Troubles nerveux

Pour tester pendant six mois des électrodes cérébrales souples destinées aux troubles de la conscience, 58 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Ils subissent l'implantation chirurgicale des électrodes vers huit semaines d'âge, des séances d'imagerie d'une à deux heures sous anesthésie, puis des enregistrements cérébraux éveillés ou sous une anesthésie générale qui peut durer quatre heures et doit simuler ces troubles, parfois sous microstimulation ou sous médicaments. Le porteur prévoit un hébergement individuel qui peut durer jusqu'à 180 jours et cite parmi les risques la douleur, des troubles neurologiques, l'infection ou le rejet de l'implant. Il retient le miniporc pour la taille de l'implant, "semblable à celui destiné à l'Homme", et parce que les mouvements de son cerveau rendent les signaux aussi instables que chez l'humain.

Objectifs

Jusqu’à 6 % de la population mondiale souffrirait de troubles de la conscience (DoC) caractérisés par une altération aigue et globale des fonctions mentales et une incapacité à répondre à des stimuli. Les DoC comprennent le coma, l’état végétatif (absence de conscience en dépit d’une vigilance préservée) et l’état de conscience minimale (mais incapacité à communiquer). Ils sont dus à une perte de l’intégrité de réseaux neuronaux (comprenant des millions de neurones interconnectés) et de leurs neurotransmetteurs qui régulent l’état d’éveil et de conscience. Les causes des DoC sont diverses : traumatisme crânien, hémorragie, ischémie, infection… induisant de multiples mécanismes d’un patient à l’autre qu’il est indispensable d’explorer afin d’élaborer une thérapie personnalisée. A ce jour, aucun traitement n’est reconnu. Des études utilisant des agents pharmacologiques ou une neurostimulation ont montrées des améliorations chez certains patients. Mais les bénéfices sont hétérogènes et la neurostimulation, lourde et peu accessible pour les patients, nécessite un gros développement pour la mise en place de paramètres personnalisés. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les DoC et de permettre la mise en place d’une thérapie personnalisée. Pour cela, nous utiliserons un implant innovant biocompatible miniature mimant les propriétés mécaniques du tissu cérébral et minimisant la réponse immunitaire. Ce dispositif unique offre aussi la possibilité d’effectuer des enregistrements de l’activité cérébrale et de la neurostimulation des zones cérébrales périphériques au plus profondes. Les électrodes seront implantées dans des régions cérébrales impliquées dans les DoC, sur 6 mois chez le miniporc, afin d’évaluer ses performances d’enregistrements et de neurostimulations à long terme. Le miniporc est un modèle adapté de par une anatomie cérébrale et des contraintes chirurgicales similaires à l’Homme. Les DoC seront simulés grâce à des niveaux d’anesthésie plus ou moins profonds. Les principaux agents pharmacologiques utilisés chez l’Homme seront aussi administrés afin d’évaluer leur action sur l’activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait, à court terme, permettre de valider et de mettre en place chez le miniporc une nouvelle approche d’anesthésie déjà bien développée chez l’Homme et qui présente de nombreux avantages en comparaison aux méthodes « conventionnelles » : réveil et récupération plus rapide, dosage plus précis, profondeur d’anesthésie plus stable et contrôlable (modérée ou profonde) et moins d’effets secondaires. Elle permettra aussi d’enrichir les connaissances sur le cerveau du miniporc grâce aux imageries réalisées ce qui nous permettra d’améliorer la précision de futures chirurgies. Les autres bénéfices attendus du projet sont d’évaluer à long terme un nouveau type d’électrodes miniatures et souples, mimant les propriétés mécaniques du tissu cérébral ce qui minimise la réponse immunitaire. Ces électrodes, qui permettent un enregistrement tout au long de leur axe, offriraient une possibilité de recueillir des signaux cérébraux sur une importante profondeur et permettraient d’enregistrer de multiples zones cérébrales avec un seul dispositif. Ici nous les utiliserons dans le cadre des DoC afin de mieux évaluer les mécanismes impliqués dans cette pathologie et d’analyser les effets thérapeutiques d’une neurostimulation. La double fonction des électrodes, enregistrements et neurostimulation, leur confèrerait également un potentiel de traitement dans certains troubles neurologiques. La souplesse des électrodes, tout comme leur capacité d’enregistrements, pourraient aussi grandement participer à développer le domaine des interfaces cerveau-machine qui prend de plus en plus d’ampleur.

Procédures

Avant la chirurgie, des séances d’imagerie (de 1 à 2h00) seront réalisées sous anesthésie afin de déterminer la meilleure trajectoire d’implantation des électrodes. Pour le transport entre la zone d’hébergement (stabulation) et le service d’imagerie, les animaux seront anesthésiés par injection afin d’éviter tout stress. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront aussi exposés, sous anesthésie générale, après la chirurgie, à une séance d’imagerie (de 1 à 2h) mensuelle au maximum pour vérifier la position des électrodes. Après la chirurgie et une période de récupération d’une semaine au minimum, les animaux seront exposés éveillés (1h environ) et sous anesthésie générale pour simuler les DoC (qui se limitera à 4h pour ne pas trop les fatiguer) à des sessions d’enregistrement de l’activité cérébrale : signaux EEG (électroencéphalogramme). Le 1er mois 2 enregistrements par semaine sont prévus (espacés de 72h au minimum) et les 5 mois suivants un enregistrement toutes les 2 semaines. Après obtention d’une ligne de base de l’activité cérébrale, les enregistrements seront effectués, bimensuellement au maximum, sous microstimulation cérébrale ou sous agents pharmacologiques utilisés chez l’Homme pour traiter les DoC. Chaque animal pourra être soumis, sous anesthésie générale, à une prise de sang si son état requière une analyse. L’euthanasie sera effectuée sous anesthésie générale et analgésie.

Impact sur les animaux

Tout acte chirurgical visant à poser un implant cérébral en profondeur, qui doit être testé pour confirmer sa fonctionnalité à long terme, peut engendrer chez les animaux : douleur, faibles pertes de poids, hypothermie, déshydratation, troubles neurologiques, risque d’infection au niveau du site d’incision ou d’implantation. Le réveil après une anesthésie générale peut induire une désorientation et un stress de courte durée. Une anesthésie générale peut engendrer un état de fatigue transitoire. La pose d’un dispositif implantable peut induire une irritation, une réaction inflammatoire, une infection ou encore un rejet. MODIFICATION L’hébergement individuel (sans isolement visuel et olfactif) qui sera réduit au minimum nécessaire peut engendrer un stress pourra durer au maximum 180 jours. L’hébergement individuel (sans isolement visuel et olfactif) qui pourrait être mis en oeuvre pour des raisons expérimentales peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés selon un protocole approprié, afin d’obtenir les prélèvements requis pour les analyses histologiques pour compléter scientifiquement l’étude. L’étude des tissus est indispensable pour valider la bonne tolérance de l’implant à long terme.

Remplacement

Même si les techniques d’aujourd’hui comme la construction d’organoïdes permettent de limiter l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro ou in silico permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. Les mécanismes des DoC étant très mal connus, ces derniers ne peuvent être reproduits qu’in vivo pour le moment. Nous devons aussi évaluer et valider à long terme l’intégrité et la fonctionnalité du dispositif implantable composé d’électrodes souples, ce qui ne peut être réalisé que sur des organismes entiers, complets avec leur physiologie et leur complexité sur le plan biologique. En amont, des premiers tests de cytotoxicité et de biocompatibilité, pour sécuriser au maximum l’implantation des dispositifs, ont été réalisés et validés, notamment chez le rongeur.

