Procédures légères

900 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chacune subit un prélèvement de sang et une échocardiographie de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, avant que ses organes ne soient prélevés. L'objet déclaré est de vérifier que ces nouvelles lignées se développent et vivent normalement. Neuf cents individus sont ainsi tués pour contrôler la normalité de lignées d'élevage, sans que l'effectif retenu soit justifié dans le texte.

Objectifs

Ce projet vise à mieux caractériser de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées afin de vérifier qu’elles se développent et vivent normalement. Il permet également de repérer d’éventuels effets inattendus liés à la modification génétique, susceptibles de fausser les résultats de recherches futures.

Bénéfices attendus

La réalisation d’un protocole de normalité lors de la création d’une nouvelle lignée de souris présente plusieurs intérêts majeurs, à la fois scientifiques et éthiques. Il permet de comprendre le phénotype de base et d’assurer la validité scientifique des études qui suivront, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires pour les recherches futures. Ce protocole permettra également de mettre en place des points de surveillance clairs pour les études ultérieures.

Procédures

Dans le cadre de cette procédure, un prélèvement de sang sera réalisé sur l'ensemble des animaux. Ce geste dure moins d'une minute. Une échocardiographie sera réalisée par animal, sous anesthésie gazeuse, chacune durant environ 20 minute.

Impact sur les animaux

L’animal va ressentir un stress lors de la contention et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille pour la prise de sang. L'animal aura une anesthésie gazeuse pouvant induire une hypothermie.

Devenir

En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder à la collecte des organes afin de les analyser.

Remplacement

Le but de ce projet est de réaliser des études de normalité sur de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées afin d’identifier potentiellement des effets inattendus de la modification génique qui pourraient biaiser toutes les études ultérieures. Ces études ne sont modélisables que dans un organisme complet, capable d’exprimer l’ensemble des fonctions physiologiques de régulation. Il n’existe actuellement pas de méthode alternative pour reproduire les analyses prévues dans ce projet. Par ailleurs, seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes impliqués dans la création de nouvelles lignées de souris. Ces études de normalité fourniront de nombreuses données pouvant ensuite être utilisées dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi réalisé des analyses permettant d’évaluer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 animaux par groupe constitue un bon compromis entre puissance d’analyse et réduction du nombre d’animaux utilisés. Durant cette étude, nous générerons des données qui seront analysées à l’aide de tests statistiques. Nous avons également conçu notre protocole de manière à utiliser une seule cohorte d’animaux, qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé et nous permettra d’évaluer l’atteinte de points limites, pouvant entraîner, à terme, l’euthanasie de l’animal afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront maintenus en groupes dans des conditions d’animalerie optimales, avec un accès illimité à la nourriture, à l’eau et à un environnement enrichi (nids en quantité suffisante, bâtons et balles à ronger). En cas de douleur, un antalgique pourra être administré conformément aux recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés chaque semaine, en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, le volume prélevé sera compensé par l’injection de sérum physiologique.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée, et nous disposons de modèles d’intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes étudiés. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative des mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données pouvant ensuite être utilisées dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux débuteront leur protocole en tant que jeunes adultes, à partir de 6 semaines. À ce stade, les différents systèmes de l’organisme sont matures.

Anesthésiées, capturées à l'épuisette, pesées puis soumises à un prélèvement de mucus et à une injection de polluants dans l'abdomen, 165 truites communes subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur expose les poissons à des PCB et à du benzopyrène, seuls ou combinés à un stress thermique, pour en mesurer l'effet sur l'immunité et le comportement. Il indique un possible léger saignement au point d'injection et un stress lié aux manipulations. La mise à mort sert à prélever le foie afin de vérifier si le mucus, moins invasif, pourrait un jour remplacer ces prélèvements.

Objectifs

Les milieux aquatiques sont régulièrement exposés à des polluants issus des activités humaines. Certains composés anciens et persistants, tels que les hydrocarbures et les polychlorobiphényles (PCB), restent présents dans l’environnement malgré leur interdiction depuis plusieurs décennies. Ces substances s’accumulent dans les organismes vivants et peuvent altérer leur santé. La truite commune a été choisie comme espèce modèle pour ce projet car elle est largement présente dans les rivières françaises et constitue un indicateur reconnu de la qualité des milieux aquatiques. L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les effets de ces polluants persistants, seuls ou en combinaison avec une élévation de la température, afin de simuler les conditions liées au changement climatique. L’approche proposée permettra d’évaluer les réponses physiologiques et comportementales de la truite face à ces stress environnementaux. Les mesures seront réalisées à partir du mucus, un fluide naturellement sécrété par les poissons. Ce choix méthodologique présente l’avantage d’être non invasif, évitant ainsi le recours à des prélèvements destructifs. Des études antérieures ont montré que les prélèvements successifs de mucus n’ont pas d’effet sur la santé, la peau ni sur les défenses naturelles des poissons.  À terme, ce travail permettra d’améliorer les stratégies de surveillance de la qualité des milieux aquatiques tout en réduisant le recours à des procédures expérimentales invasives sur les animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à identifier des indicateurs non invasifs du stress chimique et thermique chez la truite, afin de réduire l’utilisation de méthodes invasives dans les futurs suivis écotoxicologiques..

