Procédures modérées

Pour évaluer des thérapies cellulaires de type CAR-T contre des cancers du sang et des tumeurs solides humaines, 1 860 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une irradiation du corps entier la veille d'une injection de cellules tumorales humaines, puis la thérapie à tester, avec jusqu'à une prise de sang par semaine, pour certaines une imagerie hebdomadaire sous anesthésie, et parfois une ponction de moelle osseuse. Le porteur indique que la maladie peut provoquer une perte de poids, une baisse de mobilité, des signes de douleur et une gêne locomotrice quand la tumeur grossit sous la peau, et renvoie à des "critères d'arrêt prédéfinis" qu'il ne détaille pas. Toutes sont tuées à la fin pour prélever la rate, la moelle osseuse, les poumons et le côlon.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de nouvelles thérapies cellulaires dans des modèles de cancers humains développés chez la souris. Les animaux utilisés sont des souris immunodéprimées, qui permettent l'implantation et la croissance de cellules tumorales humaines sans rejet, offrant ainsi un modèle proche de certaines situations cliniques. Deux types de modèles seront étudiés. Le premier reproduira des cancers du sang grâce à l'injection de cellules tumorales humaines dans la circulation sanguine, conduisant à une dissémination de la maladie dans l'organisme. Le second reproduira des tumeurs solides par implantation de cellules tumorales sous la peau, permettant un suivi direct de leur croissance. Une fois la tumeur installée, les animaux recevront la thérapie cellulaire ou un traitement contrôle. L'évolution de la maladie et la réponse au traitement seront suivies grâce à des méthodes peu invasives, telles que l'imagerie, la mesure de la taille des tumeurs lorsqu'elles sont sous-cutanées, ainsi que des prélèvements sanguins. Les résultats de ce projet permettront de déterminer si ces nouvelles thérapies cellulaires sont capables de ralentir ou d'éliminer les cellules tumorales, d'évaluer leur durée d'action et leur persistance dans l'organisme. Ces données sont indispensables avant toute évaluation clinique chez les patients. À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l'ensemble des interactions entre les cellules tumorales, les cellules thérapeutiques et l'organisme. Les expérimentations animales restent donc nécessaires pour évaluer l'efficacité de ces traitements dans des conditions physiologiques. Le projet est conçu dans le respect du principe des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement) : le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, les protocoles ont été optimisés afin de réduire les contraintes expérimentales et le bien-être des animaux sera assuré par un suivi clinique régulier, des critères d'arrêt prédéfinis ainsi que l'utilisation d'anesthésies et d'analgésies chaque fois que nécessaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont principalement d'ordre scientifique et médical. Il permettra d'évaluer l'efficacité de nouvelles thérapies cellulaires de type CAR-T contre des cancers du sang et des tumeurs solides humaines dans des modèles précliniques pertinents. Les résultats obtenus contribueront à mieux comprendre leur activité antitumorale, leur cinétique d'action ainsi que leur persistance dans l'organisme. Ces données permettront d'identifier les candidats thérapeutiques les plus prometteurs et de sélectionner ceux susceptibles d'être développés pour des essais cliniques chez l'Homme. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers, en favorisant le développement de traitements plus efficaces, plus ciblés et potentiellement mieux tolérés que les approches thérapeutiques actuellement disponibles. Par ailleurs, les connaissances acquises sur les mécanismes d'action des thérapies cellulaires et sur les modèles précliniques de cancers pourront bénéficier à la communauté scientifique et orienter le développement de nouvelles stratégies d'immunothérapie.

Procédures

Les souris recevront une irradiation corporelle unique la veille de l'injection des cellules tumorales (une seule séance, durée inférieure à 5 minutes). L'induction de la maladie sera réalisée par une injection unique de cellules tumorales humaines (moins d’une minute par animal). Les thérapies cellulaires à évaluer seront ensuite administrées, une durée d'environ 1 minute par souris. Le suivi de l'apparition et de l'évolution de la maladie reposera sur des prélèvements sanguins. Chaque prélèvement durera moins d'une minute. En fonction de l'évolution clinique ou de la nécessité de suivre la charge tumorale, cette fréquence pourra être jusqu'à un prélèvement par semaine, en respectant un intervalle minimal d'une semaine entre deux prélèvements. Lorsque la maladie ne pourra pas être détectée dans le sang périphérique ou si des signes cliniques le justifient, un prélèvement de moelle osseuse pourra être réalisé sous anesthésie gazeuse associée à une analgésie préventive. Cette intervention durera environ 15 minutes et sera réalisée au maximum une fois. Pour les souris portant des cellules tumorales permettant un suivi par imagerie, une injection de produit de contraste sera effectuée (durée inférieure à 1 minute), suivie d'une anesthésie gazeuse permettant l'acquisition des images. L'examen d'imagerie durera moins de 5 minutes. Cette procédure pourra être réalisée au maximum une fois par semaine afin de suivre l'évolution de la maladie et la réponse au traitement.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet sont immunodéprimées et présentent donc une sensibilité accrue aux infections en cas d'exposition à un environnement non maîtrisé. Les souris provenant d'un élevage extérieur à notre établissement pourront également être soumis à un stress transitoire lié au transport et au changement de conditions d'hébergement, qui sera limité par une période d'acclimatation avant leur inclusion dans la procédure. L'injection de cellules tumorales humaines entraînera le développement de la maladie. Selon le modèle utilisé, cette évolution pourra provoquer une altération progressive de l'état général des souris, se traduisant notamment par une diminution de la mobilité, une réduction des interactions sociales, une perte de poids ou des signes d'inconfort et de douleur. Dans les modèles de tumeurs solides, la croissance de la tumeur pourra également entraîner une gêne locomotrice. Les injections de cellules tumorales, ainsi que l'administration des thérapies cellulaires, pourront occasionner une douleur légère et transitoire au point d'injection, parfois accompagnée d'un faible saignement. Les manipulations répétées, notamment les pesées et les examens cliniques, pourront être à l'origine d'un stress modéré mais de courte durée. Les prélèvements sanguins pourront provoquer une douleur légère à modérée et, occasionnellement, un hématome localisé. Les prélèvements de moelle osseuse pourront également entraîner une douleur et un inconfort transitoires, ainsi qu'un hématome susceptible de provoquer une gêne locomotrice temporaire, n'excédant pas quelques heures. Enfin, l'injection du produit de contraste pour l’imagerie pourra être responsable d'une douleur ou d'un inconfort de courte durée au site d'injection.

Devenir

Tous les animaux inclus dans cette procédure seront mis à mort à l’issue de celle-ci afin de permettre le prélèvement des organes nécessaires à la réalisation des analyses prévues dans le protocole, notamment la rate, la moelle osseuse, les poumons, colon. Ces prélèvements nécessitent l’accès aux organes après la mise à mort de l’animal et ne peuvent donc être réalisés de manière appropriée sur un animal vivant dans le cadre de cette étude.

Remplacement

À ce stade du développement d’un médicament, le recours à un modèle animal est indispensable, car il n'existe actuellement aucune méthode alternative permettant de reproduire l'ensemble des interactions entre les cellules thérapeutiques (CAR-T), les cellules tumorales et l'organisme. Les modèles cellulaires réalisés en laboratoire ne permettent pas d'étudier des phénomènes essentiels tels que la circulation des cellules thérapeutiques dans l'organisme, leur répartition dans les tissus, leur persistance au cours du temps ou leur capacité à atteindre et éliminer les cellules tumorales dans un environnement biologique complexe. Afin de limiter le recours aux animaux, tous les candidats thérapeutiques sont d'abord évalués à l'aide de modèles in vitro. Ces essais permettent de mesurer leur capacité à reconnaître et détruire les cellules tumorales ainsi que leur fonctionnalité. Seules les thérapies, applicables à l’Homme, ayant démontré une efficacité suffisante lors de ces étapes préliminaires sans induire de toxicité trop importante pour l’organisme sont ensuite étudiées chez l'animal. Les candidats n'ayant pas montré d'activité satisfaisante in vitro sont écartés et ne font pas l'objet d'une évaluation in vivo, contribuant ainsi à réduire le nombre d'animaux utilisés.

Réduction

Le nombre de souris utilisé dans ce projet est calculé de manière à obtenir des résultats scientifiques fiables tout en limitant au maximum leur utilisation. Ce calcul repose sur des méthodes statistiques permettant de déterminer le plus petit nombre d'animaux nécessaire pour mettre en évidence un effet du traitement lorsqu'il existe réellement. Par ailleurs, lorsque cela est scientifiquement possible, les mêmes groupes témoins seront utilisés pour plusieurs expériences. Cette organisation permet de réduire davantage le nombre total d'animaux nécessaires, tout en garantissant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus. Lors de la répétition des expériences, si les effets voulus sont statistiquement différents, la répétition suivante ne sera pas effectuée.

Raffinement

Le suivi de la croissance des tumeurs sera réalisé en privilégiant des méthodes peu invasives, comme l'imagerie ou la mesure de la taille des tumeurs sous-cutanées. Ces techniques permettent de suivre l'évolution de la maladie chez un même animal au cours du temps, tout en limitant le recours à des prélèvements plus invasifs. Lorsque des prélèvements sanguins sont nécessaires, leur volume et leur fréquence respectent les recommandations en vigueur afin de préserver le bien-être des animaux. Tout au long de l'étude, les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique régulière à l'aide d'une grille d'évaluation permettant de détecter précocement tout signe de souffrance. Des critères d'arrêt prédéfinis seront appliqués afin d'éviter toute souffrance inutile, en concertation avec le vétérinaire et la Structure chargée du Bien-Être Animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les souris sont aujourd'hui le modèle animal de référence validé par la communauté scientifique et règlementaire pour étudier les cancers du sang et évaluer l'efficacité de nouveaux traitements comme les thérapies cellulaires. Elles permettent de reproduire de nombreux mécanismes observés chez l'Homme, ce qui fait de ce modèle un outil essentiel pour mieux comprendre le développement de la maladie et tester de nouvelles approches thérapeutiques avant leur évaluation clinique. Le projet utilise des souris génétiquement modifiées dépourvues de système immunitaire fonctionnel. Cette caractéristique est indispensable pour permettre l'implantation et le développement de cellules tumorales humaines ainsi que l'évaluation de thérapies cellulaires d'origine humaine, sans rejet immunitaire. Les souris seront inclues dans l'étude entre l'âge de 6 et 12 semaines. À cet âge, les souris sont considérées comme des jeunes adultes et présentent les meilleures conditions pour l'implantation et le développement de cellules.

