se comportent dans le corps d’un humain. Ce projet cherche à savoir comment ces substances peuvent entrer dans l’organisme de l’homme (par ingestion, contact avec la peau ou inhalation), combien de temps elles y restent, et comment elles sont transformées. L’objectif est d’estimer de manière réaliste l’exposition humaine, que ce soit par l’alimentation (via des résidus dans les aliments) ou dans un cadre professionnel (par exemple pour les personnes qui manipulent ces produits). Avant d’être étudiées chez la souris, les substances sont d’abord testées et sélectionnées en laboratoire (sans animal). Seules celles qui respectent les exigences réglementaires en matière de sécurité pour l’humain et l’environnement sont ensuite retenues. Le projet prévoit environ 50 études par an. Sur une durée de cinq ans, cela représentera environ 17 280 animaux, répartis entre trois types de procédures expérimentales.

Bénéfices attendus

À court terme, ces études permettent de mesurer de façon réaliste la quantité de ces substances à laquelle les humains peuvent être exposés, que ce soit par l’alimentation ou par contact avec la peau ou l’air. Elles servent aussi à fixer des limites de sécurité, par exemple la quantité maximale de résidus autorisée dans les aliments, avec une large marge de sécurité pour protéger la santé. Ces travaux permettent également d’identifier les substances ou leurs dérivés qui pourraient être dangereux, notamment ceux qui s’accumulent dans le corps ou restent longtemps dans l’environnement. Cela aide à éviter d’autoriser des produits pouvant provoquer des maladies graves comme des cancers ou des troubles du système nerveux.

Procédures

Dans ce projet, les gestes réalisés sur les souris sont simples et de courte durée. Les animaux sont régulièrement pesés, ce qui prend seulement quelques secondes, afin de suivre leur état de santé. Les substances étudiées peuvent être administrées de différentes façons : • par la bouche (comme prendre un médicament), soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 3 fois par jour pendant 14 jours. La manipulation dure 30s. • par injection dans la circulation sanguine, soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 6 fois par jour sur 24h ou au plus 3 fois par jour pendant 3 jours. La manipulation dure au maximum 2 min. • par application sur la peau, soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 6 fois par jour sur 24h ou au plus 3 fois par jour pendant 3 jours. La manipulation dure au maximum 30s • par application sous la peau, en une seule fois. La manipulation dure 30s • par inhalation sous forme d’air ou de fines gouttelettes en une seule fois. La manipulation peut durer entre une heure sur un animal vigile et quatre heures sur un animal anesthésié. La durée des études va de deux à trois semaines. Des prélèvements de sang nécessitent une manipulation courte sur un animal vigile d’environ 2 min. Le sang collecté permet d’analyser comment le produit s’absorbe, circule et se distribue dans l’organisme ou les organes. Ces prélèvements sont réalisés en petites quantités, avec des limites strictes pour prévenir toute anémie et privilégier un temps de récupération entre chaque prélèvement. Certains prélèvements sont réalisés sous anesthésie en fin d’étude. Les urines et les selles peuvent aussi être collectées ponctuellement sur 23h après administration dans des cages adaptées pour compléter les analyses.

Impact sur les animaux

Aucune altération de l’état de santé des animaux n’est attendue avec les procédures prévues. Toutefois, en raison du caractère exploratoire des études, des effets imprévus peuvent survenir (perte de poids, variations de la température corporelle, modifications du comportement). Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier à l’aide d’une grille de scoring. Des points limites humanitaires sont définis afin d’interrompre l’expérimentation et de mettre en œuvre une prise en charge adaptée, y compris l’euthanasie si nécessaire, afin d’éviter toute souffrance inutile.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir collecter les matrices biologiques ou organes pour évaluer la distribution dans un organisme vivant des substances actives phytosanitaires.

Remplacement

Des tests sur cellules permettent de faire un premier tri des substances, en étudiant leur absorption et leur transformation. Cependant, ces méthodes ne suffisent pas à comprendre entièrement leur comportement dans un organisme vivant et ne sont pas encore pleinement reconnues pour les produits phytosanitaires. À ce jour, l’étude chez l’animal reste nécessaire pour évaluer de manière globale leur devenir dans l’organisme et s’assurer de leur sécurité pour l’humain, les animaux et l’environnement, conformément à la réglementation européenne.