Procédures

Pour l’ensemble des interventions, les animaux seront placés sous anesthésie. Les procédures prévues dans ce projet n’impliquent que des stress légers et de courte durée. Les poissons subissent ces procédures une seule fois. Première intervention (J0) Sous anesthésie, les poissons sont successivement : • capturés à l’épuisette, • pesés et mesurés sur une table de biométrie (durée incluant la capture : environ 30s), • soumis à un prélèvement de mucus à l’aide d’un étaleur de cellules en silicone (durée : environ 1 min), • injectés par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue préalablement préparée et chargée (durée : environ 30 s). La durée totale de manipulation par animal lors de cette première intervention est d’environ 2 minutes. Seconde intervention (J+2, 48 h plus tard) Les poissons sont capturés à l’épuisette et transférés vers les bacs de comportement situés dans la même pièce thermostatée (durée du transfert : environ 30 s). Ils sont ensuite : • laissés en acclimatation pendant 20 minutes, • filmés pendant 15 minutes pour les tests comportementaux, • puis remis dans leurs bacs d’origine.

Impact sur les animaux

Compte tenu des connaissances acquises lors d’études précédentes sur les molécules de polychlorobiphényles et le Benzo[a] pyréne nous nous attendons à : Un léger saignement est possible en raison de l'administration du contaminant par injection intrapéritonéale. Les études précédentes menées sur des truites de même poids que notre expérimentation à des doses de PCB & BaP contenant les mêmes produits que notre expérimentation ne montre pas de mortalité. Un stress pourra également survenir lors des étapes de pesée, du prélèvement de mucus et lors de l’injection intrapéritonéal. Pour cela les poissons seront anesthésiés afin de minimiser les nuisances. Le prélèvement de mucus ne devrait pas engendrer de stress ou de nuisance, de précédentes études montrent que les prélèvements successifs de mucus n'ont aucun effet sur la réponse immunitaire (activité bactéricide) ni sur la structure de la peau du poisson. Les analyses de comportements peuvent engendrer du stress en raison du transfert des poissons entre les aquariums.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation afin d’éviter le développement d’effets néfastes à long terme. Suite à leur mise à mort, des prélèvements de tissus, notamment du foie, permettront de réaliser des dosages classiques de marqueurs de stress, afin de tester si la réponse mesurée dans le mucus est pertinente et permet de remplacer ces prélèvements classiques

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire dans le cadre de ce projet, car les objectifs portent sur l’évaluation intégrée des effets de polluants persistants sur le système immunitaire, le stress oxydatif et le comportement de la truite. Ces réponses dépendent d’interactions complexes entre plusieurs tissus et organes (foie, peau, mucus, système nerveux, système immunitaire), qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable dans un modèle in vitro. De plus, les processus de bioaccumulation, de métabolisation et de réponse physiologique globale nécessitent l’étude d’un organisme entier pour comprendre la dynamique réelle d’exposition et d’effet. Enfin, ce travail s’inscrit dans une démarche de développement de méthodes non invasives, visant à réduire l’utilisation future d’animaux dans les études écotoxicologiques. À terme, les résultats obtenus permettront de proposer des outils de suivi basés sur le mucus et le comportement, contribuant ainsi aux principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement)

Réduction

Les analyses statistiques envisagées seront des analyses de variances et des modèles linéaires à effets mixtes. Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables tout en limitant au maximum le nombre de poissons employés. Des calculs d’effectifs ont permis d’établir un minimum de 15 individus par condition expérimentale, soit 165 truites au total pour les onze conditions testées. Ce nombre tient compte à la fois de la variabilité naturelle entre individus et du risque faible mais non nul de mortalité pouvant survenir après l’injection. L’exposition par injection en intrapéritonéale a été retenue plutôt qu’une exposition par l’eau (balnéation), car elle permet de maîtriser précisément la dose reçue par chaque individu et de reproduire une exposition interne contrôlée, nécessaire pour relier les concentrations internes aux réponses physiologiques mesurées. Cette méthode garantit ainsi une meilleure comparabilité entre les groupes expérimentaux et réduit le nombre total de poissons nécessaires pour obtenir des résultats exploitables

