Procédures modérées

96 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à trois campagnes de tests à 6, 12 et 18 mois. Les animaux subissent des prises de sang, une suspension à un câble à 45 cm de hauteur, un test de force, un labyrinthe et une course forcée sur tapis avec chocs électriques légers. Le projet évalue un anticorps anti-GDF15 censé freiner le déclin fonctionnel du vieillissement. Les bénéfices annoncés pour la "vitalité" et la "qualité de vie" à un âge avancé restent hypothétiques, les souris étant mises à mort pour nécropsie.

Objectifs

Le vieillissement est un processus complexe et h?t?rog?ne, se manifestant par diff?rentes trajectoires de d?clin fonctionnel et m?tabolique. GDF15 est l?une des prot?ines les plus corr?l?es ? l??ge avec des niveaux qui augmentent progressivement tout au long de la vie. Elle a un effet protecteur ? court terme, mais son ?l?vation chronique est associ?e au d?clin li? ? l??ge. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d'?valuer de mani?re approfondie l'impact d'un traitement par anticorps anti-GDF15 sur ces trajectoires. L'?tude vise ? mettre en ?vidence comment ce traitement influence la pr?servation d'un ensemble de capacit?s intrins?ques (aptitudes physiques et cognitives non li?es ? un apprentissage ou un entrainement) et l'am?lioration des marqueurs cl?s du m?tabolisme comme le taux de cholest?rol et de glucose dans le sang, et la d?pense ?nerg?tique par exemple. En identifiant les effets pr?cis du traitement, ce projet contribuera ? une meilleure compr?hension des m?canismes physiologiques impliqu?s dans le vieillissement, ouvrant ainsi la voie ? de nouvelles strat?gies th?rapeutiques pour favoriser la vitalit? et la qualit? de vie ? un ?ge avanc?. Le projet pourra se d?rouler dans deux ?tablissements Utilisateurs si n?cessaire.

Bénéfices attendus

Gr?ce ? cette ?tude, nous serons en mesure de mieux comprendre le r?le de la GDF-15 dans les processus de vieillissement ainsi que son lien avec le d?clin fonctionnel, et d'envisager de nouvelles approches th?rapeutique pour favoriser la vitalit? et la qualit? de vie ? un ?ge avanc?.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis ? une s?rie d'?valuations comportementales, motrices, et m?taboliques, r?parties sur 3 semaines, le tout ? 3 reprises, soit ? l??ge de 6, 12 et 18 mois : - Les pr?l?vements de sang : faible volume et sous anesth?sie gazeuse pour la Biochimie du sang et l'h?matologie. - L?analyse de la composition corporelle : les animaux seront plac?s dans une cellule de contention, type tube, lui-m?me plac? dans une chambre RMN durant moins de 3 minutes au total. - Evaluation de la coordination motrice : Les animaux seront suspendus ? un c?ble m?tallique ? une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes et le temps de chute (sur une surface ?paisse et molle pour amortir le choc) sera mesur? ? trois reprises, chaque mesure ?tant espac?e d?une heure. - ?valuation de la m?moire spatiale ? court terme : Les animaux seront soumis ? un test d'exploration dans un labyrinthe, d'une dur?e d'environ 8 minutes par souris. - ?valuation de la force de pr?hension : La force motrice des membres sera mesur?e par trois prises espac?es d'une heure pour une dur?e totale d'environ 5 minutes par mesure. - ?valuation de l'activit? motrice et de l'anxi?t? : Les animaux seront observ?s pendant 10 minutes dans une ar?ne lumineuse. - ?valuation de l'endurance physique : Les animaux seront soumis ? un exercice forc? sur tapis roulant. La dur?e de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles. Des stimulations ?lectriques de faible intensit? encouragent le mouvement. - La mesure des ?changes gazeux : les animaux sont temporairement individualis?s (48h) pour permettre la mesure des gaz consomm?s et produits de chaque individu. Afin de limiter la fatigue et l'interf?rence entre les mesures, les tests seront r?partis sur 3 semaines (Pr?l?vements de sang et Analyse de la composition corporelle en semaine 1, tests comportementaux en semaine 2, mesure des ?changes gazeux en semaine 3). L?ensemble du projet jusqu?? ce stade sera r?alis? dans le premier Etablissement Utilisateur. En fin de proc?dure, les animaux seront mis ? je?n durant 2 heures, anesth?si?s pour un pr?l?vement de sang terminal puis mis ? mort pour n?cropsie dans le premier ou le second Etablissement Utilisateur.

Impact sur les animaux

Les tests exp?rimentaux utilis?s pour cette ?tude g?n?rent un faible niveau de stress : - Les pr?l?vements de sang g?n?rent un stress et une douleurs l?gers. Ces pr?l?vements n'auront lieu que tous les 6 mois, soit 3 fois au cours du protocole. - L?analyse de la composition corporelle implique le placement des animaux dans une cellule de confinement exig?e, ce qui g?n?re un stress l?ger et court (moins de 3 minutes au total). - La pr?hension de une ? cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement g?n?re un stress l?ger. - L'?valuation de la coordination motrice g?n?re un stress physique l?ger. Les animaux seront suspendus ? un c?ble m?tallique ? une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes. - L'?valuation de la m?moire spatiale ? court terme g?n?re un stress l?ger et court (environ 8 minutes) li? ? un environnement nouveau et non familier. - L'?valuation de la force de pr?hension gen?re un stress lors de la pr?hension mais ?galement un stress physique court lors de l?exp?rience (5 minutes par mesure). - L'?valuation de l'activit? motrice et de l'anxi?t? g?n?re un stress l?ger et court (10 minutes) car l?environnement est nouveau, lumineux et non s?curisant (absence d?enrichissement). - L'?valuation de l'endurance physique g?n?re un stress mod?r? et un inconfort physique dus ? l'exercice forc? (la dur?e de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles). Les stimulations ?lectriques sur la grille arri?re sont utilis?es uniquement pour inciter l'animal ? courir et sont calibr?es au niveau minimal efficace (choc aversif l?ger) pour motiver le mouvement par inconfort et non par douleur. - La mesure des ?changes gazeux g?n?re un stress mod?r? li? ? l?individualisation temporaire (48h) des animaux. Les fonds de cage de calorim?trie sont les m?mes que les fonds de cages d?h?bergement habituel, ils sont transparents et les animaux peuvent se voir d?une cage ? l?autre durant l?enregistrement. - Le transport ?ventuel en fin de protocole pour la mise ? mort dans le second Etablissement Utilisateur, entrainera un stress l?ger li? au mouvement des cages durant quelques minutes (300m ? parcourir).

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort en fin de proc?dure afin de proc?der ? des n?cropsies (analyses en biochimie et en expression g?nique sur diff?rents organes d'int?r?t).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons analyser comment un traitement anti-GDF15 influence l'?volution des capacit?s intrins?ques et des fonctions m?taboliques d'individus d'?ge avanc?. L'?valuation de ces processus exige l'utilisation d'organismes vivants (humains ou mod?les animaux), car les tests comportementaux essentiels ne peuvent ?tre reproduits par des approches in vitro ou ex vivo. Compte tenu de son esp?rance de vie plus courte et de ses processus physiologiques similaires ? ceux de l'Homme, la souris appara?t comme le mod?le de choix le plus pertinent pour cette ?tude.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? r?duit au maximum en se basant sur les donn?es de la litt?rature et ce nombre a ?t? corrig? par un calcul de puissance statistique. L'utilisation d'un analyseur de composition corporelle pour ?valuer les masses grasses et maigre constitue ?galement un ?l?ment de r?duction du nombre d'animaux utilis?, en ceci que 60 secondes dans une cellule de contention remplacent l'utilisation d'animaux suppl?mentaires : avant l'utilisation de cet automate, il ?tait n?cessaire de pr?voir un groupe d'animaux d?di? ? la composition corporelle, ?valu?e par pr?l?vement et pes?e des tissus lors d'une n?cropsie.