Réduction

Les substances sont d’abord largement testées en laboratoire (sur ordinateur et sur cellules) pour prévoir leur comportement dans l’organisme. Cela permet de ne garder que les plus pertinentes et de réduire fortement le nombre d’animaux utilisés. Grâce à des techniques d’analyse très sensibles, de très petites quantités de sang sont suffisantes. On peut ainsi effectuer plusieurs prélèvements sur un même animal et obtenir toutes les informations nécessaires, tout en limitant leur nombre. Le nombre d’animaux est donc réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables : en général au minimum 3 animaux pour les études de base et au maximum 8 pour certaines analyses spécifiques. Le nombre d’animaux utilisés sur cinq ans est estimé à 17280

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages adaptées, avec des éléments d’enrichissement pour leur confort et leur permettre de faire leur nid. Ils sont observés chaque jour pour vérifier leur état de santé. L’environnement et les animaux sont régulièrement contrôlés pour garantir de bonnes conditions sanitaires par des analyses ciblées et appropriées. Si un animal présente un problème, il reçoit des soins adaptés ou est euthanasié si nécessaire, selon des règles précises. Des mesures sont aussi prévues pour réagir rapidement en cas d’événement inattendu. Des critères d’arrêt anticipé sont définis ainsi pour éviter toute souffrance inutile. Tous les gestes pouvant être douloureux ou les situations très contraignantes pour l’animal sont réalisés sous anesthésie, et les manipulations sont limitées au strict nécessaire. Pour limiter les risques, en cas de dose potentiellement toxique, un seul animal est testé en premier. Si des effets indésirables apparaissent, les autres animaux ne sont pas exposés. Enfin, toutes les procédures sont réalisées par du personnel qualifié et formé, avec des formations régulières pour améliorer les pratiques et le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’animal le plus souvent utilisé pour étudier le devenir et la sécurité des substances. Son fonctionnement biologique est assez proche de celui de l’humain, ce qui permet de mieux prévoir les effets chez l’homme. Elle est recommandée par les autorités scientifiques pour ce type de projet (lignes directrices OCDE TG 417). Sa petite taille et les techniques de micro échantillonnage permettent de respecter les 3R tout en obtenant des données robustes. Sur le plan scientifique, la souris présente une physiologie et un métabolisme bien caractérisés, permettant une évaluation fiable des processus d’absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion. Il permet l’identification des métabolites majeurs circulants et l’établissement de relations robustes entre la dose administrée et l’exposition systémique. D’un point de vue technique et éthique, la souris est adaptée aux prélèvements sériés de très petits volumes et aux études de bilan de masse, tout en permettant l’optimisation des designs expérimentaux conformément au principe des 3R. Ce choix assure ainsi la production de données pharmacocinétiques fiables, interprétables et pleinement exploitables sur le plan réglementaire. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique de ces composés phytosanitaire sur des nouveaux nés. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique de ces composés phytosanitaire sur des nouveaux nés.