Raffinement

Une grille de scoring adaptée aux poissons sera utilisée pour détecter précocement tout signe de souffrance ou d’altération de l’état de santé (comportement anormal, comportement de prise alimentaire, troubles de la nage, etc.). En cas de dégradation, les animaux concernés seront retirés de l’expérimentation et mis à mort de manière appropriée. L’environnement des truites sera enrichi pour favoriser leur bien-être : chaque bassin sera équipé de cachettes, plantes plastiques et tiges flottantes, permettant aux poissons de se dissimuler et de limiter les interactions sociales stressantes. Les bacs seront partiellement couverts afin de réduire le stress lumineux et les manipulations seront réalisées dans le calme. Les poissons seront nourris ad libitum tout au long de l’expérimentation. Avant chaque geste technique (injection, prélèvement de mucus, pesée), les animaux seront anesthésiés afin de minimiser la douleur et le stress. Les points limites seront clairement définis et appliqués pour assurer une fin anticipée à toute situation susceptible d’engendrer une souffrance inutile.

Choix des espèces

La truite commune apparait comme un bon candidat modèle pour raisons de son fort attrait économique grâce à l’activité de pêche de loisir et de son intérêt économique avec une production aquacole de 700 tonnes en France et de 19432 tonnes au niveau mondial. Ainsi, de par sa forte consommation, la truite peut faire partie de notre chaîne alimentaire ainsi la consommation de ce poisson contaminé peut avoir des répercussions sur l'homme. De plus, la truite est une espèce dont cycle de vie est maitrisé. Contrairement à d'autres modèles de poissons utilisés en laboratoire, comme le poisson-zèbre, les études sur la truite sont facilement extrapolables à d'autres espèces de poissons présentant un intérêt écologique. Les truites pour ces études seront âgées de 2 ans et donc non matures sexuellement ce qui permettra de s’affranchir pour cette étude des variations du aux hormones sexuelles. Ces truites juvéniles (~110 g) sont choisies également pour leur sensibilité accrue aux contaminants et leur comparabilité avec des poissons sauvages de taille similaire.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 20 souris dites humanisées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales d'une molécule censée faire mûrir un système immunitaire humain greffé, puis un prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse. Leur mise à mort tient à l'objet même de l'étude, vérifier après leur mort si ces cellules humaines se comportent comme chez l'humain. Le porteur affirme que ce dispositif remplace des études cliniques sur l'être humain.

Objectifs

Les modèles animaux classiques sont d’une grande utilité dans les études précliniques car ils permettent de tester des hypothèses et des traitements de manière robuste. Malheureusement, le système immunitaire de la souris reste différent de celui de l’Homme et ne peut parfaitement mimer les réponses qui se développeront chez l’Homme. A mi-chemin entre souris et Homme ont été développées des souris humanisées, c’est-à-dire qui possèdent des cellules du système immunitaire humain. L’objectif de ce projet est de tester si les cellules immunitaires présentes chez des souris humanisées possèdent les même caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques que les cellules humaines.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra de mieux caractériser le système immunitaire humain présents dans les souris humanisées. Les bénéfices attendus de ce projet doivent être considérés à l’aune de son caractère exploratoire. Sur le plan scientifique, cette étude permettra d’évaluer la transposabilité des données issues d’expériences réalisées chez les souris humanisées et ainsi de les utiliser au mieux de leur capacité. D’un point de vue translationnel, l’identification d’un modèle murin récapitulant les caractéristiques du système immunitaire humain permettra la mise en place d’études précliniques dont les résultats mimeront avec une grande fidélité ceux attendus chez l’Homme.

Procédures

Les souris vigiles recevront 4 administrations d’une molécule permettant la maturation du système immunitaire en IP (30 secondes par geste). Les souris endormies se verront prélever du sang au niveau de la mandibule une fois pendant une minute.

Impact sur les animaux

Les 4 injections de la molécule permettant la maturation du système immunitaire humain se feront en intra péritonéale. Ces injections sont susceptibles de générer un stress lié à la contention pendant l’injection. L’injection en elle-même n’est pas douloureuse. Le prélèvement de sang se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane et ne devrait pas susciter de douleur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin d’étudier le système immunitaire humain qui s’est développé dans différents organes.

Remplacement

Des expériences in vitro ont été réalisées en amont grâce à l’utilisation de poches de sang. Cependant le système immunitaire humain est complexe et dépendant de son microenvironnement, absent lors des études in vitro. L’utilisation de souris possédant un système immunitaire humanisé permet le remplacement d’étude clinique sur l’homme.