Réduction

Même si les techniques d’aujourd’hui comme la construction d’organoïdes permettent de limiter l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro ou in silico permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. Les mécanismes des DoC étant très mal connus, ces derniers ne peuvent être reproduits qu’in vivo pour le moment. Nous devons aussi évaluer et valider à long terme l’intégrité et la fonctionnalité du dispositif implantable composé d’électrodes souples, ce qui ne peut être réalisé que sur des organismes entiers, complets avec leur physiologie et leur complexité sur le plan biologique. En amont, des premiers tests in vitro pour sécuriser au maximum l’implantation des dispositifs, ont été réalisés et validés, notamment chez le rongeur.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation par des personnes expérimentées, afin d’assurer leur bien-être pendant les changes, les pesées, les protocoles, les anesthésies, les prises de sang ou tous soins nécessaires post chirurgie. Ils seront également entraînés par renforcement positif à rester dans un hamac avant le début des sessions d’enregistrements. Pour chaque chirurgie, l’animal sera sous anesthésie générale et analgésie, ses fonctions cardiaques et respiratoires seront monitorées tout comme la quantité d’oxygène dans le sang, sa température corporelle qui sera maintenue à 37 °. Un gel ophtalmique sera également appliqué pour éviter son inconfort. Des soins post opératoires adéquates seront adaptés pour chaque animal et des antalgiques seront utilisés le temps nécessaire. Toutes les imageries ou les prises de sang en cas de besoin seront réalisées sous anesthésie générale. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement tout au long de l’expérience, avec une surveillance accrue en sortie de chirurgie et d’anesthésie générale et tout sera mis en œuvre pour que les animaux aient un niveau d’inconfort aussi limité que possible. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués et en cas d’effets inattendus des traitements appropriés seront immédiatement mis en œuvre et/ou il pourra être décidé d’interrompre l’expérimentation. En parallèle, le vétérinaire sera alerté. Lors d’un hébergement individuel prolongé, en plus d’une interaction renforcée avec le personnel et afin de préserver une interaction sociale, les animaux seront mis en contact autant que possible (au moins 3 fois/semaine), selon leur comportement, au minimum 15 min sous surveillance afin de s’assurer que tout se passe sans incident.

Choix des espèces

Compte tenu des objectifs de l’étude, le modèle porcin est plus pertinent que le modèle rongeur notamment du fait de la taille de l’implant à tester (semblable à celui destiné à l’Homme), de la durée sur laquelle le dispositif doit rester implanté et du déroulé des sessions d’enregistrement et de neurostimulation. Le miniporc offre aussi la possibilité de simuler les conditions d’une future implantation humaine du dispositif. Enfin, les mouvements du cerveau produits chez le miniporc génèrent une instabilité des signaux similaire à celle rencontrée chez l’Homme. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes du fait de la durée d’implantation (6 mois) et de la taille des implants. Des animaux juvéniles âgés de 6 semaines (permettant une meilleure habituation à la manipulation et une meilleure constitution des groupes sociaux du fait de leur jeune âge) seront réceptionnés et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les chirurgies seront réalisées sur les animaux jeunes adultes d’environ 8 semaines. Les animaux seront utilisés dans la procédure à l’âge adulte, entre 2 et 8 mois.

Opérées jusqu'à trois fois sous anesthésie générale, pour l'implantation d'un dispositif qui enregistre l'activité de leur cerveau, des injections dans le cerveau ou la pose d'un dispositif d'administration prolongée, 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le laboratoire déclare 200 souris réutilisées, pour de la formation ou une autre étude, et la mise à mort des autres pour prélever leur cerveau et leurs tissus. Le projet doit aider "les laboratoires pharmaceutiques" à sélectionner de nouveaux médicaments en mesurant leurs effets sur le sommeil et l'éveil, avec jusqu'à deux administrations par jour pendant 28 jours au plus. Pendant les enregistrements, de 2 à 72 heures, chaque souris est hébergée seule, dans ce que le porteur appelle "un espace plus petit" à un endroit et des "compartiments spacieux" à un autre.

Objectifs

Les troubles du sommeil et certaines maladies du cerveau ou de la santé mentale sont nombreux et peuvent modifier la qualité du sommeil ou les moments d’éveil. Ces problèmes représentent un enjeu important de santé publique, notamment parce qu’ils touchent de plus en plus de personnes avec le vieillissement de la population. Ce projet vise à mieux comprendre les différents états entre l’éveil et le sommeil (par exemple être bien réveillé, somnolent, ou dans différentes phases du sommeil). Pour cela, des études sont réalisées sur des animaux en bonne santé ainsi que sur d’autres présentant des caractéristiques proches de certaines maladies humaines. L’objectif est aussi d’observer comment des médicaments influencent ces états, à court et à long terme. Pour mesurer ces effets, des enregistrements de l’activité du cerveau et des muscles sont réalisés chez les animaux. Ces données permettent d’identifier leurs états de vigilance (éveil ou sommeil) et d’analyser le fonctionnement du cerveau pendant ces périodes. Ces analyses offrent une meilleure compréhension du sommeil et de ses perturbations. Elles permettent également de détecter des effets secondaires de certains médicaments qui ne sont pas visibles à l’œil nu, comme une somnolence accrue ou une altération de la qualité du sommeil. Les entreprises pharmaceutiques peuvent utiliser ces résultats pour vérifier l’efficacité et la sécurité de leurs nouveaux médicaments. Il est aussi possible de comparer ces nouveaux traitements à d’autres déjà utilisés, afin d’évaluer leur intérêt. L’objectif global de ce travail est de fournir des données fiables, précises et utiles pour aider au développement de nouveaux traitements et améliorer la prise en charge des troubles du sommeil.

Bénéfices attendus

Ce projet a plusieurs objectifs. En étudiant les différents états entre l’éveil et le sommeil, ainsi que l’activité du cerveau associée, il permet d’évaluer l’impact de certains traitements sur la qualité du sommeil, les périodes d’éveil, et le fonctionnement du cerveau dans ces différents états. Aujourd’hui, les traitements contre l’insomnie ne sont pas toujours suffisamment efficaces. Il est donc important de développer de nouveaux médicaments. Ce projet a pour but d’aider les laboratoires pharmaceutiques à identifier, sélectionner et valider de nouvelles solutions afin de mieux répondre aux besoins des patients. Au-delà de l’insomnie, de nombreuses maladies comme la dépression, l’anxiété ou des maladies neurologiques comme Parkinson ou Alzheimer sont liées à des troubles du sommeil ou à des perturbations de l’éveil. Dans certains cas, les troubles du sommeil peuvent même apparaître avant la maladie et servir de signe précoce. Mieux les comprendre et les traiter pourrait donc aider à prévenir certaines pathologies ou à en réduire les symptômes. Il est donc essentiel de vérifier que les traitements développés n’aggravent pas ces troubles. Ce projet permet également de détecter d’éventuels effets secondaires des médicaments sur le sommeil et l’éveil, comme une somnolence excessive ou une mauvaise qualité de sommeil. Cela aide les entreprises à choisir les traitements les plus efficaces tout en limitant les effets indésirables. Enfin, la technologie utilisée permet d’analyser de manière précise et fiable le fonctionnement de modèles animaux. Elle aide à identifier des indicateurs mesurables liés à l’activité cérébrale ou aux états de vigilance. Ces indicateurs peuvent ensuite servir à évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

Procédures

Les animaux de ce projet pourront subir jusqu'à deux interventions chirurgicales, ainsi qu'une intervention supplémentaire pour la mise en place éventuelle d'un dispositif permettant l'administration prolongée de traitements. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale. Une intervention chirurgicale, d'une durée d'environ une heure, permettra la mise en place d'un dispositif d'enregistrement de l'activité cérébrale. Lors de cette même intervention, les animaux pourront également recevoir des injections au niveau du cerveau ainsi que la mise en place de dispositifs nécessaires à l'administration des traitements. Ces procédures complémentaires dureront quelques minutes. Les animaux pourront être soumis à des périodes d'enregistrement de l'activité cérébrale à plusieurs reprises au cours de l'étude. Pendant ces enregistrements, ils seront hébergés individuellement afin de garantir la qualité des données recueillies, tout en conservant leur liberté de mouvement. La durée et la fréquence des enregistrements seront adaptées aux objectifs scientifiques de chaque étude et ne dépasseront pas les limites définies dans le protocole. Les animaux pourront recevoir des traitements pharmacologiques. Dans le cadre des études aiguës, un maximum de deux administrations par jour pourra être réalisé, sans dépasser vingt administrations au total et avec un intervalle minimal de 48 heures entre deux administrations. Dans le cadre des études chroniques, un maximum de deux administrations par jour pourra être effectué pendant une période maximale de 28 jours. Certaines administrations pourront nécessiter une anesthésie générale et dureront quelques minutes. Des prélèvements sanguins, d'une durée de quelques minutes chacun, pourront être réalisés conformément au plan expérimental afin de répondre aux objectifs scientifiques de l'étude. Le nombre de prélèvements sera limité aux volumes et fréquences autorisés par la réglementation et adaptés au bien-être des animaux.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux peuvent subir jusqu’à trois opérations, chacune durant environ une heure (incluant le temps d’anesthésie). Ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale. Après l’opération, les animaux peuvent être temporairement moins actifs et présenter une légère déshydratation. Il peut arriver que certains animaux perdent leur dispositif d’enregistrement ou développent une infection à son point d’implantation. Dans de rares cas, une atteinte plus grave de la peau peut apparaître à l’endroit où un dispositif a été implanté. Les animaux peuvent participer à des sessions d’enregistrement, d’une durée allant de 2 à 72 heures. La fréquence des enregistrements dépendra de la durée de ceux-ci et sera adaptée en fonction du protocole établi. Pendant ces périodes, ils sont placés dans un espace plus petit, mais équipé de l’essentiel (litière, eau, nourriture et matériel pour faire un nid) afin de rester dans des conditions proches de leur environnement habituel. Ils peuvent se déplacer librement. L’administration de substances au cours de l’étude peut provoquer un stress ou une douleur légère au moment de l’injection. Bien que les produits testés aient déjà été évalués sur le plan de la sécurité, certains effets imprévus peuvent survenir, comme une baisse du tonus musculaire, une somnolence ou au contraire une agitation. Enfin, les prélèvements sanguins peuvent entraîner une douleur modérée liée à la piqûre. Un type de prélèvement spécifique, réalisé près de l’œil, peut dans de rares cas provoquer un hématome ou affecter la vision.