Après l'administration de cellules ou de fragments de tissus destinés à leur provoquer une endométriose, 9 928 rongeurs, 4 964 souris et autant de rats, peuvent subir jusqu'à trois chirurgies, des administrations de composés jusqu'à deux fois par jour pendant seize semaines et jusqu'à vingt prises de sang. Tous sont tués à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent, jusqu'à deux fois par semaine, des séances d'imagerie sous anesthésie, des tests de douleur par stimuli mécaniques et des tests comportementaux de quatre heures au plus, que le résumé ne nomme pas. Les composés testés sont des "molécules clients", candidats médicaments contre l'endométriose apportés par les clients du laboratoire. Le porteur écrit n'en connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles", et déclare pourtant l'ensemble en souffrance modérée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester des molécules candidats médicaments dans des modèles d’endométriose permettant de suivre l’évolution des lésions endométriotiques et du système immunitaire, mais aussi d’évaluer la réponse nociceptive, la fibrose et la fertilité.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patientes atteintes d’endométriose.

Procédures

Les animaux auront des administrations de cellules ou de fragments de tissus inducteurs de la pathologie, des administrations d’hormones, de produits « contrastants » ou de composés à tester (administration pendant 16 semaines de façon biquotidienne maximum). Ces administrations pourront se faire sur animal vigile ou anesthésie et dureront environ 30 secondes. Les animaux pourront avoir des chirurgies (3 maximum de 30 minutes maximum avec au moins 1 semaine entre chaque chirurgie). Les animaux seront anesthésiés pour l’évaluation de certains paramètres par imagerie (maximum 2 fois par semaine pendant 16 semaines avec 72 heures minimum entre chaque expérimentation ; chaque mesure dure environ 30 minutes). Les animaux auront des tests de douleurs via des stimuli mécaniques, des tests comportementaux (maximum 2 par semaine pendant 16 semaines selon les tests évalués, durée de 4 heures maximum par test). Les animaux pourront être mis en accouplement. Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours et à la fin de l’expérimentation (maximum 20 prélèvements durant les 16 semaines, un prélèvement dure de 1 à 5 min selon si l’animal est vigile ou anesthésié).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles. Il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Une surveillance accrue des animaux après les premières administrations de produits clients sera réalisée. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, chirurgies, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une douleur (douleur de l’aiguille, douleur post-opératoire). Les modèles utilisés miment une endométriose, par conséquent les animaux vont avoir les mêmes symptômes que ceux observés chez l’Homme à savoir des douleurs abdominales principalement. Des tests de douleur seront réalisés provoquant par conséquent de la douleur, du stress et une gêne chez les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront collectés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’endométriose. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) avant l’induction de la pathologie. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Aucun test statistique ne sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre de 8 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Des analgésiques seront utilisés lors des chirurgies. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Un protocole de soin sera mis en place si besoin lors des observations quotidiennes des animaux selon leur état. Une phase d’habituation sera réalisée pour certains tests comportementaux. Quand cela est possible, les animaux anesthésiés pourront subir plusieurs tests afin de limiter le nombre d’anesthésie. Des pellets d’hormones seront placés dans l’animal pour éviter des traitements pendant 120 jours. Bien que l’animal subisse une chirurgie légère, cela est ensuite plus confortable pour lui et nécessite moins de contention.

Choix des espèces

Ces modèles sont bien décrits chez le rat et la souris dans la littérature. Nous utiliserons des animaux adultes afin d’avoir des animaux sexuellement matures (6-8 semaines). Cependant, des animaux immatures (3-4 semaines) pourront aussi être utilisés pour les animaux donneurs afin de stimuler l’endomètre hormonalement dans des conditions naïves mieux contrôlées (pas encore de cycle sexuel).

Pendant 21 jours, des souris subissent des stress imprévisibles le matin, l'après-midi et la nuit, cage inclinée, litière mouillée ou retirée, privation de nourriture pendant douze heures, cycle lumineux perturbé et, dans le second protocole, une heure de contention et deux heures d'exposition à une odeur de prédateur. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sous antibiotique dans l'eau de boisson, la moitié recevant par gavage une bactérie porteuse d'un gène de résistance, avant des tests en open field, en labyrinthe en croix surélevé et d'appétence au sucrose. Le porteur écrit que le non-respect du cycle lumineux "va induire un épuisement", puis classe ce premier protocole de stress en "léger". Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur intestin et leur cerveau, après une injection de pilocarpine qui provoque une hypersécrétion de salive.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un ensemble de micro-organismes (bactéries, virus) qui vivent dans nos intestins et qui jouent un rôle crucial pour notre santé. Son équilibre est influencé par des facteurs liés à notre corps, comme notre génétique, ainsi que par des éléments extérieurs, comme notre alimentation et les médicaments que nous prenons. Des recherches récentes montrent que le stress, qu'il soit temporaire ou prolongé, peut modifier la composition de ce microbiote. En période de stress, les bactéries de notre intestin peuvent être exposées à des substances qui changent leur croissance et leur comportement. De plus, le stress pourrait faciliter le transfert de gènes entre les bactéries, y compris les gènes qui rendent certaines bactéries résistantes aux antibiotiques. L’ensemble de ces observations suggère que le stress pourrait augmenter la fréquence des transferts de gènes dans l’intestin et participer à la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. Or, d’une part, le stress est un problème courant dans notre société, et, d’autre part, la résistance aux antibiotiques, en forte augmentation ces dernières années, devient une menace majeure pour la santé humaine. A l’heure actuelle, l’influence du stress sur la dissémination des gènes de résistances aux antibiotiques n’a jamais été évaluée dans un organisme vivant. Etant donné la complexité des interactions dans le microbiote intestinal entre les bactéries et les cellules humaines, il n’est pas possible d’explorer cette hypothèse en dehors d’un modèle animal. Ce projet a pour but d’étudier l’impact du stress sur la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal de souris. Nous comparerons les effets de deux modèles de stress imitant chez l’humain les contrariétés de la vie quotidienne, le premier étant léger (protocole 1) et le second modéré (protocole 2), en examinant si le sexe des animaux (mâles ou femelles) influence leur réponse au stress.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus ici permettront de mieux comprendre les effets du stress sur la propagation de gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal, en tenant compte de son intensité et des différences entre les sexes. Ces résultats seront innovants. Ils permettront de déterminer si le stress influence le microbiote intestinal, en particulier la transmission des gènes de résistance aux antibiotiques dans les intestins. Si on observe un effet du stress sur cette transmission, nous chercherons à identifier les mécanismes en jeu, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles voies pour lutter contre la propagation de la résistance aux antibiotiques. Ces avancées bénéficieront à la fois aux humains et aux animaux, car la résistance aux antibiotiques affecte les deux.

Procédures

Les protocoles entraînant un stress léger (protocole 1) ou modéré (protocole 2) consistent à appliquer des facteurs de stress de manière imprévisible. Le stress durera 21 jours, avec 1 heure le matin, 2 heures l’après-midi et une période de stress pendant la nuit. Les facteurs de stress sont légers à modérés (par exemple, incliner la cage, humidifier ou enlever la litière) et il y aura des périodes d’au moins 2 heures où l’animal ne subira aucun stress. Aucun prélèvement douloureux ne sera effectué sur les animaux vivants. À la fin du protocole, un échantillon de salive sera prélevé. Par ailleurs, l’ensemble des animaux recevra un antibiotique à raison de 0.5 mg/L dans son eau de boisson à partir de J-3 du début du stress et durant les 21 jours de la durée du stress. A J0 du stress, la moitié des animaux se verra administrer en une fois par gavage la bactérie donneuse du plasmide de résistance aux antibiotiques. Des tests comportementaux (Open Field, Labyrinthe en croix surélevé, test d’appétence au sucrose) seront réalisés en fin de protocole de stress. Une injection intrapéritonéale de pilocarpine sera réalisée à la fin du protocole, afin de permettre le prélèvement d’une quantité suffisante de salive.

Impact sur les animaux

L’inclinaison de la cage va perturber la souris ; la privation de nourriture (12h) va induire un besoin non comblé ; dans la première procédure, la réduction de l’espace va induire un stress situationnel, la cohabitation et l’inversion de cage vont générer un stress social ; la litière humide ainsi que le placement dans une cage sans litière vont déranger l’animal ; le non-respect du cycle lumineux va induire un épuisement. L’ensemble de ces différents stress légers justifie un classement de la première procédure de stress imprévisibles en léger. Dans la seconde procédure, trois stress d’intensité plus importante seront utilisés : contention (1h), stress d’exposition à une odeur de prédateur (2h) et litière fortement humidifiée (12h), justifiant un classement de la deuxième procédure de stress imprévisibles en modéré. Le gavage nécessaire à l’administration des bactéries peut induire un stress léger (moins de 1 minute). L’injection de la pilocarpine peut induire une courte douleur d'intensité identique à celle de l'introduction d'une aiguille (moins de 1 minute). La pilocarpine induit des effets non douloureux chez l’animal, à savoir une hypersécrétion salivaire, lacrymale et gastrique, ainsi qu’une bradycardie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements intestinaux (pour mettre en évidence les transferts de gènes entre bactéries) et des prélèvements cérébraux (pour mettre en évidence le niveau de stress).

Remplacement

Les recherches en laboratoire montrent que des molécules libérées dans l’intestin en cas de stress pourraient influencer le transfert de gènes entre certaines bactéries. Cependant, ces études ne prennent pas en compte la complexité du microbiote intestinal. Les protocoles de stress chronique léger et modéré utilisés ici sont plus proches de la réalité que les modèles en laboratoire. Ainsi, il n'est pas possible de remplacer les expérimentations animales par des méthodes alternatives dans ce cas. En effet, les effets du stress dépendent de nombreuses interactions et processus biologiques spécifiques à l’organisme, ce qui ne peut être étudié que par des modèles in vivo (sur des animaux vivants).