Réduction

Le principe de réduction est au cœur de la conception de cette étude pilote. En menant d’abord une étude préliminaire, nous pourrons déterminer si ces souris humanisées possèdent un système immunitaire humain dont les fonctionnalités sont proches de celle d’un être humain. Cette étape exploratoire permettra d’évaluer la pertinence et la faisabilité d’une étude plus vaste, évitant ainsi l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux sans justification scientifique préalable. De plus, notre équipe a déjà généré un volume important de données in vitro en utilisant des poches de sang. En combinant ces deux éléments — étude pilote préalable et exploitation des données expérimentales existantes — nous respectons pleinement le principe de réduction, en utilisant le minimum d’animaux nécessaires pour répondre à la question scientifique tout en assurant la robustesse et la pertinence des conclusions.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit). L’hébergement se fera classiquement en cagepouvant accueillir 10 animaux. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers, permettant de réduire l‘ennui, diminuer le stress en stimulant l‘activité et procure un sentiment de sécurité à l‘animal dans la cage. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale de l’animal (isoflurane) suivi de la mise à mort par dislocation cervicale avant le réveil.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus d’humanisation de leur système immunitaire est maitrisé en routine par la société les mettant en œuvre. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal qui a pu reconstituer un système immunitaire humain complet.

Créer une lignée de poissons zèbres mutants pour un gène de la reproduction, tel est l'objet de ce projet qui utilise 1 050 poissons zèbres dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le génotypage passe par la section d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et les femelles peuvent voir leurs pontes se bloquer, ce qui conduit alors à leur mise à mort. Après deux générations, les animaux sont tués pour l'analyse de leurs ovaires, et 100 poissons hétérozygotes sont réutilisés pour maintenir la lignée. Le projet vise à vérifier si l'effet d'un microARN sur la reproduction, déjà observé chez le médaka, se retrouve chez le poisson zèbre.

Objectifs

Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans l’ovaire, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez la femelle médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins d’œufs produits et moins bien fécondés. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse du nombre d’œufs a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les femelles mutantes pondent elles aussi moins d’œufs, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.

Bénéfices attendus

Les microARN sont très bien conservés au cours de l'évolution, et on considère généralement que leurs cibles le sont aussi. Pourtant, aucun modèle expérimental n'a encore démontré cette conservation évolutive des cibles de microARN, ni celle des phénotypes associés à leur régulation. Notre microARN d'intérêt ayant un impact similaire sur les phénotypes reproducteurs chez le médaka et le zebrafish, démontrer une conservation évolutive de ces phénotypes et de leurs gènes cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir de nouvelles voies pour étudier les défauts de fertilité humaine.

Procédures

Ce projet concerne la création d'une lignées mutante. Pour l'établissement de cette lignée, une procédure de génotypage (section d'un fragment de nageoire caudale) sera réalisée sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l'anesthésie et de la récupération à l'anesthésie du poisson compris. La récolte des oeufs est faite dans l'aquarium, une fois qu'ils sont tombés dans le fond après que le mâle a fécondé les oeufs expulsés par la femelle (il n'y a donc pas manipulation directement sur l'animal pour cette récolte).

Impact sur les animaux

Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car nos gènes d’intérêts sont principalement exprimés dans les gamètes. Le gène sera modifié pour empêcher la fixation de son inhibiteur dessus et donc empêcher sa régulation. Nous nous attendons principalement à une réduction du nombre d’œufs pondus. Cependant, chez le médaka, il peut arriver un blocage des pontes lorsque les poissons sont mis en couple (arrêt des pontes par la femelle), caractérisé par une absence d’œufs dans le bassin et un gonflement anormal du ventre de la femelle. Si cet événement venait à se produire chez le zébrafish, un autre male serait d’abord ajouté en première instance, afin de stimuler la femelle. Et si cela ne débloque pas la femelle, et que des modifications de la nage ou de comportement alimentaire venant à apparaitre, une euthanasie sera effectuée. Le génotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l'activité de nage. Les anesthésies pratiquées pour les prélèvements (fragment de nageoire) peuvent entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.

Devenir

Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 100 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet à venir ensuite).

Remplacement

L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre miR‑202 et le gène tead3b sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule sans recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour miR‑202, et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.

Réduction

In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur 6x4 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en F2) et 6x4 individus de génotype sauvage (WT), soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus F0 porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en F1 lorsque les F0 sont croisés avec des animaux WT. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la génération F1 produira une génération F2 homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de la génération F2). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse de l’ovaire des 48 animaux.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l'interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d'œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d'édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Son ovaire est accessible à l'analyse histologique et transcriptomique Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 mois âge de maturité et 6 mois), l’analyse moléculaire, transcriptomique et histologique des ovaires permettant une étude a deux stades de maturité de développement de l’organe.

Les moustaches coupées d'un seul côté sous anesthésie, 180 souris subissent une privation sensorielle d'au plus dix-huit heures, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Douze heures après la coupe, une partie passe zéro, trois ou six heures dans une cage remplie d'objets, puis toutes sont mises à mort et leur cerveau prélevé. Le projet cherche à décrire le rôle d'une protéine, PK2, dans la plasticité d'un segment du neurone. Chaque animal sert de son propre témoin, la coupe étant unilatérale, ce qui limite le nombre d'individus sans changer leur devenir.