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans le but de faire des prélèvements et des analyses du cerveau et des tissus. Si les animaux ne sont pas mis à mort, ils pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d’administrations maximum n'a pas été atteint - le bien-être de l'animal le permet. Une procédure de réutilisation des animaux a été écrite et validée par le vétérinaire référent.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l'effet de certaines substances sur le sommeil et l'éveil. Le sommeil dépend de nombreuses interactions entre le cerveau et le reste de l'organisme. Aujourd'hui, ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits complètement en laboratoire sans utiliser un animal vivant. Il n'existe donc pas de méthode de remplacement adaptée à cet objectif. L'étude chez l'animal est nécessaire pour comprendre ces phénomènes et mesurer les effets des substances testées.

Réduction

Nous recueillerons plusieurs types d'informations à partir d'un même enregistrement, ce qui permet d'obtenir un maximum de connaissances à partir de chaque animal. Les mesures réalisées fourniront à la fois des informations sur les différents états d'éveil et de sommeil ainsi que sur l'activité du cerveau pendant ces états. Cette approche permet de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Afin de garantir la qualité des résultats, les souris seront habituées progressivement aux conditions expérimentales avant les enregistrements. Les expériences seront réalisées dans des conditions standardisées pour obtenir des données fiables et reproductibles. Les résultats déjà obtenus avec des substances de référence pourront également être réutilisés pour certaines comparaisons, ce qui évitera de répéter inutilement des expériences sur de nouveaux animaux. Pour l'évaluation des substances testées, chaque souris recevra successivement les différentes conditions expérimentales. Chaque animal servira ainsi de référence pour lui-même. Cette méthode permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires tout en conservant une bonne qualité d'analyse des résultats. Le nombre d'animaux a été calculé afin d'utiliser le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement fiables. Une première cohorte de 16 souris sera incluse dans le projet. Certaines pertes peuvent survenir au cours des procédures, par exemple lors de l'intervention chirurgicale ou lorsque les enregistrements obtenus ne sont pas exploitables. Ce risque, estimé à moins de 25 %, est pris en compte dans le calcul des effectifs afin de garantir qu'au moins 12 animaux puissent être inclus dans les analyses finales. Les données recueillies seront analysées à l'aide de méthodes statistiques adaptées afin de tirer le maximum d'informations de chaque expérience et d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Après leur arrivée, les souris bénéficieront d'une période d'adaptation à leur environnement avant toute intervention. Une opération sera ensuite réalisée sous conditions adaptées. Des médicaments contre la douleur seront administrés avant l'intervention puis renouvelés après celle-ci afin de prévenir toute douleur liée à la chirurgie. Les animaux feront l'objet d'une surveillance quotidienne, particulièrement durant la semaine qui suit l'opération, afin de détecter rapidement tout signe de douleur, d'infection ou de complication et d'apporter les soins nécessaires. Les dispositifs d'enregistrement ont été conçus de manière à permettre l'hébergement des souris en groupe après l'intervention, ce qui favorise leur bien-être. Les conditions d'hébergement sont également adaptées pour réduire le stress et permettre aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels. L'état de chaque animal sera évalué régulièrement à l'aide d'une grille d'observation basée sur des signes de douleur, de gêne ou de mal-être. Cette évaluation permet d'intervenir rapidement si nécessaire et de mettre en œuvre les mesures appropriées pour préserver le bien-être des animaux. Lors des enregistrements, les souris seront placées dans des compartiments spacieux contenant de la litière, de l'eau, de la nourriture et du matériel permettant la construction d'un nid, afin de recréer un environnement aussi familier que possible. Elles pourront se déplacer librement pendant toute la durée des enregistrements. Avant les expérimentations, elles seront progressivement habituées à ces conditions ainsi qu'aux manipulations réalisées par les expérimentateurs, afin de limiter le stress lié aux procédures. Le nombre d'administrations de substances sera limité au strict nécessaire. Lorsque plusieurs injections sont requises, les sites d'injection seront alternés afin de réduire l'inconfort local. Après chaque administration, les animaux seront observés attentivement afin de détecter rapidement tout effet indésirable et d'assurer une prise en charge adaptée si besoin.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle particulièrement adapté à l'étude du sommeil et de l'éveil. Son cerveau présente de nombreuses similitudes avec celui de l'être humain, notamment pour les réseaux nerveux qui contrôlent les états de veille et de sommeil. Les connaissances acquises chez la souris peuvent donc contribuer à une meilleure compréhension de ces mécanismes chez l'Homme et au développement de futurs traitements. Cette espèce présente également des avantages pratiques importants pour la recherche. Sa taille permet de réaliser avec précision les interventions nécessaires à la mise en place des dispositifs d'enregistrement de l'activité cérébrale. De plus, il est possible de travailler avec des animaux du même âge, de poids comparable et présentant des caractéristiques génétiques similaires, ce qui permet d'obtenir des résultats plus fiables et reproductibles. Certaines lignées de souris spécialement développées pour l'étude de maladies ou de mécanismes biologiques particuliers sont également disponibles lorsque cela est nécessaire. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées d'au moins 11 semaines. À cet âge, le cerveau a atteint un niveau de maturité suffisant pour permettre l'implantation des dispositifs d'enregistrement et l'étude des mécanismes du sommeil dans des conditions stables. Dans certains travaux portant sur les effets du vieillissement sur le sommeil et les états de vigilance, des souris plus âgées pourront également être utilisées.

Tous mis à mort à l'issue de chaque procédure pour une analyse post-mortem, 300 souris et 300 rats sains, 600 rongeurs en tout, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de deux heures pour implanter des électrodes dans des régions du cerveau liées à la mémoire, comme l'hippocampe, puis reçoit les composés testés, jusqu'à 180 fois par voie orale ou 21 fois par injection, avec jusqu'à huit prises de sang. Le porteur affirme que des administrations répétées "ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées", tout en reconnaissant qu'elles peuvent réduire l'activité spontanée. Les composés ont déjà été évalués in vitro "par nos clients", et ces enregistrements constituent une prestation à leur service.

Objectifs

La mémoire est une fonction essentielle du cerveau, souvent perturbée dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychiatriques. C’est pourquoi elle représente une cible importante pour développer de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier, chez des rongeurs sains (souris ou rats, selon les besoins), l’effet de nouveaux composés sur le fonctionnement du cerveau lié à la mémoire, et plus particulièrement sur la façon dont les connexions entre les neurones peuvent se renforcer ou s’affaiblir. La mémoire repose en grande partie sur ces modifications durables des connexions, appelées plasticité synaptique, comme la potentialisation à long terme (LTP) — un renforcement durable de la transmission entre deux neurones après leur activation répétée — ou la dépression à long terme (LTD) — une diminution prolongée de cette transmission synaptique. Ces mécanismes permettent au cerveau d’apprendre et de stocker des informations. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons une méthode appelée électrophysiologie in vivo, qui consiste à enregistrer l’activité électrique du cerveau chez des animaux éveillés. Concrètement, nous implantons de petites électrodes, avec une grande précision, dans des régions clés impliquées dans la mémoire, comme l’hippocampe ou le cortex préfrontal. Cela nous permet de mesurer l’activité des neurones et de voir comment les signaux entre eux changent après l’administration des composés testés. Les composés seront donnés par voie orale ou injectés, selon ce qui est le plus adapté, et nous mesurerons leurs effets à différents moments. En observant comment ces substances influencent l’activité des réseaux de neurones, nous espérons mieux comprendre leur impact potentiel sur la mémoire. Les résultats obtenus serviront de base pour des recherches futures dans des modèles animaux reproduisant des troubles de la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment de nouveaux composés agissent sur les mécanismes qui permettent au cerveau de renforcer ou d’ajuster les connexions entre neurones, un processus essentiel à la mémoire. En étudiant leur effet sur l’activité des réseaux de neurones dans un cerveau vivant, nous pourrons mieux cerner l’impact de ces candidats médicaments sur la plasticité cérébrale. Les données obtenues, issues d’un modèle préclinique dans des conditions proches du fonctionnement normal du cerveau, représenteront une étape clé avant de tester ces composés dans des modèles de maladies. Elles poseront ainsi les bases pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les dysfonctionnements des circuits neuronaux impliqués dans les troubles cognitifs liés à différentes maladies neurologiques ou psychiatriques.