Tués au jour 21 de la lactation pour prélever leurs organes, 544 rats vont être utilisés, des femelles accouplées et leur descendance, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Les femelles sont gavées chaque jour à la sonde du sixième jour de gestation jusqu'à trois semaines après la mise bas, soit 38 jours au plus, pour mesurer ce que trois substances connues pour induire des enzymes hépatiques font à leurs hormones thyroïdiennes et au développement nerveux de leur descendance. Les petits sont posés sur le dos dès le quatrième jour pour évaluer s'ils se retournent en moins de deux secondes, puis isolés quelques minutes et soumis à un clic mécanique à partir du dixième jour, chaque jour jusqu'à obtention d'une réponse. Le rat est retenu, indique le porteur, pour sa gestation courte, la disponibilité d'une souche caractérisée et les recommandations des instances réglementaires.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la continuité d'un projet précédent, qui a permis de mieux caractériser les paramètres clés de la toxicité neurodéveloppementale associée à une perturbation des taux d’hormones thyroïdiennes. Ces travaux ont conduit à la publication de trois articles scientifiques. Ce nouveau projet s’attachera à caractériser plus précisément le mécanisme d’action reliant une diminution des concentrations en hormones thyroïdiennes, consécutive à une augmentation de leur métabolisation hépatique, à d’éventuels effets sur le neurodéveloppement. Ce projet visera ainsi à approfondir la compréhension des liens mécanistiques entre induction enzymatique hépatique, déséquilibre de l’homéostasie thyroïdienne et altérations neurodéveloppementales. À cette fin, il s’appuiera à la fois sur des substances décrites dans la littérature scientifique et sur des molécules internes, toutes identifiées comme inducteurs d’enzymes hépatiques impliquées dans la métabolisation des hormones thyroïdiennes.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques reliant l’induction du métabolisme hépatique des hormones thyroïdiennes à des effets sur le neurodéveloppement. Il contribue à mieux caractériser les conséquences d’une perturbation thyroïdienne secondaire à une action hépatique, en documentant à la fois les modifications hormonales et les marqueurs morphologiques et moléculaires observés chez la ratte et sa descendance. Les résultats attendus permettront également de comparer plusieurs substances partageant des mécanismes d’action proches, afin d’affiner leur caractérisation toxicologique et de mieux identifier les paramètres pertinents pour l’évaluation de leur potentiel de perturbation endocrinienne. À plus long terme, ce projet apportera des connaissances utiles à l’évaluation du risque pour la santé et à l’amélioration des stratégies de développement et de sélection de composés.

Procédures

Les femelles gestantes et allaitantes vigiles seront administrées journalièrement à l’aide d’une sonde souple adaptée à leur taille et âge, pendant maximum 38 jours (du jour 6 de gestation au jour 20 ou 21 après la mise bas). Cette technique est réalisée en moins de 15 secondes et n’engendre pas de douleur. Durant la période de gestation, un prélèvement sanguin, pourra être réalisé sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Chaque femelle gestante pourra faire l’objet d’un micro-prélèvement à la veine saphène sur animaux vigiles pour un maximum de 200µL ou un prélèvement sanguin plus important, dans la limite des volumes recommandés, pourra être réalisé sous anesthésie à la veine sublinguale ou submentale. Ce prélèvement de sang sera réalisé sur une période d’une durée inférieure à 2 minutes. Au moment du sacrifice terminal (jour 21 de la lactation) un prélèvement à l’aorte abdominale sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sans réveil. Pendant la lactation des tests de développement seront réalisés sur les rats juvéniles. Pour mesurer le réflexe auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. Pour tester la mobilité, le petit sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner en moins de 2 secondes à partir de l’âge de 4 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. Des organes seront prélevés après la mise à mort des femelles et leur descendance au jour 21 de la lactation.

Impact sur les animaux

Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des rattes et de leur descendance ainsi que pendant la période d’hébergement isolé des femelles gestantes. Le gavage effectué à l’aide d’une sonde souple peut induire un léger inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage. Un échantillon de sang peut être prélevé sur animaux vigiles par ponction à la veine saphène ou un prélèvement peut être fait après anesthésie par ponction à la veine submentale ou à la veine sublinguale. Le prélèvement de sang peut induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. De plus, au moment du sacrifice terminal (PND21) un prélèvement à l’aorte abdominale sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sans réveil. Afin d’évaluer si le développement des rats juvéniles est normal, pour le système auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner en moins de 2 secondes. La nuisance engendrée est un stress léger car les tests sont peu invasifs et non douloureux. Les effets toxiques attendus devraient être modérés, car les trois substances étudiées sont des produits connus : les données disponibles dans la littérature et dans les études précédentes, notamment l’étude de toxicocinétique menée en amont de ce projet permet d’évaluer la tolérance aux doses prévues chez des femelles gestantes et allaitantes ainsi que chez leur descendance, indiquent que peu de signes cliniques sont attendus aux doses retenues. Les signes de toxicité pouvant apparaître en cours d'études incluent des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de la salivation, augmentation ou diminution de la mobilité et de l'agressivité, tremblements. D’autre part, des signes cliniques liés à la difficulté à mettre bas naturellement incluant un effort expulsif prolongé, agitation, écoulement vaginal inhabituel, respiration laborieuse, ou des signes cliniques liés à une difficulté à téter des petits à la naissance incluant déshydratation, pâleur, retard de croissance peuvent être observés.