Raffinement

Les tests exp?rimentaux utilis?s pour cette ?tude g?n?rent peu de stress (pr?hension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectu?e avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le d?but des tests pour limiter le stress g?n?r? par l?exp?rimentateur. Les animaux seront ?galement acclimat?s ? la salle d?exp?rimentation pendant la phase d?habituation. Les pr?l?vements de sang seront r?alis?s sous anesth?sie gazeuse afin de limiter le stress et la douleur, ce geste sera effectu? par une personne ayant une longue ex?rience de ce geste technique. Des ?l?ments d?enrichissement seront mis en place dans la cage d?h?bergement afin d?assurer leur bien-?tre et r?duire le stress : animaux plac?s en groupe dans les cages, mise en place de tunnels en cartons, du papier pour faire un nid. A partir de l??ge de 12 mois, les souris seront plac?es dans des portoirs connect?s DVC (Cage Digitales Ventil?es) permettant d?identifier pr?coc?ment toute perte d?activit? et de prostration. Enfin, si la mise ? mort a lieu dans le second Etablissement Utilisateur, les animaux seront transport?s entre les deux ?tablissements suivant une proc?dure de transport d?clar?e lors de l?agr?ment du second Etablissement Utilisateur (cheminement et conditions de transport valid?s par signature d?une charte de transport). Les animaux sont transport?s dans leur cage d'origine et les cages seront prot?g?es du froid ou de la chaleur dans un container souple occultant et isotherme afin de minimiser le stress, pour un transport d'une dur?e de moins de 10 minutes. Le choix de la mise ? mort dans le premier Etablissement Utilisateur sera privil?gi? si l?organisation des laboratoires et des ?quipements au moment de la mise ? mort le permet.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons ? ?tudier l??volution des capacit?s intrins?ques (aptitudes physiques et cognitives non li?es ? un apprentissage ou un entrainement) d?un individu d??ge avanc? et ses fonctions m?taboliques en fonction d?un traitement anti-GDF15. Cela n?cessite de l??tudier sur des organismes vivants, humains ou mod?les animaux. La souris semble un choix plus appropri? pour cette ?tude gr?ce ? l?esp?rance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires ? l?Homme. Pour ?tudier les diff?rentes trajectoires de vieillissement, une ?valuation des capacit?s et des fonctions m?taboliques sera r?alis?e ? trois ?ges diff?rents : 6, 12 et 18 mois. L?objectif est d?identifier le r?le pr?coce de GDF-15 et de l?action du traitement test? ? long terme.

846 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal reçoit une greffe de moelle, une irradiation aux rayons X sur animal vigile, jusqu'à quarante injections de médicaments et des prélèvements de moelle osseuse. Certaines développent une leucémie induite, avec augmentation de la rate et perte de poids, avant le déclenchement de points limites biologiques. Le porteur juge le modèle murin "incontournable" et "indispensable" pour étudier une leucémie liée à la protéine p53, faute de prélèvements de patients en nombre suffisant.

Objectifs

Dans les cancers du sang, les mutations de p53 sont peu fr?quentes except? dans certaines cat?gories comme les leuc?mies aigu?s my?lo?des (LAM) secondaires aux n?oplasmes my?loprolif?ratifs (NMP). Les NMP sont des maladies chroniques caract?ris?es par une augmentation des cellules matures du sang (globules rouges, globules blancs, plaquettes). Ils peuvent se transformer en LAM, de tr?s mauvais pronostic avec, dans plus de la moiti? des cas, une implication de la voie p53. Les mutations de TP53 retrouv?es dans les cancers inactivent les fonctions de p53 (qui emp?che normalement la prolif?ration cellulaire en cas d?anomalie survenant dans la cellule), ce qui entra?ne une prolif?ration et une survie cellulaire non contr?l?es. Il a ?t? montr? que ces mutations pouvaient ?galement conf?rer de nouvelles fonctions ? p53 mut?e. Dans ce projet, nous souhaitons identifier les m?canismes reposant sur des anomalies de p53 responsables du d?veloppement de la leuc?mie. Nous avons d?j? d?velopp? des mod?les murins nous permettant d??tudier la maladie, et montr? que des diff?rences existaient entre les mod?les d?l?t?s ou mut?s pour p53. Objectif (1) : Continuer la caract?risation les mod?les murins. Nous ?tudions la coop?ration des alt?rations de p53 avec celles de g?nes retrouv?s mut?s. Nous ?tudierons quelles populations de cellules prog?nitrices (populations encore peu diff?renci?es qui vont donner naissance apr?s plusieurs divisions aux cellules matures) sont amplifi?es dans la moelle osseuse, lieu de fabrication des cellules sanguines. Nous d?terminerons ?galement si les mutations de p53 conf?rent un avantage s?lectif par rapport ? sa d?l?tion. Objectif (2) : Identification des m?canismes impliqu?s. Nous ?tudierons quels m?canismes sont impliqu?s, en particulier quelles diff?rences sont observ?es sur la prolif?ration cellulaire et la mort cellulaire en pr?sence des alt?rations de p53 dans la moelle osseuse. Nous d?terminerons comment les anomalies de p53 modifient l?expression de g?nes et l?ADN. Nous d?terminerons ?galement le niveau d?instabilit? g?n?tique dans nos mod?les. Objectif (3) : Effet de nouveaux traitements. Nous testerons l?effet de mol?cules pharmacologiques ciblant les voies identifi?es comme importantes dans le d?veloppement de la LAM, dans les mod?les d?velopp?s pour les objectifs 1 et 2 et dans des mod?les de greffes de cellules humaines de patients atteints de LAM post NMP dans des souris immunod?ficientes.

Bénéfices attendus

Notre ?tude permettra de mieux comprendre les ?tapes conduisant au d?veloppement de la maladie chez les patients. Si nous identifions un g?ne ou une voie importante, nous pourrons d?velopper de nouveaux traitements que nous testerons dans les mod?les pr?cliniques d?velopp?s dans le cadre de ce projet. A long terme, nous esp?rons ainsi proposer de nouvelles th?rapies dans ces leuc?mies de mauvais pronostic et am?liorer la survie des patients. Nos r?sultats pourraient aussi ?tre applicables ? d?autres types de cancers avec des mutations de p53, qui repr?sentent plus de la moiti? des cancers solides.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : greffe de cellules murines provenant de souris donneuses portant les g?nes d?int?r?t dans des souris receveuses : une injection, dur?e 1 minute, sous anesth?sie g?n?rale. Irradiation vigile (rayons X), dur?e maximale 15 minutes. Injections de m?dicaments, au maximum 40 sur 3 mois, sous anesth?sie locale, dur?e 30 secondes. Pr?l?vements de sang toutes les 2 semaines sous anesth?sie g?n?rale, n=12 maximum, dur?e 2 minutes. Pour certains animaux, pr?l?vement de moelle osseuse sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie, dur?e 1 minute, nombre maximal: 10.