Réduction

Le nombre minimal d’animaux utilisés pour ce projet a été calculé en utilisant des tests statistiques. Ces tests ont montré que nous aurons besoin de 12 animaux par groupe testé pour pouvoir obtenir des résultats analysables, soit un total de 192 animaux pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les cages seront munies d’éléments permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera vérifié quotidiennement à la recherche de symptômes légers, modérés ou sévères référencés dans la grille de scoring interne à la structure. En cas de symptômes légers, les soigneurs et zootechniciens surveilleront particulièrement ces animaux. En cas de symptômes modérés, la structure bien-être animal sera sollicitée avec ou sans le vétérinaire référent. En cas de symptômes sévères, l’animal sera sorti du protocole.

Choix des espèces

Des études récentes ont validé les effets du protocole de stress léger que nous allons utiliser durant 3 semaines sur des souris. En effet, celui-ci entraîne une augmentation des marqueurs du stress dans le sang des animaux ainsi qu’un comportement anxieux tels qu’attendus dans notre étude. Notre étude portera sur des animaux mâles et femelles jeunes adultes.

Le premier bénéfice annoncé est la mise au point de tumeurs du sein chez la souris, que le porteur présente comme des "modèles fidèles de tumeurs mammaires", le laboratoire ayant déjà mis au point des tumeurs de l'endomètre. 260 souris femelles, dont des souris génétiquement modifiées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent une chirurgie de 5 à 15 minutes sous anesthésie gazeuse, puis la croissance de leurs tumeurs, issues de greffes de lignées tumorales de souris, est suivie six à sept fois, au pied à coulisse ou par imagerie sous anesthésie, ces tumeurs pouvant réduire leur mobilité et des métastases aux poumons pouvant gêner leur respiration. Pour écarter les méthodes sans animaux, le porteur invoque la "règle des 3R" et écrit que "le recours à ces modèles murins reste indispensables pour développer de nouvelles thérapies".

Objectifs

Comprendre le rôle de la rigidification de la matrice extra-cellulaire dans la progression tumorale mammaire et du cancer de l’endomètre. Comprendre le rôle de la rigidification de la matrice extra-cellulaire dans la progression métastatique des tumeurs mammaires et du cancer de l’endomètre.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer des modèles fidèles de tumeurs mammaires, en plus du modèle de tumeurs de l’endomètre déjà mis au point dans notre laboratoire. Les travaux préliminaires réalisés au sein de notre laboratoire ont mis en évidence le rôle central d'une protéine dans l’organisation et les propriétés mécaniques du milieu extracellulaire. Ces modèles permettront pour la première fois de comprendre le rôle de la modulation de l’ECM par notre protéine d'intérêt sur la croissance et la progression tumorale. Cette étude présente à la fois un intérêt fondamental et translationnel. D’une part, elle permettra de mieux caractériser l’implication de notre protéine dans le remodelage de la matrice ainsi que ses conséquences sur la progression tumorale, notamment en termes d’agressivité, d’invasion et de dissémination métastatique. D’autre part, l’évaluation des groupes traités avec un traitement innovant permettra d’étudier le potentiel thérapeutique de cette approche, en particulier son impact sur la survie, la progression tumorale et le développement des métastases.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de 5 minutes pour le projet sur les tumeurs mammaires et 10 à 15 minutes pour le projet sur les tumeurs de l'endomètre, sous anésthésie gazeuse. Des techniques non-invasives seront ensuite utilisées pour suivre la croissance tumorale tout au long de la procédure (6 à 7 fois, 10-20 minutes) : la mesure au pied à coulisse ne nécessite pas d'anesthésie tandis que l'imagerie nécessite une anesthésie. .

Impact sur les animaux

Il est possible que la mobilité des animaux soit réduite du fait de la localisation des tumeurs mammaires et endométriales. La présence de tumeurs secondaires aux poumons (métastases) peut générer des difficultés respiratoires chez l’animal. Enfin, les contentions des animaux lors de pesées, anesthésies sont générateurs de stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux qui auront subi des procédures chirurgicales (au maximum 260 animaux) seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever les organes nécessaires à l'analyse.

Remplacement

Une attention particulière sera accordée à la règle des 3R afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour valider l’observation clinique et analyser les effets de la présence de notre protéine d'intérêt dans les tumeurs. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture et de tests in vitro largement utilisés en parallèle. Au vu de l’importance de la rigidité du tissu dans les tumeurs mammaires et endométriales, le recours à ces modèles murins reste indispensables pour développer de nouvelles thérapies.

Réduction

Des approches statistiques basées sur des résultats précédents du laboratoire ont permis de calculer les effectifs nécessaires pour obtenir des résultats exploitables avec une bonne puissance statistique. Les études se feront de manière séquentielle et donc en fonction des premiers résultats, les expérimentateurs pourront réduire le nombre d'animaux nécessaires au total.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de manipulation des animaux et de chirurgie. Il est important de noter qu'en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront mis à mort dans le respect de la réglementation en fonction des signes de souffrance. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé, de manière non-invasive, soit par mesure directe, soit par échographie soit par imagerie de bioluminescence, sous anesthésie, une fois par semaine. Ces techniques d'imagerie non-invasive permettent de réduire les manipulations et le stress de l'animal, et surtout le nombre d'animaux utilisés. Pour le traitement de la douleur, un analgésique sera administré 30 min avant le début de la procédure chirurgicale afin de prévenir toute douleur opératoire. Pour le traitement des douleurs post-opératoires, l'administration sera répétée puis poursuivie si l'animal montre des signes de douleur.

Choix des espèces

La souris immunocompétente permettra d’analyser la contribution du système immunitaire dans les effets observés après greffes de lignées tumorales murines. Les animaux de 8 semaines seront utilisés, car ils présentent des glandes mammaires et des endomètres matures et fonctionnels. Seules les femelles seront utilisées du fait des organes cibles de cette étude et de l'importance de l'apport d'estrogène pour la prise tumorale. Des souris génétiquement modifiées sont nécesssaires pour évaluer le rôle du facteur de guidage axonal, qui sera alors exprimé par un sous-type de cellules de l'environnement de la tumeur, dans la progression tumorale.

256 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et chacune peut être suivie jusqu'à six mois, sous régime standard ou riche en graisses, avec une prise de sang au bout de la queue chaque semaine. S'y ajoutent cinq jours d'injections de tamoxifène pour supprimer une protéine dans leurs cellules graisseuses, deux tests par mois après quatre heures de jeûne, l'un par gavage, l'autre par injection d'insuline, chacun suivi de cinq mesures de glycémie, puis un jeûne de seize heures et des échographies du cœur sous anesthésie. Le porteur reconnaît que la répétition des contentions et des prélèvements peut causer un "stress cumulatif". Au bout de ce suivi, le bénéfice annoncé se limite à des connaissances qui "pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de recherche" sur les complications de l'obésité.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer plusieurs maladies, notamment le diabète de type 2, certaines maladies du foie et les maladies cardiovasculaires. Le tissu adipeux, qui assure principalement le stockage des graisses, joue un rôle important dans le développement de ces complications lorsqu’il ne fonctionne plus correctement. Le bon fonctionnement des cellules du tissu adipeux dépend notamment des échanges entre les différentes structures présentes à l’intérieur de ces cellules. Nos travaux récents ont identifié une protéine susceptible de jouer un rôle important dans leur organisation et dans la capacité des cellules adipeuses à s’adapter aux variations des apports nutritionnels. L’objectif de ce projet est de déterminer les conséquences de la suppression de cette protéine spécifiquement dans les cellules adipeuses chez la souris adulte. Nous étudierons son rôle dans le fonctionnement du tissu adipeux et dans la capacité de l’organisme à s’adapter à différentes situations nutritionnelles, notamment à un régime riche en graisses ou à une période de jeûne. Nous évaluerons également si la suppression de cette protéine modifie la prise de poids, le contrôle du sucre dans le sang, le stockage des graisses dans le foie ou encore le fonctionnement du cœur. Ce modèle permettra ainsi de mieux comprendre certains mécanismes par lesquels un dysfonctionnement du tissu adipeux peut favoriser l’apparition de complications associées à l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le tissu adipeux fonctionne et s’adapte aux variations des apports nutritionnels. Il vise en particulier à identifier les mécanismes qui permettent aux cellules adipeuses de stocker et d’utiliser correctement les graisses, et à déterminer comment leur altération peut contribuer au développement de maladies associées à l’obésité. Les résultats permettront également de mieux comprendre les liens entre le dysfonctionnement du tissu adipeux et certaines complications de l’obésité, notamment le diabète de type 2, l’accumulation de graisses dans le foie et les atteintes cardiovasculaires. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de recherche pour préserver le bon fonctionnement du tissu adipeux et prévenir ou limiter les complications métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Administration de tamoxifène par voie sous-cutanée pendant 5 jours consécutifs (1 injection par jour, durée inférieure à 2 minutes par injection). • Suivi du poids corporel tout au long de l'étude (mesure hebdomadaire, durée inférieure à 1 minute). • Mesure de la glycémie par prélèvement sanguin à l'extrémité de la queue (hebdomadaire, durée inférieure à 2 minutes). • Tests de tolérance au glucose réalisés une fois par mois après une mise à jeun de 4 heures. Chaque test comprend un gavage oral suivi de cinq mesures de glycémie réparties sur 120 minutes. • Tests de sensibilité à l'insuline réalisés une fois par mois, à une semaine d'intervalle des tests de tolérance au glucose, après une mise à jeun de 4 heures. Chaque test comprend une injection intrapéritonéale d'insuline suivie de cinq mesures de glycémie sur 120 minutes. • Étude de l'adaptation au jeûne consistant en une mise à jeun de 16 heures, avec mesures successives de la glycémie, des corps cétoniques et de la température corporelle. • Échocardiographie sous anesthésie générale à l'isoflurane pour le suivi de la fonction cardiaque (selon les groupes expérimentaux, durée approximative de 20 à 30 minutes par examen). • Hébergement sous régime riche en lipides ou sous régime standard pendant une durée maximale de 6 mois. • Pour un sous-groupe d'animaux, hébergement en thermoneutralité (environ 30 °C) pendant la durée de l'étude afin d'étudier l'impact de la réduction de la thermogenèse adaptative. • Mise à mort en fin de procédure, sous anesthésie générale suivie d'une méthode réglementaire permettant les prélèvements tissulaires.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en œuvre dans ce projet sont peu invasives et conçues de manière à limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les principaux effets indésirables attendus sont ceux liés aux injections de tamoxifène, au régime riche en lipides et aux périodes de jeûne, qui pourront entraîner un stress transitoire ou une légère perte de poids. La répétition des contentions, prélèvements sanguins et manipulations au cours du suivi peut également être à l’origine d’un stress cumulatif. Afin de limiter cette nuisance, les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté, avec des temps de contention réduits au strict nécessaire. Les animaux seront habitués progressivement aux manipulations et celles-ci seront, lorsque cela est possible, regroupées afin d’en limiter la fréquence. Une attention particulière sera portée à l’apparition de signes de stress ou de modifications comportementales au cours du suivi. Dans une démarche de raffinement, le protocole d'administration du tamoxifène a été modifié : les injections sont désormais réalisées par voie sous-cutanée, une technique moins invasive et mieux tolérée que la voie intrapéritonéale, permettant de réduire le stress et le risque de complications. Les prélèvements sanguins seront réalisés conformément aux recommandations en vigueur afin de limiter la douleur et les contraintes pour les animaux. Nous ne nous attendons pas à un phénotype dommageable lié à la délétion de la protéine d'intéret, celle-ci étant induite uniquement à l'âge adulte et spécifiquement dans les adipocytes. Les animaux feront néanmoins l'objet d'un suivi régulier comprenant l'évaluation de leur état général, de leur poids, de leur comportement, de leur mobilité et de leur consommation alimentaire afin de détecter précocement toute altération de leur bien-être. Les effets attendus sont essentiellement liés au développement progressif des altérations métaboliques induites par le régime riche en lipides au cours des six mois de suivi. Aucun effet aigu ou sévère directement imputable à la délétion dela protéine d'intéret n'est anticipé au regard des connaissances actuelles et de nos données préliminaires.