Objectifs

Le projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle de la protéine PK2 dans la plasticité du segment initial de l'axone.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux comprendre le rôle de la protéine PK2 dans la mise en place de la plasticité du segment initial de l’axone (SIA). Le SIA est une structure clé du neurone, cellule la plus représentée dans le cerveau. C'est au niveau du SIA que sont initiés et régulés les signaux électriques, principal moyen de communication du cerveau avec le reste du corps. La protéine PK2 est une des protéines de la PCP (Polarité Cellulaire Planaire). Les protéines de la PCP sont bien connues pour leur rôle dans l’organisation tissulaire, mais leur implication dans l’établissement et la dynamique de la polarité neuronale reste encore peu explorée. Grâce à ce projet nous devrions mieux comprendre comment ces protéines peuvent influencer la polarisation fonctionnelle des neurones. Les défauts de polarité sont un élément commun à différents troubles neurologiques comme l’autisme, l’épilepsie ou l’autisme. Étudier cette plasticité est essentiel pour comprendre comment les neurones s’adaptent à leur environnement, comment les réseaux cérébraux maintiennent leur stabilité, et comment des dérégulations de ces mécanismes peuvent conduire à des troubles neurologiques (épilepsie, autisme, schizophrénie, etc.). Enfin, cela ouvre des perspectives thérapeutiques, en ciblant l’AIS pour moduler l’activité neuronale dans certaines pathologies.

Procédures

Les moustaches de chaque animal seront coupées sur un des côtés à l'aide d'une paire de ciseaux non traumatiques sous anesthésie générale. L'intervention durera environ 5 minutes. 12 heures après cette intervention et suivant le groupe testé l'animal sera transféré dans une cage contenant de nombreux objets (cage sur-enrichie) avec ces congénères. Le temps passé dans la cage sur-enrichie sera de 0h, 3h ou 6heures.

Impact sur les animaux

Les souris peuvent subir un stress au moment de la coupe des vibrisses qui sera réalisée sous anesthésie générale. Suite à la coupe unilatérale des moustaches, les souris subiront une privation sensorielle limitée pendant au maximum 18h.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure prévue dans ce projet, les animaux seront euthanasiés. Les cerveaux des animaux seront prélevés pour des analyses sur la morphologies et la compositions des neurones.

Remplacement

Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou bio moléculaire au comportement. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en culture en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. Le laboratoire a ainsi réalisé des études in vitro pour décrire la présence, l'organisation et l'interaction des protéines de la polarité cellulaire planaire au niveau de l'AIS. Il est important de pouvoir étudier le rôle de ces protéines dans un système intégratif utilisant des études comportementales. Pour cela l'animal est indispensable.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux, chaque animal sera son propre contrôle puisque les moustaches des animaux ne seront coupées que d'un seul côté. Nous pourrons ainsi comparer la longueur des SIA chez un même animal en condition stimulée (présence de moustaches) et en condition non stimulée (pas de moustaches). La longueur des SIA pouvant varier d'un animal à l’autre, le fait d'utiliser l'animal comme son propre contrôle permet de limiter la variabilité et donc le nombre d’animaux nécessaires pour les tests.

Raffinement

Le test utilisé pour mesurer la plasticité neuronale est peu stressant pour l'animal. La privation sensorielle par coupe des moustaches sera réalisée de façon unilatérale et sous anesthésie générale pour éviter toute blessure involontaire et limiter la contention. Durant tout le projet les animaux seront laissés avec leur congénère. Durant tout le temps de leur hébergement les animaux seront surveillés quotidiennement. La détection de signes anormaux sera immédiatement reportée aux porteurs de projet pour décider des mesures / action à mettre en place. En l'absence de réponse des porteurs, la vétérinaire désignée sera contactée et prendra les décisions permettant de limiter la souffrance des animaux en concertation avec le personnel de zootechnie.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la plasticité du segment initial de l’axone (SIA) dans un contexte de privation sensorielle, notamment à travers la coupe des moustaches. La coupe des moustaches est réalisée sur un seul côté de l'animal. En l'absence de moustaches, une partie du cerveau n'est pas stimulée lors du comportement exploratoire de la souris. Il est ainsi possible d'étudier les différences de morphologies, de structure et de composition entre les neurones ayant été stimulés et ceux qui ne l'ont pas été. Cette différence définie la plasticité structurale et fonctionnelle des neurones. Le cerveau des rongeurs est bien cartographié, facilitant l'analyse régionale fine des effets de la privation. Ce modèle reproduit également certaines formes de plasticité sensorielle observées chez l’humain, ce qui renforce sa transférabilité vers des contextes pathologiques dans lesquels un défaut de plasticité a été identifié. Nous disposons de plus de modèles murins transgéniques chez lesquels l’expression de certains gènes de la polarité planaire a été invalidée ce qui permet de pouvoir étudier le rôle de ces protéines dans la mise en place la plasticité neuronale. La procédure sera réalisée sur des animaux d'environ 28 jours. La littérature indique qu'à cet âge la mise en place de la plasticité entraine des effets les plus marqués sur les neurones.