Impact sur les animaux

Certains des mod?les murins d?veloppent une leuc?mie, ce qui peut conduire ? une spl?nom?galie et une perte de poids. Notre exp?rience pass?e nous a permis de mieux ma?triser le d?veloppement de la maladie chez les souris, en ?tablissant des points limites biologiques pr?coces, avant d?gradation de l??tat g?n?ral des souris, bas?s sur la d?tection de cellules leuc?miques dans le sang. Concernant l?administration de nouveaux traitements, nous ne connaissons pas toujours l??ventuelle toxicit? des mol?cules administr?es. Le traitement peut conduire ? une perte de poids et ? des effets ind?sirables encore inconnus mais nous nous r?aliserons des exp?riences pilotes afin de d?celer une ?ventuelle toxicit?.

Devenir

Les animaux seront euthanasi?s pour analyses et ?tudes sur organes et tissus post-mortem.

Remplacement

Les leuc?mies aig?es my?lo?des post n?oplasmes my?loprolif?ratifs sont des maladies complexes, et l'?tude de ces cancers repose sur la mise en ?uvre en conditions physiologiques d'interactions complexes entre diff?rentes cellules (dont des cellules immunitaires) et m?diateurs (cytokines, etc..). Etant donn? l?implication de la voie p53 dans les leuc?mie post n?oplasmes my?olprolif?ratifs (retrouv?e dans plus de la moiti? des cas), un mod?le in vivo porteur des alt?rations g?n?tiques retrouv?es dans ces maladies est incontournable. De plus, comme le nombre de pr?l?vements de patients est limit? du fait de la raret? de cette maladie, il est indispensable de d?velopper des mod?les murins. Ils nous permettront de valider et consolider les r?sultats obtenus chez l?Homme. Par ailleurs, le processus de leuc?mogen?se requiert l?environnement m?dullaire impossible ? reproduire in vitro. Enfin, la prolif?ration in vitro de cellules tumorales est limit?e et ne refl?te pas ce qui se passe in vivo chez l?homme. Notre mod?le pourra ?ventuellement par la suite servir ?galement de mod?le pr?clinique si nous identifions de nouvelles cibles th?rapeutiques.

Réduction

Afin de r?duire le nombre d?animaux nous r?alisons au maximum des transplantations primaires (c?est-?-dire que nous r?coltons les cellules de moelle osseuse d?une souris que nous greffons dans plusieurs souris receveuses (5)), pour limiter les couples en ?levage et le nombre de port?es (car les souris donneuses sont des souris en ?levage). Lorsque nous voulons ?tudier plusieurs g?notypes, nous ?tudions le maximum de groupes en m?me temps afin de n?avoir qu?un seul groupe contr?le. Si nous d?terminons que les mutants de TP53 se comportent de la m?me mani?re, nous focaliserons la suite de notre ?tude sur un seul des mutants. Dans le cas de tests de nouvelles drogues, nous r?aliserons au pr?alable des ?tudes pilotes pour identifier d??ventuelles toxicit?s. Le nombre n?cessaire d?animaux a ?t? estim? afin d?avoir un pouvoir statistique suffisant, en accord avec les ?tudes publi?es.

Raffinement

Les conditions d?h?bergement veilleront ? limiter le stress des animaux (enrichissement : sizzlenests, tunnels, domes). Dans les mod?les leuc?miques ou lors des traitements, la surveillance des animaux sera accrue : observation quotidienne et pes?e minimum 3 fois par semaine, prise de sang toutes les 1-2 semaines, et les points limites pr?coces seront strictement appliqu?s. Des variations de certains param?tres biologiques ? la prise de sang ont ?t? identifi?es comme fortement pr?dictives du d?veloppement d?une leuc?mie, avant que les souris ne pr?sentent de signes de souffrance. Toute intervention sera accompagn? d?anesth?sie locale ou g?n?rale, avec analg?sique en cas d?acte douloureux. En cas de nouveaux traitements, nous r?aliserons des exp?riences pilotes afin de d?celer une ?ventuelle toxicit?.

Choix des espèces

Les mod?les murins sont ad?quats pour notre ?tude, car ils nous permettent d?explorer les diff?rentes ?tapes de la leuc?mogen?se, dans un mod?le mammif?re qui refl?te en g?n?ral ce qui se passe chez l?homme. Par ailleurs, nous pourrons obtenir dans un temps assez court un nombre satisfaisant d?animaux pr?t ? ?tre exp?riment?. Les exp?rimentations seront men?es sur des dur?es d?un an maximum. Les souris porteuses de mutations de d'int?ret pr?sentent des mutations retrouv?es chez les patients atteints leuc?mie post cancer my?lo?de, et reproduiront donc le plus fid?lement possible les conditions de d?veloppement de la maladie. L?invalidation/expression de ces g?nes d?pendent de l?expression d?une enzyme que nous pouvons induire. Etant donn? que nous souhaitons mod?liser la maladie qui survient chez l?homme ? l??ge adulte, nous induirons les d?l?tions/ expressions de ces g?nes chez les souris autour de 2 mois et ?tudierons les souris ? partir de 5 semaines apr?s induction, soit ? partir de l??ge de 3 mois (?ge adulte).

Greffées avec des cellules leucémiques humaines puis suivies par imagerie, 1 290 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal reçoit des injections répétées, jusqu'à sept séances de chimiothérapie, des prises de sang mensuelles et des ponctions de moelle osseuse au genou. Le projet étudie la distribution de cellules d'une leucémie de mauvais pronostic et la résistance aux traitements. Le porteur retient des souris immunodéprimées, qui acceptent la greffe de cellules humaines sans rejet, et écarte le poisson zèbre jugé trop éloigné du système sanguin des mammifères.

Objectifs

Sur la base de donn?es cliniques obtenues au laboratoire ? partir de patients atteints d?un cancer du sang d?un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de d?terminer l?implication, dans le processus de d?veloppement et de la r?sistance aux traitements de cette leuc?mie, de deux prot?ines retrouv?es dans les cellules malades de ces patients. Pour cela, nous d?velopperons un mod?le de greffe chez la souris de cellules de patients, qui expriment une prot?ine qui ?met de la lumi?re, et o? la pr?sence de ces deux prot?ines sera ?ventuellement modifi?e. Nous pourrons ainsi suivre la distribution des cellules leuc?miques dans la souris greff?e gr?ce ? des m?thodes d?imagerie du petit animal. Ce mod?le, s?il mime cette h?mopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les m?canismes responsables de la r?sistance aux traitements de ce type de leuc?mie chez l?Homme. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour d?velopper des th?rapies adapt?es ? ce sous-type particulier de leuc?mie lymphoblastique qui ?chappe aux th?rapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s?int?gre dans un projet de recherche translationnelle, ? partir d?observations cliniques, qui ont permis de mettre en ?vidence l?expression massive de deux prot?ines pour un sous-groupe particulier de patients atteints de cancer du sang de mauvais pronostic. Une meilleure compr?hension des m?canismes de d?veloppement de la maladie et de sa r?sistance aux traitements permettra d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques. Des mod?les murins nous permettront d?une part, de contr?ler l?expression des deux prot?ines et d??tudier les cons?quences de leur expression sur la distribution des cellules canc?reuse dans la moelle osseuse. Une meilleure connaissance des processus de diss?mination des cellules leuc?miques est n?cessaire pour d?velopper de nouvelles strat?gies th?rapeutiques. Le projet d?crit ici est int?gr? dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autres, le criblage de mol?cules sur des lign?es cellulaires de patients de ce sous-groupe de leuc?mie pour identifier de nouveaux m?dicaments qui permettraient de cibler ces cellules leuc?miques particuli?res, et de gu?rir les patients.