Devenir

À l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des tissus et organes nécessaires aux analyses prévues (histologie, biologie moléculaire, biochimie, lipidomique et autres analyses ex vivo). Ces prélèvements terminaux sont indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques du projet et ne peuvent être réalisés sur des animaux maintenus en vie. La réutilisation, le replacement ou l'adoption des animaux ne sont donc pas envisageables.

Remplacement

Le projet s'inscrit dans une démarche progressive visant à limiter le recours à l'expérimentation animale. En amont des études in vivo, nous avons développé des modèles cellulaires d'adipocytes invalidés pour la protéine d'intéret, qui nous ont permis de démontrer que cette protéine joue un rôle majeur dans l'organisation des contacts entre le réticulum endoplasmique, les mitochondries et les gouttelettes lipidiques. Ces modèles ont permis de valider notre hypothèse et d'établir un rationnel scientifique solide. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas d'étudier les conséquences physiologiques de cette altération sur le fonctionnement du tissu adipeux dans son environnement, ni sur le métabolisme énergétique de l'organisme dans son ensemble. Des paramètres tels que la communication entre organes, la flexibilité métabolique, l'adaptation au jeûne, l'homéostasie glucidique ou encore le développement des complications cardiométaboliques ne peuvent être étudiés qu'à l'aide d'un modèle animal. Les expériences proposées interviennent donc uniquement lorsque les approches alternatives ont atteint leurs limites et que le recours à l'animal est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au strict nécessaire afin d'obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant le principe de réduction. Les effectifs retenus reposent sur l'expérience acquise par notre équipe dans l'étude de modèles murins similaires ainsi que sur les variabilités observées lors de nos travaux précédents. Chaque animal fera l'objet d'un phénotypage complet et plusieurs organes seront prélevés après mise à mort afin de réaliser des analyses histologiques, biochimiques, moléculaires et de biologie cellulaire sur un même individu. Cette stratégie permet de maximiser les informations obtenues à partir de chaque animal et de limiter le nombre total d'animaux nécessaires. Les expérimentations seront réalisées de manière séquentielle. Les analyses à des temps intermédiaires (2 et 4 mois de régime) ne seront entreprises que si les résultats obtenus au point terminal justifient d'explorer plus finement la cinétique d'apparition des phénotypes. Les analyses statistiques seront adaptées à la nature des données générées.

Raffinement

L'ensemble des procédures a été conçu afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance, le stress et les contraintes imposés aux animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies comprenant une litière adaptée, des frisottis ainsi qu'un dispositif d'enrichissement (igloo ou tunnel en polycarbonate) favorisant l'expression de leurs comportements naturels. Dans une démarche de raffinement, notre protocole d'administration du tamoxifène a évolué. Les injections sont désormais réalisées par voie sous-cutanée, mieux tolérée que la voie intrapéritonéale précédemment utilisée, permettant de diminuer les contraintes et le risque de complications associées à cette procédure. Les injections sont réalisées à l'aide d'aiguilles micro-fines afin de limiter la douleur. Lorsque des gavages sont nécessaires, des sondes souples en polypropylène sont utilisées afin de réduire les risques de lésions et l'inconfort des animaux. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière, incluant le suivi du poids, de l'état général, du comportement, de la mobilité et de la prise alimentaire. Des points limites adaptés aux procédures expérimentales ont été définis afin de permettre une prise en charge rapide de tout animal présentant des signes de souffrance. La surveillance est assurée quotidiennement, y compris les week-ends, garantissant l'application rigoureuse de ces critères. Enfin, les procédures de raffinement sont régulièrement réévaluées en s'appuyant sur les recommandations de la littérature spécialisée et sur les ressources du NC3Rs (National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research), afin d'intégrer les meilleures pratiques disponibles en matière de bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence pour l'étude des maladies métaboliques et du tissu adipeux. Son métabolisme, l'organisation de son tissu adipeux et les mécanismes impliqués dans le développement de l'obésité, du diabète de type 2 et de leurs complications présentent de fortes similitudes avec ceux observés chez l'Homme. De nombreux modèles murins de surcharge nutritionnelle ont été largement validés et reproduisent les principales caractéristiques physiopathologiques des maladies cardiométaboliques humaines. L'utilisation de la souris présente également des avantages techniques majeurs. De nombreux outils génétiques permettant une invalidation tissulaire et temporelle spécifique des gènes sont disponibles. Le modèle de souris généré permet une délétion de la protéine d'intéret spécifiquement dans les adipocytes et uniquement chez l'animal adulte après administration de tamoxifène. Cette stratégie permet d'éviter les mécanismes de compensation susceptibles de survenir lors d'une invalidation constitutive au cours du développement et d'étudier plus fidèlement le rôle physiologique de cette protéine dans le maintien de l'homéostasie du tissu adipeux. D'un point de vue scientifique, ce modèle constitue la suite logique de nos travaux réalisés sur des adipocytes invalidés pour PTPIP51, qui ont démontré le rôle de cette protéine dans l'organisation des contacts entre le réticulum endoplasmique, les mitochondries et les gouttelettes lipidiques. L'étude chez la souris est désormais indispensable pour déterminer les conséquences de cette altération sur la physiologie du tissu adipeux, la flexibilité métabolique et les réponses intégrées de l'organisme. Enfin, le choix de cette espèce répond également à des considérations éthiques et réglementaires. La souris représente le plus petit mammifère permettant d'étudier de manière intégrée les interactions entre organes, tout en bénéficiant d'un grand nombre d'outils génétiques validés, ce qui limite le recours à des espèces de plus grande taille. Les animaux seront utilisés exclusivement au stade adulte. La délétion de la proté sera induite à l'âge adulte par administration de tamoxifène chez des souris âgées de 8 à 10 semaines car l'objectif du projet est d'en étudier le rôle dans le maintien de l'homéostasie du tissu adipeux mature et dans le développement des altérations métaboliques induites par un régime riche en lipides.

Chaque jour de leur gestation, des souris femelles sont placées dans une "machine à enfumer" et subissent des stress, un espace restreint le matin, une litière humide ou une cage inclinée le soir, et le week-end trente minutes de lumière toutes les trois heures. Leur descendance est exposée à la fumée de cigarette chaque jour jusqu'au 30e jour de vie, puis placée éveillée une heure dans un pléthysmographe, à plusieurs âges, pour mesurer sa respiration. Le porteur indique que ce stress quotidien pourrait "conduire à un cannibalisme maternel". Les 640 souris, 160 femelles gestantes et 480 souriceaux, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes mises à mort à la fin de la procédure, les analyses de la descendance s'échelonnant de 7 à 60 jours de vie.

Objectifs

L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. L'approche expérimentale qui fait l'objet de la présente demande vient compléter une approche épidémiologique réalisée sur une cohorte mère-enfant, avec pour objectif général d'identifier les mécanismes biologiques sous-tendant les interactions entre stress chronique et chimique. Le volet expérimental du projet va nous permettre de comprendre à quel(s) stade(s) du développement pulmonaire cette interaction exerce son effet, grâce aux analyses fonctionnelles et moléculaires qui seront réalisées sur les prélèvements pulmonaires notamment.

Bénéfices attendus

Ce projet explore la relation entre l'exposition aux polluants, en particulier le tabac, et la vulnérabilité induite par le stress sur la santé respiratoire. Il se concentre sur un problème majeur de santé publique qui a été peu exploré jusqu'à présent : comment l'exposition précoce à un événement stressant de la vie rend les individus plus susceptibles de développer des troubles respiratoires après une exposition à des polluants environnementaux tels que le tabac. L'identification de biomarqueurs enrichira la construction d'AOPs (adverse outcome pathways) et donc, au-delà de la science fondamentale, renforcera le panel d'outils de régulation dans ce domaine. Ces biomarqueurs seront aussi recherchés chez les patients, ce qui devrait conduire à terme à de fortes implications en santé publique grâce à l'approche pluri- et transdisciplinaire du projet dans son ensemble (volets épidémiologique et expérimental).

Procédures

Les femelles gestantes seront exposées à la fumée de cigarettes quotidiennement, selon une procédure non douloureuse (cage placée dans une machine à enfumer), et/ou à différents stress chroniques. Ainsi, un évènement de stress léger sera appliqué le matin (femelle placée dans un environnement restreint), ainsi que le soir (litière humide, cage inclinée). Les week-ends, seule une inversion du cycle de lumière (30 min de lumière toutes les 3 h) sera appliquée. La descendance sera exposée quotidiennement à la fumée de cigarette jusqu'au 30è jour de vie. Elle sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leur vie (Pléthysmographie).

