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Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la diffusion des lésions inflammatoires dans un contexte de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des souris subissent l'une de quatre méthodes d'inflammation du côlon, avec perte de poids, mobilité réduite et diarrhée parfois sanglante, sans traitement contre la douleur pendant l'inflammation. 2 160 souris, dont une lignée génétiquement prédisposée aux maladies inflammatoires de l'intestin, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec jusqu'à quatorze injections dans l'abdomen. Le porteur reconnaît que ces colites sont "associées à des douleurs" et écarte les antalgiques pour ne pas fausser l'inflammation, mais il présente ailleurs ces douleurs comme "transitoires" et affirme que les actes douloureux se feront sous anesthésie générale. Les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure, ou dès qu'un score de poids, d'apparence ou de comportement dépasse 2, et leurs organes sont prélevés pour les analyses.
Objectifs
D’une manière générale, la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) est décrite pour être le résultat d’une réponse anormale du système immunitaire stimulé par des modifications du microbiote. Bien qu’on ne connaisse pas à l’heure actuelle le « primum movens » entre les altérations du microbiote et du système immunitaire, une augmentation de la perméabilité intestinale est impliquée dans la genèse et l’entretien de ce « dialogue » anormal aboutissant au processus inflammatoire. D’un point de vue expérimental, quelques travaux ont montré qu’un excès de perméabilité intestinale était impliqué dans le développement et la sévérité de l’inflammation digestive. De plus nous avons montré, chez des souris sauvages et prédisposées génétiquement au MICI, que la perméabilité de l’intestin grêle était augmentée mais que seules les souris prédisposées génétiquement aux MICI présentaient des lésions inflammatoires au niveau de l’intestin grêle. Ainsi, les objectifs du projet, sont d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels une inflammation du colon altère la physiologie de l’intestin grêle pour favoriser le développement de lésions inflammatoires chez des souris génétiquement prédisposées aux MICI. Pour réaliser ce projet, 4 modèles d’inflammations coliques seront réalisés sur des souris sauvages et souris génétiquement prédisposées aux MICI. Dans chaque modèle, nous étudierons l'implication de la circulation des lymphocytes inflammatoires, d’un enzyme impliqué dans la régulation de la perméabilité, et du microbiote dans l’augmentation de la perméabilité et le développement des lésions inflammatoires.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de comprendre comment les lésions inflammatoires des MICI se propagent tout au long du tractus digestif. Ce projet permettra notamment de montrer le rôle d'une circulation lymphocytaire, des cellules épithéliales et du microbiote dans la diffusion des lésions inflammatoires. Ainsi, une meilleure compréhension de la physiopathologie des MICI permettra alors une meilleure prise en charge thérapeutique.
Procédures
Les principales nuisances attendues sont liées aux 4 procédures d’inflammation colique. Ces inflammations vont se traduire par une perte de poids, une réduction de la mobilité des souris et une diarrhée plus moins sévère associée ou non à du sang dans les selles. Tous ces paramètres seront contrôlés, une fois par jours, et nous serons particulièrement attentifs lors des procédures inflammatoires sur l’apparition de ces nuisances/effets indésirables. Une autre nuisance potentielle sera liée à l’administration intrapéritonéale chronique d’inhibiteur de la circulation des lymphocytes et de l’inhibiteur de la MLCK qui occasionnera une gêne transitoire liée à la contention de la souris et à l’injection. Les souris Nod2ko présentent un phénotype dommageable intestinale, à savoir une inflammation à bas bruit qui est asymptomatique d’un point bien-être animal (pas de signes d’angoisse, de douleur…). Lors des procédures inflammatoires sur cette lignée murine, nous serons particulièrement attentifs sur l’apparition et l’intensité des nuisances/effets indésirables qui sont attendus plus sévère que chez les souris sauvages. Pour les 4 procédures, il est prévu des injections intrapéritonéales (IP, d’une durée d’une minute chacune) de produits : -procédure 1, il est prévu 3 IP -procédure 2, il est prévu 14 IP -procédure 3, il est prévu 14 IP -procédure 4, il est prévu 6 IP Pour les procédures 1 et 4 il est prévu une injection intra-rectale de produit, réalisée sous anesthésie gazeuse et tapis chauffant (environ 5 minutes). Enfin, pour la procédure 4, une injection sous-cutanée (environ 2 minutes) est également nécessaire. Dans les 4 procédures, des selles seront récupérées pour réaliser des tests Hemoccult. Aucun autre prélèvement et chirurgie ne seront fait sur animaux vigiles. Tous les prélèvements seront réalisés sur des souris en post-mortem.
Impact sur les animaux
Seuls les animaux traités par injection intrapéritonéale ressentiront potentiellement une douleur légère de courte durée. Pour les 4 modèles d'inflammation colique, des douleurs inflammatoires transitoires seront ressenties par les animaux. Seules les souris prédisposées génétiquement aux MICI présentent un phénotype dommageable d'inflammation intestinale.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire
Remplacement
Le développement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) chez l’Homme est un processus long et complexe mettant en jeu des facteurs génétiques et environnementaux. Les modèles murins génétiquement prédisposés aux MICI, miment les pathologies humaines et sont la seule solution actuelle pour obtenir des données avec une relevance physiologique correcte. Pour atteindre les objectifs de nos études, il est nécessaire d'utiliser des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées. Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives à ces études in vivo. L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques sur les MICI. De plus, notre projet est basé sur l'utilisation de souris génétiquement prédisposées aux MICI, ces modèles n’existent pas chez d’autres espèces. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima en tenant compte de la variance biologique (empiriquement n=12/groupe) des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés souris par groupe) tous les échantillons prélevés sont stockés à -80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les 4 procédures de colite utilisées dans ce projet sont décrites pour être associées à des douleurs. Cependant, comme l’utilisation d’analgésiques, d’antalgiques ou d’anti-inflammatoires risquerait d'interférer avec le développement de l’inflammation intestinale, ces traitements ne peuvent pas être utilisés. Néanmoins, nous avons mis en place des critères d'arrêt par rapport à la souffrance potentielle des souris durant l'expérimentation (voir grille de scoring). Pendant la durée des procédures inflammatoires, les animaux sont contrôlés à minima 1 fois par jours (matin), voire deux fois par jour. En effet, pendant les périodes critiques pouvant générer de la douleur liée au pic d’inflammation, une surveillance biquotidienne sera mise en place. Le suivi quotidien est assuré par les membres l’équipe la semaine et le weekend. Le personnel de la zootechnie, peut également, être impliqué dans le suivi uniquement la semaine. Pour évaluer l’intensité de la douleur associée au développement de l’inflammation intestinale, 3 paramètres seront mesurés (voir grille de scoring) : la perte de poids, l’apparence générale et le comportement. Si le score de l’un des 3 paramètres dépasse le score de 2, l’animal sera immédiatement mis à mort par dislocation cervicale après une anesthésie. Lorsqu’un des trois paramètres atteint un score de 1, des soins seront apportés (voir grille de scoring). Toutes les procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entraîner une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques sur et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). De plus, la souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau intestinal. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Enfin, notre projet est basé sur d’animaux génétiquement prédisposés aux MICI qui ne sont disponibles que chez qu’une seule espèce : la souris. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps…) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Enfin, les procédures de MICI utilisées dans ce projet ont été validées que chez la souris. Pour les 4 procédures, nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 semaines
Rôle des hormones sexuelles et des récepteurs nucléaires ERalpha et PPARalpha dans le développement et la progression des hépatopathies métaboliques (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des souris femelles subissent une ablation des deux ovaires sous anesthésie, et la moitié des souris du projet reçoit pendant 52 semaines un régime riche en graisses et en sucres, avec six prises de sang à la joue après six heures de jeûne, quatre échographies cardiaques sous anesthésie et 44 heures en cage individuelle. 4 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue. Après un gavage ou une injection, une incision de la queue sert à prélever une goutte de sang toutes les quinze minutes pendant deux heures, dans un projet qui cherche à comprendre pourquoi les œstrogènes protégeraient les femmes de maladies du foie liées au syndrome métabolique. Le porteur annonce dix souris par groupe, fixées par un calcul de puissance, sans dire combien de groupes mènent au total de 4 480.
Objectifs
Le syndrome métabolique touche actuellement 38% de la population mondiale. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans cet organe. Ce stade précoce et bénin peut évoluer vers des stades plus graves, caractérisés par une inflammation et une fibrose conduisant à une dysfonction de l’organe. L’ensemble de ces atteintes hépatiques chroniques, nommées hépatopathies métaboliques (HM), représentent la première cause de transplantation de foie et sont associées à des complications cardiaques. Comprendre les mécanismes contrôlant la progression des HM est crucial pour identifier les patient(e)s à risque et développer des traitements préventifs et/ou curatifs actuellement inexistants. Les données cliniques et scientifiques montrent que les femmes sont protégées de la survenue et de la progression de ces HM et de leurs complications grâce aux hormones sexuelles féminines, les œstrogènes. Dans ce projet nous souhaitons déterminer le rôle de 2 protéines importantes pour le métabolisme des graisses dans le foie dans la progression des HM. Ce projet permettra de comprendre la fonction des hormones sexuelles à l’origine des différences liées au sexe dans la susceptibilité aux HM. Il nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire, car, à l'heure actuelle, les modèles et lignées cellulaires disponibles ne permettent pas de reproduire la complexité du système hormonal et ne conservent pas leurs caractéristiques sexuelles.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera donc des connaissances essentielles permettant de comprendre les mécanismes protégeant les femmes du développement de ces maladies. Il permettra l’élaboration de stratégies thérapeutiques préventives et /ou curatives adaptées au sexe contre ces atteintes hépatiques qui représentent aujourd'hui la première cause de transplantation de foie dans le monde.
Procédures
Les animaux anesthésiés subiront une opération chirurgicale de 15 minutes avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire – La moitié des animaux auront une alimentation riche en graisse et en sucre pendant 52 semaines et seront hébergés à thermoneutralité - les animaux vigiles seront placés en isolement pendant 90 à 120 secondes, à trois reprises - A 6 reprises nous serons amenés à effectuer des prises de sang à la joue des souris vigiles après 6 heures de jeûne (1 minute par animal) – A 4 reprises, les animaux anesthésiés auront une échographie cardiaque d’environ 10 minutes pour chaque animal - Les animaux vigiles recevront soit un gavage soit une injection d’une durée de 20 secondes par animal suivi par une incision au niveau de la queue et le prélèvement d’une goute de sang toutes les 15 minutes sur une durée totale de 2h - A 2 reprises les animaux seront transportés dans leurs cages d’origine dans un autre établissement (durée inférieure à 10 minutes) - Les animaux seront mis dans des cages individuelles pour une durée totale de 44 heures. « A la fin de l'expérimentation une prise de sang sur chaque animal vigile sera effectuée et, directement après, il sera mis à mort.
Impact sur les animaux
Pour l’ovariectomie, c'est-à-dire l'ablation des 2 ovaires, comme pour tout autre acte de chirurgie, les risques attendus sont majoritairement des complications post-opératoires comme des infections, hémorragies, des adhérences internes et des problèmes de cicatrisation (fils cassés). De plus, même si la prise en charge de la douleur est totale lors de cette procédure, l’animal peut ressentir une gêne temporaire lors du réveil dont les signes sont le poil hérissé, l’isolement des congénères et/ou une perte de poids supérieure à 10%. Enfin, des fils de suture peuvent être arrachés les jours suivant l’opération. De plus, les animaux pourraient subir plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourrait survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min) lors des 52 semaines de régime western diet (régime enrichi en graisse, sucres et cholestérol) ou encore lors de la détermination de leur composition corporelle et des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 10 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors des prises de sang ou lors des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline ou encore lors des injections intrapéritonéales. Également, un stress pourrait être subit par les animaux liés à l’isolation de leurs congénères lors des mesures de la composition corporelle ou des mises en cage à métabolisme.
Devenir
A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation des cervicales.