Procédures

Sous analgésie anésthésie une seule étape de chirurgie (2 heures). Administrations : sous cutanée 1 à 14 fois max 5 sec ou Intrapéritonéale 1 à 21 fois max 5 sec ou 1 à 14 fois max 1 minute ou voie orale 1 à 180 fois max 5 sec. Prélèvements sanguins maximum 8 fois sur animal vigile ou anesthésiés (5 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les administrations uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. Les produits administrés peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire transitoire. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré au lieu d'injection. Une injection provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie. MODIF Les enregistrements électrophysiologiques in vivo sont réalisés sur animal vigile, dans une cage à laquelle ils ont été habitués pendant 3 jours afin de limiter considérablement le stress et les perturbations comportementales. L’implantation d’électrodes lors de la procédure chirurgicale peut provoquer une douleur au site d'incision ou des saignements. En post chirurgie, un risque inflammatoire ou infectieux est présent.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée chez l’animal vigile à l’aide de techniques d’électrophysiologie in vivo. Ces approches permettent d’enregistrer l’activité neuronale dans un environnement physiologique préservé, en tenant compte des interactions complexes entre différentes structures cérébrales et des influences de l’état de vigilance ou du comportement spontané. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, ce qui a permis d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’intégration de ces effets dans un réseau cérébral fonctionnel et intact. C’est pourquoi l’expérimentation in vivo s’avère nécessaire dans ce contexte, afin de caractériser l’impact des composés sur l’activité neuronale dans des conditions physiologiques réalistes.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies avec des éléments favorisant leur bien-être, comme des bûchettes de bois à ronger, de la frisure de papier et des carrés de coton. Des tunnels en carton faciliteront les transferts entre cages tout en limitant le stress. Des interactions régulières avec le personnel, ainsi qu’une transition progressive de la lumière, contribueront à améliorer leur acclimatation. Une période d’adaptation d’au moins 10 jours est prévue afin de permettre aux animaux de récupérer du transport et de s’habituer à leur nouvel environnement. Ils seront surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Après chaque intervention technique, leur comportement et leur état général seront observés avec attention pour détecter rapidement toute réaction anormale ou signe de douleur. Si nécessaire, une surveillance renforcée sera mise en place, en lien avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les seuils définis dans le cadre du projet seront scrupuleusement respectés pour assurer une détection précoce de toute souffrance. Les animaux seront pesés au moins deux fois par semaine après le début des traitements, afin d’adapter précisément les volumes administrés. Pour les injections répétées (intrapéritonéales ou sous-cutanées), les sites d’administration seront régulièrement changés pour limiter les réactions locales. Concernant les interventions chirurgicales, les animaux seront placés sous anesthésie générale / analgésie pendant toute la durée de l’opération. Une analgésie locale préventive sera administrée, avec une injection 10 minutes avant l’incision, ainsi qu’une application locale d’un mélange anesthésique au niveau du site opératoire. Le maintien de la température corporelle (tapis chauffant), le suivi pendant l’opération (monitoring) et des techniques chirurgicales stériles seront appliqués pour limiter les complications. Une solution ophtalmique sera appliquée sur les yeux pendant l’anesthésie pour éviter leur dessèchement, et une injection de solution saline tiédie à la fin de la chirurgie permettra d’assurer l’hydratation. Enfin, une analgésie post-opératoire sera assurée par l’ajout d’un traitement antidouleur dans l’eau de boisson pendant deux jours.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées sur la souris et le rat, deux modèles couramment utilisés en neurosciences pour étudier les mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes majeures avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des circuits neuronaux et les mécanismes synaptiques. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés pour explorer les bases du fonctionnement normal du cerveau ainsi que les processus altérés dans les maladies affectant la mémoire. Grâce à un cerveau moins complexe tout en restant suffisamment proche de celui de l’humain, les souris et les rats permettent d’étudier des fonctions essentielles telles que la plasticité neuronale, l’apprentissage et la mémoire, souvent perturbées dans les pathologies du système nerveux central. Ces modèles offrent ainsi la possibilité d’observer et de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux du fonctionnement cérébral, fournissant des données précieuses pour le développement de traitements ciblés contre ces maladies. Les animaux seront utilisés du jeune l’âge adulte, c’est-à-dire à partir de 4 semaines. Ils seront suivis jusqu’à environ 8 mois, ce qui couvre la période d’âge adulte sans atteindre le stade de vieillissement avancé soit avant l’apparition des altérations liées à l’âge ou à d’éventuelles pathologies. Les données obtenues chez ces animaux fourniront une base fiable pour la comparaison avec des modèles pathologiques plus avancés.

64 rats, dont le porteur prévoit qu'ils ne présenteront pas le comportement attendu, seront exclus de l'expérience et pourront être réutilisés dans d'autres projets. Les 176 autres rats, sur 240, sont tués à l'issue sous anesthésie profonde pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale d'une heure, puis vingt jours d'injections quotidiennes d'un médicament connu pour provoquer des comportements impulsifs, et pour l'une des procédures trente sessions d'évaluation de 45 minutes, avec hébergement individuel et restriction alimentaire. Le porteur ne nomme pas les tests qui mesurent cette impulsivité.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment une petite molécule naturellement présente dans l’organisme appelée microARN et qui régule l’expression de certains gènes, peut influencer certains comportements impulsifs lorsque le fonctionnement du cerveau est modifié par un traitement médicamenteux (dont un des effets secondaires est justement d’induire des comportements impulsifs et des addictions comportementales). L’objectif est de vérifier si réduire l'activité de cette molécule de façon ciblée dans une zone cérébrale impliquée dans la motivation et la prise de décision permet de réduire ces comportements impulsifs sans perturber le fonctionnement normal.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans certains troubles du contrôle du comportement et d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques plus ciblées et efficaces. À plus long terme, les résultats pourraient contribuer à améliorer l’identification des personnes à risque ainsi que la prise en charge de troubles encore mal compris et pour lesquels les traitements actuels restent insuffisants.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale ciblée sur une région cérébrale sous anesthésie générale, d'une durée d'environ une heure. Après minimum 2 semaines de récupération, ils recevront des injections quotidiennes pendant 20 jours d’un traitement médicamenteux connu pour induire des comportements impulsifs. Pour une des procédures, 30 sessions d'évaluation comportementale répétées d'environ 45 minutes seront également réalisées, avant chirurgie et après traitement médicamenteux, avec la nécéssité d'un hébergement individuel et d'une restriction alimentaire. À l'issue de l'étude, les animaux seront mis à mort sous anesthésie profonde pour analyse des tissus.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont liés à la chirurgie au niveau cérébral, pouvant entraîner un inconfort transitoire malgré l'anesthésie et la prise en charge de la douleur. Les injections répétées pendant plusieurs semaines peuvent également générer un stress, ainsi que les évaluations comportementales répétées associées à un hébergement individuel et à la restriction alimentaire.