Impact sur les animaux

D'après la littérature scientifique et des données expérimentales préalables, les souris femelles exposées aux polluants au cours de la gestation tolèrent bien une telle exposition, sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. L’exposition des femelles au stress chronique chaque jour pendant la gestation pourrait induire un stress pouvant conduire à un cannibalisme maternel. Dans le cadre de ce projet, une attention particulière sera portée à la croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels. La mesure de la fonction pulmonaire par pléthysmographie corps entier est non invasive, elle est réalisée sur animaux vigiles et libres de mouvement, elle n’induit pas d’effets indésirables. "MODIFICATION"

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux différents stress (chronique et/ou chimique).

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. De cette co-exposition résulte une complexité impossible à modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet est de 640 animaux (480 souriceaux de la descendance et 160 femelles gestantes). Ce nombre a été déterminé en fonction des données de la littérature et des données expérimentales préalables, permettant de réaliser des calculs statistiques rigoureux afin de définir l'effectif nécessaire pour obtenir un effet significatif tout en minimisant le surplus, conformément au principe des 3R. En fonction du calendrier des expériences et de la réussite des accouplements, le nombre d'animaux utilisés pourra être revu à la baisse. L'estimation de l'effectif a été validée par un calcul de puissance effectué avec le logiciel G*Power (v3.1.9.7). Pour une analyse de variance (ANOVA) à un facteur comparant les 4 groupes expérimentaux, avec une puissance statistique (1 - beta) de 0,80, un risque alpha de 0,05 et une taille d'effet moyenne à grande (f = 0,50), un effectif de n = 10 souriceaux par groupe et par point temporel est statistiquement requis. L’analyse des données sera réalisée à l’aide du logiciel GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). "MODIFICATION"

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées conformément aux règles éthiques visant à respecter le bien être animal, c’est-à-dire dans un environnement contrôlé (hébergement dans des enceintes autonomes d'animalerie). Ces conditions expérimentales offrent de plus l’avantage de minimiser l’impact de stress non contrôlés sur les paramètres mesurés. Plus spécifiquement, pour la réalisation du protocole de stress, les animaux seront stabulés dans des enceintes autonomes. Ces enceintes permettent d'éviter aux animaux d'être dérangés par le bruit extérieur (source de stress que nous ne pourrions contrôler dans un projet qui s'intéresse à l'effet d'événement stressant). D'après la littérature scientifique et des données expérimentales préalables portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser le stress (non souhaité), notamment en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hébergées en groupes sociaux, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. L'exposition à la fumée de cigarettes se fait en placant directement les cages dans un système automatisé d'exposition à la fumée de cigarette, ce qui permet de ne pas avoir à changer les animaux de cages. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite."MODIFICATION"

Choix des espèces

L'étude de la descendance sera étendue aux stades précoces J7, J10 et J14, en plus des stades déjà prévus (J21, J30, J60). Ces points temporels sont essentiels car ils correspondent à la phase critique de la septation alvéolaire secondaire (formation fine des alvéoles permettant les échanges gazeux). L'analyse à J7 et J10 permettra d'identifier les mécanismes de signalisation moléculaire et le stress oxydatif (déséquilibre chimique agressant les cellules) au moment précis où l'architecture pulmonaire se forme. Le stade J14 caractérisera la fin de cette fenêtre de vulnérabilité. Cette approche longitudinale permet d'évaluer l'impact de l'exposome (ensemble des expositions environnementales et de stress subies), expliquant ainsi le phénotype pathologique observé à l'âge adulte (J60). "MODIFICATION"

Une perte de poids allant jusqu'à environ 20 % est attendue dans les jours qui suivent l'infection par la grippe, selon la réponse au virus et le génotype de chaque souris. 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Génétiquement modifiées pour porter des mutations repérées chez des enfants atteints de lupus ou de syndromes auto-inflammatoires, elles subissent une prise de sang et une infection par le nez, toutes deux sous anesthésie, une seconde souche de virus n'étant employée que si la première ne montre pas d'effet. Le porteur affirme que le recours à la souris "s'impose" pour reproduire ces variants, et décrit la grippe comme "un modèle pertinent" parce que son contrôle dépend de la réponse aux interférons.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre l’impact de mutations génétiques sur le fonctionnement du système immunitaire. Dans ce cadre, le génome de patients pédiatriques (atteints de lupus ou de syndromes auto-inflammatoires) a été séquencé, et a permis d’identifier des variants rares dans deux gènes. Afin d’étudier les conséquences de ces mutations, des modèles cellulaires à partir de cellules de patient ont été développés. Des données obtenues in vitro au laboratoire ont montré que ces deux variants altèrent la réponse aux interférons, qui sont des molécules essentielles pour lutter contre les infections virales. Ainsi, des modèles murins portant ces mutations ont ensuite été générés afin d’évaluer leur impact à l’échelle de l’organisme. Ce projet s’inscrit dans une démarche translationnelle visant à relier des observations issues de patients à leurs conséquences fonctionnelles in vivo. L’objectif de ce projet est donc de déterminer si ces mutations altèrent la capacité de l’organisme à contrôler une infection grippale (le virus de la grippe constituent un modèle pertinent, car leur contrôle dépend fortement de la réponse aux interférons). Une première souche du virus de la grippe sera utilisée. Ensuite, une approche séquentielle sera mise en place : En l’absence d’effet observable avec la 1ere souche de virus, une seconde souche du virus sera étudiée. Cette stratégie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en explorant des contextes viraux distincts.

Bénéfices attendus

L’étude des mutations gèniques identifiés chez des enfants présentant des pathologies immunitaires, permettra de déterminer leur rôle fonctionnel dans un contexte infectieux in vivo. L’utilisation de modèles murins porteurs de variants humains constitue une approche directement translationnelle, permettant de relier des observations cliniques à des mécanismes biologiques. Sur le plan scientifique, les résultats attendus permettront : • de préciser le rôle de ces gênes dans la régulation de la réponse antivirale • de caractériser l’impact fonctionnel de ces genes dans la signalisation des interférons • d’identifier des altérations potentielles de la réponse à l’infection par le virus de la grippe. Sur le plan médical, ces données pourraient contribuer à mieux comprendre les bases génétiques de certaines susceptibilités aux infections virales ou de certaines dérégulations immunitaires observées chez les patients porteurs de variants génétiques. Les maladies auto-inflammatoires pédiatriques concernent globalement un nombre limité de patients, avec une prévalence estimée inférieure à 5 cas pour 100 000 enfants, ce qui souligne leur caractère rare mais cliniquement important. À plus long terme, ce travail pourrait aider à mieux stratifier certains patients en fonction de leur profil génétique et à orienter le choix thérapeutique.

Procédures

Un prélevement sanguin sur animaux anesthesié (30 secondes) / Une Intervention nasale sous anesthésie (2 min)

Impact sur les animaux

Infection nasale : ce geste sera réalisé sur animal anesthésié et peut induire un inconfort transitoire au réveil. - Perte de poids liée à l’infection : une diminution du poids corporel est attendue dans les jours suivant l’infection, pouvant aller jusqu’à environ 20% du poids initial selon la sévérité de la réponse virale et le génotype des animaux. Cette perte de poids est associée à une altération transitoire de l’état général et constitue un paramètre de suivi de la sévérité de l’infection. - Prélèvements sanguins : les prélèvements sanguins peuvent induire un stress transitoire et comportent un risque de douleur au moment de la ponction.

Devenir

Mise à mort pour prélevements d'organes

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est justifié par la nécessité d’étudier des mécanismes immunitaires complexes impliquant des interactions entre différents types cellulaires, des organes cibles et une réponse inflammatoire systémique. À ce jour, ces interactions ne peuvent pas être reproduites de manière complète par des modèles in vitro ou in silico et ne peut être étudiée qu’à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des expérimentations. Le nombre d’animaux par groupe a été défini sur la base de données issues de la littérature et d’expériences antérieures réalisées dans des modèles murins d’infection par Influenza. Une estimation de puissance statistique (power analysis) a été réalisée a priori, en considérant un risque α de 5 % et une puissance de 80 %, ainsi que la variabilité observée sur les paramètres principaux mesurées. Cette analyse indique qu’un effectif de 5 animaux par condition permet de détecter des différences biologiquement pertinentes pour les effets attendus dans ce modèle. Une approche séquentielle sera mise en place afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés. La première étape reposera sur l’utilisation d'une premier souche de virus. La 2eme souche ne sera utilisée que si aucun effet ou phénotype différentiel n’est observé avec la 1ere, permettant ainsi d’éviter une expérimentation systématique sur les deux modèles viraux. Les analyses sont également optimisées par la réalisation de nombreux prélèvements sur les mêmes animaux (virologie, immunologie, histologie), limitant ainsi le recours à des cohortes supplémentaires.

Raffinement

• Les infections seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress et l’inconfort liés à l’administration du virus. Les animaux seront maintenus sous surveillance jusqu’au réveil complet. • Un suivi quotidien sera mis en place après infection afin de détecter précocement toute altération de l’état général. Ce suivi comprendra notamment la mesure du poids corporel et l’observation de signes cliniques (activité, posture, aspect général et respiration). • Les prélèvements sanguins se feront sous analgésie et anesthésie générale gazeuse en limitant les volumes prélevés afin de réduire leur impact sur le bien-être animal.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans une démarche translationnelle, en lien avec le suivi de patients pédiatriques présentant des mutations génétiques. Le recours au modèle murin est indispensable pour étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacents dans un organisme entier, en particulier dans le contexte d’une infection virale impliquant des réponses immunitaires systémiques et dans plusieurs organes, ce qui ne peut être évalué directement chez l’Homme. Le choix du modèle murin s’impose en raison de la nécessité d’utiliser des animaux génétiquement modifiés permettant de reproduire les variants génetiques identifiés chez l’Homme. De plus, la souris est une espèce sensible aux virus de la grippe, ce qui en fait un modèle pertinent pour l’étude de l’infection grippale et de la réponse immunitaire associée. Les souris seront âgées de 7-12 semaines au démarrage de l'expérience, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

Tuées à l'issue pour qu'on prélève les muscles de leur patte, 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie deux à quatre injections dans le muscle releveur de la patte, puis plusieurs injections d'antidouleur, afin d'étudier comment une protéine agit sur la réparation du muscle blessé. Le porteur affirme qu'aucune méthode actuelle ne peut "se substituer à l'utilisation d'animaux" pour étudier cette régénération. Il mentionne aussi des "procédures de lésion musculaire" et assure que la méthode "provoque peu de douleur", sans décrire comment le muscle est blessé.