Procédures

MODIFICATION : Les animaux seront soumis ? deux injections sur animal vigile. Pour les animaux trait?s par chimioth?rapie, 7 injections de produits de chimioth?rapies seront r?alis?es sur animal vigile au cours de la proc?dure par semaine (traitement sur 4 semaines). Pour suivre l??volution de l?h?mopathie attendue, 2 ? 12 prises de sang, ? raison d?une prise par mois ou au maximum deux pr?l?vements de moelle osseuse (r?alis?s sur animal anesth?si?, avec au minimum 2 mois entre les deux pr?l?vements), pourront ?tre r?alis?s sur la souris. Les souris seront anesth?si?es pour suivre la distribution des cellules qui ?mettent de la lumi?re dans un appareil d?di? apr?s une injection d'un produit de d?tection (3 injections / semaine). La dur?e des chaque geste ne d?passe pas 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite ? l?injection de cellules leuc?miques, les souris sont susceptibles de d?velopper une leuc?mie. La majorit? des effets d?l?t?res sera d?e ? l??mergence de cette maladie : l??tat de sant? des souris greff?es peut se d?grader rapidement, n?cessitant un suivi tr?s r?gulier. Les leuc?mies entrainent une forte perturbation de la formule sanguine : en cons?quence, elles perdent du poids et, dans les stades avanc?s, pr?sentent des signes de dyspn?e, d?an?mie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostr?es, avec un pelage non entretenu. L?imagerie de bioluminescence n?cessite l?injection de luciferine sur animal vigile et une anesth?sie des souris ce qui peut constituer une nuisance temporaire g?n?ralement bien support?e. La ponction de moelle osseuse ?tant r?alis?e au niveau du genou, la souris peut avoir des l?sions au niveau du cartilage qui peuvent provoquer des douleurs et perturber temporairement ses d?placements. Enfin, il existe toujours un risque d?infection ou d?inflammation au niveau des points de ponction ou d?injection.

Devenir

Les animaux seront mis ? mort ? la fin des proc?dures pour pr?l?vements et analyses ult?rieures sur les tissus pr?lev?s. Ils ne pourront donc pas servir pour d'autres exp?rimentations.

Remplacement

L?impact des modifications d?expression de CDX2 et/ou UBTF-ATXN7L3 sur la canc?rog?n?se et la distribution dans le corps de la souris des cellules leuc?miques avant et apr?s traitement chimioth?rapeutique sera ?tabli in vivo dans les mod?les murins de greffes. Ce mod?le permet le suivi de cellules leuc?miques dans leur environnement m?dullaire qui est un environnement complexe difficilement mod?lisable in vitro ou ex vivo, et dans un environnement extra-m?dullaire. Cette ?tude de la biodistribution des cellules leuc?miques n?cessite donc l?utilisation d?animaux vivants. Les ?tudes m?canistiques associ?es, non d?crites ici, seront r?alis?es ? partir de mod?les de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lign?es cellulaires en culture mais ne peuvent pas r?pondre aux questions abord?es par un mod?le murin in vivo dans lequel la distribution m?dullaire et extra-m?dullaire peut ?tre suivie et o? l?interaction avec les cellules de la niche est essentielle. L?utilisation d?un autre mod?le animal, par exemple le poisson z?bre, ne permettrait pas non plus de r?capituler la complexit? du syst?me h?matopo??tique des mammif?res.

Réduction

Les chiffres indiqu?s dans le dossier correspondent au nombre estim? maximal d?animaux utilis?s pour les exp?riences envisag?es. Le nombre d?animaux minimum et suffisant a ?t? d?termin? avec un outil math?matique ? 10 animaux par groupe au minimum pour obtenir des r?sultats robustes et fiables statistiquement. La possibilit? d?imager les animaux, d?analyser la num?ration sanguine des animaux par prise de sang et d?immunoph?notyper les cellules de moelle osseuse ponctionn?es au niveau du genou permet une ?tude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilis?s.

Raffinement

Les animaux seront h?berg?s en groupes dans des conditions sanitaires contr?l?es et permettant un bien-?tre optimal dans des portoirs ventil?s (igloo, tubes de cellulose pour la fabrication des nids, balan?oires, liti?re d?poussi?r?e). Ils seront acclimat?s au moins deux semaines apr?s leur arriv?e ? l?animalerie et avant le d?but de toute proc?dure. Les proc?dures ont ?t? ?tablies afin de r?duire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux exp?rimentations. Une anesth?sie sera pratiqu?e pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveill?s quotidiennement durant les proc?dures. En cas de signes d?infection, la plaie sera trait?e avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analg?sique. Des points limites pr?coces ont ?t? d?finis afin d?interrompre les proc?dures et limiter la souffrance animale et garantir le bien-?tre animal.

Choix des espèces

L'esp?ce utilis?e est la souris (Mus musculus) qui repr?sente l?esp?ce animal la plus propice pour ce type d??tude pour les raisons suivantes : ?nombreux protocoles bien ?tablis pour cette esp?ce ?possibilit? d'avoir acc?s ? des animaux g?n?tiquement modifi?s, notamment permettant les greffes de cellules humaines sans rejet (animaux immunod?prim?s) ?mod?les mimant tr?s bien les cancers h?matologiques et qui ont d?j? fait l?objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilis?s car les potentielles applications th?rapeutiques s'adresseront ? une population humaine adulte.

Espèce en danger critique d'extinction, l'Apron du Rhône fait ici l'objet d'une étude où 160 individus issus d'élevage vont être utilisés, tous mis à mort, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque poisson est marqué, soumis à une restriction alimentaire, à un test de tolérance à la chaleur poussé jusqu'à la perte d'équilibre et à des mesures d'effort de nage. Le porteur inscrit le projet dans un Plan National d'Action et annonce vouloir améliorer les connaissances utiles à la conservation. L'étude vise donc à protéger une espèce menacée en mettant à mort 160 de ses représentants élevés pour l'occasion, leurs organes prélevés pour analyse.

Objectifs

Ce projet vise ? identifier les m?canismes responsables du d?clin des populations d?Apron du Rh?ne, une esp?ce end?mique du bassin du Rh?ne aujourd?hui class?e en danger critique d?extinction et faisant l?objet d?un Plan National d?Action. De nombreuses ?tudes ont ?t? men?es afin de conna?tre les causes ?cologiques de ce d?clin mais tr?s peu se sont int?ress?es aux m?canismes physiologiques pouvant expliquer la difficult? de cette esp?ce ? maintenir des populations stables. Dans le contexte des changements climatiques et du r?chauffement des rivi?res, il avait ?t? sugg?r? que cette esp?ce pr?sentait une faible capacit? d?acclimatation aux hausses de la temp?rature environnementale. Cependant, lors d?une ?tude r?cente, une ?quipe a montr? que cette esp?ce tol?rait facilement une vague de chaleur. Comme l?augmentation de la temp?rature du milieu s?accompagne chez les poissons (dont la temp?rature corporelle d?pend de l?eau), d?une augmentation de la d?pense d??nergie, une autre hypoth?se attenante serait que l?Apron du Rh?ne ne pourrait tol?rer les variations de temp?rature qu?avec assez de nourriture pour faire face ? cette d?pense d??nergie. Afin de tester cette hypoth?se, des Aprons issus d?une reproduction artificielle seront soumis ? deux temp?ratures diff?rentes et/ou ? une diminution de la quantit? de nourriture pendant 4 semaines au minimum. Puis des mesures de tol?rance thermique, de performances de nage et des d?penses d??nergie de l?animal et fonctionnement ?nerg?tique de ses tissus seront r?alis?es pour d?crire, ? la fois sur l?animal et sur ses tissus, les cons?quences de ces deux contraintes isol?es ou combin?es sur le fonctionnement de cette esp?ce prot?g?e, afin d?am?liorer les connaissances visant ? sa conservation.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d?am?liorer les connaissances sur le fonctionnement et les besoins de l?Apron du Rh?ne, une esp?ce menac?e. Il permettra notamment de mieux comprendre comment les variations de temp?rature de l?eau et la disponibilit? de nourriture peuvent influencer la capacit? de ces poissons ? vivre, ? se d?placer et ? faire face ? des conditions difficiles. Ces r?sultats aideront ? mieux prendre en compte ces facteurs dans les actions de conservation.