Devenir

Il est établi que dans une de nos procédures, la moitié des animaux (64 rats) ne présentera pas le comportement attendu et ils devront être exclus de la suite de l'expérience et pourront être ré utilisés. Le reste des animaux sera mis à mort à l'issue de l'étude pour permettre l'analyse des tissus cérébraux. Cette étape est indispensable pour vérifier que le traitement a bien atteint la région cérébrale ciblée et pour mesurer les modifications biologiques attendues.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour évaluer l'efficacité d'une nouvelle approche thérapeutique sur un comportement complexe impliquant des circuits cérébraux qui ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives. Cependant, avant toute expérimentation chez l'animal, l'efficacité du traitement sera validée sur des cellules en culture afin de vérifier son action biologique et d'optimiser les paramètres expérimentaux. Cette validation préalable permet de limiter le nombre d'animaux en ne passant aux tests sur eux uniquement après confirmation de l'activité du traitement au niveau cellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé sur la base d'études préalables utilisant les mêmes approches expérimentales, ainsi qu'en prenant en compte les analyses statistiques qui seront utilisées, afin de garantir des résultats exploitables tout en limitant l'effectif au strict minimum nécessaire. Le plan expérimental maximise l'information obtenue à partir de chaque animal en combinant plusieurs mesures complémentaires sur les mêmes individus : évaluation comportementale, analyse des tissus et moléculaire. Cette approche intégrée réduit considérablement le nombre total d'animaux par rapport à des études séparées et l'analyse statistique prévue prendra également en compte un effet potentiel du sexe, tout en évitant de devoir doubler les groupes.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation pour réduire le stress. L'intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur par anesthésie locale, et un traitement antalgique complémentaire sera administré en post-opératoire. Une surveillance rapprochée permettra de détecter tout signe d'inconfort. Pour les injections, les sites d'injection seront alternés. Un suivi quotidien incluant observation et pesée régulière sera assuré et des points limites basés sur des signes significatifs seront utilisés, afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver leur bien-être. Dans le cas d'un hébergement individuel, l'effet de l'isolement sera limité par l'utilisation de cages ouvertes permettant des échanges olfactifs et sonores entre congénères, des objets différents mis dans les cages pour enrichir le milieu, ainsi qu'une manipulation quotidienne des rats.

Choix des espèces

Le rat adulte constitue le modèle de référence pour l'étude des comportements impulsifs, car il présente une organisation cérébrale et des circuits neuronaux similaires à ceux observés chez l'humain. Ce modèle validé permet une évaluation fiable et reproductible. L'utilisation d'animaux adultes est nécessaire car les circuits cérébraux et les comportements étudiés ne sont pleinement matures qu'à l'âge adulte, permettant le transfert potentiel de ses connaissance à l'homme. Les données préliminaires ayant identifié le mécanisme biologique ont également été obtenues chez le rat adulte, justifiant la poursuite de l’utilisation de ce modèle animal.

820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris rendues "dépressives" par de la corticostérone dans leur eau de boisson reçoivent des agonistes du récepteur 5-HT2A, hallucinogènes ou non, puis passent quatre tests en onze à seize jours, parmi la nage forcée de six minutes, l'alimentation inhibée par la nouveauté, la préférence pour l'eau sucrée, le splash test et l'open field. 195 d'entre elles subissent une trépanation sous anesthésie pour l'implantation de deux sondes de microdialyse dans le cortex préfrontal, et le porteur juge la douleur modérée parce que le cerveau serait "dépourvu de fibres nociceptives". Les bénéfices annoncés se résument à une "avancée supplémentaire" vers des antidépresseurs à action rapide. Il indique que les cages resteront sans enrichissement, sans dire pourquoi.

Objectifs

Depuis peu les psychédéliques ont démontré un effet antidépressif rapide. Notre projet vise donc à étudier les effets antidépresseurs rapides de ces molécules qui ciblent des récepteurs particuliers de la sérotonine : le récepteur 5-HT2A. Ces effets seront aussi étudiés au travers des neurotransmissions (libérations de neurotransmetteurs par les neurones) dans une région cérébrale impliquée dans l'effet antidépresseur des molécules déjà commercialisées ; le cortex médian préfrontal. Il est donc important de comprendre comment ces molécules affectent le fonctionnement des différents types de neurones du cortex. La meilleur compréhension des mécanismes d'action de ces molécules est une étape clé dans le développement de nouvelles prises en charge de la dépression notamment chez des patients résistants ou suicidaires.

Bénéfices attendus

La mise en évidence des mécanismes sous-jacents aux effets antidépresseurs des agonistes des 5-HT2AR hallucinogènes et non hallucinogènes seront une avancée supplémentaire dans le développement d'antidépresseurs non monoaminergiques à action rapide.

Procédures

En comportement : administration d'agonistes ou d'antagoniste 5-HT2AR ou de saline pour chaque souris. Chaque souris sera testée en comportement pour évaluer l'effet anxiolytique et antidépresseur des agonistes 5-HT2AR. En neurochimie: anesthésie de la souris, chirurgie stéréotaxique pour implanter deux sondes de microdialyse, administration d'agonistes ou d'antagonistes 5-HT2AR ou de saline pour chaque souris: 24h après, collecte des dialysats du cortex médian préfrontal toutes les 30 minutes pendant 3 heures, soit 6 dialysats/souris. Expérience 1 : nombre n=300, toutes les souris seront soumis à une batterie de tests comportementaux ; 4 tests en 16 jours : novelty suppressed feeding test dure 5 minute - SPT : les animaux sont soumis à un choix dans leur cage d'hébergement : soit un biberon d'eau, soit un biberon d'eau sucrée. La consommation de chaque boisson est ensuite enregistrée. - FST : dure 6 minutes - Open field : dure 10 minutes. Expérience 2 : nombre n=325, toutes les souris seront soumis à une batterie de tests comportementaux ; 4 test en 11 jours : Open field qui dure 10 minutes - novelty suppressed feeding test dure 5 minute - Splash test dure 5 minutes - FST : dure 6 minutes. Expérience 3 : implantation stéréotaxique de 2 sondes de microdialyse : une intervention par souris, durée 24h/souris ; nombre n=195

Impact sur les animaux

Les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour l'implantation intracérébrale de sonde qui inclue le positionnement sur le cadre stéréotaxique, la trépanation osseuse et l’incision du scalp, l'animal est sous anesthésie. Le cerveau étant dépourvu de fibres nociceptives, le niveau de douleur pour ces implantations intracérébrales est modéré.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour analyse post-mortem

Remplacement

Les expériences in vitro et in vivo sont complémentaires et ne s'excluent pas l'une l'autre. À ce jour, il n'est possible ni de modéliser les troubles de l'humeur, ni de modéliser les effets de molécules sur de tels troubles in vitro ou in silico — les mécanismes sous-jacents sont trop complexes pour cela. Il est donc nécessaire de recourir à l'expérimentation animale dans une telle situation.

Réduction

Le calcul de puissance effectué pour les expériences de comportement a été réalisé avec un logiciel statistique. Ceci indique 22 animaux par groupe ; nombre qui est augmenté à 25 pour pallier les aléas expérimentaux. Pour les expériences de microdialyse, un calcul de puissance a aussi été effectué grâce à un logiciel statistique. Ceci indique 14 animaux par groupe ; nombre qui est augmenté à 15 pour pallier les aléas expérimentaux.

Raffinement

Un anesthésique est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux. Cependant, pour prévenir des douleurs induites par la chirurgie crânienne, un traitement anti-inflammatoire sera entrepris le jour de la chirurgie. Un suivi quotidien sera assuré et l'état de prostration des animaux sera évalué. Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Les points limites définis dans les différentes procédures expérimentales seront strictement appliqués. L’enrichissement dans les cages ne peut être utilisé mais la durée des procédures est limitée.

Choix des espèces

L'animal, dans son entité, est la seule alternative à l'étude des troubles de l'humeur et de leurs mécanismes de part l'implication de nombreuses populations neuronales différentes interconnectées entre elles. Le modèle de rongeur rendues dépressives par l'application chronique de corticostérone dans l'eau de boisson (modèle CORT) a été développé et validé au sein du laboratoire chez la souris. Les animaux seront adultes et âgés de 8 à 10 semaines au moment de débuter le CDM. Les animaux seront adultes et âgés de 8 à 10 semaines au moment de débuter le traitement à la corticosterone. Ainsi la chirurgie sera menées sur les animaux agés de 16 à 18 semaines.

Une injection intracérébrale d'un vecteur viral, avec incision du scalp et pose d'agrafes, doit provoquer chez des souris l'accumulation d'une protéine Tau humaine mutée, dans les neurones ou dans les astrocytes. 408 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'étude histologique de leur cerveau. L'objectif déclaré est de reproduire chez la souris la paralysie supranucléaire progressive, et le porteur annonce des troubles de la coordination motrice et de la mémoire, peut-être des mouvements répétitifs. Les souris destinées aux tests vivront avec un enrichissement de cage réduit au minimum, pour ne pas biaiser les résultats, et passeront cinq tests comportementaux qu'il ne nomme pas, d'une durée de trente secondes à vingt-trois heures par jour.