Remplacement
Les effets sur tout l'organisme des hormones sexuelles dont les œstrogènes, synthétisés majoritairement par les ovaires, font intervenir des dialogues inter-organes, notamment centraux, et inter-cellulaires à l’échelle de l’organisme qui restent encore non modélisables par des approches cellulaires. Des modèles alternatifs ont été décrits pour l’étude des HM, notamment des modèles de lignées cellulaires d'hépatocytes incubés avec des cocktails de graisses et de sucres permettant de mimer le stockage de graisses dans les cellules qui est caractéristique des HM. Cependant ces modèles ne permettent pas encore d’étudier l’effet des hormones sexuelles et leur rôle dans le développement de l'inflammation et de la fibrose hépatique, qui sont des éléments majeurs dans le développement des complications liées aux HM. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre l'impact physiologique des hormones sexuelles à l'échelle de l'organisme.
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour, à la fois, répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs, c'est-à-dire 10 animaux par groupe expérimental. Ainsi, le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes à la directive européenne. Du papier et du carton sont fournis pour permettre aux souris de fabriquer des nids et exprimer des comportements naturels. Des tunnels en carton favorisent leur activité physique et leurs interactions sociales. La préhension des animaux se fera grâce à un tube en plastique pour soulever les animaux. Une grille de scoring, en collaboration avec les zootechniciens, permet de surveiller en temps réel l'état de santé et de confort des animaux et d'adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Lors de l'ablation des ovaires, la diminution de la température corporelle sera limitée par un tapis chauffant. Un gel occuloprotecteur préviendra le dessèchement des yeux. La douleur et la sédation seront contrôlées par des injections d'analgésiques et l'inhalation d'anesthésiants. Les complications post-opératoires potentielles incluent le développement d’infections, d’hémorragies, d’adhérences internes et des problèmes de cicatrisation. Une injection supplémentaire d'analgésique sera réalisée 6h après l'opération pour éviter toute gêne au réveil. Une surveillance quotidienne sera assurée pendant 7 jours. En cas de signes de douleur (poils hérissés, isolement, perte de poids >10%), une intervention analgésique sera initiée en concertation avec le vétérinaire. Si les symptômes persistent, l’animal sera mis à mort par dislocation des cervicales. En cas de déchirure des fils de suture le lendemain, une réintervention sous anesthésiants et analgésiants sera effectuée sous surveillance stricte. Pour les prélèvements de sang sur animal vigile, les animaux seront laissés au maximum libres de leurs mouvements. Les animaux sont transportés suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont gardés dans leur cage d’origine pour le transport d’une durée de moins de 10 minutes avant l'euthanasie. Pour les mâles aussi bien que pour les femelles, la répartition des animaux dans les cages n’est pas modifiée par rapport à leur arrivée en zootechnie d’expérimentation.
Choix des espèces
Dans ce projet nous souhaitons étudier le rôle de deux protéines importantes pour le métabolisme des graisses dans le foie et impliquées dans la progression des HM. Donc la souris est le meilleur modèle expérimental car il existe des modèles transgéniques dans lesquels ces protéines ont été supprimées dans le foie spécifiquement. Aussi, dans les études publiées par différentes équipes, les mécanismes métaboliques sont pour beaucoup bien décrits chez la souris, avec une transposabilité à l'Homme élevée. En conséquence, la souris demeure une espèce de choix pour ce projet de recherche basé sur les effets des hormones sexuelles sur la progression des HM et leurs conséquences cardiaques. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d’âge, correspondant à la phase de fin de croissance et de maturité sexuelle et hépatique.
Étude et ciblage des fibroblastes portaux dans la fibrose hépatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une partie des souris est génétiquement modifiée et reçoit pendant trois jours, sans anesthésie, une molécule par voie orale qui déclenche la modification de ses gènes, avant qu'on lui provoque une cholangite sclérosante primitive, une maladie qui obstrue les voies biliaires. En tout, 1 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, une partie étant tuée sous anesthésie, avant tout réveil. La maladie est induite soit par un régime spécial de deux à quatre semaines, qui peut entraîner perte de poids, inconfort digestif et jaunisse dans les cas les plus graves, soit par une chirurgie du foie qui peut entraîner douleurs et altération de l'état général. Toutes sont tuées à la fin des procédures, ou plus tôt si elles atteignent un point limite, pour prélever leurs tissus.
Objectifs
Les maladies du foie et des voies biliaires représentent un véritable défi de santé d'un point de vue socio-économique, mais surtout du point de vue des patients car il n’existe pas à ce jour de traitement curatif. Les maladies du foie et des voies biliaires évoluent généralement vers une fibrose, c’est-à-dire une accumulation de tissu cicatriciel qui altère progressivement le foie jusqu'à empêcher son activité normale en cas de cirrhose. Le tissu cicatriciel déposé dans le foie est fabriqué par des cellules appelées myofibroblastes. Les myofibroblastes proviennent en partie des cellules étoilées du foie, des cellules qui ont été impliquées dans la fibrose d'origine métabolique ou virale. En revanche, il n'existe que peu d'information concernant les fibroblastes portaux, qui représentent un type de cellule pouvant être impliqué dans la fibrose survenant au cours des maladies biliaires. Le projet de recherche s’intéresse précisément aux fibroblastes portaux, et plus particulièrement à un sous-groupe que nous avons identifié précédemment. Le sous-groupe de fibroblastes portaux qui nous intéresse pourraient avoir un rôle clé dans une maladie grave et rare qui provoque une fibrose oblitérante des voies biliaires : la cholangite sclérosante primitive. Le projet vise à répondre à trois grands points : 1.Définir les caractéristiques spécifiques des fibroblastes d'intérêt pour qu'ils puissent ensuite servir de marqueur pour détecter ou suivre la maladie. 2.Identifier les interactions des fibroblastes d'intérêt avec les autres types cellulaires du foie afin de comprendre les mécanismes aboutissant à la fibrose biliaire. 3.Explorer l'impact du ciblage thérapeutique des fibroblastes d'intérêt dans le traitement de la fibrose.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront à la communauté scientifique de mieux comprendre l'implication des fibroblastes portaux (PFs) dans la physiopathologie de la cholangite sclérosante primitive (CSP). Nos données préliminaires et les résultats d'autres groupes indiquent que les PFs activés pourraient être spécifiquement impliqués dans les processus fibrotiques observés lors de la CSP. Sur la base des résultats obtenus avec les modèles murins, le projet a pour objectif d'analyser d'un point de vue moléculaire des échantillons humains. Au travers de cette transposition, il sera possible d'identifier les signatures moléculaires spécifiques aux cellules directement impliquées dans le dépôt de tissu cicatriciel dans la CSP. L'identification de biomarqueurs spécifiques aux cellules impliquées dans la pathogenèse de la CSP pourrait permettre le développement d'outils capables de prédire la gravité et/ou la progression de la maladie. A long terme, l'objectif est d'être en capacité de développer de nouvelles thérapies, notamment des thérapies par anticorps, ou de repositionner des médicaments.
Procédures
Les souris génétiquement modifiées seront soumises à un traitement par voie orale sur animal vigile afin d’induire la modification génétique (une administration quotidienne durant 3 jours, 15 secondes par animal). Une partie des animaux recevra également une injection au niveau de l’abdomen sur animal vigile (deux injections réalisées à 2 jours d’intervalle, 15 secondes par animal). Par la suite les animaux seront soumis à l’induction d’une cholangite sclérosante primitive (CSP). Le premier modèle de CSP peut être mis en place par administration d’un régime spécial (aliment a volonté) durant une période comprise entre 2 et 4 semaines environ (prise spontanée). Le second implique une unique chirurgie hépatique effectuée sous anesthésie et analgésie d’une durée d’environ 15-20 minutes par animal. Afin de tester des molécules, les animaux pourront être soumis à un régime contenant des molécules thérapeutique durant une période comprise entre 1 et 4 semaines (prise spontanée, délivré à volonté). Enfin, une partie des animaux seront ensuite anesthésié et analgésié afin de réaliser un prélèvement sanguin préalable à l’euthanasiés par une méthode réglementaire. Dans tous les cas les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.
Impact sur les animaux
Afin d’induire le modèle expérimental chez certains animaux génétiquement modifiés, il sera nécessaire d’administrer une molécule par voie orale. Cet acte entrainera un stress léger lié à la contention et à l’administration oral elle-même ainsi que des effets transitoires de la molécule (légère perte de poids, stress de la manipulation) Une autre molécule sera également administrée aux animaux par injection au niveau de l’abdomen pouvant induire un léger stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d’introduction de l’aiguille. Les principales nuisances attendues dans le cadre de ce projet sont liées aux modèles expérimentaux utilisés pour induire la cholangite sclérosante primitive (CSP). Ces atteintes sont provoquées soit par un régime alimentaire spécifique, soit par une unique chirurgie. Le régime alimentaire spécifique peut induire une perte de poids, une altération de la fourrure, des signes d’inconfort digestif voire une jaunisse dans les cas les plus graves. La chirurgie hépatique mise en œuvre peut entrainer des douleurs post-opératoire, une perte de poids, une altération de l’état général en post-opératoire et à distance de l'acte chirurgical. Il existe également des risques liés à l’anesthésie générale (hypothermie, dépression cardio-respiratoire, etc.). Les animaux pourront recevoir un traitement permettant de moduler la fibrose selon les résultats obtenus au cours du projet. Le traitement sera induit par ajout de la/les molécules identifiées dans le régime alimentaire standard. Les changements de régime pourront induire un léger stress chez les souris qui sont néophobes (peur de la nouveauté). Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour réaliser un prélèvement sanguin ou une chirurgie immédiatement suivie de l’euthanasie sans réveil des animaux en vue des prélèvements.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à la fin des procédures prévues (ou avant en cas d’atteinte des point limites), les tissus seront récupérés afin de permettre de réaliser les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Le recours à un animal est indispensable à l'étude des fibroblastes portaux (PFs) dans le contexte des maladies biliaires. En effet, l'activation, la modulation de l'activité et les interactions des PFs avec les autres cellules du foie ne peuvent être appréhendées qu’au sein d’un environnement tissulaire et systémique intact. Une partie des expériences du présent projet sont effectués in vitro à partir de cellules isolées à partir d’animaux (remplacement partiel). Cependant, les modèles in vitro (cultures primaires, co-cultures ou organoïdes hépatiques) ne permettent pas de reproduire in extenso la complexité du microenvironnement du foie ni les signaux physiopathologiques qui régulent l’activation des PFs dans un contexte pathologique. En particulier, les processus fibrotiques observés dans les maladies biliaires font appel à des interactions avec des cellules du foie ou provenant de la circulation générale, qui ne peuvent être modélisées de façon fiable in vitro. Par conséquent, aucun modèle alternatif ne permet à ce jour de remplacer totalement l’usage d'un modèle animal expérimental pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1600 animaux au maximum. L'ensemble des procédures a été conçu afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse scientifique des données. Le nombre de groupes expérimentaux a été réduit au minimum, et la taille des échantillons a été optimisée à partir de données préliminaires et d’analyses de puissance statistique. En cohérence avec les données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour garantir une analyse statistique fiable et cohérente. Les données sont analysées à l’aide de tests statistiques adaptés à leur distribution. Par ailleurs, chaque animal est valorisé au maximum, avec la collecte de différents types de données : corporelle, histologique, biochimique, cellulaire sur les mêmes échantillons biologiques. Enfin, les données déjà générées dans le cadre de projets antérieurs ou en cours sont intégrées à l’analyse afin d’éviter les redondances expérimentales.