Procédures

Les poissons seront soumis ? plusieurs interventions au cours du projet. Toutes les interventions ne concerneront pas n?cessairement chaque individu, car les essais seront organis?s par lots et par s?quences. ? Marquage individuel pour le suivi : 1 fois, dur?e d?environ 5 ? 10 minutes par poisson. ? Manipulations de routine (capture, transfert, pes?e et mesure) : plusieurs fois au cours du suivi (environ 3 ? 6 fois selon les s?quences), dur?e de quelques minutes par poisson ? chaque fois. ? Une restriction alimentaire pour certains groupes : alimentation r?duite ? 50% de la ration ?normale?, pendant la p?riode de conditionnement (jusqu?? ~8 semaines pour le groupe exp?rimental ? restriction alimentaire ?). ? Une mise ? jeun avant certaines mesures afin d??viter l?effet de la digestion sur le m?tabolisme : je?ne standardis? d?environ 24h, avec une dur?e totale strictement inf?rieure ? 48h, r?p?t? avant chaque test m?tabolique (au maximum 2 fois selon la s?quence exp?rimentale). ? Test de tol?rance ? la chaleur (exposition ? une augmentation progressive de la temp?rature jusqu?? un point limite) : au maximum 1 fois par poisson, dur?e totale d?environ 90 minutes. ? Mesures en dispositif de nage : au maximum 1 fois par poisson. Les poissons sont plac?s la veille (vers 16h-18h) dans un tunnel de nage pour une phase d?acclimatation d?environ 12h et le matin (8h-9h) l?enregistrement de performance de nage commence pour maximum 6 heures. ? Mesure de temp?rature pr?f?r?e dans un dispositif d?di? (pr?f?rence thermique) : au maximum 1 fois par poisson, dur?e d?environ 24 heures. ? Fin de proc?dure : euthanasie sur un sous-?chantillons de poissons en fin de protocole, suivie de pr?l?vements d?organes r?alis?s imm?diatement apr?s (quelques minutes) pour des analyses en laboratoire.

Impact sur les animaux

Les effets ind?sirables attendus sont principalement li?s au stress physiologique induit par : - Le changement d?environnement (transport entre les deux animaleries), - Les manipulations exp?rimentales (tunnels de nage, chambre de respirom?trie, ?chauffement thermique, restriction calorique). Ce stress peut favoriser des troubles immunitaires et l?apparition d?infections opportunistes, notamment chez des individus d?j? fragilis?s. Ce risque sera r?duit par des phases de r?cup?ration post-manipulation, une surveillance rigoureuse de l??tat des animaux et une stabulation adapt?e (eau filtr?e, oxyg?n?e, cachettes, densit? contr?l?e). Les autres effets ind?sirables incluent : - Le je?ne alimentaire impos? avant les mesures m?taboliques (~24h, strictement

Devenir

Les poissons seront mis ? mort ? la fin de la proc?dure selon la r?glementation en vigueur, afin de pouvoir pr?lever les organes et r?aliser les mesures de fonctionnement ?nerg?tique des cellules (capacit? des tissus ? produire de l??nergie).

Remplacement

A ce jour, seule l?exp?rimentation sur animaux permet de r?aliser une ?tude int?grative qui prend en compte l?ensemble de l?organisme et ses r?ponses physiologiques, surtout lorsqu?il s?agit d?animaux issus de la faune sauvage, ou non mod?les. Cela permet notamment de caract?riser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour ?tudier de fa?on compl?te, les r?ponses m?taboliques de l?animal face ? son environnement. Afin de ne pas impacter les populations naturelles (tr?s faibles dans le cas de l?Apron du Rh?ne), notre ?tude utilise des poissons uniquement issus d?un ?levage.

Réduction

Compte tenu de la variabilit? interindividuelle attendue (taille, masse, r?ponses physiologiques), le nombre d?animaux a ?t? r?duit au strict n?cessaire tout en garantissant la pertinence scientifique et statistique. Le marquage individuel permet un suivi longitudinal et l?utilisation de mod?les ? mesures r?p?t?es dans lesquels l?individu est l?unit? statistique et peut ?tre int?gr? comme effet al?atoire, ce qui optimise l?information obtenue par poisson et limite le besoin d?augmenter les effectifs. Le projet pr?voit jusqu?? 160 poissons. Le nombre d?animaux n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques est de 136 poissons (r?partis entre les groupes temp?rature ? alimentation). Une r?serve de 24 poissons (?15%) est pr?vue uniquement pour compenser d??ventuelles pertes li?es au transport, ? l?acclimatation ou au retrait pr?coce d?un individu pour raison de bien-?tre. Cette r?serve n?augmente pas le nombre d?animaux effectivement utilis?s si elle n?est pas mobilis?e. Le plan exp?rimental vise ? maximiser l?information recueillie par individu (mesures standardis?es et comparables) afin de limiter le recours ? des animaux suppl?mentaires. Dans notre cas, les effets attendus incluent non seulement l?impact d?une restriction calorique, mais aussi l?interaction crois?e temp?rature ? restriction calorique, pour laquelle les r?ponses peuvent se chevaucher entre groupes et g?n?rer des tailles d?effet plus modestes. Un effectif de 16 individus par groupe nous permet donc de conserver une puissance statistique suffisante pour d?tecter ces effets tout en restant dans un cadre de r?duction.