Objectifs

Les muscles squelettiques composent la moitié de la masse totale d'un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires mais également de vaisseaux sanguins, de nerfs et d'un tissu de soutien. Suite à une blessure, les différents types cellulaires qui composent le tissu coopèrent et interagissent pour reconstruire le muscle blessé. Parmi eux, les cellules souches musculaires s'activent et fusionnent ensemble pour former de nouvelles fibres musculaires. Le projet de recherche porte sur l'étude du rôle d'une protéine impliquée dans la fusion de ces cellules souches. Cette protéine est connue pour bloquer la fusion et donc la bonne réparation des muscles blessés. Nos résultats préliminaires sur cellules et sur un modèle animal ont montré que la présence de la protéine dans le muscle augmente le nombre de cellules souches, et semble agir sur leur biologie et leur devenir. Pour bien comprendre le mécanisme qui permet cette régulation, ce projet souhaite étudier l’effet de la protéine dès l’activation des cellules souches, à un moment plus précoce de la régénération. Egalement, et parce que cette protéine est impliquée dans des maladies chroniques fibrosantes, une approche de traitements chroniques des muscles avec cette protéine permettra d’observer l’effet à plus long terme sur la structure globale du muscle, et sa bonne réparation après blessure. A terme, ce projet de recherche permettra de comprendre les mécanismes précoces par lesquels la protéine contrôle les cellules souches du muscle, et comment la présence chronique de cette protéine affecte la bonne réparation des muscles blessés.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats du projet permettront de comprendre précisément comment la protéine d'intérêt contrôle les cellules souches musculaires, et quelles sont les conséquences de sa présence chroniques pendant la réparation d'un muscle squelettique blessé. En plus d'augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction de ces cellules lors de la régénération, les résultats de cette étude pourraient permettre la mise en évidence des mécanismes par lesquelles cette protéine participe à certaines maladies, et de concevoir de nouvelles stratégies pour lutter contre ses effets.

Procédures

Deux à quatre injections intramusculaires dans le muscle releveur de la patte seront réalisées. Elles durent moins de 5 secondes et seront faites sur animaux anesthésiés. Plusieurs injections d’analgésique (anti-douleur) seront ensuite réalisées pour empêcher les douleurs qui en résultent.

Impact sur les animaux

Les injections de la protéine d'intérêt n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal aux doses utilisées. L'utilisation d'anesthésique au cours des procédures de lésion musculaire et d'injection de la protéine garantit l'absence de stress chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu'elles ne montrent pas de signes de douleurs pendant les jours suivants.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les muscles de la patte seront prélevés pour étudier le devenir des cellules musculaires selon les protéines d’intérêt.

Remplacement

Le maximum de résultats a été obtenu sur des cellules pour remplacer l’utilisation d’animaux. Pour continuer le projet, aucune autre méthode alternative actuelle ne peut se substituer à l'utilisation d'animaux pour l'étude de la régénération du muscle via l'activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entre les tissus blessés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats ne peuvent pas être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de ce projet utilisant des modèles murins.

Réduction

L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlée à l'aide d'analyses statistiques adaptées. Nous avons optimisé notre expérience afin d’utiliser un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiques fiables, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. La méthode de lésion musculaire utilisée est déjà bien décrite au sein de la littérature et provoque peu de douleur chez l’animal.

Raffinement

Avant le début de la procédure, les animaux suivront une période d'acclimatation d'au moins une semaine. Les animaux seront également pesés tout au long de la procédure afin de vérifier qu'il n'y a pas de perte de poids anormale. Des anesthésiques et des médicaments anti- douleur seront utilisés afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés régulièrement. Si des changements dans l’attitude des animaux sont relevés pendant la procédure, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d'améliorer les conditions de vie de l'animal et d'éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l'humain, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l'analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 7 à 15 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.

Pour tester une immunothérapie contre le chondrosarcome, une tumeur osseuse rare, 171 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour récupérer et analyser les tumeurs. Âgés de quatre semaines, ils subissent une chirurgie d'implantation tumorale puis jusqu'à dix injections, intrapéritonéales ou intraveineuses, ces dernières sous anesthésie générale. Les rats chez qui la greffe ne prend pas sont tués comme les autres, leurs organes servant de tissus témoins. La tumeur entraîne une gêne pour se déplacer qui augmente avec son volume, et une ulcération de la peau, que le porteur dit rare, constitue selon lui un critère d'arrêt immédiat.

Objectifs

Le chondrosarcome est une tumeur osseuse rare pour laquelle les traitements disponibles sont très limités. Cette tumeur répond peu à la chimiothérapie et à la radiothérapie, et la chirurgie reste souvent la seule option. L’environnement immunitaire du chondrosarcome est fortement protumoral, notamment en raison d’une abondance de cellules immunitaires qui favorisent la progression tumorale. L’objectif de ce projet est d’évaluer un nouveau traitement capable de programmer les cellules immunitaires contre les cellules tumorales. Le projet vise à : 1. tester son efficacité antitumorale ; 2. analyser la dynamique de la réponse immunitaire induite

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait contribuer à : • proposer une nouvelle stratégie de thérapie immunitaire pour une tumeur aujourd’hui sans alternative thérapeutique efficace ; • fournir des données précliniques nécessaires pour la poursuite du développement du traitement.

Procédures

- Chirurgie d’implantation tumorale (unique) - Injections répétées (durée du geste inférieure à 1min ; intrapéritonéales et intraveineuse ; 10 maximum par animal) - Injections sous-cutanées d’analgésique - Anesthésie générale pour la chirurgie et pour toutes les injections intraveineuses (inférieure à 3minutes)

Impact sur les animaux

1. Suite à la chirurgie d’implantation tumorale • Douleur locale transitoire 2. Suite à la croissance tumorale • Augmentation progressive de la gêne locomotrice en fonction du volume tumoral • Ulcération cutanée (rare, mais fait l’objet d’un critère d’arrêt immédiat) 3. Liés aux injections répétées • Injection intrapéritonéale (IP) : douleur brève au moment de l’injection • Injection intraveineuse (IV) : petite ecchymose ou hématome 4. Effets indésirables potentiels liés au traitement testé : • Aucun effet toxique sévère n’a été rapporté dans les données préliminaires disponibles.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour la récupération et l’analyse de tumeurs. Ces analyses sont indispensables pour apprécier l’effet antitumoral des composés

Remplacement

Les modèles tumoraux chez le rat nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme complet (comprenant un système immunitaire, des interactions avec l’os, impossibles à reproduire sur cellules seules) ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique.

Réduction

Nous utilisons le strict minimum d'animaux nécessaire, calculé par des méthodes statistiques pour garantir des résultats fiables. De plus, les expérimentations prévues dans ce projet sont séquentielles. Si aucune différence significative de croissance tumorale n'est observée entre les groupes, la dernière procédure ne sera pas réalisée, réduisant le nombre total d'animaux impliqués.

Raffinement

• Anesthésie systématique pour tout geste invasif. • Analgésie renforcée et surveillance clinique rapprochée. • Conditions d’hébergement adaptées et manipulation douce. • Critères d’arrêt stricts pour éviter toute souffrance prolongée. • Les animaux n’ayant pas développé de tumeurs seront traités comme le reste des animaux, les organes seront également prélevés pour servir de tissus contrôles sains.

Choix des espèces

Le modèle de chondrosarcome de rat a été établi à partir de chondrosarcome rendu transplantable. Peu de modèles cellulaires sont disponibles et utilisables in vitro et c’est encore plus vrai pour le in vivo, Ce modèle est à notre connaissance le plus proche, pour cette tumeur, de la pathologie humaine (histologie, agressivité, environnement immunitaire). Ces modèles sont établis sur des rats n’ayant pas le même profil immunitaire; nous pensons que cette caractéristique permet de mieux refléter les profils immunitaires humains et les différences de réponses aux traitements qui peuvent également s’observer dans les cohortes humaines. Pour exemple, un rat ne répondant pas comme les autres nous permettra d’élucider de potentiels mécanismes d’échappement tumoral. Par ailleurs, ce modèle a toujours été réalisé sur cette souche de rat et nous connaissons donc mieux son évolution dans ces conditions. Le modèle est développé sur des rats âgés de 4 semaines au moment de la greffe tumorale et ils seront conservés jusqu’à l’âge de 10 semaines maximum. Les animaux ont cet âge car la prise de greffe tumorale est meilleure chez des animaux de 4 semaines que sur des animaux plus âgés.

Opérées jusqu'à trois fois sous anesthésie générale, pour l'implantation d'un dispositif qui enregistre l'activité de leur cerveau, des injections dans le cerveau ou la pose d'un dispositif d'administration prolongée, 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le laboratoire déclare 200 souris réutilisées, pour de la formation ou une autre étude, et la mise à mort des autres pour prélever leur cerveau et leurs tissus. Le projet doit aider "les laboratoires pharmaceutiques" à sélectionner de nouveaux médicaments en mesurant leurs effets sur le sommeil et l'éveil, avec jusqu'à deux administrations par jour pendant 28 jours au plus. Pendant les enregistrements, de 2 à 72 heures, chaque souris est hébergée seule, dans ce que le porteur appelle "un espace plus petit" à un endroit et des "compartiments spacieux" à un autre.