Raffinement
L’ensemble des procédures a été adapté pour minimiser les douleurs et le stress chez les animaux. Les modèles de maladies biliaires utilisés (chirurgicaux ou via un régime alimentaire) sont bien caractérisés, et des points limites précis ont été définis pour détecter précocement tout signe de souffrance. Chaque étape du protocole (chirurgie, injections, prélèvements) a été évaluée pour limiter les manipulations, éviter la répétition des gestes et choisir les méthodes les moins invasives compatibles avec les objectifs scientifiques. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie appropriée, avec administration systématique d’antalgiques en pré- et post-opératoire et associé à une grille d'évaluation précise. Pour le régime, un suivi pondéral très rigoureux est appliqué avec éventuellement une remise sous régime standard en cas de perte de poids trop importante. Les animaux sont suivis quotidiennement, et leur hébergement respecte les recommandations en matière d’enrichissement et de confort. Toutes les manipulations sont effectuées par un personnel formé, expérimenté dans le maniement des souris et sensibilisé aux principes du bien-être animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est un modèle adapté pour l’étude de des maladies biliaires. Il s’agit d’un mammifère dans lequel les différents modèles de fibroses utilisés dans ce projet sont validés, maîtrisés et documentés. Les résultats obtenus permettront ainsi de consolider les nombreuses informations déjà disponibles sur le sujet et le modèle utilisé au bénéfice de la communauté scientifique et plus généralement au bénéfice du public. Enfin, l'animalerie sur site permet l’hébergement optimal des modèles utilisés garantissant un hébergement conforme aux exigences réglementaires, assurant le bien-être, la surveillance et la traçabilité des animaux. Justification des stades de développement : Les animaux seront ainsi testés biologiquement à la phase adulte jeune qui est caractérisée par une stabilité physiologique et immunitaire. L'intervalle d'âge ainsi choisi permet d'une part de s'intégrer dans les données produites par la littérature internationale et d'autre part de limiter la variabilité liée à la croissance ou au vieillissement. L’utilisation d’animaux adultes jeunes assure ainsi à la fois la validité scientifique et le respect du bien-être animal.
Modèle d’encéphalopathie induit par régime chez le rat BDL
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Les rats de ce projet ont une maladie chronique du foie provoquée par chirurgie, et certains arrivent déjà opérés de chez un fournisseur spécialisé. 2 010 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, nourris pour certains d'un régime enrichi en protéines ou en ammoniac, et reçoivent une substance impliquée dans les troubles neurologiques de la maladie. S'y ajoutent des prises de sang, des traitements expérimentaux par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, jusqu'à vingt minutes en enceinte thermostatique avant certaines injections, et des tests de mémoire, d'apprentissage et de motricité que le porteur ne nomme pas. Tous sont tués à l'issue, car les dosages prévus exigent un grand volume de sang prélevé en fin de vie et plusieurs tissus.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie peuvent entraîner des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, de coordination des mouvements ou des changements de comportement. Dans les formes les plus sévères, l’état de conscience peut être altéré. L’objectif de ce projet est de développer et caractériser des modèles reproduisant certaines de ces complications chez le rat et d’utiliser ces modèles pour évaluer de futurs traitements. Pour cela, une maladie chronique du foie sera induite par une intervention chirurgicale. Cette intervention sera associée à une alimentation enrichie en protéines ou en ammoniac ainsi qu’à l’administration ponctuelle d’une substance impliquée dans l’apparition des troubles neurologiques observés chez les patients. Ces travaux permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes responsables de la maladie et d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques destinées à prévenir ou à réduire les troubles neurologiques associés aux maladies chroniques du foie. Les conditions expérimentales seront définies afin de reproduire des formes modérées de la maladie compatibles avec le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Les maladies chroniques du foie peuvent provoquer des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, d’apprentissage ou de coordination des mouvements. Dans certains cas, ces troubles peuvent réduire l’autonomie des patients et avoir un impact important sur leur vie quotidienne et celle de leurs proches. Ce projet vise à développer des modèles permettant de mieux reproduire ces complications et de mieux comprendre les mécanismes responsables de leur apparition. Ces modèles seront également utilisés pour évaluer de nouveaux traitements destinés à prévenir, limiter ou corriger les troubles observés. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies chroniques du foie, à réduire les conséquences neurologiques associées à ces maladies, à préserver leur autonomie et à améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale accompagnée d'un traitement adapté contre la douleur. Cette intervention vise à provoquer une maladie chronique du foie similaire à celle observée chez certains patients. Selon la procédure concernée, les animaux pourront recevoir une injection sous-cutanée d'une substance impliquée dans l'apparition des troubles neurologiques observés chez les patients atteints de maladie du foie. Cette administration dure moins d'une minute. Un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours de l'étude ainsi qu'un prélèvement final. Ces actes sont effectués sous anesthésie gazeuse de courte durée, généralement comprise entre 2 et 5 minutes, et le prélèvement lui-même dure environ une minute. Les animaux pourront également recevoir un traitement expérimental administré par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Chaque administration dure habituellement moins d'une minute. Certaines administrations intraveineuses pourront nécessiter un maintien temporaire dans une enceinte thermostatique pendant une durée maximale de 20 minutes afin de faciliter l'administration. Dans certaines études, un traitement unique pourra être administré selon un principe de dialyse péritonéale sous anesthésie gazeuse de courte durée. L'administration dure environ une à deux minutes et l'anesthésie quelques minutes. Enfin, les animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer l'activité, la mémoire, l'apprentissage ou les capacités motrices. Ces évaluations reposent principalement sur l'observation des animaux et ne nécessitent pas d'acte invasif.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et bénéficieront d'un traitement adapté contre la douleur. Après l'opération, ils pourront présenter une gêne temporaire, une diminution transitoire de l'activité ou une baisse de l'alimentation. Au cours de l'étude, le développement de la maladie pourra entraîner une diminution modérée de la prise de poids, une baisse de l'activité spontanée ainsi que des modifications du comportement, de la mémoire, de l'apprentissage ou de la coordination des mouvements. Certains régimes alimentaires utilisés dans le projet pourront renforcer temporairement ces effets. Une substance impliquée dans les mécanismes de la maladie pourra également être administrée afin de reproduire certains épisodes observés chez les patients. Cette administration pourra entraîner, pendant une courte durée, une diminution de l'activité ou des capacités motrices. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière tout au long du projet. Des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'intervenir rapidement en cas d'aggravation inattendue afin de préserver leur bien-être.
Devenir
À l’issue des procédures, l’ensemble des animaux sera mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements biologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Les analyses prévues nécessitent le recueil d’un volume sanguin terminal important ainsi que la collecte de plusieurs tissus d’intérêt, notamment au niveau cervical. Ces prélèvements permettent la réalisation concomitante de nombreux dosages qui ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. L’utilisation de prélèvements terminaux permet également de maximiser la quantité de données obtenues à partir d’un même animal et contribue ainsi à l’application du principe de réduction en limitant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. En raison de la nature des prélèvements réalisés et de leur caractère invasif, aucun animal ne pourra être réutilisé à l’issue de l’étude.
Remplacement
Avant de réaliser les études chez l'animal, des tests in vitro et des approches de modélisation informatique sont utilisés pour sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs. Ces méthodes permettent notamment d'étudier l'action de composés sur des cellules, des tissus ou certaines bactéries présentes dans l'intestin, ainsi que de prédire certains de leurs effets dans l'organisme. Cependant, les troubles étudiés dans ce projet résultent d'interactions complexes entre plusieurs organes, notamment l'intestin, le foie, les reins et le cerveau. Aucune méthode alternative disponible aujourd'hui ne permet de reproduire simultanément l'ensemble de ces mécanismes dans un organisme vivant. Les méthodes sans animaux ne permettent pas non plus d'évaluer les effets de la maladie sur la mémoire, l'apprentissage, le comportement ou les capacités motrices, ni de mesurer l'efficacité globale d'un traitement dans l'organisme. Elles ne permettent pas davantage de suivre la façon dont un médicament est absorbé, transformé et agit sur différents organes. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet donc d'atteindre les objectifs de ce projet sans recourir à l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Avant les études thérapeutiques, plusieurs phases de caractérisation permettront d'identifier les conditions expérimentales les plus adaptées et de vérifier la reproductibilité des modèles. Les connaissances acquises lors de ces premières étapes seront utilisées pour concevoir les études suivantes et éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Les mêmes animaux seront suivis à plusieurs reprises au cours des études afin de recueillir différentes informations (état général, prélèvements biologiques et évaluations comportementales) sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Les groupes expérimentaux ont également été conçus de façon à permettre la comparaison de plusieurs traitements au sein d'une même étude lorsque cela est possible. Cette stratégie permet d'obtenir un maximum d'informations à partir de chaque animal tout en utilisant le plus petit nombre d'animaux compatible avec la qualité et la fiabilité des résultats scientifiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions favorisant leur bien-être, avec un enrichissement du milieu comprenant notamment des abris, des matériaux permettant la construction de nids et des objets à ronger. Lorsque leur état le permet, ils seront maintenus en groupe. Certains animaux pourront être reçus déjà opérés auprès d'un fournisseur spécialisé. Dans tous les cas, une période d'acclimatation et une surveillance renforcée seront mises en place après leur arrivée ou après l'intervention chirurgicale. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement contre la douleur. Les animaux bénéficieront d'une surveillance adaptée jusqu'à leur rétablissement complet et d'un complément alimentaire favorisant la reprise de l'alimentation. Avant le début des évaluations, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations et aux différents tests afin de limiter le stress. Les conditions expérimentales seront définies de manière à reproduire des formes modérées de la maladie sans rechercher l'apparition de troubles sévères. Une surveillance régulière sera réalisée tout au long du projet afin de détecter rapidement toute dégradation de l'état des animaux. Des mesures adaptées seront mises en place si nécessaire et des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'éviter toute souffrance excessive.
Choix des espèces
Aucun modèle alternatif ne permet aujourd'hui de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les complications neurologiques associées aux maladies chroniques du foie. Le rat a été choisi car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l'Homme concernant le fonctionnement du foie, de l'intestin et du cerveau. Il permet également d'étudier la mémoire, l'apprentissage, l'activité et le comportement à l'aide de méthodes reconnues et largement utilisées en recherche pharmaceutique. Cette espèce est particulièrement adaptée au modèle utilisé dans ce projet, notamment pour la réalisation de l'intervention chirurgicale nécessaire à l'induction de la maladie. De plus, de nombreuses études scientifiques ont déjà été réalisées chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats et contribue à limiter le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. Ce stade de développement a été retenu car il correspond à celui le plus fréquemment utilisé pour l'étude de ces maladies et permet de réaliser les interventions et les évaluations prévues dans des conditions optimales.
Modèle d’entéropathie induite par le méthotrexate chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 758
1 516 rongeurs, 758 souris et 758 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des injections répétées dans l'abdomen d'un produit, le méthotrexate d'après le titre, abîment leur paroi intestinale pendant 14 à 16 jours, avec perte de poids, baisse d'appétit et troubles digestifs, auxquels s'ajoutent jusqu'à deux traitements par jour, un jeûne de 6 à 16 heures et un gavage de marqueur. Le but est de mettre au point une méthode d'induction de lésions intestinales pour tester des traitements contre l'aggravation des maladies chroniques du foie. Le porteur écrit qu'"aucune douleur significative" n'est attendue, et subordonne pourtant le recours à une analgésie morphinique à sa "compatibilité avec les objectifs scientifiques".
Objectifs
Notre laboratoire cherche à mieux comprendre le rôle de l’intestin dans l’aggravation de certaines maladies chroniques du foie. Chez les personnes atteintes de cirrhose, une altération de la paroi intestinale peut favoriser le passage de bactéries ou de substances normalement contenues dans l’intestin vers l’organisme. Ce phénomène peut contribuer à déclencher ou à amplifier une inflammation importante et favoriser l’apparition d’une défaillance de plusieurs organes suite une atteinte chronique du foie. L’objectif de ce projet est de développer un modèle expérimental permettant de reproduire de façon contrôlée ces altérations précoces de la barrière intestinale et d’en étudier les conséquences. Ce modèle permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le passage de bactéries et de substances inflammatoires depuis l’intestin vers le reste de l’organisme. Il servira également à évaluer de nouveaux traitements destinés à protéger ou restaurer la fonction normale de la barrière intestinale, à limiter le passage de substances indésirables dans l’organisme et, à plus long terme, à prévenir l’aggravation des maladies chroniques du foie.