Raffinement

Le transport (du site d??levage ? l?animalerie) est r?alis? dans des contenants adapt?s (bacs de transport calorifug?s), avec eau bull?e en continu, contr?le de la temp?rature, densit? limit?e et dur?e r?duite (< 5 heures). ? l?arriv?e, les poissons sont plac?s en aquariums pr?par?s ? l?avance et font l?objet d?une surveillance rapproch?e (3 rondes journali?res minimum durant la premi?re semaine). Lors des protocoles in vivo, un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesures et changement de milieu ? tunnel, chambre ou nouvel aquarium) sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re, suivi par un temps d?acclimatation de 12h dans le tunnel de nage avant les protocoles de respirom?trie. Apr?s chaque exp?rience, les poissons seront replac?s dans leur aquarium de stabulation et toutes les pr?cautions seront prises pour leur ?viter toutes nuisances visuelles et sonores. Les Aprons seront maintenus dans des aquariums de 50L ou 90L en densit? adapt?e ? leur esp?ce, agr?ment?s de plantes artificielles, de gravier et de cachettes en tube PVC. Quel que soit leur groupe exp?rimental, les poissons seront nourris une fois par jour, avec des larves de chironome et lors du nourrissage, leur comportement sera particuli?rement observ?. Un poisson ne se nourrissant pas ou pr?sentant un comportement anormal sera imm?diatement isol? dans un bac de r?cup?ration o? il b?n?ficiera de conditions environnementales optimis?es (r?duction des stimuli, oxyg?nation renforc?e, diminution du stress par apport de sel, acc?s facilit? ? la nourriture). Une observation biquotidienne sera r?alis?e par le personnel animalier et les exp?rimentateurs afin de veiller au bien-?tre des animaux depuis leur arriv?e ? l?animalerie jusqu?? l?euthanasie. Enfin, les ?tats de sant? et de bien-?tre des animaux seront ainsi ?valu?s quotidiennement en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d??valuation afin de d?finir des points limites adapt?s et pr?coces pour mettre fin ? toute douleur incompatible avec les objectifs du projet dans les plus brefs d?lais : retrait du protocole si un poisson pr?sente durablement une respiration anormale, une perte d??quilibre, une incapacit? ? nager correctement, un refus de s?alimenter, ou des l?sions visibles. L?animal est alors plac? en bac de r?cup?ration ; en l?absence d?am?lioration rapide, une euthanasie est pratiqu?e selon les m?thodes r?glementaires.

Choix des espèces

Comprendre les causes du d?clin de l?Apron du Rh?ne n?cessite l?utilisation de ce poisson en tant que mod?le d??tude. Du fait de l?importance des actions de conservation engag?es pour la sauvegarde de cette esp?ce, il existe une litt?rature cons?quente concernant des approches ?cologiques mais les param?tres physiologiques que l?on souhaite caract?riser dans cette ?tude n?ont que tr?s peu ?t? abord?s. Afin de ne pas impacter les populations naturelles, les poissons utilis?s dans cette ?tude proviennent exclusivement d?un ?levage exp?rimental. Les Aprons seront des jeunes adultes (2ans) afin de (i) limiter la variabilit? li?e au d?veloppement rapide des juv?niles (croissance/ontog?nie), (ii) travailler sur des individus dont les fonctions physiologiques sont stabilis?es (morphologie, capacit?s de nage, tol?rance thermique), et (iii) ?viter des biais potentiels li?s ? la maturation/reproduction (changements hormonaux, allocation d??nergie aux gonades) qui peuvent modifier fortement le m?tabolisme et la r?ponse ? la temp?rature et ? l?alimentation.

Le crâne ouvert sous anesthésie pour environ six heures afin d'y implanter une chambre d'enregistrement, cinq macaques rhésus sont soumis à des enregistrements électrophysiologiques quotidiens, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal est installé chaque jour en chaise de contention, avec un contrôle de sa consommation d'eau, cinq jours par semaine pendant six à vingt-quatre mois. Le porteur met en avant que tous les animaux sont gardés vivants à l'issue. Après une chirurgie de désimplantation, les électrodes sont pourtant laissées dans le lobe temporal, trois macaques pouvant être réutilisés et deux replacés en élevage.

Objectifs

La voix humaine est l?un de nos signaux sociaux les plus puissants. En une fraction de seconde, nous reconnaissons qui parle, percevons son ?motion et devinons son intention. Cette aptitude remarquable n?est pas propre ? l??tre humain : les macaques, les ouistitis et d?autres primates extraient eux aussi des informations sur l?identit? et l??tat affectif ? partir des vocalisations, afin de s?orienter dans leurs environnements sociaux complexes. Les ?tudes de neuroimagerie ont mis en ?vidence des ? patchs vocaux? (? voice patches ?) chez l?humain?, et plus r?cemment chez le macaque et le ouistiti, sugg?rant l?existence d?une architecture neuronale conserv?e pour le d?codage des voix, fa?onn?e par des millions d?ann?es d??volution des primates. Cependant, nous ne disposons toujours pas d?un mod?le au niveau neuronal expliquant comment les voix sont repr?sent?es dans le cerveau. L?IRM fonctionnelle permet de localiser les r?gions du cerveau sensibles ? la voix, mais ces cartes ne permettent pas d?expliquer comment les populations de neurones encodent les voix. Ce projet vise ? combler ce foss? en passant des cartes corticales aux neurones individuels chez le macaque. Le projet cartographiera les neurones s?lectifs aux voix chez n=5 macaques ? l?aide d?enregistrements des neurones ? haute densit? guid?s par IRM fonctionnelle. Il mod?lisera comment les neurones respondent aux voix ? partir de descripteurs acoustiques et de r?seaux neuronaux profonds, afin de r?v?ler les strat?gies de repr?sentation vocale chez le macaque.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compr?hension unique de l?information vocale contenue dans l?activit? de populations de neurones individuels du cortex auditif secondaire. Ceci contribuera ? notre connaissance des m?canismes neuronaux de la communication, avec un impact potentiel sur le d?veloppement des nouvelles g?n?rations d?implants corticaux pour restaurer/augmenter l?audition.

Procédures

Chaque animal sera soumis aux interventions suivantes : - D?placement au centre IRM pour acquisition d'images IRM, sous anesth?sie pour une dur?e totale d'environ 3h ; - Chirurgie d'implantation de chambre d'enregistrement, sous anesth?sie, pour une dur?e d'environ 6h ; - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements ?lectrophysiologiques, environ 2h, 5 jours par semaine, ainsi que le contr?le hydrique . Un maximum de 5 sessions d?imagerie par animal sera effectu? pour la localisation des aires sensibles ? la voix (limit?es ? 1 ou 2 en cas de r?sultats concluants). L?entrainement ? la t?che et l?enregistrement pendant la t?che seront effectu?s 5j/semaine pendant la dur?e de l'exp?rience, qui n'est pas d?finissable a priori. Une estimation vraisemblable serait entre 6 et 24 mois (entrainement 3- 6 mois / enregistrement 3-18 mois) selon l'avancement de l'entra?nement des animaux et la qualit? des enregistrements. Dans le cas d'un protocole d'enregistrement plus long, une prolongation serait demand?e ? la SBEA.

Impact sur les animaux

Stress li? ? la capture en cage de contention: Douleur li?e ? la piq?re pour les anesth?sies; Risques li?s ? l'anesth?sie pour l?IRMf et la chirurgie d?implantation; Irritation de la trach?e li?e ? l?intubation pour l?anesth?sie gazeuse; Douleur post-op?ratoire pour l'implantation; Possibles infections au niveau des implants.

Devenir

Tous les animaux sont gard?s en vie ? l'issue de la proc?dure. Une fois les enregistrements termin?s, les animaux subissent une chirurgie de d?-implantation du connecteur (les ?lectrodes subdurales sont laiss?es en place pour ?viter une nouvelle craniotomie). Apr?s cicatrisation et r?cup?ration, ils peuvent soit ?tre r?utilis?s dans es projets pour lesquels la pr?sence d??lectrodes dans le lobe temporal n?est pas g?nante (potentiellement 3/5), ou replac?s dans des groupes reproducteurs dans des ?levages (potentiellement n=2).

Remplacement

Le but du projet est de comprendre comment les neurones dans les aires s?lectives ? la voix du cortex auditif traitent l?information vocale. Les enregistrement de neurones isol?s dans les aires de la voix sont inexistants chez l?humain, il est donc n?cessaire d?avoir recours ? des animaux pour cette recherche.