Génétiquement modifiées pour marquer de façon permanente leurs neurones activés, 80 souris de lignée FosTRAP vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever cerveau, nerfs et intestin. Elles subissent un jeûne, trois injections sous la peau, et pour la moitié d'entre elles une déplétion du microbiote par antibiotiques dans l'eau pendant quatre semaines. L'étude porte sur l'action de l'hormone GLP-1, utilisée contre l'obésité, et sur ses différences entre mâles et femelles. Le porteur retient ce modèle transgénique parce qu'il permet de comparer deux états successifs chez un même animal, ce qu'il présente comme une façon de réduire le nombre d'animaux.

Objectifs

Les comportements alimentaires ne sont pas uniquement dictés par les besoins énergétiques : ils sont aussi fortement influencés par le plaisir procuré par certains aliments riches en sucres ou en graisses. Cette recherche vise à mieux comprendre les mécanismes biologiques qui régulent cette « alimentation de plaisir », dont les dérèglements peuvent favoriser le surpoids, l’obésité et certains troubles du comportement alimentaire. Le projet s’intéresse à une hormone digestive appelée GLP-1, produite par l’intestin, qui joue un rôle clé dans la régulation de l’appétit et de la sensation de récompense liée à l’alimentation. Les analogues du GLP-1 sont aujourd’hui largement utilisés en médecine pour traiter l’obésité et le diabète. Cependant, leur efficacité varie fortement d’un individu à l’autre, et leurs effets à long terme sur le cerveau restent encore mal compris. Des travaux récents suggèrent que le microbiote intestinal – l’ensemble des micro-organismes vivant dans notre intestin – influence profondément la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment en modulant la signalisation du GLP-1. De plus, des différences importantes entre les sexes ont été observées, sans que leurs causes biologiques soient clairement identifiées. L’objectif principal de ce projet est donc de déterminer comment le microbiote intestinal influence l’action du GLP-1 sur les circuits cérébraux de la récompense alimentaire, et d’identifier les mécanismes responsables des différences observées entre mâles et femelles. À l’aide de modèles animaux, le projet cherchera à comprendre si des modifications du microbiote peuvent entraîner une perte de sensibilité du cerveau au GLP-1, favorisant ainsi une consommation excessive d’aliments très appétents, et si ces effets sont réversibles. À terme, ces travaux visent à améliorer la compréhension des interactions entre microbiote, hormones digestives et cerveau, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies nutritionnelles ou thérapeutiques plus personnalisées, tenant compte du sexe biologique, pour prévenir ou traiter les troubles du comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes d’action des analogues du GLP-1, largement utilisés chez l’humain dans le traitement de l’obésité. En identifiant le rôle du microbiote intestinal et les différences entre femelles et mâles dans la réponse cérébrale au GLP-1, il permettra de mieux interpréter les variations d’efficacité et les résistances observées en pratique clinique. Les connaissances générées contribueront à orienter le développement de stratégies thérapeutiques plus adaptées et potentiellement plus efficaces, tout en limitant l’exposition inutile à des traitements inefficaces.

Procédures

Les 80 animaux subiront un jeûne court de 5 à 6 heures avant la première session d’injections sous-cutanées. Chaque animal recevra trois injections sous-cutanées au total (deux lors de la première session, puis une injection finale). Quarante animaux recevront une déplétion du microbiote par administration d’un cocktail d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant une durée maximale de 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées réalisées dans ce protocole sont des actes de courte durée et faiblement invasif. Elles ne devraient pas entraîner d’inconfort significatif. Néanmoins, les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière des sites d’injection dans les jours suivant l’administration afin de détecter toute réaction locale éventuelle (rougeur, œdème, induration). La déplétion du microbiote intestinal par l’administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson est susceptible d’induire un inconfort digestif léger et transitoire. Les animaux seront suivis tout au long de la procédure pour évaluer leur état général, leur comportement, leur hydratation et leur consommation de boisson. En cas d’apparition de signes persistants de mal-être, des mesures adaptées seront mises en œuvre conformément aux procédures de l’établissement.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux sera mis à mort de manière réglementaire afin de permettre les analyses biologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Celui-ci vise à caractériser les effets de la modulation du microbiote intestinal sur la signalisation du GLP-1 et l’activation des circuits de l’axe intestin–nerf vague–cerveau chez la souris adulte. La mise à mort est indispensable pour permettre la collecte et l’analyse de plusieurs organes d’intérêt, incluant l’intestin, les ganglions sensoriels vagaux et le cerveau, en vue de réaliser des approches d’immunohistochimie, d’imagerie fluorescente et de quantification de marqueurs d’activation neuronale (td-Tomato, c-Fos). Ces analyses ne peuvent être réalisées chez l’animal vivant et ne sont pas compatibles avec une réutilisation ultérieure des animaux.