Bénéfices attendus
Les maladies chroniques du foie peuvent s’aggraver lorsque la paroi intestinale est endommagée. Dans cette situation, des bactéries ou des substances normalement présentes dans l’intestin peuvent plus facilement passer dans l’organisme et contribuer à entretenir une inflammation importante. Ce phénomène est suspecté de jouer un rôle dans l’aggravation de certaines maladies du foie et dans l’apparition de complications sévères. Ce projet vise à développer un modèle expérimental permettant d’étudier ces altérations de la paroi intestinale et leur réparation. Il permettra de mieux comprendre comment l’intestin participe à l’évolution des maladies du foie et d’identifier les mécanismes impliqués dans le rétablissement d’une fonction intestinale normale. Ce modèle sera également utilisé pour évaluer de nouveaux traitements destinés à protéger ou restaurer la paroi intestinale après une lésion. Les résultats obtenus seront comparés à ceux d’un second modèle expérimental étudiant d’autres aspects du fonctionnement de la barrière intestinale. Cette approche permettra de mieux comprendre le mode d’action des traitements étudiés et d’identifier les candidats les plus prometteurs. À plus long terme, les connaissances acquises pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter l’aggravation des maladies chroniques du foie et à réduire le risque de complications sévères associées à ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront plusieurs administrations en intrapéritonéal d’un produit permettant d’induire une altération modérée et transitoire de la fonction de protection de l’intestin afin de reproduire certaines situations observées chez l’Homme. La durée maximale des procédures sera de 16 jours chez le rat et de 14 jours chez la souris. Selon les procédures, les animaux pourront recevoir un ou plusieurs traitements expérimentaux ou leurs véhicules par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Ces administrations pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour pendant plusieurs jours afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques. Lors des injections intraveineuses, les animaux pourront être placés dans une enceinte chauffée pendant une durée maximale de 20 minutes afin de faciliter l’injection. Afin d’évaluer cette fonction de protection intestinale, les animaux seront soumis à une courte période de jeûne (16 heures chez le rat et 6 heures chez la souris), puis recevront par gavage une substance marqueur permettant de suivre son passage à travers la paroi intestinale. Chez le rat, plusieurs prélèvements sanguins seront réalisés au cours de l’étude. Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse de courte durée (2 à 5 minutes). Chez la souris, l’évaluation reposera sur un prélèvement sanguin final réalisé sous anesthésie gazeuse, suivi d’une mise à mort sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets attendus dans ce modèle concernent principalement le système digestif. Après l’administration du produit, les animaux peuvent présenter une diminution temporaire de leur activité, une baisse de leur consommation de nourriture et d’eau ainsi qu’une perte de poids modérée. Des troubles digestifs légers à modérés, pouvant se traduire par un inconfort abdominal ou des modifications des selles, peuvent également être observés. Ces effets sont généralement transitoires et font l’objet d’une surveillance attentive tout au long de l’étude afin de garantir le respect du bien-être animal. Pour certaines évaluations, les animaux seront soumis à une courte période de jeûne (16 heures chez le rat et 6 heures chez la souris) pouvant entraîner un inconfort léger et temporaire. Cette évaluation nécessite également l’administration d’un marqueur par voie orale suivie d’un prélèvement sanguin sous anesthésie.
Devenir
À l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort afin de permettre la réalisation des examens nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Les analyses des échantillons de sang ainsi que différents organes, en particulier l’intestin, permettront d’évaluer les effets du traitement et de mieux comprendre les mécanismes étudiés. Ces analyses nécessitent le prélèvement de quantités de sang et de tissus qui ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. La collecte de plusieurs échantillons chez un même animal permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque individu et contribue ainsi à réduire le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation du projet. En raison de la nature des prélèvements réalisés et des analyses prévues, les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d’autres études après la fin de la procédure.
Remplacement
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’altération de la barrière intestinale et à évaluer de nouveaux traitements destinés à préserver ou restaurer son intégrité. Avant leur évaluation chez l’animal, les composés candidats sont sélectionnés à l’aide de méthodes alternatives telles que des cultures cellulaires et des modèles simplifiés de tissus intestinaux. Ces approches permettent de limiter le recours aux animaux conformément au principe de remplacement de la règle des 3R. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans le fonctionnement normal de l’intestin ni les conséquences d’une altération de la barrière intestinale dans un organisme vivant. Elles ne permettent notamment pas d’étudier les interactions entre les cellules intestinales, le système immunitaire, les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin et les différents tissus de l’organisme. Elles ne permettent pas non plus d’évaluer de manière fiable l’absorption, la distribution et l’élimination des traitements étudiés, ni leurs effets sur la restauration de la fonction barrière dans un organisme complet. Le recours à un modèle animal reste donc nécessaire pour étudier les mécanismes impliqués dans l’altération de la perméabilité intestinale et pour déterminer si de nouveaux traitements sont capables de prévenir ces altérations ou d’en favoriser la réparation. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet de répondre à l’ensemble des objectifs scientifiques du projet avec un niveau de fiabilité comparable à celui obtenu dans un organisme vivant complet.
Réduction
Les effectifs animaux ont été déterminés de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux compatible avec l’obtention de résultats scientifiquement fiables. Ce nombre s’appuie sur les connaissances acquises dans la littérature scientifique ainsi que sur l’expérience de l’établissement dans l’étude des altérations de la barrière intestinale. Les études de caractérisation du modèle seront réalisées par étapes afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes avant la mise en œuvre des études thérapeutiques. Cette approche permet de limiter la répétition inutile d’expériences et de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Plusieurs analyses biologiques et histologiques seront réalisées à partir de chaque animal afin d’obtenir un maximum d’informations à partir des mêmes prélèvements. Les données obtenues au cours du projet seront utilisées pour orienter les phases suivantes de l’étude et ajuster les effectifs lorsque cela sera possible sans compromettre la qualité des résultats. L’ensemble de ces mesures a été conçu pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique du projet, conformément au principe de réduction de la règle des 3R.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière de leur état général. Une attention particulière sera portée à leur poids, à leur consommation de nourriture et d’eau ainsi qu’à leur comportement. Afin de limiter les conséquences de l’atteinte intestinale induite au cours de l’étude, des aliments enrichis et faciles d’accès seront mis à disposition lorsque cela sera nécessaire. L’état d’hydratation sera également surveillé et des gels hydratants pourront être fournis aux animaux en cas de besoin. Le projet prévoit également l’évaluation de mesures destinées à réduire davantage l’inconfort des animaux. L'opportunité d'un recours à une analgésie, de type morphinique, sera évaluée tout au long du projet. Bien qu'aucune douleur significative ne soit attendue, cette mesure pourra être mise en œuvre si des signes cliniques suggèrent un inconfort supérieur à celui anticipé et sous réserve de sa compatibilité avec les objectifs scientifiques. Des critères de surveillance prédéfinis permettront d’identifier rapidement tout signe de dégradation de l’état de santé ou du bien-être des animaux. Si nécessaire, des mesures adaptées seront immédiatement mises en place afin de limiter leur inconfort. Dans les situations où le niveau de souffrance dépasserait les limites préalablement définies, l’animal serait retiré de l’étude et euthanasié afin de prévenir toute souffrance inutile. L’ensemble de ces dispositions a pour objectif de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout en garantissant la qualité scientifique des résultats obtenus, conformément au principe de raffinement de la règle des 3R.
Choix des espèces
Les rats et les souris ont été sélectionnés car leur système digestif présente de nombreuses similitudes anatomiques, physiologiques et fonctionnelles avec celui de l’Homme. Ces similitudes permettent d’étudier de façon pertinente les altérations de la barrière intestinale et d’évaluer l’efficacité potentielle de nouveaux traitements dans des conditions proches de celles observées chez l’être humain. À l’inverse, les invertébrés ne possèdent pas une organisation du tube digestif ni une fonction de barrière intestinale comparables à celles des mammifères, ce qui ne permet pas de répondre aux objectifs du projet ni de prédire de manière fiable le devenir des candidats médicaments. Les rats et les souris sont largement utilisés dans ce domaine de recherche et bénéficient d’une importante base de connaissances scientifiques permettant une interprétation robuste des résultats. Le choix du rat ou de la souris dépendra des caractéristiques des composés étudiés ainsi que des connaissances acquises lors des étapes précédentes du projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. À ce stade de développement, le système digestif est mature et la fonction de barrière intestinale est pleinement établie, permettant l’étude fiable des mécanismes impliqués dans son altération et sa réparation. Les rats seront âgés de 6 à 7 semaines à leur arrivée dans l’établissement et les souris de 6 à 8 semaines. L’utilisation de jeunes adultes permet également de limiter la variabilité biologique et d’améliorer la reproductibilité des résultats obtenus.
Modèle d’insuffisance pancréatique exocrine chez le cochon : mise en place du modèle et évaluation de traitements
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rendus malades d'une insuffisance pancréatique que le porteur juge "non compatible avec leur maintien en vie dans de bonnes conditions", 114 des 117 miniporcs Göttingen sont tués à l'issue, trois seulement pouvant être gardés en vie et réutilisés si la ligature échoue en cours d'opération. Ces cochons d'environ deux ans vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une chirurgie de deux à quatre heures pour ligaturer un conduit du pancréas et parfois implanter des dispositifs d'administration et de prélèvement. Ils sont ensuite hébergés seuls jusqu'à la fin de l'étude, six semaines en général, nourris d'un régime enrichi en graisses, et peuvent recevoir des enzymes dans le duodénum jusqu'à trois fois après chaque repas pendant sept jours. Le porteur affirme que l'utilisation d'un "modèle animal reste nécessaire" et que le miniporc permet de "maximiser la pertinence des données obtenues".
Objectifs
L’insuffisance pancréatique exocrine (IPE) est une pathologie caractérisée par une diminution de la sécrétion d’enzymes digestives, entrainant une mauvaise digestion, en particulier des lipides, et des complications cliniques telles que la stéatorrhée, la perte de poids et des carences nutritionnelles. Elle est observée dans plusieurs contextes cliniques, notamment la pancréatite chronique, la mucoviscidose et certaines résections pancréatiques. À ce jour, la prise en charge repose principalement sur la supplémentation en enzymes pancréatiques, qui permet une amélioration symptomatique mais reste imparfaite, avec une variabilité importante de réponse interindividuelle et une efficacité parfois insuffisante, notamment en conditions de régime riche en lipides ou en cas d’altération sévère de la fonction pancréatique. Dans ce contexte, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite des modèles précliniques pertinents reproduisant fidèlement la physiopathologie humaine. Le présent projet vise ainsi à établir et caractériser un modèle d’IPE induite par ligature du conduit pancréatique accessoire chez le miniporc Göttingen(PDL= Pancreatic Duct Ligation), une espèce dont la physiologie digestive est proche de celle de l’Homme. Plus spécifiquement, ce modèle permettra d’évaluer l’impact de différents régimes lipidiques sur la maldigestion, ainsi que l’efficacité de traitements enzymatiques substitutifs, dans une optique de validation d’un outil robuste pour le criblage et l’évaluation préclinique de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Sur le plan préclinique et translationnel, ce modèle constituera un outil pertinent pour évaluer l’efficacité de stratégies thérapeutiques existantes, telles que la supplémentation enzymatique, dans des conditions contrôlées et comparables à la clinique, et surtout il permettra de tester de nouvelles approches (e.g. formes galéniques améliorées, enzymes de nouvelle génération, combinaisons thérapeutiques...), en tenant compte de variables critiques comme la teneur en lipides du régime, qui influence fortement la réponse au traitement. Ceci répond à un besoin identifié, les traitements actuels présentant une efficacité variable et parfois insuffisante chez certains patients. À plus long terme, les résultats issus de ce modèle devraient contribuer à optimiser les stratégies thérapeutiques chez les patients atteints d’IPE, en améliorant le contrôle des symptômes digestifs, l’absorption des nutriments et la qualité de vie. Enfin, la disponibilité d’un modèle préclinique robuste et bien caractérisé pourrait permettre de rationaliser le développement de nouveaux traitements, contribuant ainsi à réduire l’incertitude lors du passage en clinique et, indirectement, à limiter le recours à des études animales supplémentaires en phase exploratoire.
Procédures
Les miniporcs subiront une chirurgie (Semaine 1, 1 fois, durée estimée de l’ordre de 2 h pour la seule induction du modèle, et jusqu'à 4h en cas d'implantation de dispositifs d'administration et de prélèvement). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu'à la fin de l'étude (récupération post-chirurgicale, cicatrisation, maintien du catheter, collecte de féces). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés avant chirurgie, avant changement de régime alimentaire (Semaine 5), avant traitement (e.g. Semaine 6), et en fin d’étude (soit minimum 4 fois (potentiellement jusqu'à 6 fois), durée de l’ordre de quelques minutes). Les animaux seront pesés environ 2 fois/semaine. En Semaine -1 et à partir de la Semaine 5, les animaux seront soumis à un régime enrichi en lipides selon leur groupe. Une supplémentation enzymatique et/ou un traitement pourront être administrés (selon leur groupe), généralement de manière aiguë ou répétée (max prévu : 2 fois par jour pendant 1 à 2 semaines). En cas d'administration dans le duodénum, elle sera réalisée jusqu'à 3 fois après chaque repas généralement pendant 7 jours (environ 1 min/administration). La durée standard de l’étude est de 6 semaines, avec une extension possible de 1 à 2 semaines dans certains cas particuliers.