Objectifs

Les troubles du sommeil et certaines maladies du cerveau ou de la santé mentale sont nombreux et peuvent modifier la qualité du sommeil ou les moments d’éveil. Ces problèmes représentent un enjeu important de santé publique, notamment parce qu’ils touchent de plus en plus de personnes avec le vieillissement de la population. Ce projet vise à mieux comprendre les différents états entre l’éveil et le sommeil (par exemple être bien réveillé, somnolent, ou dans différentes phases du sommeil). Pour cela, des études sont réalisées sur des animaux en bonne santé ainsi que sur d’autres présentant des caractéristiques proches de certaines maladies humaines. L’objectif est aussi d’observer comment des médicaments influencent ces états, à court et à long terme. Pour mesurer ces effets, des enregistrements de l’activité du cerveau et des muscles sont réalisés chez les animaux. Ces données permettent d’identifier leurs états de vigilance (éveil ou sommeil) et d’analyser le fonctionnement du cerveau pendant ces périodes. Ces analyses offrent une meilleure compréhension du sommeil et de ses perturbations. Elles permettent également de détecter des effets secondaires de certains médicaments qui ne sont pas visibles à l’œil nu, comme une somnolence accrue ou une altération de la qualité du sommeil. Les entreprises pharmaceutiques peuvent utiliser ces résultats pour vérifier l’efficacité et la sécurité de leurs nouveaux médicaments. Il est aussi possible de comparer ces nouveaux traitements à d’autres déjà utilisés, afin d’évaluer leur intérêt. L’objectif global de ce travail est de fournir des données fiables, précises et utiles pour aider au développement de nouveaux traitements et améliorer la prise en charge des troubles du sommeil.

Bénéfices attendus

Ce projet a plusieurs objectifs. En étudiant les différents états entre l’éveil et le sommeil, ainsi que l’activité du cerveau associée, il permet d’évaluer l’impact de certains traitements sur la qualité du sommeil, les périodes d’éveil, et le fonctionnement du cerveau dans ces différents états. Aujourd’hui, les traitements contre l’insomnie ne sont pas toujours suffisamment efficaces. Il est donc important de développer de nouveaux médicaments. Ce projet a pour but d’aider les laboratoires pharmaceutiques à identifier, sélectionner et valider de nouvelles solutions afin de mieux répondre aux besoins des patients. Au-delà de l’insomnie, de nombreuses maladies comme la dépression, l’anxiété ou des maladies neurologiques comme Parkinson ou Alzheimer sont liées à des troubles du sommeil ou à des perturbations de l’éveil. Dans certains cas, les troubles du sommeil peuvent même apparaître avant la maladie et servir de signe précoce. Mieux les comprendre et les traiter pourrait donc aider à prévenir certaines pathologies ou à en réduire les symptômes. Il est donc essentiel de vérifier que les traitements développés n’aggravent pas ces troubles. Ce projet permet également de détecter d’éventuels effets secondaires des médicaments sur le sommeil et l’éveil, comme une somnolence excessive ou une mauvaise qualité de sommeil. Cela aide les entreprises à choisir les traitements les plus efficaces tout en limitant les effets indésirables. Enfin, la technologie utilisée permet d’analyser de manière précise et fiable le fonctionnement de modèles animaux. Elle aide à identifier des indicateurs mesurables liés à l’activité cérébrale ou aux états de vigilance. Ces indicateurs peuvent ensuite servir à évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

Procédures

Les animaux de ce projet pourront subir jusqu'à deux interventions chirurgicales, ainsi qu'une intervention supplémentaire pour la mise en place éventuelle d'un dispositif permettant l'administration prolongée de traitements. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale. Une intervention chirurgicale, d'une durée d'environ une heure, permettra la mise en place d'un dispositif d'enregistrement de l'activité cérébrale. Lors de cette même intervention, les animaux pourront également recevoir des injections au niveau du cerveau ainsi que la mise en place de dispositifs nécessaires à l'administration des traitements. Ces procédures complémentaires dureront quelques minutes. Les animaux pourront être soumis à des périodes d'enregistrement de l'activité cérébrale à plusieurs reprises au cours de l'étude. Pendant ces enregistrements, ils seront hébergés individuellement afin de garantir la qualité des données recueillies, tout en conservant leur liberté de mouvement. La durée et la fréquence des enregistrements seront adaptées aux objectifs scientifiques de chaque étude et ne dépasseront pas les limites définies dans le protocole. Les animaux pourront recevoir des traitements pharmacologiques. Dans le cadre des études aiguës, un maximum de deux administrations par jour pourra être réalisé, sans dépasser vingt administrations au total et avec un intervalle minimal de 48 heures entre deux administrations. Dans le cadre des études chroniques, un maximum de deux administrations par jour pourra être effectué pendant une période maximale de 28 jours. Certaines administrations pourront nécessiter une anesthésie générale et dureront quelques minutes. Des prélèvements sanguins, d'une durée de quelques minutes chacun, pourront être réalisés conformément au plan expérimental afin de répondre aux objectifs scientifiques de l'étude. Le nombre de prélèvements sera limité aux volumes et fréquences autorisés par la réglementation et adaptés au bien-être des animaux.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux peuvent subir jusqu’à trois opérations, chacune durant environ une heure (incluant le temps d’anesthésie). Ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale. Après l’opération, les animaux peuvent être temporairement moins actifs et présenter une légère déshydratation. Il peut arriver que certains animaux perdent leur dispositif d’enregistrement ou développent une infection à son point d’implantation. Dans de rares cas, une atteinte plus grave de la peau peut apparaître à l’endroit où un dispositif a été implanté. Les animaux peuvent participer à des sessions d’enregistrement, d’une durée allant de 2 à 72 heures. La fréquence des enregistrements dépendra de la durée de ceux-ci et sera adaptée en fonction du protocole établi. Pendant ces périodes, ils sont placés dans un espace plus petit, mais équipé de l’essentiel (litière, eau, nourriture et matériel pour faire un nid) afin de rester dans des conditions proches de leur environnement habituel. Ils peuvent se déplacer librement. L’administration de substances au cours de l’étude peut provoquer un stress ou une douleur légère au moment de l’injection. Bien que les produits testés aient déjà été évalués sur le plan de la sécurité, certains effets imprévus peuvent survenir, comme une baisse du tonus musculaire, une somnolence ou au contraire une agitation. Enfin, les prélèvements sanguins peuvent entraîner une douleur modérée liée à la piqûre. Un type de prélèvement spécifique, réalisé près de l’œil, peut dans de rares cas provoquer un hématome ou affecter la vision.

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans le but de faire des prélèvements et des analyses du cerveau et des tissus. Si les animaux ne sont pas mis à mort, ils pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d’administrations maximum n'a pas été atteint - le bien-être de l'animal le permet. Une procédure de réutilisation des animaux a été écrite et validée par le vétérinaire référent.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l'effet de certaines substances sur le sommeil et l'éveil. Le sommeil dépend de nombreuses interactions entre le cerveau et le reste de l'organisme. Aujourd'hui, ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits complètement en laboratoire sans utiliser un animal vivant. Il n'existe donc pas de méthode de remplacement adaptée à cet objectif. L'étude chez l'animal est nécessaire pour comprendre ces phénomènes et mesurer les effets des substances testées.

Réduction

Nous recueillerons plusieurs types d'informations à partir d'un même enregistrement, ce qui permet d'obtenir un maximum de connaissances à partir de chaque animal. Les mesures réalisées fourniront à la fois des informations sur les différents états d'éveil et de sommeil ainsi que sur l'activité du cerveau pendant ces états. Cette approche permet de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Afin de garantir la qualité des résultats, les souris seront habituées progressivement aux conditions expérimentales avant les enregistrements. Les expériences seront réalisées dans des conditions standardisées pour obtenir des données fiables et reproductibles. Les résultats déjà obtenus avec des substances de référence pourront également être réutilisés pour certaines comparaisons, ce qui évitera de répéter inutilement des expériences sur de nouveaux animaux. Pour l'évaluation des substances testées, chaque souris recevra successivement les différentes conditions expérimentales. Chaque animal servira ainsi de référence pour lui-même. Cette méthode permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires tout en conservant une bonne qualité d'analyse des résultats. Le nombre d'animaux a été calculé afin d'utiliser le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement fiables. Une première cohorte de 16 souris sera incluse dans le projet. Certaines pertes peuvent survenir au cours des procédures, par exemple lors de l'intervention chirurgicale ou lorsque les enregistrements obtenus ne sont pas exploitables. Ce risque, estimé à moins de 25 %, est pris en compte dans le calcul des effectifs afin de garantir qu'au moins 12 animaux puissent être inclus dans les analyses finales. Les données recueillies seront analysées à l'aide de méthodes statistiques adaptées afin de tirer le maximum d'informations de chaque expérience et d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Après leur arrivée, les souris bénéficieront d'une période d'adaptation à leur environnement avant toute intervention. Une opération sera ensuite réalisée sous conditions adaptées. Des médicaments contre la douleur seront administrés avant l'intervention puis renouvelés après celle-ci afin de prévenir toute douleur liée à la chirurgie. Les animaux feront l'objet d'une surveillance quotidienne, particulièrement durant la semaine qui suit l'opération, afin de détecter rapidement tout signe de douleur, d'infection ou de complication et d'apporter les soins nécessaires. Les dispositifs d'enregistrement ont été conçus de manière à permettre l'hébergement des souris en groupe après l'intervention, ce qui favorise leur bien-être. Les conditions d'hébergement sont également adaptées pour réduire le stress et permettre aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels. L'état de chaque animal sera évalué régulièrement à l'aide d'une grille d'observation basée sur des signes de douleur, de gêne ou de mal-être. Cette évaluation permet d'intervenir rapidement si nécessaire et de mettre en œuvre les mesures appropriées pour préserver le bien-être des animaux. Lors des enregistrements, les souris seront placées dans des compartiments spacieux contenant de la litière, de l'eau, de la nourriture et du matériel permettant la construction d'un nid, afin de recréer un environnement aussi familier que possible. Elles pourront se déplacer librement pendant toute la durée des enregistrements. Avant les expérimentations, elles seront progressivement habituées à ces conditions ainsi qu'aux manipulations réalisées par les expérimentateurs, afin de limiter le stress lié aux procédures. Le nombre d'administrations de substances sera limité au strict nécessaire. Lorsque plusieurs injections sont requises, les sites d'injection seront alternés afin de réduire l'inconfort local. Après chaque administration, les animaux seront observés attentivement afin de détecter rapidement tout effet indésirable et d'assurer une prise en charge adaptée si besoin.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle particulièrement adapté à l'étude du sommeil et de l'éveil. Son cerveau présente de nombreuses similitudes avec celui de l'être humain, notamment pour les réseaux nerveux qui contrôlent les états de veille et de sommeil. Les connaissances acquises chez la souris peuvent donc contribuer à une meilleure compréhension de ces mécanismes chez l'Homme et au développement de futurs traitements. Cette espèce présente également des avantages pratiques importants pour la recherche. Sa taille permet de réaliser avec précision les interventions nécessaires à la mise en place des dispositifs d'enregistrement de l'activité cérébrale. De plus, il est possible de travailler avec des animaux du même âge, de poids comparable et présentant des caractéristiques génétiques similaires, ce qui permet d'obtenir des résultats plus fiables et reproductibles. Certaines lignées de souris spécialement développées pour l'étude de maladies ou de mécanismes biologiques particuliers sont également disponibles lorsque cela est nécessaire. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées d'au moins 11 semaines. À cet âge, le cerveau a atteint un niveau de maturité suffisant pour permettre l'implantation des dispositifs d'enregistrement et l'étude des mécanismes du sommeil dans des conditions stables. Dans certains travaux portant sur les effets du vieillissement sur le sommeil et les états de vigilance, des souris plus âgées pourront également être utilisées.