Devenir

En raison du but de l’étude qui est d’évaluer les effets sur la gestation, la lactation et le développement de la descendance, tous les rats seront mis à mort au terme de la procédure pour prélèvements d’organes.

Remplacement

Avant la réalisation de l’étude in vivo, des essais in vitro, notamment sur cultures d’hépatocytes et de thyréocytes en 3D, sont utilisés pour évaluer le potentiel toxique hépatique et thyroïdien des substances. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, en particulier les interactions entre organes et les conditions physiologiques propres à la gestation et à la lactation. Elles ne permettent donc pas, à elles seules, de prédire de manière complète les effets chez la femelle gestante et sa descendance. L’étude chez l’animal reste ainsi nécessaire pour mesurer de façon intégrée les effets sur la mère, les modifications hormonales, l’exposition de la descendance et les conséquences potentielles sur le neurodéveloppement. Les résultats obtenus seront comparés aux données in vitro et utilisés pour alimenter des modèles mathématiques, afin d’améliorer à terme la prédiction des effets sur les hormones thyroïdiennes et le neurodéveloppement, tout en renforçant progressivement le remplacement des études animales.

Réduction

Ce projet est conçu dans le respect du principe de Réduction, en veillant à utiliser le nombre minimal d’animaux compatible avec l’obtention de résultats scientifiquement robustes. Le nombre d’animaux retenu, fondé sur l’expérience du laboratoire, est limité au strict nécessaire pour répondre aux objectifs de l’étude, notamment pour garantir une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des paramètres hormonaux. Ainsi, un effectif restreint de 8 femelles accouplées par groupe sera utilisé. Par ailleurs, plusieurs substances seront étudiées au sein d’une même étude, permettant le recours à un groupe témoin unique et contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux. En outre, seules des molécules préalablement sélectionnées au moyen de méthodes alternatives et considérées comme non dangereuses à ce stade seront évaluées in vivo, afin de restreindre le recours à l’animal au cours du processus de recherche et développement. Enfin, ce projet contribuera également au développement et à la validation d’approches alternatives susceptibles, à terme, de réduire plus largement le nombre d’animaux utilisés en toxicologie.

Raffinement

Les conditions d’hébergement enrichies et adaptées aux rattes gestantes et allaitantes (matériel de nidification), le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré procédural au strict minimum. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particulière le 1er jour de traitement (au moins 2 observations dans la journée) ainsi qu’au moment de la mise bas théorique à partir de GD 21. Ils sont pesés à intervalles réguliers pour vérifier leur croissance et leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Des points limites suffisamment prédictifs et adaptés aux femelles gestantes et allaitantes ainsi qu’aux rats juvéniles seront appliqués. Des micro-prélèvements sanguins seront privilégiés. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Le jour précédent leur mise à mort (sauf pour les rats juvéniles à PND 4), les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle d’autopsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Ce projet est réalisé avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo- thyroïdien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal.

Choix des espèces

Le rat est le modèle expérimental choisi en raison de sa courte durée de gestation, de son utilisation fréquente dans les études de toxicologie du développement et de la disponibilité de souche suffisamment caractérisée. Les modèles rongeurs et notamment le rat sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l’espèce et la souche choisies. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Des jeunes femelles rats accouplées, âgées de 8 à 12 semaines au début de l’étude, seront utilisées dans ce projet, conformément aux pratiques en toxicologie du développement et aux recommandations internationales. Leur descendance sera suivie jusqu’à l’âge de 21 jours après la naissance, ce stade de développement étant particulièrement adapté à l’évaluation des effets des substances administrées à la femelle gestante et allaitante sur le développement embryonnaire, fœtal et postnatal précoce, après exposition in utero puis au cours de la lactation via le lait maternel. En effet, la période allant de la naissance jusqu’à la fin de la lactation, est reconnue comme une fenêtre de sensibilité particulière aux expositions susceptibles d’affecter le neurodéveloppement.