Impact sur les animaux
Les nuisances associées à ce projet sont liées à la fois à l’intervention chirurgicale (risque de pancréatique iatrogène), à l’induction de l’IPE et aux procédures de suivi. La procédure chirurgicale est susceptible d’entraîner une douleur post-opératoire, une inflammation locale et un inconfort transitoire (malgré une analgésie pré et post-opératoire adaptées). La mise en place et la présence prolongée (le cas échéant) de dispositifs implantables peuvent entraîner un inconfort local transitoire au site d'implantation. Le modèle étudié vise à reproduire une maladie digestive entraînant une mauvaise digestion des aliments, en particulier des graisses. Cela pourra se traduire par des selles plus fréquentes, plus abondantes ou plus grasses, ainsi qu’une possible perte de poids ou un inconfort digestif. Les procédures expérimentales associées (notamment prélèvements sanguins, pesée et administration de substances le cas échéant) peuvent générer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation. Enfin, l’hébergement individuel, avec maintien de contacts physiques (portes avec barreau), pendant la récupération post chirurgicale et les phases de collecte des fèces, peut constituer une source de stress.
Devenir
Euthanasie, car ces animaux présenteront une insuffisance pancréatique exocrine non compatible avec leur maintien en vie dans de bonnes conditions. Uniquement pour ceux qui auraient subi le début de la chirurgie mais dont la ligature du canal aurait été rendue impossible, sans autre complication majeure nuisant à leur bien-être après le réveil : ces cochons pourraient être gardés en vie et réutilisés. Ce cas de figure reste très peu probable (3 animaux indiqués).
Remplacement
Le recours à l’animal est justifié par l’absence de méthodes alternatives permettant de reproduire la complexité de la digestion et de l’absorption des nutriments à l’échelle de l’organisme entier. Les modèles in vitro ou ex vivo ne permettent pas de mimer de manière satisfaisante les interactions entre sécrétions pancréatiques, transit intestinal, microbiote et absorption des lipides. De même, les approches in silico ne permettent pas à ce jour de prédire de façon fiable les effets de traitements sur la digestion dans un contexte pathologique. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal reste nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Le choix du miniporc, dont la physiologie digestive est proche de celle de l’Homme, permet de maximiser la pertinence des données obtenues.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Les études sont conçues avec des effectifs réduits (généralement 4 animaux par groupe), adaptés à la variabilité attendue des paramètres mesurés. La réalisation de mesures répétées chez un même animal (collectes fécales sur plusieurs jours, suivi longitudinal) permet d’augmenter la robustesse des données sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, plusieurs conditions expérimentales peuvent être évaluées au sein d’une même étude, limitant le recours à des expérimentations supplémentaires. Enfin, les données issues de ce projet pourront être utilisées pour optimiser les études ultérieures, contribuant ainsi à une réduction globale du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. De plus, suite à la phase de chirurgie, un formulaire interne spécifique à l’espèce sera complété. Il intègre une évaluation de l’appétit, du poids, de l’attitude, de l’activité, et du comportement général de l’animal, ainsi que l’évaluation du comportement vis-à-vis de la zone de chirurgie et de la réaction lors de la palpation de la zone de chirurgie. Ce formulaire d’évaluation de la douleur permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale inutile. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. litière, plateformes, bacs de repos, jouets et musique, présence de congénères...). Pour les phases chirurgicales, les animaux sont anesthésiés et analgésiés selon un programme défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré- et postopératoires complets. Le recours à des dispositifs implantables constitue une mesure de raffinement spécifique : la littérature sur le porc montre que ces dispositifs chroniques permettent des prélèvements et administrations répétés avec un stress et une contention nettement réduits par rapport aux méthodes conventionnelles de contention/ponction directe.
Choix des espèces
Le choix du miniporc Göttingen repose sur la forte proximité anatomique, physiologique et fonctionnelle de son système digestif avec celui de l’Homme, en particulier en ce qui concerne la structure du pancréas, la sécrétion des enzymes digestives et la digestion des lipides. Cette espèce est reconnue comme un modèle pertinent en recherche translationnelle pour l’étude des pathologies pancréatiques et des troubles de la digestion, notamment en raison de profils enzymatiques et de mécanismes d’absorption intestinale comparables à ceux observés chez l’Homme. L’utilisation d’animaux adultes (environ 2 ans, d'environ 35 kg) permet de travailler sur un système digestif pleinement mature, limitant ainsi la variabilité liée au développement et améliorant la reproductibilité des données.
Effet des métabolites microbiens sur la fonction des neutrophiles chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
2 390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après sept jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson ou par voie orale, elles reçoivent pendant 3 à 21 jours des métabolites à tester, et une partie subit en plus une colite provoquée ou une inflammation du péritoine, avec perte de poids et selles molles annoncées. L'objectif est de voir si ces métabolites du microbiote freinent les neutrophiles dans l'intestin, piste avancée pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. L'équipe a déjà criblé 50 métabolites sur des neutrophiles murins et humains in vitro, puis affirme qu'aucun système in vitro ne recrée un "organisme entier" et conclut que le recours à la souris est "donc de ce fait indispensable".
Objectifs
Le microbiote intestinal (ensemble des micro-organismes hébergés au sein de l’intestin) participe à la physiologie, au métabolisme et à la réponse immunitaire de l’hôte, via notamment la production ou la modification de petites molécules, appelées métabolites. Des travaux ont montré que la production de ces métabolites est altérée chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Ces métabolites sont présents ensemble dans la lumière intestinale, où ils peuvent interagir les uns avec les autres et avec les cellules hôtes. Nous nous intéressons notamment aux neutrophiles, cellules inflammatoires très abondantes dans la muqueuse intestinale en cas de MICI, mais dont la régulation et les interactions avec le microbiote restent peu connues. Nous souhaitons décrypter l’effet propre et combiné de certains métabolites du microbiote sur les neutrophiles in vivo afin de mieux comprendre la dynamique de cette population immunitaire en lien avec le microbiote. L’objectif est d’identifier des métabolites capables de réguler les neutrophiles hyperactivés dans l’intestin, afin de réduire l’inflammation tout en maintenant une fonction de protection efficace de l’hôte contre les pathogènes. Ce projet ouvrira des perspectives pour de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, les MICI concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). L'approche que nous proposons est complètement nouvelle et basée sur des découvertes concernant le rôle de certains métabolites dans les processus inflammatoires. Il a été montré que les métabolites du microbiote intestinal sont capables de moduler l’activité de certaines cellules immunitaires, comme les cellules T et les macrophages, mais les données sont très rares sur les neutrophiles, alors que ces cellules jouent un rôle prépondérant dans le développement de la maladie. Le critère de nouveauté de ce projet repose sur l’étude spécifique des neutrophiles, cellules immunitaires recrutées de façon prépondérante lors d’inflammation de la muqueuse intestinale. Ces cellules peuvent provoquer des dommages tissulaires importants en cas d’inflammation chronique, mais restent absolument essentielles pour protéger l’organisme d’infections sévères. Le rôle et la régulation des neutrophiles dans les contextes physiologiques et pathologiques restent encore peu compris, notamment à l’interaction avec le microbiote intestinal. C’est ce que nous proposons d’étudier par ces approches expérimentales Étudier les interactions neutrophiles-microbiote dans des conditions d’homéostasie et d’inflammation intestinale est essentiel pour mieux comprendre le développement de cette maladie chronique. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension de ces interactions et identifier une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin.
Procédures
Au cours de ce projet, les souris seront impliquées dans une première étape de traitement antibiotique administré via l’eau de boisson (prise spontanée) sur une période de 7 jours. Pour une partie des animaux, le traitement antibiotique sera remplacé par une administration orale quotidienne durant 7 jours maximum (animal vigile, 15 secondes par animal). À l’issue de cette première étape de 7 jours, une partie des animaux sera soumise à une colite expérimentale mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) ou à une inflammation péritonéale. Pour la colite, deux modèles seront utilisés : 1) les animaux seront exposés à un agent dans l’eau de boisson pendant 7 jours puis replacés en eau standard durant 5 à 7 jours (prise spontanée) ou 2) les animaux recevront une administration unique sous anesthésie générale (5 minutes par animal). Pour l’inflammation péritonéale, les animaux recevront une seule injection sur animal vigile (moins de 30 secondes). En parallèle, les animaux recevront une ou plusieurs molécules à tester par administration orale quotidienne ou par injection durant 3 à 21 jours (animal vigile, moins de 30 secondes). Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront 2 à 3 prélèvements de sang maximum effectué sur animal vigile par simple contention par une personne formée avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
Les traitements antibiotiques mis en œuvre avant l’administration des molécules à tester peuvent induire une diminution transitoire de la prise hydrique en raison de la néophobie (peur de la nouveauté) de la souris. De plus, ce traitement pourrait induire quelques désordres intestinaux pouvant conduire à des selles plus liquides que la normale. À la place du traitement antibiotique, certains animaux recevront une administration orale quotidienne, ce qui peut induire des irritations ou des microlésions. Les modèles de colites ou d’inflammation péritonéale sont associés à des effets indésirables attendus liés à l’inflammation (perte de poids, selles molles, etc.). On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Les molécules à tester seront administrées par voie orale ou par injection, pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des administrations orales peut induire des irritations ou des microlésions. La répétition des injections pourrait induire dans de rares cas une inflammation locale. Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraîches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient induire aucune nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons deux à trois prélèvements sanguins pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’une possible déshydratation, un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques (sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie).
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. Nous avons réalisé au préalable un criblage de 50 métabolites sur des neutrophiles murins et humains in vitro. Ces expériences nous ont permis de sélectionner 15 métabolites pour les tests in vivo. À l’heure actuelle, il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu ; un modèle animal est donc de ce fait indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera un maximum de 2390 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Les productions d’animaux seront adaptées en fonction des expériences à mener et des capacités de traitement par les personnels concernés afin d’éviter toute surproduction. Les expériences seront menées de manière séquentielle pour permettre de réduire le nombre de conditions en sélectionnant systématiquement les conditions de traitement les plus intéressantes avec des résultats significatifs en utilisant le moins d’animaux. Si cela est possible, nous mutualiserons les conditions contrôles permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux impliqués. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail, apportent des résultats négatifs importants pour la compréhension du projet, ou amènent à une découverte fortuite intéressante. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et de l’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les animaux en provenance de l’extérieur seront acclimatés au minimum une semaine. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée à la colite ou à l’inflammation péritonéale induite expérimentalement et aux signes cliniques qui y sont associés. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associé à un scoring de la sévérité de la colite permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. La colite dans ce projet est estimée à modérée compte tenu des points limites mis en œuvre. De plus, les animaux sont hébergés dans des conditions exemptes d’organismes pathogènes spécifiques permettant de réduire également les risques d’inflammation supplémentaires. Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (aiguille de petite taille) afin de réduire au maximum la contrainte. L’ensemble des actes est parfaitement maîtrisé et est effectué par un personnel formé et autorisé.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en nutrition, infectiologie et immunologie, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris commerciales non transgéniques. Justification des stades : Les animaux seront traités avec des antibiotiques entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les traitements antibiotiques et les modèles de colites/inflammation. Nous souhaitons en effet utiliser des conditions qui permettent une reproductibilité et une comparaison avec les études précédemment publiées.