Chacun des 9 cochons de ce projet, âgés de 18 mois, subit le même jour l'extraction de quatre prémolaires, au cours d'une chirurgie d'environ deux heures sous anesthésie générale, et sur l'ensemble de l'étude cinq anesthésies par injection dans le muscle et trois prises de sang. Dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, les quatre alvéoles servent à tester une nouvelle greffe osseuse déminéralisée destinée à la chirurgie dentaire, et le porteur annonce une douleur après l'opération, une gêne à la mastication et de possibles infections, œdèmes ou hématomes. Il justifie le choix du porc par la ressemblance de son os et de sa denture avec ceux des humains, et le qualifie de "modèle pertinent". Tous les cochons sont tués pour une analyse histologique des tissus autour des greffes, sans que le porteur précise combien de temps ils vivent entre l'opération et leur mise à mort.

Objectifs

La perte ou la résorption de tissu osseux constitue une problématique fréquente en chirurgie dentaire. Elle peut survenir à la suite d’une extraction dentaire, d’un traumatisme, d’une intervention chirurgicale. Lorsque la quantité ou la qualité d’os disponible est insuffisante, un matériau de comblement peut être nécessaire pour restaurer un volume osseux. En chirurgie dentaire, l’extraction d’une dent entraîne la formation d’une alvéole dont la cicatrisation s’accompagne d’un remodelage osseux pouvant conduire à une diminution du volume de l’os alvéolaire. Le comblement de cette alvéole peut alors être réalisé afin de préserver le volume osseux, notamment en vue d’une réhabilitation implantaire ultérieure. Différentes solutions de comblement osseux sont disponibles, comprenant : une autogreffe d'os, greffe osseuse provenant de la même espèce et substituts osseux synthétique. Ces matériaux se présente sous différentes formes physiques : sous forme de particules, de blocs ou de matériaux préformés. Malgré leur intérêt, ces différentes solutions présentent des limites liées à leur manipulation, à leur adaptation au site receveur voire leur maintien dans le défaut osseux (particulaires). Ces difficultés sont particulièrement importantes lorsque le défaut présente une géométrie complexe ou lorsqu’il est soumis à des contraintes mécaniques. En chirurgie dentaire, par exemple, les particules utilisées pour combler une alvéole peuvent être difficiles à maintenir en place. Le projet vise à développer une nouvelle greffe osseuse issue d’os ayant subi un traitement d'inactivation virale et de déminéralisation. Ce procédé permet d’obtenir une matrice conservant une architecture tridimensionnelle de l’os initial. Après réhydratation, le greffon devient malléable et découpable, permettant son adaptation aux dimensions et à la géométrie du défaut osseux. Sa structure poreuse lui confère une capacité d’absorption des fluides biologiques et lui permet de reprendre du volume après hydratation. De plus, la structure tridimensionnelle naturelle est susceptible de fournir un support physique à la colonisation cellulaire et à la formation osseuse. L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt de ce nouveau matériau pour le comblement de défauts osseux, notamment sa capacité à être facilement manipulé et adapté au site receveur, à se maintenir dans le défaut et à favoriser la reconstruction osseuse.

Bénéfices attendus

À court terme, le principal bénéfice attendu du projet est de déterminer si le nouveau biomatériau présente un comportement compatible avec son utilisation comme matériau de comblement osseux. Le projet permettra notamment de caractériser sa vitesse de résorption après implantation, d’évaluer la formation et le remodelage du tissu osseux au niveau du site traité et de documenter sa tolérance locale. Les résultats obtenus contribueront ainsi à définir les conditions de poursuite du développement préclinique et, le cas échéant, clinique du produit. À long terme, le projet pourrait conduire à la mise à disposition d’une nouvelle solution de comblement osseux en chirurgie dentaire, offrant aux chirurgiens une alternative présentant des propriétés de manipulation et d’adaptation au site opératoire particulièrement intéressantes. D’autres applications pourraient également être envisagées en chirurgie orthopédique et de la colonne vertébrale. En chirurgie orthopédique, un matériau malléable et adaptable pourrait notamment présenter un intérêt pour le comblement de défauts situés à proximité d’une articulation, où l’utilisation de matériaux particulaires peut présenter un risque de migration. En chirurgie de la colonne, sa capacité à être découpé et adapté à un espace donné pourrait notamment être exploitée pour remplacer un disque intervertébral abîmé et souder les os entre eux. Ces mêmes propriétés pourraient être recherchées en chirurgie osseuse vétérinaire, pour les mêmes indications. Le développement de ce produit répond ainsi à un besoin potentiel commun aux applications de chirurgie humaine et vétérinaire : disposer d’une allogreffe osseuse dont les propriétés physiques facilitent la manipulation, l’adaptation au défaut et le maintien au niveau du site receveur.

Procédures

Les animaux subiront, le même jour, quatre extractions dentaires sous anesthésie générale. La durée de la chirurgie est estimée à 2h par animal. Trois prises de sang seront réalisées durant l'étude sur animal anesthésié, le prélèvement durera moins d'une minute. Les animaux seront anesthésiés durant l'étude par injection d'anesthésique dans le muscle. Il y'aura 5 anesthésies au total. Les injections dureront 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections nécessaires pour les anesthésies provoqueront un stress chez les animaux. Les mise à jeun pour les anesthésies provoqueront un inconfort pour les animaux. Les animaux seront également manipulés régulièrement pour différents actes (pesées, observations cliniques.) susceptible d’induire un stress. Les procédures chirurgicales (création du défaut osseux) peuvent entraîner une douleur postopératoire transitoire liée à l’extraction des prémolaires. Les animaux pourront ressentir une gêne lors de la mastication des aliments. Des complications locales peuvent également survenir post chirurgie, notamment : une infection, une inflammation transitoire du site opératoire, un oedème, un hématome. La présence du biomatériau peut également provoquer une réaction inflammatoire locale.

Devenir

L'objectif de cette étude est d'évaluer la résorption du biomatériau et la qualité du remodelage osseuse obtenue. Cette évaluation repose notamment sur la caractérisation de la réponse tissulaire au niveau des implants. Cette dernière nécessite une analyse histologique, qui ne peut être réalisée qu'après prélèvement des tissus et implique donc l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Les objectifs de l’étude reposent sur l’analyse d’interactions complexes entre le biomatériau implanté et l’environnement biologique de l’organisme vivant. Les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reproduire de manière complète les conditions physiologiques rencontrées après implantation, notamment les interactions entre cellules, matrice extracellulaire, système immunitaire, vascularisation et processus de remodelage osseux.

Réduction

Le développement de ce produit s’appuie sur une expérience préclinique acquise au cours de précédents projets de développement de substituts et de greffons osseux. Dans le cadre de différents projets, plusieurs études in vivo ont été réalisées, sur différents modèles animaux. Ces travaux antérieurs concernaient toutefois d’autres matériaux et ne peuvent donc pas être considérés comme des données précliniques directement transposables au nouveau biomatériau déminéralisé. Ils ont néanmoins permis d’acquérir une expérience dans l’évaluation de matériaux de comblement osseux, dans le choix et la conduite de modèles animaux pertinents ainsi que dans l’analyse de la tolérance et du remodelage osseux. Des tests in vitro ont été réalisés pour valider 1-la non toxicité du biomatériau 2-sa colonisation par des cellules. Nous créerons un défaut osseux par prémolaire retirée. Ainsi, chaque animal sera utilisé pour tester 4 conditions expérimentales (sans impacter la fiabilité des résultats) de façon à utiliser le moins d'animaux possible.

Raffinement

Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, lors des interactions avec le personnel en charge des soins, ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Un examen clinique sera réalisé au minimum 1x/jour la première semaine puis 2x/semaine le mois suivant et enfin 1x/semaine. Les pesées auront lieu au minimum 1x/semaine. Un protocole analgésique et anesthésique adpaté à la chirugie est mis en place. Un suivi dentraire sera mis en place pour observer les réactions locales (Gingivite aspect des musqueuse). Un suvi de la consommation alimentaire sera mis en place. L’aliment sera rammollis les premiers jours post-opératoires. Si les animaux montrent de la douleur au-delà du procotole d’analgésie, les traitements seront prolongés autant que nécessaire. Des points limites ont été définis. La fréquence des suivis (dentaire, pesée, prise de sang) sera augmentée si nécessaire. En fonction de la clinique des animaux et si nécessaire, nous mettrons en place un suivi de la température des animaux.

Choix des espèces

Le porc constitue un modèle pertinent pour l’évaluation des implants dentaires en raison des similitudes de son tissu osseux avec celui de l’Homme. Son remodelage osseux, sa composition minérale et sa structure lamellaire sont comparables à ceux observés chez l’Homme. De plus, l’anatomie et la morphologie dento-alvéolaires porcines sont représentatives de celles de l’Homme. Ces caractéristiques en font un modèle adapté pour évaluer l’intégration et le remodelage osseux autour d’un implant dentaire. De plus, le choix d'animaux de taille adaptée permet la réalisation de plusieurs défauts sur un seul animal, ce qui permet d'obtenir des résultats exploitables sur un plus faible nombre d'animaux. Nous utiliserons des animaux de 18 mois afin de s’assurer que la dentition est suffisamment développée.