Remplacement

Ce projet repose sur une étude in vivo visant à analyser les interactions complexes de l’axe microbiote–intestin–cerveau. L’objectif est d’étudier des réponses physiopathologiques intégrées impliquant simultanément le tube digestif, le système nerveux périphérique, en particulier le nerf vague, et le cerveau. Ces interactions dynamiques ne peuvent être appréhendées que dans un organisme vivant, où les communications neuro-hormonales, immunitaires et métaboliques sont fonctionnelles et coordonnées. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire de manière pertinente et intégrée les mécanismes reliant l’intestin au cerveau, notamment dans le contexte de la modulation du GLP-1 et de l’activation de circuits cérébraux spécifiques. Les approches in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la complexité des boucles de rétrocontrôle, de la plasticité neuronale et des interactions systémiques nécessaires à la réalisation des objectifs du projet.

Réduction

Une attention particulière est portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la solidité scientifique des résultats attendus dans le cadre de ce projet visant la production de données robustes. Les effectifs sont déterminés à partir de l’expertise du laboratoire et de données préexistantes issues de projets comparables, intégrant la variabilité interindividuelle inhérente aux études in vivo. Les analyses statistiques prévues, reposant sur des tests adaptés à la distribution des données, permettent d’optimiser la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, un effectif limité de 10 souris par sexe et par groupe est retenu, garantissant un équilibre entre puissance statistique et réduction du nombre total d’animaux. Par ailleurs, les protocoles expérimentaux sont conçus afin de maximiser les informations obtenues à partir de chaque animal. Chaque souris fera l’objet d’analyses multiples et complémentaires, incluant des approches neuroanatomiques, physiologiques et moléculaires sur plusieurs tissus (cerveau, structures nerveuses périphériques et intestin). Cette stratégie intégrative permet de limiter le recours à des cohortes supplémentaires et s’inscrit pleinement dans le principe de réduction des 3R.

Raffinement

L’ensemble des procédures expérimentales est conçu afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, conformément aux exigences éthiques et réglementaires en vigueur. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et habilité, utilisant des techniques standardisées et maîtrisées. Dans le cadre de ce projet, les interventions se limitent principalement à des injections sous-cutanées, réalisées sur des sites distincts afin de réduire l’inconfort local, ainsi qu’à l’administration d’un cocktail d’antibiotiques via l’eau de boisson. Ces procédures sont associées à une nuisance de faible intensité et de durée limitée. Les animaux sont hébergés en groupes (au minimum deux par cage) et bénéficient d’un enrichissement de l’environnement incluant un tunnel opaque, permettant l’expression de comportements naturels et le maintien du bien-être tout au long de l’étude. Un suivi régulier de l’état de santé et du comportement des animaux est assuré pendant toute la durée du protocole, avec une attention particulière lors de la phase de traitement antibiotique prolongé. Pendant cette phase de déplétion du microbiote, les animaux seront maintenus en conditions sanitaires contrôlées de l’animalerie (pièce spécifique en « A2 like »), en cages ventilées, avec des pratiques d’hygiène adaptées (manipulation sous poste, équipements de protection, matériel dédié, évacuations des déchets suivants un circuit dédié), afin de limiter le risque de contamination opportuniste chez des animaux au microbiote perturbé. En cas de baisse de consommation d’eau, de perte de poids ou de signes digestifs persistants, des mesures de soutien seront mises en œuvre : nourriture humidifiée et accessible, gel d’hydratation si validé par l’établissement, surveillance rapprochée, adaptation voire arrêt du traitement antibiotique, et sollicitation d’un avis vétérinaire. L’évaluation repose sur des critères prédéfinis (poids, apparence générale, pelage, posture, activité, comportement et respiration). En cas d’apparition de signes évocateurs de douleur ou de mal-être, des mesures adaptées seront mises en œuvre, arrêt du traitement antibiotiques (si inconfort digestif) pouvant aller jusqu’à l’administration d’un traitement analgésique approprié ou un analgésique de type central serait administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, a la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Le projet repose sur l’utilisation de souris transgéniques FosTRAP sur fond génétique C57BL/6J, un modèle de référence en neurosciences, particulièrement adapté à l’étude de l’axe microbiote–intestin–cerveau. Ce modèle permet de marquer de façon permanente et spécifique les neurones activés en réponse à un stimulus périphérique, notamment nutritionnel, avec un contrôle temporel précis (utilisant la technologie CRE et gène rapporteur td Tomato). L’intérêt majeur du modèle FosTRAP réside dans la possibilité d’étudier, chez un même animal, l’activation neuronale induite par un même stimulus appliqué à deux temps distincts, correspondant à deux états physiologiques différents. Cette approche permet de comparer directement la réponse cérébrale à un analogue du GLP-1 avant et après modification du microbiote intestinal, tout en limitant la variabilité interindividuelle. Ce choix méthodologique renforce la robustesse des résultats et contribue au principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la pertinence biologique et la reproductibilité des données. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, entre 70 et 120 jours d’âge. Ce stade correspond à une période où les systèmes physiologiques et neurobiologiques, en particulier les circuits impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, de la récompense et de l’axe intestin–cerveau, sont pleinement matures et fonctionnels. Le recours à des souris jeunes adultes permet d’éviter les biais liés au développement encore incomplet observé chez les animaux plus jeunes, ainsi que ceux associés au vieillissement. Il garantit ainsi des conditions expérimentales stables, une variabilité interindividuelle réduite et une meilleure reproductibilité des résultats. Ce choix est particulièrement adapté aux objectifs du projet, qui vise à analyser les réponses neuronales et comportementales à des signaux périphériques, notamment nutritionnels et hormonaux, dans un contexte physiologique représentatif de l’âge adulte.