Évaluation du potentiel émétique et antiémétique de substances d’essai
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Furets : 915
Placés seuls en cage d'observation pendant 60 à 90 minutes, des furets et des chiens reçoivent une substance par voie orale, sous-cutanée ou intraveineuse, puis sont observés jusqu'à 12 heures pour compter leurs haut-le-cœur et leurs vomissements. Pour tester un antiémétique, l'agent qui fait vomir arrive après un prétraitement de quelques jours à plusieurs semaines, et certains individus reçoivent par chirurgie un implant télémétrique qui enregistre la pression abdominale. 1 055 individus, 915 furets et 140 chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, un même individu participant en général à trois à cinq sessions, davantage sur avis du vétérinaire. Le champ structuré déclare 1 045 furets et chiens réutilisés et 10 chiens renvoyés en élevage, aucun tué, alors que le porteur écrit que les individus des procédures sévères sont tués à la fin du test et évoque un reclassement des chiens.
Objectifs
Les nausées et les vomissements constituent des effets indésirables fréquents de nombreux médicaments. Ils peuvent altérer la qualité de vie des patients, compromettre l’observance thérapeutique et conduire à l’interruption de traitements. Ces manifestations sont par exemple observées lors de traitements anticancéreux, après certaines interventions chirurgicales sous anesthésie générale ou encore avec des classes thérapeutiques plus récentes telles que les incrétines utilisées dans le traitement de l’obésité. Malgré les progrès réalisés dans leur prise en charge, les traitements disponibles ne permettent pas toujours un contrôle satisfaisant des nausées et vomissements dans toutes les situations cliniques, justifiant la poursuite des recherches visant à développer de nouvelles approches thérapeutiques et à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués. À l'inverse, le développement de nouveaux médicaments nécessite également d'identifier les substances susceptibles d'induire une réponse émétique, afin de mieux caractériser leur profil pharmacologique et de sécurité. Les rongeurs ne possédant pas les mécanismes neurophysiologiques nécessaires à l’expression du réflexe de vomissement, le furet et le chien sont aujourd’hui considérés comme les espèces de choix pour l’évaluation préclinique de ces effets. Ces espèces présentent une physiologie de la réponse émétique proche de celle observée chez l’Homme et ont démontré leur valeur translationnelle prédictive. L’objectif du présent projet est d’évaluer les effets de substances en développement sur la réponse émétique, soit afin de caractériser leur potentiel à induire des nausées et des vomissements dans le cadre de leur évaluation de sécurité pharmacologique, soit afin d’évaluer leurs propriétés antiémétiques dans le cadre du développement de traitements destinés à prévenir, réduire ou supprimer ces manifestations. Selon les objectifs scientifiques, l’évaluation pourra porter sur une substance administrée seule ou dans des conditions représentatives de son utilisation envisagée, c'est à dire seule ou associée à d’autres composés susceptibles de moduler la réponse observée. Les données générées contribueront à l’évaluation de la sécurité et/ou de l’efficacité pharmacologique des produits étudiés et soutiendront leur développement préclinique en médecine humaine ou vétérinaire.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer des données permettant d'évaluer le potentiel émétisant ou les propriétés antiémétiques de nouvelles substances. Les résultats obtenus contribueront au développement de médicaments plus sûrs et plus efficaces ainsi qu'à l'amélioration de la prise en charge des nausées et des vomissements en médecine humaine et vétérinaire.
Procédures
Dans les études évaluant le potentiel émétisant, les animaux sont placés individuellement en cage d'observation pendant une période d'habituation (généralement 60 à 90 minutes), puis reçoivent une ou plusieurs substances d'essai administrées par voie orale, sous-cutanée, intraveineuse ou autre voie adaptée. Lorsque des administrations intraveineuses sont prévues, un cathéter intraveineux peut, si nécessaire, être mis en place (durée d'environ 10 min). Les administrations durent généralement de quelques secondes à une minute. Les animaux sont ensuite observés pendant 2 à 6 heures (jusqu'à 12 heures chez le furet et 3 heures chez le chien selon les protocoles) afin de quantifier les épisodes de haut-le-cœur et de vomissements. Les animaux sont alors hébergés individuellement lors de la phase d’observation (durée maximale de 6 heures). Lorsque l'observation doit être prolongée, les animaux sont réintégrés dans leur hébergement collectif et leur comportement est enregistré par vidéo. Dans les études évaluant les propriétés antiémétiques, les animaux reçoivent dans un premier temps la substance d'essai (administration unique ou répétée pendant quelques jours à plusieurs semaines selon les objectifs de l'étude). Après une période de prétraitement adaptée, ils sont placés individuellement en cage d'observation puis reçoivent un agent émétisant de référence avant une période d'observation de 2 à 6 heures destinée à évaluer la diminution des événements émétiques. Un même animal peut participer à plusieurs sessions expérimentales, notamment pour l'évaluation de différentes doses ou conditions expérimentales, généralement dans la limite de 3 à 5 sessions séparées par une période de récupération adaptée. Si un nombre supérieur de sessions est scientifiquement justifié, celui-ci est soumis à l'avis préalable du vétérinaire. Certaines études portant sur les effets retardés nécessitent l'implantation chirurgicale unique d'un dispositif télémétrique sous anesthésie générale permettant l'enregistrement continu de la pression abdominale pendant plusieurs jours. Lorsque cela est scientifiquement justifié, jusqu'à trois prélèvements sanguins par session peuvent être réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement dure généralement moins d'une minute. Un prélèvement de liquide cérébrospinal peut également être réalisé sous anesthésie générale (durée d'environ 15 min) lorsque les objectifs de l'étude le nécessitent.
Impact sur les animaux
Les animaux sont temporairement hébergés individuellement pendant les périodes d'habituation et d'observation afin de permettre l'identification et la quantification précise des épisodes émétiques. Cet hébergement individuel de courte durée peut constituer une source de stress. Les procédures réalisées dans le cadre de ce projet visent à évaluer les effets de substances sur la réponse émétique. En conséquence, l'apparition de haut-le-cœur, de nausées et/ou de vomissements est attendue dans ces études. Comme pour toute étude évaluant de nouvelles substances, des effets indésirables non anticipés peuvent exceptionnellement survenir. Les animaux font l'objet d'une surveillance clinique régulière et tout signe clinique observé est documenté et évalué afin de mettre en œuvre les mesures appropriées si nécessaire. Selon les substances évaluées, d'autres effets pharmacologiques transitoires peuvent également être observés, tels qu'une diminution de l'activité, une hypersalivation, des crampes abdominales, une diarrhée ou d'autres signes digestifs compatibles avec leur profil pharmacologique. Selon les objectifs de l'étude, les animaux peuvent également subir les contraintes associées à l'administration des substances testées ou à des prélèvements sanguins (contention de courte durée, injections, administrations ou ponctions veineuses). Dans certains protocoles spécifiques visant à étudier les vomissements retardés, une intervention chirurgicale peut être réalisée afin d'implanter un dispositif télémétrique permettant l'enregistrement continu de paramètres physiologiques. Cette intervention peut entraîner une douleur post-opératoire transitoire, une gêne liée à la cicatrisation et une période de récupération et de surveillance clinique renforcée sont alors nécessaires.
Devenir
Pour les procédures légères ou modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sévères, les animaux sont euthanasiés à la fin du test. Lorsque possible et après avis vétérinaire, un programme de reclassement des chiens est mis en place.
Remplacement
Les procédures décrites dans ce projet visent à évaluer les effets de substances sur la réponse émétique. La réponse émétique résulte de l'intégration de mécanismes complexes impliquant le système nerveux central et périphérique, le tractus gastro-intestinal ainsi que de nombreux médiateurs neurochimiques. A ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet de reproduire l'ensemble de ces interactions physiologiques ni de prédire de manière fiable l'apparition ou l'inhibition d'événements émétiques. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico peuvent contribuer à la compréhension de certains mécanismes d'action mais ne permettent pas de remplacer l'utilisation d'animaux pour l'évaluation intégrée de la réponse émétique. Le recours à l'animal demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet repose en premier lieu sur la réutilisation des animaux entre différentes sessions, lorsque cela est compatible avec leur état de santé et les objectifs scientifiques de l’étude. Les plans expérimentaux sont optimisés afin de maximiser les informations obtenues à partir d’un même groupe d’animaux tout en conservant une sensibilité suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de l’étude. Dans le cadre de l’évaluation du potentiel émétisant de nouvelles substances, une approche séquentielle est privilégiée. Les composés sont évalués progressivement et seules les doses ou conditions pertinentes sont investiguées, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Ces études incluent généralement 6 furets ou 5 chiens par condition expérimentale. Dans le cadre de l’évaluation des propriétés antiémétiques, les études incluent généralement 8 furets ou 5 chiens par groupe, permettant une comparaison statistique appropriée entre les groupes expérimentaux et les groupes contrôles tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, plusieurs objectifs expérimentaux ou prélèvements complémentaires peuvent être intégrés au sein d’une même étude afin d’éviter la réalisation d’expériences supplémentaires.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi du poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Lorsque plusieurs sessions sont prévues au cours d'une même étude, une période de récupération d'au moins une semaine est respectée entre deux sessions afin de permettre un retour à l'état physiologique normal des animaux. Par ailleurs, un enrichissement complet est fourni quotidiennement aux animaux. Celui-ci comprend notamment une litière adaptée, un tunnel, une plateforme, des jouets, des objets à ronger ainsi que la présence de congénères, sauf lorsque l'hébergement individuel est imposé temporairement par la procédure. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le protocole d'anesthésie et d'analgésie est défini par un vétérinaire afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Lorsque cela est possible, un système d’analyse vidéo est mis en place afin de permettre une observation simultanée et non invasive de l’ensemble des animaux, tout en limitant les manipulations nécessaires à leur suivi.
Choix des espèces
Les études seront réalisées chez le furet ou le chien, deux espèces adaptées à l'évaluation préclinique des nausées et vomissements. Le furet constitue le modèle de référence dans ce domaine en raison de sa bonne valeur translationnelle vers l'Homme. Le chien peut également être utilisé selon les caractéristiques de la substance étudiée. Contrairement aux rongeurs, ces deux espèces possèdent un réflexe de vomissement fonctionnel. Des furets et des chiens adultes seront utilisés conformément aux données historiques de l'établissement et aux recommandations de la littérature scientifique. L'utilisation d'animaux adultes permet de garantir la maturité physiologique des animaux et la comparabilité des résultats avec les données de référence disponibles.
Rôle de l’immunité innée et mécanismes de défense de l’hôte dans les infections à méningocoques dans un modèle murin de xénogreffe de peau humaine.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Un morceau de peau humaine est greffé sur le dos de souris immunodéficientes, au cours d'une chirurgie de 30 minutes suivie de sept jours sous bandage, avant qu'on leur injecte le méningocoque dans la veine de la queue. 1 308 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur décrit une septicémie qui mène à la prostration entre 6 et 16 heures après l'infection et assure que ses procédures "ne dépasseront pas 3h post-infection". Il prévoit pourtant des souris infectées "pendant 3 ou 16 heures" avant leur mise à mort.
Objectifs
Le méningocoque est une bactérie pathogène de l’homme responsable de septicémies (infections généralisées) et de méningites (infections du système nerveux). Ces infections graves sont souvent associées à des séquelles importantes, et restent parfois mortelles (10-20% des cas) malgré les traitements disponibles. Le pouvoir pathogène du méningocoque réside dans sa capacité à « coloniser » les vaisseaux sanguins humains. Après 24 à 48 heures, ce processus aboutit à la destruction du vaisseau colonisé. L’étude in-vivo des infections invasives à méningocoques nécessite un modèle murin basé sur la xénogreffe d’un morceau de peau humaine sur le dos de souris du fait de la spécificité de la bactérie pour les vaisseaux humains. Lors de la prise du greffon, les micro-vaisseaux humains contenus dans la peau humaine vont se connecter au réseau vasculaire murin. Ainsi, lorsque l’on injecte par voie intraveineuse des bactéries aux animaux, celles-ci vont se fixer sur la paroi des vaisseaux humains du greffon, se multiplier et induire des lésions vasculaires importantes comme dans la pathologie humaine. Toutefois, une limite majeure de ce modèle est qu’il utilise des souris immunodéficientes, qui sont donc incapables de reproduire la réponse immunitaire complète qui se met en place chez l’Homme. Dans ce contexte, notre projet vise à analyser, au sein de ce modèle de xénogreffe, le comportement des cellules humaines et murines, en conditions infectées et non infectées. Nous étudierons également leurs interactions avec les cellules immunitaires. À terme, une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires en jeu pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces.