Réduction

R?duction du nombre d?animaux au minimum (n=5) pour obtenir des r?sultats chez au moins deux (voire trois singes) sur chacune des exp?riences pr?vues sur 5 ans, ?tant donn?e la complexit? de la chirurgie qui implique un certain risque, et la possibilit? que des matrices cessent de donner du signal exploitable apr?s quelques mois. Si nous obtenons suffisamment de donn?es neurophysiologiques pour une analyse statistique satisfaisante chez trois animaux, nous n'en utiliserons pas d?autres. Pour chaque animal, l?enregistrement avec plusieurs micro?lectrodes multi-contacts permettra de mesurer l?activit? de populations neuronales dans plusieurs structures corticales et sous-corticales. La richesse des enregistrements multi-?lectrodes offre la possibilit? de r?aliser de tr?s nombreux types d?analyses portant sur les potentiels d?actions de neurones isol?s (modulation de fr?quence de d?charges ou de synchronisation entre neurones dans diff?rentes p?riodes de la t?che ou dans diff?rentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l?activit?, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d?actions. La r?p?tition des s?ances d?enregistrement sur plusieurs mois a pour objectif d?augmenter le nombre de neurones diff?rents enregistr?s dans chaque structure. Cette augmentation permet d?augmenter la puissance statistique de nos analyses La dur?e totale des enregistrements pour un animal est ?troitement d?pendante de la quantit? de neurones enregistr?s quotidiennement. De fait, elle ne peut ?tre d?finie ? priori.

Raffinement

Les animaux sont h?berg?s en paires dans des cages et voli?re enrichis de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires et aussi le retour ? une activit? normale en p?riode post-chirurgicale. Apr?s un d?lai minimal d'une semaine et selon l'?tat de r?cup?ration apr?s l?implantation, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est famili?re. Les m?thodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilis?es afin de r?duire le stress des sujets. L'IRM anatomique et fonctionnelle seront r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale afin de s'assurer de l'inconscience de l'animal, r?duisant de fait le stress de l'animal lors de la r?alisation de la proc?dure. Lors d'interventions chirurgicales, en plus de l'anesth?sie, un analg?sique sera administr? et prolong? en p?riode post-op?ratoire. Des points limites pr?coces et adapt?s seront appliqu?s.

Choix des espèces

Les raisons justifiant le choix des macaques comme esp?ce de comparaison sont les suivantes : - Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylog?n?tique de sorte que les r?sultats nous renseigneront sur l'histoire de l'?volution relativement r?cente ; - Ils utilisent des vocalisations complexes et vari?es, bien caract?ris?es acoustiquement; - Il s'agit d?un mod?le neuroscientifique largement ?tudi?, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les r?sultats obtenus seront interpr?tables en relation avec une grande quantit? de donn?es compl?mentaires; - Enfin, ils peuvent ?tre scann?s en IRMf sur le m?me scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la litt?rature ?lectrophysiologique sur les singes. Les animaux seront pr?f?rentiellement utilis?s au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du d?veloppement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilis?s. Cela permet un contr?le plus pr?cis des protocoles exp?rimentaux, que ce soit en termes de volume des r?compenses utilis?es pour l'apprentissage par renforcement, de contr?le du r?gime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures c?r?brales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux ?tant encore jeunes, ils pr?sentent une meilleure tol?rance aux proc?dures exp?rimentales et une meilleure r?cup?ration suite aux proc?dures n?cessitant une anesth?sie. Des animaux plus jeunes mais ayant d?j? atteints leur maturit? sexuelle pourraient ?tre utilis?s pour les premi?res phases d'habituation (entrainement ? la t?che auditive) et ?tre ainsi jeunes adultes lors du commencement des parties ult?rieures de la proc?dure (implantation, ?lectrophysiologie).

688 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant traitement antibiotique, gavages répétés, inoculations rectales sous anesthésie et tests de tolérance au glucose. Certaines reçoivent en plus l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau pendant six semaines et des instillations nasales d'acariens pour induire un asthme. Le projet étudie un métabolite du microbiote intestinal dans l'obésité, le diabète et l'asthme, avec des applications probiotiques adossées à un brevet. Le porteur affirme qu'il reste "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, la complexité des interactions entre organes étant difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d'int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l'h?te et son environnement, font l'objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.

Procédures

Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.

Devenir

Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.

Remplacement

Le contr?le du m?tabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins ?nerg?tiques et contr?ler les flux ?nerg?tiques en fonction des besoins. Il est tr?s difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des mod?les animaux vivants est encore n?cessaire.

Réduction

Pour r?duire le nombre d'animaux, nous avons effectu? un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bact?ries, non virulentes et qui peuvent cro?tre dans des conditions compatibles ? la souris, gr?ce ? des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette s?lection, effectu?e en partenariat avec l'?quipe de microbiologie, a abouti ? ne retenir que les bact?ries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront test?es in vivo, r?duisant ainsi le nombre d'animaux n?cessaires ? l'?tude. Les ?chantillons pr?lev?s chez chaque animal permettront de g?n?rer un grand nombre d?informations sur des marqueurs mol?culaires. De plus, nous avons estim? la taille des ?chantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace gr?ce aux donn?es de la litt?rature.

Raffinement

Les animaux feront l?objet d?une observation quotidienne durant les phases d?induction exp?rimentale, notamment lors de l?induction de l?asthme allergique. Un suivi du poids corporel sera ensuite r?alis? trois fois par semaine afin de d?tecter pr?cocement tout signe de mal-?tre ou de d?tresse respiratoire. Toute souris atteignant un point limite pr?d?fini, notamment une perte de poids sup?rieure ? 15 % ou des signes respiratoires s?v?res, sera imm?diatement euthanasi?e conform?ment aux proc?dures en vigueur. Afin de r?duire le stress et l?inconfort, l?enrichissement de la flore intestinale par voie rectale sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re apr?s induction ? l?isoflurane. Les sondes utilis?es seront souples et de diam?tre adapt? ? la taille de l?animal afin d??viter toute l?sion. L?inoculation par voie orale sera r?alis?e chez l?animal vigile, cette m?thode ?tant mieux tol?r?e et ne n?cessitant qu?une contention de courte dur?e. Lors des tests de tol?rance au glucose, le volume de sang pr?lev? sera strictement limit? au minimum n?cessaire au dosage de l?insuline (5 ?l de plasma), afin de r?duire la contrainte li?e aux pr?l?vements r?p?t?s. Apr?s l?implantation des minipompes osmotiques, les animaux seront surveill?s attentivement et une analg?sie appropri?e (m?loxicam (5 mg/kg)) toutes les 12h pendant 2 jours sera syst?matiquement mise en place pour pr?venir la douleur postop?ratoire. Enfin, les animaux seront pr?alablement habitu?s ? la contention et au gavage avant le d?but des inoculations, afin de limiter le stress li? aux manipulations r?p?t?es.

Choix des espèces

Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d'abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.

Deux heures par jour, cinq jours sur sept, pendant un à trois mois d'exposition à la fumée de cigarette: 1 100 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une instillation d'élastase dans la trachée, l'implantation d'une pompe sous la peau et un cathétérisme cardiaque. Le projet vise à comprendre la perte musculaire associée à la bronchopneumopathie chronique obstructive et à explorer des pistes thérapeutiques. Le porteur retire les éléments de nidification des cages pendant les deux heures d'exposition quotidienne et met à mort tout animal atteignant un score de dégradation trop élevé, les organes étant ensuite prélevés.