Objectifs

La paralysie supranucléaire progressive (PSP) est une maladie neurodégénérative rare mais sévère. Débutant entre 40 et 60 ans, elle évolue rapidement et se caractérise par une instabilité posturale, des troubles des muscles oculaires, des troubles moteurs progressifs et des déficits cognitifs et comportementaux marqués. À un stade avancé, la marche, la vision, le langage et la déglutition sont fortement altérés, entraînant une perte majeure d’autonomie. Sur le plan neuropathologique, la PSP est définie par l’accumulation anormale de la protéine Tau dans les neurones et les cellules gliales (cellules non neuronales du système nerveux), notamment les astrocytes. Longtemps considérée comme une maladie principalement neuronale, la PSP est désormais reconnue comme impliquant les astrocytes, dont les altérations sont associées à la gravité des symptômes. Cependant, l’absence de modèles animaux fidèles, reproduisant à la fois les lésions neuronales et astrocytaires ainsi que les symptômes cliniques, constitue un frein majeur au développement de thérapies, alors qu’aucun traitement efficace n’existe à ce jour. Ce projet a pour objectif de développer de nouveaux modèles chez la souris de la PSP grâce à des vecteurs viraux exprimant une forme mutée de la protéine Tau, ciblant initialement soit les neurones, soit les astrocytes. Ces modèles permettront de reproduire les lésions clés de la PSP, d’évaluer les déficits comportementaux associés et de déterminer la contribution propre des astrocytes à la pathologie. À terme, ils constitueront des outils précieux pour mieux comprendre la maladie et accélérer le développement de stratégies thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

La PSP est la deuxième tauopathie la plus fréquente, après la maladie d’Alzheimer, avec une prévalence estimée entre 1 et 18 personnes pour 100 000, soit environ 5000 à 10 000 patients en France. Cette maladie agressive débute entre 40 et 60 ans et progresse rapidement sur 5 à 10 ans. Mieux comprendre comment les astrocytes participent à la maladie est une question essentielle à poser pour développer de nouvelles pistes thérapeutiques. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement efficace pour traiter cette maladie mortelle. Un obstacle majeur au développement de nouvelles thérapies est le manque de modèles animaux reproduisant à la fois les lésions neuronales et astrocytaires, mais aussi des symptômes typiques de la pathologie. Les modèles transgéniques murins surexprimant des formes de la protéine Tau développent très peu de lésions astrocytaires et présentent des déficits comportementaux modestes. Le transfert de gène, via l’utilisation de virus génétiquement modifiés codant pour la protéine Tau humaine est un recours intéressant, car il permet de cibler spécifiquement les neurones ou les astrocytes, dans des régions choisies du cerveau en réalisant des injections stéréotaxiques chez l’animal adulte. Cette approche est donc très prometteuse pour modéliser les lésions typiques de la PSP. Elle pourrait permettre de mieux comprendre comment l’accumulation de Tau dans les astrocytes contribue à la pathologie. A terme, ces nouveaux modèles de PSP pourraient être des outils essentiels pour le criblage rapide de molécules thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions : - L’ensemble des animaux inclus recevront une injection d’un vecteur viral (durée : 20 à 30 minutes) pour apporter le gène Tau muté ou un placebo. Les animaux récupèrent généralement en quelques heures. - Une partie des animaux sera soumise à 5 tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacités motrices et cognitives. Chacun de ces tests dure entre 30 sec et 23h par souris et par jour. L’ensemble des tests est effectué 2 fois sur une période de 6 semaines, effectué à 2 stades de la pathologie (1 mois et 4 mois après injection du vecteur viral).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui entraineront des effets indésirables différents : - Les effets secondaires liés à l’injection intracérébrale se limitent à une douleur transitoire au niveau de l’injection (incision du scalp et pose d’agrafes). - La pathologie induite par la surexpression de Tau peut générer une altération de la coordination motrice et de la mémoire. Des troubles du comportement de type mouvements répétitifs pourraient apparaitre. - Les tests comportementaux sont réalisés sur animaux vigiles et peuvent entraîner un stress léger. Le stress ponctuel dû au test sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. La diminution de l’enrichissement dans les cages d’hébergement peut engendre un léger stress des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont destinés à une étude histologique des tissus au niveau des régions atteintes du cerveau, ce qui nécessite leur euthanasie.

Remplacement

Ce projet fait appel à des modèles de souris de la PSP. A l’heure actuelle, ce projet ne peut, ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des modèles informatiques. En effet les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles murins. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur une espèce modèle mammifère comme la souris, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est à dire possédant un cerveau complexe doté d’un système moteur et mnésique permettant d’exprimer des comportements sophistiqués à l’instar de l’être humain.

Réduction

Une étude statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe nécessaire pour observer des effets significatifs. Cette étude est basée sur des données obtenues dans la littérature scientifique et sur les valeurs que nous avons observées lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 408 animaux lors des expériences qui seront menées pendant l’étude. Ce nombre maximum, a été déterminé en fonction des expériences à réaliser pour pouvoir répondre à la question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous avons prévu les procédures au fur et à mesure avec une réduction du nombre de groupes possible si les premiers lots de vecteurs viraux produits permettent d’effectuer l’ensemble de l’étude.

Raffinement

En cas d’atteinte des points limite, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Afin d’éviter tout biais dans les résultats des tests comportementaux destinés à évaluer la motricité et la mémoire des souris, les animaux destinés à ces tests seront hébergés en conditions minimales d’enrichissement. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience, notamment lors des tests de comportement. Les protocoles d’anesthésie et de diminution de la douleur des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.

Choix des espèces

Choix de l’espèce modèle : L’objectif de ce projet est d’améliorer les connaissances sur la paralysie supranucléaire progressive (PSP) afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. La région initialement et la plus gravement atteinte dans la forme commune de PSP est située dans des noyaux sous-corticaux. La pathologie se propage ensuite aux régions corticales du cerveau. Les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas ces régions cérébrales. Il est donc nécessaire de mener ce projet sur une espèce dotée d’un tel système, similaire à celui retrouvé dans l’espèce humaine. Les rongeurs, et la souris en particulier, possèdent des systèmes moteur et limbique très proches de celui de l’êtrehumain. De plus, la grande proximité entre le génome de la souris et le génome humain assure une pertinence maximale des cibles thérapeutiques qui seront identifiées au cours de ce projet. Les souris qui seront utilisées reproduisent les différentes lésions anatomiques retrouvées dans le cerveau des patients atteints de la PSP. Elles devraient également présenter des altérations motrices et cognitives qui sont caractéristiques de la PSP. Ces déficits peuvent être quantifiés par des tests comportementaux qui sont réalisés en routine au laboratoire. Choix du stade de développement étudié : Les animaux seront d’abord évalués au stade jeune adulte (3 mois) puis au stade adulte (6 mois) afin de mimer les stades auxquels la PSP se déclare chez l’homme (entre 40 et 60 ans) et d’évaluer comment les fonctions motrices et cognitives s’altèrent au cours du temps.