Bénéfices attendus
Notre modèle murin avec xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoque observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins, entrainant le déclenchement d’une septicémie. À court et moyen terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment le système immunitaire réagit face à une infection à méningocoque. Il s’intéressera notamment au rôle de plusieurs types de cellules immunitaires qui participent à la défense de l’organisme contre ces agents infectieux. Les résultats obtenus pourraient conduire à des avancées thérapeutiques en identifiant de nouvelles cibles pour moduler la réponse inflammatoire. À long terme, nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme en permettant une prise en charge précoce plus efficace. Sur le plan scientifique, cette étude contribuera également à optimiser les protocoles expérimentaux pour les modèles de greffe et d’infection, tout en fournissant des données précieuses pour la recherche translationnelle. Enfin, ce projet renforcera la collaboration interdisciplinaire entre immunologie, biologie vasculaire et modélisation animale, tout en soutenant la formation de jeunes chercheurs dans un domaine à fort impact médical.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 3 types d’expériences : 1- Des expériences où les animaux seront infectés par l’injection intraveineuse de bactéries. Les injections se feront via la veine caudale sur des animaux vigiles placés dans un tube de contention pendant 2 min. Les animaux seront infectés pendant 3 ou 16 heures puis seront mis à mort. 2- À la suite de l’infection des animaux par l'injection intraveineuse de bactéries, des observations seront réalisées pendant une période maximale de 3h sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : - L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine est une chirurgie qui entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. Cette douleur sera contrôlée par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure chirurgicale. - La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. - Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection intraveineuse de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection). L’introduction de l’aiguille lors de l’injection intraveineuse entraine une douleur légère de courte durée. Nos procédures ne dépasseront pas 3h post-infection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.
Remplacement
Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilise des cellules en culture (i.e. culture et infection de cellules épithéliales ou endothéliales humaines in vitro, les deux types cellulaires sur lesquels la bactérie peut se fixer) ou des organes sur puce (i.e. développement d’un modèle de « vaisseaux sur puce »). Ces études permettent uniquement d’obtenir des informations sur les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité et dynamique du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin avec xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoque.
Réduction
Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude. Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. La répartition des animaux sera faite grâce à un outil de randomisation afin de créer des groupes expérimentaux homogènes. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées grâce à des analyses de variance et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Le recours à l’imagerie a permis un suivi longitudinal des mêmes animaux au cours du temps, offrant une étude dynamique et transversale de l’évolution de l’infection sans nécessiter le sacrifice d’animaux à chaque point expérimental. Cette approche a ainsi contribué à réduire ainsi le nombre total d’animaux requis tout en améliorant la qualité et la robustesse des données obtenues. De plus, plusieurs organes seront prélevés sur un même animal en fin d’étude afin de recueillir un maximum d’informations biologiques à partir de chaque individu et d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Notre expérience sur les procédures mises en œuvre nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs du projet. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle.
Raffinement
Souris immunodéficientes Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ils seront hébergés dans des portoirs ventilés, en cages individuelles autoclavées. Ils disposeront d'eau de boisson autoclavée et d'une alimentation irradiée. Tous les équipements et matériels entrant en contact avec les animaux seront autoclavés ou, lorsque l'autoclave n'est pas possible, décontaminés selon les procédures adaptées. Xénogreffe de peau humaine : 30 minutes avant la chirurgie, les animaux sont prémédiqués par injection sous-cutanée d'un antalgique et d'un anti-inflammatoire non stéroïdien. La chirurgie (~30 min) est réalisée sous anesthésie et sous loupe binoculaire pour une meilleure précision des gestes chirurgicaux, les animaux étant placés sur un tapis chauffant (37°C) pour éviter la baisse de leur température corporelle. Avant d'être placés dans leur cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante, les animaux greffés sont réhydratés par une injection sous-cutanée de sérum physiologique. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 2 jours après la chirurgie malgré le traitement (poils hérissés, changements d'expressions faciales, abattement, perte d'activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont évalués quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie, pendant le port du bandage, afin de détecter d'éventuels signes de souffrance et vérifier l'intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l'animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie ; s'il a lésé le greffon de peau humaine, l'animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l'évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Infection par le méningocoque : L'infection des animaux est réalisée par injection intraveineuse des bactéries. Les animaux sont ensuite placés dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichis en sucres et dont la moitié du sol est chauffée à l'aide de chaufferettes pour aider au maintien de leur température corporelle. Les animaux sont mis à mort à la fin de l'expérience. Hébergement : Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 4 maximum par cage, dans des cages contenant du coton et un igloo.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée et leur coût est relativement faible. Leur système vasculaire est proche du système vasculaire humain, ce qui permet l’interconnexion des deux réseaux lors de la xénogreffe de peau. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre la génération de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe immunitaire humaine efficace et prolongée. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentions sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.
Modèle d’entéropathie induite par l’indométacine chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 730
Le projet vise d'abord à mettre au point une méthode pour altérer l'intestin avec l'indométacine, un anti-inflammatoire, afin d'y tester ensuite des composés censés protéger la paroi intestinale dans les maladies du foie. 1 460 rongeurs, 730 souris et 730 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur sang, leur intestin et d'autres organes. Ils reçoivent plusieurs doses d'indométacine, des traitements par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, un jeûne de 16 heures pour les rats et de 6 heures pour les souris, et passent jusqu'à 20 minutes dans une enceinte à 38 °C avant certaines injections. Un second protocole au méthotrexate doit provoquer des lésions plus profondes. Le porteur mentionne des "critères d'arrêt prédéfinis" sans en donner aucun.
Objectifs
Notre laboratoire cherche à mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à l’aggravation brutale des maladies du foie, en particulier chez les patients atteints de cirrhose. Dans ces situations, une altération rapide de la paroi de l’intestin peut se produire, rendant celui-ci plus perméable. Cette perte de « barrière » permet à des bactéries ou à des substances issues de l’intestin de passer dans le sang et d’atteindre le foie, ce qui peut déclencher ou aggraver une inflammation et contribuer à la détérioration de l’état de santé. L’objectif de ce projet est de développer un modèle expérimental permettant de reproduire ces altérations précoces de la perméabilité intestinale sur une courte durée. Ce modèle aidera à mieux comprendre les premières étapes de ce phénomène et à évaluer de nouveaux traitements visant à protéger l’intestin, limiter le passage de substances nocives dans l’organisme et ainsi ralentir ou prévenir l’aggravation des maladies du foie.
Bénéfices attendus
Le modèle utilisant l’indométacine permet de provoquer une altération rapide et temporaire du fonctionnement normal de l’intestin. Il est particulièrement utile pour étudier les premières étapes de la perte de l’effet barrière de l’intestin et pour évaluer des traitements capables de restaurer rapidement cette fonction protectrice. Un second modèle utilisant le méthotrexate sera développé en parallèle afin d’étudier des lésions plus profondes de la paroi intestinale. La comparaison de ces deux modèles permettra de mieux comprendre comment les traitements agissent. Un composé efficace uniquement dans le modèle à l’indométacine pourrait agir principalement sur les perturbations précoces et réversibles du fonctionnement intestinal. À l’inverse, un composé efficace dans les deux modèles pourrait à la fois améliorer le fonctionnement de l’intestin et protéger sa structure. De tels effets pourraient limiter le passage de substances indésirables depuis l’intestin vers l’organisme et contribuer à réduire l’inflammation associée aux maladies du foie.
Procédures
Les animaux recevront plusieurs administrations d’indométacine afin de provoquer une altération temporaire du fonctionnement de l’intestin. Selon les procédures, ils recevront également des traitements ou leurs véhicules par différentes voies d’administration (orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse). Les administrations durent généralement moins d’une minute. Dans certaines situations, les animaux pourront être placés jusqu’à 20 minutes dans une enceinte thermostatique maintenue à 38 °C afin de faciliter certaines injections intraveineuses. Les animaux seront soumis à une courte période sans nourriture (16 heures chez le rat et 6 heures chez la souris), pouvant entraîner un inconfort léger et temporaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse de courte durée. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés profondément puis mis à mort afin de permettre la réalisation des analyses biologiques et tissulaires nécessaires aux objectifs scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
Après l’administration de l’indométacine, les animaux peuvent présenter une diminution temporaire de leur activité, une baisse de leur consommation de nourriture et d’eau ainsi qu’une perte de poids modérée. Des troubles digestifs légers à modérés peuvent également être observés, notamment une gêne abdominale ou des modifications de l’aspect des selles. Ces effets sont attendus, généralement temporaires et font l’objet d’une surveillance régulière tout au long de l’étude. Pour certaines évaluations, les animaux seront soumis à une courte période sans nourriture (16 heures chez le rat et 6 heures chez la souris), pouvant entraîner un inconfort léger et passager. Ils recevront ensuite un marqueur par voie orale, suivi d’un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie de courte durée afin d’évaluer le fonctionnement de la barrière intestinale.
Devenir
À l’issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre la réalisation des analyses prévues dans le projet. Ces analyses nécessitent des prélèvements sanguins et le recueil de différents organes et tissus, notamment au niveau intestinal. Les informations obtenues à partir de ces prélèvements permettent de répondre aux objectifs scientifiques de l’étude tout en maximisant les données recueillies sur chaque animal utilisé. En raison de la nature de ces prélèvements, les animaux ne pourront pas être réutilisés à l’issue de l’étude.
Remplacement
Des méthodes alternatives, telles que les cultures cellulaires, sont utilisées en amont pour sélectionner les composés les plus prometteurs et limiter le recours aux animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l'ensemble des interactions qui existent dans un organisme vivant entre l'intestin, les bactéries naturellement présentes dans le tube digestif, le système immunitaire et les autres organes, notamment le foie. Elles ne permettent pas non plus d'évaluer comment un médicament est absorbé, transformé et éliminé par l'organisme. L'utilisation d'animaux reste donc nécessaire pour étudier les conséquences d'une altération de la fonction protectrice de l'intestin et pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dans des conditions se rapprochant de la maladie. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet de répondre à l'ensemble des objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en utilisant le plus petit effectif possible. Les effectifs reposent sur les connaissances acquises à partir de la littérature scientifique ainsi que sur l’expérience de l’établissement avec ce type de modèle. Les études seront conçues de manière à recueillir un maximum d’informations à partir de chaque animal utilisé. Lors des phases de mise au point du modèle, une approche progressive sera appliquée afin d’ajuster les effectifs aux besoins réels du projet et d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Cette stratégie permet de respecter le principe de réduction du nombre d’animaux utilisé tout en garantissant la qualité des résultats obtenus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leurs besoins physiologiques et comportementaux, avec un hébergement social et un enrichissement de leur environnement. Leur état de santé et leur bien-être sont surveillés tout au long de l’étude. Afin de limiter les effets des procédures expérimentales, un complément alimentaire appétent et nutritif pourra être mis à disposition pour favoriser le maintien de l’état général et la récupération des animaux. Les animaux font l’objet d’un suivi régulier portant notamment sur leur comportement, leur activité, leur poids et leur consommation alimentaire et hydrique. Des critères d’arrêt prédéfinis sont appliqués afin d’identifier rapidement toute dégradation de leur état de santé et de mettre en œuvre les mesures appropriées, pouvant aller jusqu’à une euthanasie anticipée si nécessaire. Les procédures ont été conçues pour limiter le stress, les manipulations et les contraintes imposées aux animaux, tout en permettant d’atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Choix des espèces
À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble des mécanismes impliqués dans les altérations du fonctionnement de l’intestin observées dans certaines maladies digestives et hépatiques. Les rats et les souris sont couramment utilisés en recherche biomédicale car ils présentent de nombreuses similitudes anatomiques, physiologiques, immunitaires et métaboliques avec l'espèce humaine, tout en permettant l’étude intégrée des interactions complexes entre l’intestin, le foie et la réponse inflammatoire dans un organisme vivant. Le choix de l’une ou l’autre espèce dépendra des caractéristiques des composés étudiés ainsi que des connaissances acquises au cours des études précédentes. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes, âge auquel les fonctions digestives, immunitaires et métaboliques sont pleinement développées, permettant une évaluation fiable des mécanismes étudiés. Les rats seront âgés de 6 à 7 semaines à leur arrivée dans l’établissement et les souris de 6 à 8 semaines.