Objectifs

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est l’une des maladies respiratoires les plus fréquentes dans le monde et constitue une cause majeure de décès. Elle provoque une dégradation progressive des poumons, rendant la respiration de plus en plus difficile. Le tabagisme en est la principale cause, mais d’autres facteurs, comme la pollution de l’air, des infections respiratoires répétées durant l’enfance ou certaines prédispositions héréditaires, peuvent également favoriser son développement. Cette maladie s’accompagne souvent d’une diminution de la masse et de la force musculaires, appelée sarcopénie, ce qui altère la qualité de vie des personnes atteintes. Chez l’adulte, les muscles possèdent normalement une grande capacité d’adaptation et de réparation, leur permettant de se renouveler efficacement. Cette capacité repose sur des cellules souches présentes dans les muscles, généralement au repos, mais capables de s’activer en cas de besoin pour assurer leur entretien et leur régénération. Avec l’âge, ces mécanismes deviennent toutefois moins performants : les muscles se réparent moins bien, ce qui entraîne une diminution progressive de leur masse et de leur force, comme observé dans certaines situations de fragilité musculaire. Par ailleurs, certaines protéines présentes dans l’organisme jouent un rôle clé dans ces processus et pourraient constituer des pistes prometteuses pour de futurs traitements, afin de limiter les atteintes pulmonaires et de préserver la fonction musculaire. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de la perte musculaire associée à cette maladie et d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la santé et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la sarcopénie associée à la BPCO et fournir un cadre de traitement potentiel.

Procédures

Exposition à la fumée de cigarette : 2h/ jour, 5 jours/7 pendant 1, 2 ou 3 mois. Administration intratrachéale d'élastase sous anesthésie : 15min, 1 fois. Implantation sous-cutanée de pompe osmotique : 10-15min. Test d'agrippement : 5 min, entre 2 et 4 fois par procédures. Test de course : 16 min, entre 2 et 4 fois par procédures. Évaluation de la fonction cardiaque et de la pression artérielle par cathétérisme : 25-30min, 1 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement dues au stress lié : - à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement, test de course). - à l’exposition à la cigarette incluant l’odeur et le bruit généré par la machine. Remarque : en cas d’agressivité ou de mortalité, les animaux pourraient être isolés (seul dans une cage) afin de les garder dans l’étude.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.

Remplacement

Afin de tester l’impact direct de l’hypoxie intermittente sur la biologie des cellules satellites, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux, dont les systèmes musculosquelettique et pulmonaire sont similaires à l’Homme, reste essentielle afin d’étudier les effets délétères de la BPCO sur le muscle squelettique et la biologie des cellules satellites. Par ailleurs, la variabilité des caractéristiques des patients comme leur âge, leur consommation de tabac, ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux en utilisant des méthodes non invasives (test d’agrippement, test de course sur tapis roulant) qui permettent de répéter les analyses sur le même animal mais aussi en utilisant des tests statistiques appropriés. Des expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=11 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans nos modèles de BPCO.

Raffinement

Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des anesthésiques et analgésiques. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, des perturbations de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. Une surveillance accrue sera mise en place pendant les 24h suivant l’instillation d’élastase. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson. Remarque : Afin de facilité l'exposition à la fumée de cigarettes, les éléments de nidification seront retirés des cages pendant les 2h d'exposition.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car les systèmes physiologiques pulmonaire et musculosquelettique sont proches de ceux de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées afin de faciliter les analyses nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude. Enfin, nous utilisons des outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes de 8 semaines. A ce stade, l’appareil respiratoire est totalement développé et les muscles squelettiques sont parfaitement formés avec les cellules souches musculaires résidant en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos.

Pour cartographier les circuits nerveux de la sensibilité de la langue, 220 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des injections dans la langue, l'application de molécules et jusqu'à deux chirurgies d'une heure sous anesthésie. Le porteur rattache ce travail au syndrome de la bouche qui brûle, une douleur orale touchant surtout les femmes ménopausées, et évoque un rôle des hormones. Les perspectives thérapeutiques annoncées restent renvoyées au long terme, les souris étant tuées pour le prélèvement de tissus.

Objectifs

La langue est un organe essentiel au bon déroulement de nombreuses fonctions orales (mastication, gustation, phonation etc.). Sa sensibilité conditionne le bon déroulement de ses fonctions. Certaines conditions médicales ou environnementales altèrent la bonne exécution de ces fonctions, dégradent la santé et altèrent la qualité de vie. Par exemple, le syndrome de la langue qui brûle correspond à une pathologie douloureuse encore mal comprise. Cliniquement, ce syndrome se manifeste par une sensation persistante de brûlure au niveau de la pointe de la langue, caractérisée par une douleur modérée à sévère sans lésion apparente. Avec son impact significatif sur la qualité de vie, elle représente un véritable enjeu de santé publique ainsi qu’un enjeu socio-économique majeur. Les traitements actuellement disponibles ne traitent pas les causes de la pathologie et ne soulagent que trop peu la douleur. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués pour permettre une meilleure prise en charge de la pathologie. Il faut noter que le syndrôme de la bouche qui brûle affecte 7 femmes pour 1 homme, et atteint principalement les femmes au moment de la ménopause. Ceci suggère un rôle des hormones dans cette pathologie. Ici, l’objectif du projet est de caractériser les circuits nerveux impliqués dans la sensibilité de la langue et d’évaluer l’effet des changements hormonaux sur cette sensibilité dans des modèles murins reproduisant la carence hormonale associée à la ménopause, et leur contrôle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra une meilleure caractérisation des circuits nerveux du syndrôme de la bouche qui brûle, inconnus à ce jour. Plus largement, il permettra également d’évaluer les effets des modifications hormonales survenant à la ménopause, qui restent très peu étudiées du point de vue de la sensibilité (douleur, tact, goût, sensation de bouche sèche etc.). A plus long terme, l’identification des mécanismes sous-tendant ce syndrome et les circuits nerveux de modulation de la sensibilité ouvrira des perspectives thérapeutiques ciblées pour les patients.

Procédures

Injection (2x, 20 secondes, sous anesthésie), application de molécule (1x, 10 minutes, sous anesthésie), injection (jusqu’à 3x, 20 secondes, animal vigile), chirurgie (jusqu’à 2x, 1 heure, sous anesthésie).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engender une douleur post-opératoire transitoire et légère de quelques heures à quelques jours. Les procédures d’injection de molécules peuvent également induire une douleur transitoire de quelques heures à quelques jours, notamment localement au niveau des sites d’injection.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de procéder à des prélèvements de tissus pour des études immunohistochimiques.

Remplacement

L’innervation précise des neurones sensitifs innervant la langue, et les projections descendantes pouvant médier l’apparition des douleurs spécifiques à la langue n’est pas connue à ce jour. Cela nécessite donc une caractérisation chez l’animal vivant par traçage neuronal. En effet, il n’existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico permettant de modéliser des voies nerveuses qui n’auraient été caractérisées sur modèle vivant au préalable.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Le bien-être des animaux sera garanti grâce à l’utilisation d’anesthésie générale et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout au long des procédures, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort ont été définis.

Choix des espèces

Le travail sera effectué sur la souris car il s’agit d’un excellent modèle pour étudier le système nerveux et les pathologies pouvant affecter la sensibilité. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et humain, permettant l’extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout majeur dans l’analyse et l’interprétation des résultats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car les circuits neuronaux sont développés et matures.