23 648 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour créer et entretenir des lignées destinées à l'étude des réponses immunitaires. Les souriceaux sont tatoués aux coussinets et subissent une biopsie de la queue vers 7 à 10 jours, certains une prise de sang sans analgésie dès quatre semaines. La grande majorité, environ 19 720, est transférée vers d'autres projets, tandis que les animaux au mauvais génotype et les anciens reproducteurs sont mis à mort. Le porteur justifie l'effectif par des stratégies d'accouplement conçues pour produire un nombre selon lui restreint mais suffisant.

Objectifs

Les objectifs du projet sont la création et le maintien des lignées permettant d'étudier les mécanismes des maladies chroniques inflammatoires, en particulier l’interaction entre les cellules immunitaires et les cellules résidentes des tissus cibles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est d'avoir les animaux nécessaires pour augmenter la connaissance scientifique sur les réponses immunes, et l’interaction des cellules du système immunitaire avec les cellules résidentes des tissus.

Procédures

Les souriceaux subiront une contention d'environ une minute pendant laquelle un ou deux coussinets des pattes seront tatoués. Une biopsie de queue sera prélevée en même temps que l'identification. Pour certaines souris, un prélèvement sanguin sera effectué à partir de l’âge de 4 semaines sans analgésie.

Impact sur les animaux

La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal. La piqure du coussinet lors du tatouage peut provoquer une légère douleur. Le prélèvement sanguin peut induire une légère douleur de manière transitoire.

Devenir

Les animaux d'intérêt seront utilisés dans des projets scientifiques ou pour renouveler les accouplements. Les animaux n'ayant pas le bon génotype et anciens reproducteurs seront mis à mort.

Remplacement

Les questions scientifiques posées sur l’initiation et la modulation des réponses immunes par l’environnement ne peuvent être étudiées que directement dans l'animal, car la complexité et la richesse des interactions entre les nombreux et divers types cellulaires en présence ne peuvent, à ce jour, être reproduites dans aucun modèle de remplacement.

Réduction

Les stratégies d’accouplement ont été élaborées selon nos expériences antérieures pour générer un nombre restreint mais suffisant d’animaux pour réaliser au mieux ces expériences.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) et en groupe social. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum puis sont surveillés pour vérifier qu’ils sont bien réacceptés par leur mère. Des points limites stricts et spécifiques ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de référence pour mener les études sur le système immunitaire, principalement en raison des nombreux modèles génétiquement modifiés qu’elle permet de générer et aux nombreux outils à disposition, tels que des anticorps pour les immunomarquages, par exemple. Les souriceaux sont identifiés entre 7 et 10 jours après la naissance, âge auquel on peut tatouer les coussinets des pattes et/ou biopsier (queue). Le prélèvement caudal permet un génotypage avant le sevrage. Le prélèvement de sang permet un phénotypage indiquant le génotype des souris. Pour l'une des lignées, un prélèvement s’effectue à partir de l’âge de 4 semaines via une prise de sang sans analgésie. Le geste sera effectué par le personnel de l’animalerie formé au bien-être animal. Un prélèvement unique de faible volume (< 50 microlitres) est suffisant pour effectuer le phénotypage indiquant le génotype de la souris.