Développement d’un modèle de prélèvement de sang total hépariné chez le rat pour la réalisation d’essais pharmacologiques et immunologiques ex vivo
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une partie du sang peut provenir de rats témoins déjà engagés dans d'autres procédures, mais ce projet utilise à lui seul 100 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent de l'héparine, en deux injections dans l'abdomen à 16 heures d'intervalle ou en une injection dans la queue après jusqu'à 15 minutes dans une enceinte chauffée à 38 °C. Sous anesthésie, ils subissent ensuite un prélèvement terminal destiné à récupérer "un maximum de sang", pour mettre au point un essai ex vivo sur la réponse inflammatoire, que le porteur appelle un "modèle" dans son titre. Il présente cet essai comme une "approche intermédiaire" qui limiterait le recours à des "modèles animaux plus complexes".
Objectifs
Le sang transporte de nombreuses cellules et protéines impliquées dans les mécanismes de l’inflammation et dans la réponse de l’organisme aux médicaments. Pour mieux comprendre ces phénomènes et évaluer de nouveaux traitements, les chercheurs utilisent parfois du sang total prélevé sur des animaux de laboratoire. L’objectif de ce projet est de recueillir du sang total chez le rat tout en évitant sa coagulation. Pour cela, un anticoagulant appelé héparine est administré avant le prélèvement. Le sang obtenu pourra ensuite être utilisé pour réaliser des essais ex vivo en laboratoire pour évaluer l'efficacité de médicaments sur la réponse inflammatoire.
Bénéfices attendus
Cette procédure permettra la mise en place d’un essai de sang total (whole blood assay) robuste et reproductible permettant la réalisation d'essais pharmacologiques ex-vivo conservant l’ensemble des compartiments cellulaires sanguins, pour étudier par exemple, les réactions inflammatoires ou tester l’effet de nouvelles molécules. Cette approche permet d’obtenir de nombreuses informations biologiques à partir d’un seul prélèvement sanguin et contribue à améliorer la valeur prédictive des études précliniques réalisées sur un plus grans nombre de sujets.
Procédures
Les animaux subiront soit 2 injections à 16h d'intervalle dans la cavité abdominale soit une injection en intraveineuse unique dans la veine de la queue. Les animaux seront ensuite anesthésiés profondément avant de subir un prélèvement sanguin terminal suivi de l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées sont limitées à deux injections d’héparine pour l'intrapéritonéale ou à une injection unique en intraveineuse, suivies d’un prélèvement terminal sous anesthésie générale. Les effets indésirables possibles sont: une gêne transitoire liée à l’injection, un allongement du temps de coagulation induit par l’héparine, faible risque de saignement local au site d’injection. Dans le cas de l’injection IV, les animaux sont placés au maximum 15 minutes dans une enceinte thermostatée à 38°C, une compresse de lidocaïne sera appliquée sur la queue avant l'injection pour éviter toute douleur. Le prélèvement sanguin est réalisé exclusivement sous anesthésie profonde et constitue une procédure terminale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après anesthésie à la fin de la procédure, le but étant de récupérer un maximum de sang afin de réaliser des expériences in vitro.
Remplacement
Aucune méthode in vitro ne permet actuellement de reproduire simultanément les interactions entre leucocytes, érythrocytes, plaquettes, protéines plasmatiques et système du complément. Le whole blood assay constitue néanmoins une approche intermédiaire permettant de générer un grand nombre de données en limitant le recours à des modèles animaux plus complexes. Ainsi, le sang d'un seul rat permet, par l'utilisation de méthode in vitro réalisée en plaque de dosages, d'effectuer des tests de stimuli et composés d'intérêt plutôt que de tester directement sur des animaux.
Réduction
Un unique prélèvement sanguin permet la réalisation de nombreux essais pharmacologiques, le test simultané de plusieurs concentrations, l’évaluation de plusieurs composés ou stimuli biologiques. Cette approche réduit significativement le nombre d’animaux requis. Dans certains cas, il est possible de profiter d’animaux engagés dans d’autres procédures expérimentales, et n’ayant subi aucune administration (groupe contrôle) pour pratiquer des prélèvements d’échantillons biologiques.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation de 5 jours minimum au sein de notre animalerie et seront hébergés avec d'autres congénères afin de conserver leur mode de vie en groupe social. L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de ronger (blocs ou billes des bois), un apport de sizzle compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rongeurs. Les animaux sont anesthésiés par voie aérienne ( induction gazeuse en boite) pour permettre la réalisation du prélèvement sanguin. Aucun geste ni action douloureuse n'est appliqué qui justifierait l'application de méthodes analgésiques.
Choix des espèces
Le rat est largement utilisé dans les études pharmacologiques et immunologiques. Son volume sanguin permet d’obtenir suffisamment de sang total pour réaliser de nombreuses analyses à partir d’un seul prélèvement. Cette caractéristique contribue directement à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Les réponses inflammatoires du rat sont également bien caractérisées, ce qui en fait un modèle adapté aux essais de sang total ex vivo. Les animaux utilisés seront des animaux adultes agés de 8 à 10 semaines. Il est important que les animaux soient matures du point de vue immulogique.
Mise en place et caractérisation du modèle de cholestase hépatique par ligature du canal biliaire commun chez le rat. Application à l’évaluation de composés dans la défaillance hépatique aigüe.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Ouverts à l'abdomen pour une ligature du canal biliaire, 1 040 rats développent ensuite une jaunisse et une fibrose du foie. Ils sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, et tous sont tués à l'issue. Le porteur affirme que les rats "se remettent très bien de la chirurgie", puis décrit dans le même paragraphe un possible gonflement de l'abdomen par déchirement du sac résiduel. Trois à quatre semaines après l'opération, une injection de LPS mimant une infection bactérienne majeure provoque prostration et troubles de la température, et chaque rat est observé jusqu'à 24 heures : mis à mort au point limite, sa durée de survie servant de mesure, ou tué à la fin s'il survit.
Objectifs
La cirrhose hépatique est une maladie chronique caractérisée par le développement progressif d’une fibrose hépatique, conduisant à une altération de l’architecture du foie, à des perturbations de la circulation sanguine intra-hépatique et, à terme, à une insuffisance hépatique. Les patients peuvent évoluer vers une décompensation aiguë, pouvant conduire à une insuffisance hépatique aiguë sur maladie chronique (ACLF, Acute-on-Chronic Liver Failure), syndrome grave associé à des défaillances multiples d’organes et à une mortalité élevée. La fibrose résulte d’agressions hépatiques répétées ou continues entraînant une accumulation excessive de matrice extracellulaire et la formation d’un tissu cicatriciel non fonctionnel. Parmi les causes de fibrose, la cholestase induite par une obstruction des voies biliaires provoque une accumulation d’acides biliaires toxiques, responsable de lésions hépatiques, d’inflammation et d’une progression rapide vers la cirrhose. Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la décompensation de la cirrhose et de développer de nouvelles approches thérapeutiques, des modèles expérimentaux reproduisant les principales caractéristiques de la maladie humaine sont nécessaires. La ligature du canal cholédoque chez le rat est un modèle reconnu permettant d’induire rapidement une fibrose hépatique et une cirrhose présentant des similitudes avec la cirrhose biliaire humaine, constituant ainsi une étape essentielle pour l’étude de l’ACLF.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence une efficacité de nos molécules d'intérêt afin d'améliorer la qualité de vie des patients atteints d'ACLF, de diminuer l'inflammation, de retarder voire stopper la défaillance multi-organes et de prolonger la survie des patients.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie d'une durée de 30mn par animal, lors de laquelle ils seront ouverts au niveau de l'abdomen pour effectuer une ligature du canal biliaire. Cette dernière se fait sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésie avec un dérivé morphinique. L'analgésie se poursuivra au cours des 3 jours suivant l'opération. 2 semaines après la chirurgie, ils auront un prélèvement de sang toujours sous anesthésie de l'ordre de 0.75 à 1mL. 3 à 4 semaines post chirurgie, ils subiront le challenge ACLF par injection d'un agent précipitant. Le traitement avec la molécule testée sera appliqué soit par voie orale, soit par voie intrapéritonéale, pour ces voies l'administration dure environ 5s, soit par voie intraveineuse et durera environ 10 à 15s. Des micro-prélèvements à la veine de la queue ou à la veine saphène (intérieur de la cuisse) pourront être réalisés, ils seront de très faible volume, de l'ordre de quelques gouttes, d'une durée de 10s chacun et seront de 6 au maximum. Enfin, après anesthésie générale, le sang des animaux sera prélevé avant mise à mort sous sédation.
Impact sur les animaux
Le modèle est réalisé en deux phases : 1) La première phase correspond à la chirurgie lors de laquelle la ligature du canal biliaire est réalisée, entrainant par la suite ,une accumulation de bile au niveau hépatique responsable du développement de la fibrose. La chirurgie est réalisée sous anesthésie gazeuse, une analgésie est prévue en amont et en aval de la chirurgie, la prise en charge de la douleur est assurée et les animaux se remettent très bien de la chirurgie. Ils développent ensuite une jaunisse. L’intervention qui est réalisée peut dans certains cas provoquer le gonflement de l’abdomen de l’animal, cela peut être le reflet du déchirement du sac résiduel qui se forme après l’opération. 2) La seconde phase qui correspond à la précipitation de l'ACLF par injection du composé qui mime un infection bactérienne majeure (LPS) est par définition aigue. Elle génère rapidement des signes de stress et d'inconfort chez le rat (trouble de la régulation de la température corporelle, prostration, pâleur des muqueuses etc). Ces effets sont évalués et scorés à la fois dans le but de grader la sévérité ce qui reflète aussi un effet pharmacologique du produit testé, et pour évaluer les points d'arrêts anticipés ou points limites.
Devenir
A l'issue de la procédure expérimentale, les animaux seront observés au cours d'une période de 24heures maximum après le déclenchement de la phase aigue de la défaillance multi organe. Cette phase d'observation se traduira soit par la mise à mort de l'animal pour atteinte des points limites (avec mesure de la durée de survie = étude de survie) soit par une mise à mort pour les animaux survivants. La justification repose sur l'objectif de ce projet qui consiste à évaluer les effets de composés sensés réduire la mortalité lors de défaillance aigue de l'organisme. Les animaux qui survivent seront mis à mort et seront nécropsiés.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles un outil translationnel très pertinent. Nous ne disposons pas actuellement de modèles in vitro ayant des caractéristiques permettant d'évaluer les propriétés de composé sur l'ACLF. Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, et même sur des modèles de tyoe organoïdes contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global ».
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La chimie des médicaments peut produire des familles de composés chimiques très importante, la stratégie de sélection de produits intéressants à l’aide de tests in vitro exclut une très grande majorité des produits et diminue donc drastiquement le nombre de tests à réaliser chez l’animal.
Raffinement
Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse sur tapis chauffant. L'anesthésiant est mélangé à de l'oxygène au lieu d'air pour permettre une meilleure oxygénation de l'animal. Une pré-médication est réalisée en amont, 30mn avant le début de la chirurgie. Les animaux reçoivent également une injection en sous-cutané de Ringer Lactate afin d'éviter toute deshydratation et en reçoivent potentiellement une seconde en sortie de chirurgie si nécessaire. Un anesthésique local est appliqué au niveau de la laparotomie. Le principal raffinement dans ce projet se traduit par la méthode d'administration de l'analgésie en post op grâce à l'implantation de pompes osmotiques permettant une diffusion lente et constante d'un dérivé morphinique durant 48h. Des gels nutritifs sont fournis pour aider à la récupération après la chirurgie. La température de la zone d'hébergement est relevée à 22°C toujours pour que les animaux se remettent au mieux de la chirurgie. Les animaux sont identifiés à l'aide de puce RFID permettant la prise de température facile lors de l'épisode d'ACLF. Lors de l'épisode d'ACLF, les animaux sont observés selon une grille de scoring permettant d'évaluer les points d'arrêt anticipés précoces.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les rats sont agés de 5 à 6 semaines (poids 250-275g), à ce stade la masse adipeuse n'est pas trop élevée.