Les rats de ce projet ont une maladie chronique du foie provoquée par chirurgie, et certains arrivent déjà opérés de chez un fournisseur spécialisé. 2 010 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, nourris pour certains d'un régime enrichi en protéines ou en ammoniac, et reçoivent une substance impliquée dans les troubles neurologiques de la maladie. S'y ajoutent des prises de sang, des traitements expérimentaux par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, jusqu'à vingt minutes en enceinte thermostatique avant certaines injections, et des tests de mémoire, d'apprentissage et de motricité que le porteur ne nomme pas. Tous sont tués à l'issue, car les dosages prévus exigent un grand volume de sang prélevé en fin de vie et plusieurs tissus.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie peuvent entraîner des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, de coordination des mouvements ou des changements de comportement. Dans les formes les plus sévères, l’état de conscience peut être altéré. L’objectif de ce projet est de développer et caractériser des modèles reproduisant certaines de ces complications chez le rat et d’utiliser ces modèles pour évaluer de futurs traitements. Pour cela, une maladie chronique du foie sera induite par une intervention chirurgicale. Cette intervention sera associée à une alimentation enrichie en protéines ou en ammoniac ainsi qu’à l’administration ponctuelle d’une substance impliquée dans l’apparition des troubles neurologiques observés chez les patients. Ces travaux permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes responsables de la maladie et d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques destinées à prévenir ou à réduire les troubles neurologiques associés aux maladies chroniques du foie. Les conditions expérimentales seront définies afin de reproduire des formes modérées de la maladie compatibles avec le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques du foie peuvent provoquer des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, d’apprentissage ou de coordination des mouvements. Dans certains cas, ces troubles peuvent réduire l’autonomie des patients et avoir un impact important sur leur vie quotidienne et celle de leurs proches. Ce projet vise à développer des modèles permettant de mieux reproduire ces complications et de mieux comprendre les mécanismes responsables de leur apparition. Ces modèles seront également utilisés pour évaluer de nouveaux traitements destinés à prévenir, limiter ou corriger les troubles observés. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies chroniques du foie, à réduire les conséquences neurologiques associées à ces maladies, à préserver leur autonomie et à améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale accompagnée d'un traitement adapté contre la douleur. Cette intervention vise à provoquer une maladie chronique du foie similaire à celle observée chez certains patients. Selon la procédure concernée, les animaux pourront recevoir une injection sous-cutanée d'une substance impliquée dans l'apparition des troubles neurologiques observés chez les patients atteints de maladie du foie. Cette administration dure moins d'une minute. Un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours de l'étude ainsi qu'un prélèvement final. Ces actes sont effectués sous anesthésie gazeuse de courte durée, généralement comprise entre 2 et 5 minutes, et le prélèvement lui-même dure environ une minute. Les animaux pourront également recevoir un traitement expérimental administré par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Chaque administration dure habituellement moins d'une minute. Certaines administrations intraveineuses pourront nécessiter un maintien temporaire dans une enceinte thermostatique pendant une durée maximale de 20 minutes afin de faciliter l'administration. Dans certaines études, un traitement unique pourra être administré selon un principe de dialyse péritonéale sous anesthésie gazeuse de courte durée. L'administration dure environ une à deux minutes et l'anesthésie quelques minutes. Enfin, les animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer l'activité, la mémoire, l'apprentissage ou les capacités motrices. Ces évaluations reposent principalement sur l'observation des animaux et ne nécessitent pas d'acte invasif.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et bénéficieront d'un traitement adapté contre la douleur. Après l'opération, ils pourront présenter une gêne temporaire, une diminution transitoire de l'activité ou une baisse de l'alimentation. Au cours de l'étude, le développement de la maladie pourra entraîner une diminution modérée de la prise de poids, une baisse de l'activité spontanée ainsi que des modifications du comportement, de la mémoire, de l'apprentissage ou de la coordination des mouvements. Certains régimes alimentaires utilisés dans le projet pourront renforcer temporairement ces effets. Une substance impliquée dans les mécanismes de la maladie pourra également être administrée afin de reproduire certains épisodes observés chez les patients. Cette administration pourra entraîner, pendant une courte durée, une diminution de l'activité ou des capacités motrices. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière tout au long du projet. Des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'intervenir rapidement en cas d'aggravation inattendue afin de préserver leur bien-être.

Devenir

À l’issue des procédures, l’ensemble des animaux sera mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements biologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Les analyses prévues nécessitent le recueil d’un volume sanguin terminal important ainsi que la collecte de plusieurs tissus d’intérêt, notamment au niveau cervical. Ces prélèvements permettent la réalisation concomitante de nombreux dosages qui ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. L’utilisation de prélèvements terminaux permet également de maximiser la quantité de données obtenues à partir d’un même animal et contribue ainsi à l’application du principe de réduction en limitant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. En raison de la nature des prélèvements réalisés et de leur caractère invasif, aucun animal ne pourra être réutilisé à l’issue de l’étude.

Remplacement

Avant de réaliser les études chez l'animal, des tests in vitro et des approches de modélisation informatique sont utilisés pour sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs. Ces méthodes permettent notamment d'étudier l'action de composés sur des cellules, des tissus ou certaines bactéries présentes dans l'intestin, ainsi que de prédire certains de leurs effets dans l'organisme. Cependant, les troubles étudiés dans ce projet résultent d'interactions complexes entre plusieurs organes, notamment l'intestin, le foie, les reins et le cerveau. Aucune méthode alternative disponible aujourd'hui ne permet de reproduire simultanément l'ensemble de ces mécanismes dans un organisme vivant. Les méthodes sans animaux ne permettent pas non plus d'évaluer les effets de la maladie sur la mémoire, l'apprentissage, le comportement ou les capacités motrices, ni de mesurer l'efficacité globale d'un traitement dans l'organisme. Elles ne permettent pas davantage de suivre la façon dont un médicament est absorbé, transformé et agit sur différents organes. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet donc d'atteindre les objectifs de ce projet sans recourir à l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Avant les études thérapeutiques, plusieurs phases de caractérisation permettront d'identifier les conditions expérimentales les plus adaptées et de vérifier la reproductibilité des modèles. Les connaissances acquises lors de ces premières étapes seront utilisées pour concevoir les études suivantes et éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Les mêmes animaux seront suivis à plusieurs reprises au cours des études afin de recueillir différentes informations (état général, prélèvements biologiques et évaluations comportementales) sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Les groupes expérimentaux ont également été conçus de façon à permettre la comparaison de plusieurs traitements au sein d'une même étude lorsque cela est possible. Cette stratégie permet d'obtenir un maximum d'informations à partir de chaque animal tout en utilisant le plus petit nombre d'animaux compatible avec la qualité et la fiabilité des résultats scientifiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions favorisant leur bien-être, avec un enrichissement du milieu comprenant notamment des abris, des matériaux permettant la construction de nids et des objets à ronger. Lorsque leur état le permet, ils seront maintenus en groupe. Certains animaux pourront être reçus déjà opérés auprès d'un fournisseur spécialisé. Dans tous les cas, une période d'acclimatation et une surveillance renforcée seront mises en place après leur arrivée ou après l'intervention chirurgicale. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement contre la douleur. Les animaux bénéficieront d'une surveillance adaptée jusqu'à leur rétablissement complet et d'un complément alimentaire favorisant la reprise de l'alimentation. Avant le début des évaluations, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations et aux différents tests afin de limiter le stress. Les conditions expérimentales seront définies de manière à reproduire des formes modérées de la maladie sans rechercher l'apparition de troubles sévères. Une surveillance régulière sera réalisée tout au long du projet afin de détecter rapidement toute dégradation de l'état des animaux. Des mesures adaptées seront mises en place si nécessaire et des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'éviter toute souffrance excessive.

Choix des espèces

Aucun modèle alternatif ne permet aujourd'hui de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les complications neurologiques associées aux maladies chroniques du foie. Le rat a été choisi car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l'Homme concernant le fonctionnement du foie, de l'intestin et du cerveau. Il permet également d'étudier la mémoire, l'apprentissage, l'activité et le comportement à l'aide de méthodes reconnues et largement utilisées en recherche pharmaceutique. Cette espèce est particulièrement adaptée au modèle utilisé dans ce projet, notamment pour la réalisation de l'intervention chirurgicale nécessaire à l'induction de la maladie. De plus, de nombreuses études scientifiques ont déjà été réalisées chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats et contribue à limiter le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. Ce stade de développement a été retenu car il correspond à celui le plus fréquemment utilisé pour l'étude de ces maladies et permet de réaliser les interventions et les évaluations prévues dans des conditions optimales.

1 440 souris nouveau-nées ou juvéniles, âgées de un à vingt-et-un jours, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Pour évaluer des molécules destinées à des épilepsies rares de l'enfant, on leur injecte sous anesthésie gazeuse des candidats médicaments directement dans le cerveau, à travers le crâne encore souple chez les souriceaux de un à trois jours et après incision de la peau chez les plus âgées, avec pour effets possibles un retard de croissance et le rejet par la mère. Les mères et les souriceaux non traités, hors de ce décompte, sont utilisés pour former le personnel à des gestes techniques ou dans un autre projet autorisé. Le porteur qualifie l'incision chez les juvéniles de "nécessaire et justifiée", et l'élargissement à cet âge de "scientifiquement indispensable".

Objectifs

Les DEEs sont des maladies neurodéveloppementales rares, génétiques et syndromiques, caractérisées par une déficience intellectuelle, des troubles du langage, un développement moteur potentiellement altéré et des crises d'épilepsie d'apparition précoce, souvent accompagnées d'une régression du développement. Les traitements actuels (médicaments antiépileptiques) sont peu efficaces pour les formes rares, et les interventions chirurgicales sont lourdes et risquées chez les jeunes enfants. Il est nécessaire d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie et l’apprentissage des patients. L’objectif de ce projet est de définir un modèle permettant d’administrer nos candidats médicaments dans des zones spécifiques du cerveau de souris nouveau nées âgés de 1 à 3 jours par voie intracérébrale (phase développementale cérébrale similaire entre un souriceau de 3 jours et un nourrisson humain de 3 mois). [Afin de couvrir une fenêtre développementale plus large et représentative de l'évolution de ces pathologies durant la petite enfance, ce projet intègre également la réalisation d'injections chez des souris juvéniles âgées de 4 à 21 jours (stade de développement correspondant approximativement à la période allant de 6 mois à 3 ans chez l'enfant humain). Cette extension de la fourchette d'âge est scientifiquement indispensable car les cibles thérapeutiques étudiées peuvent s'exprimer de manière différentielle en fonction de l'âge et de la maturité neuronale.] En effet, les candidats médicaments ne passant pas la Barrière Hémato-Encéphalique, nous sommes obligés de les administrer par voie intra-cérébrale. Il est essentiel d’évaluer l’effet de nos candidats médicaments pendant les stades de développement du cerveau où les crises épileptiques se manifestent le plus dans le cadre des DEEs. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets différents sur un cerveau en développement (nouveau-né) par rapport à un cerveau plus mature (souris sevrée, jeune adulte ou adulte). Les composés étudiés dans ce modèle chez la souris nouveau-née, seront issus de sélection par des tests in silico et in vitro, puis in vivo chez la souris adulte afin d’évaluer leur tolérabilité et leur efficacité sur une cible d’intérêt. L’efficacité des meilleurs candidats ainsi sélectionnés sera évaluée dans le cadre du traitement des maladies épileptiques rares, et dans le but d’être administrés à de jeunes enfants (à partir de 3 mois).

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. [En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares (moins d’une personne atteinte sur 2000) est estimé à 3.5 millions. Plus de 7000 maladies rares, dont 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte pour certaines d’entre elles peut provoquer des signes cliniques pathologiques apparaissant dès la naissance ou durant l’enfance (entre 3 mois et 6 ans), telle que les encéphalopathies épileptiques et/ou développementales (DEEs).] Les traitements de la DEE reposent sur la prescription de médicaments antiépileptiques, qui ne sont pas toujours efficaces pour les formes rares d’épilepsie, et sur des interventions chirurgicales curatives (ablation de la zone épileptogène, radiochirurgie cérébrale ou thermocoagulation) qui peuvent être lourdes et risquées notamment chez les jeunes enfants. Les futurs candidats médicaments évalués dans ce projet sont connus pour ne pas passer la Barrière Hématoencéphalique (barrière naturelle qui sépare le cerveau du reste du corps). Ils seront donc administrés directement dans le système nerveux central (SNC) des patients afin de permettre un ciblage direct de celui-ci, augmentant ainsi l’efficacité des traitements, et diminuant les effets secondaires qui pourraient survenir après une administration orale ou intraveineuse, améliorant ainsi grandement la qualité de vie des patients. Les bénéfices attendus de ce projet sont de caractériser les potentiels candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques infantiles. Chez la souris, afin de mimer au mieux la voie d’administration humaine, les composés seront administrés par voir intracérébrale.

Procédures

- Administration de composés étudiés sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 15 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) - Administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) et administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) avant l’euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : - Des administrations d’anesthésique. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent également générer un léger stress. - De la phase d’anesthésie gazeuse (durée maximale de 20min) et du suivi post-anesthésie qui peuvent générer un stress modéré. - De l’administration de composés sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 30s qui peut générer un stress modéré. - [De l’administration pré et post-opératoire d’un analgésique et administration pré-opératoire d’un anesthésique local selon l’âge au moment de l’injection. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent générer un léger stress.] Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : D’une non prise de poids des souriceaux jusqu’au sevrage pouvant être induite par l’administration du composé ainsi qu’un retard de croissance (nuisance modérée) Du rejet de la mère (nuisance modérée) Les composés administrés peuvent également induire des effets cliniques (par exemple atteinte des mouvements spontanés, retard du comportement de recherche de la tétée) et provoquer une nuisance pour l’animal (durée maximale de l’étude : [4 mois]).

Devenir

Tous les [animaux] inclus dans les procédures sont soit euthanasiés en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiés en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques (effet des composés sur l’expression de la protéine d’intérêt par exemple). De plus, les mères ainsi que les souriceaux non-traités, non inclus dans les procédures de cette demande de projet seront soit utilisés pour de la formation à des gestes techniques, soit utilisés dans des études d’évaluation d’efficacité de composé faisant l’objet d’un autre projet autorisé.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal sain possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant d’évaluer l’activité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Un premier filtre in vivo est effectué via une autre autorisation de projet afin d’identifier les meilleurs candidats médicaments pharmacologiquement intéressants. En effet, des études préalables permettront d’évaluer la tolérabilité des composés sur des souris adultes ainsi que leur efficacité sur une cible d’intérêt, afin de pouvoir sélectionner les candidats médicament les plus puissants. A l’issue de ce premier filtre, les administrations chez la souris nouveau-née pourront être réalisées sur un nombre restreint d’animaux (6 souris maximum par groupe) et sur des animaux des deux sexes (la détermination sexuelle ne pouvant être sûre qu’à partir de 21 jours) dans le cadre de l’évaluation pharmacologique des composés. Une consultation du service de Biostatistique sera effectuée après la réalisation des premières études afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par groupe mais en assurant l’obtention de résultats exploitable et reproductibles. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. Lors des prélèvements effectués à la fin des études après euthanasie des souris, un maximum de tissus seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce processus nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé par projet de recherche

Raffinement

Les souriceaux seront stabulés avec leur mère jusqu’au sevrage (21 jours) puis maintenus en groupes sociaux une fois retirés de leur mère, dans un environnement adapté limitant au maximum les facteurs de stress (bruits, manipulations fréquentes …) et en séparant les mâles des femelles pour les études de plus de 21 jours. Gestion de la douleur, par anesthésies et analgésies adaptées en fonction de l’âge, afin de couvrir les phases d’administration intracérébrale et de prélèvement terminal : - [Souriceaux de 1 à 3 jours] : Aucune incision ne sera nécessaire pour insérer l’aiguille d’injection dans les ventricules – l’os du crâne étant encore souple. - [Juvéniles de 4 à 21 jours : approche chirurgicale avec incision cutanée nécessaire et justifiée par l'évolution physiologique et anatomique inhérente au stade de développement le crâne se renforce, la peau mûrit, la couleur naturelle apparaît et le pelage commence à pousser. Les volumes administrés respecteront strictement les recommandations de la Structure de Bien Etre Animal en fonction de l'âge et du poids.] Après l'administration, les animaux font l'objet d'une surveillance attentive et régulière de leur état général et de leur bien-être tout au long de l'étude ([max 4 mois]). Leur rétablissement, leur comportement, leur croissance et leur développement sont évalués à l'aide d'observations adaptées et de critères standardisés. Ces suivis permettent de détecter rapidement tout signe d'inconfort, de détresse ou d'effet indésirable. Une attention particulière est portée à la bonne évolution des animaux, notamment par comparaison avec des animaux de référence. Si un animal présente des signes indiquant que son bien-être est compromis au-delà des limites prédéfinies, des mesures appropriées sont mises en œuvre conformément aux procédures établies afin d'éviter toute souffrance inutile. Afin de réduire le risque de rejet des souriceaux, plusieurs précautions sont prises : la mère est progressivement familiarisée avec les odeurs associées aux procédures, les perturbations de son environnement sont limitées au maximum après la naissance, les manipulations sont organisées de manière à maintenir un contact permanent avec une partie de la portée, et les souriceaux sont réimprégnés des odeurs du nid avant leur retour auprès de leur mère. L'environnement des animaux est enrichi à l'aide de matériaux de nidification et d'éléments favorisant l'exploration et l'expression de comportements naturels

Choix des espèces

La souris saine présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’évaluer l’efficacité des composés sur les cibles génétiques sans avoir systématiquement recours à des souris génétiquement modifiées. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des DEEs, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau nées. [L'utilisation de souris juvéniles de 4 à 21 jours est, quant à elle, requise pour évaluer l’effet de nos composés à un stade plus avancé de la maturation cérébrale (expression des cibles thérapeutiques différentes en fonction de l’âge). Ce stade pré-sevrage est indispensable pour étudier l'impact des traitements pour évaluer une fenêtre thérapeutique plus tardive. L'utilisation de ces deux stades de développement est donc scientifiquement incontournable pour garantir la pertinence translationnelle des résultats vers la clinique pédiatrique humaine pour la pathologie ciblée.] Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les administrations seront réalisées sur des souriceaux âgés de 1 à 3 jours [et des souris âgées de 4 à 21 jours.]