Procédures modérées

2 408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule jusqu'à dix-sept semaines pour mesurer sa consommation d'alcool. Rendues dépendantes, elles reçoivent des candidats médicaments par voie orale, intraveineuse ou intrapéritonéale, avec des prélèvements sanguins répétés puis, à la demande du client, une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le projet est présenté comme une prestation proposée à des laboratoires privés ou académiques, la finalité commerciale précédant l'apport scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun test ne rend compte du comportement sur un 'organisme vivant entier' et conclut au recours 'nécessaire' à la souris.

Objectifs

Selon l’OMS, le trouble lié à la consommation d'alcool touche environ 283 millions de personnes, à l’échelle mondiale. En France, il est estimé à 1.5 millions de personnes et environ 70 000 personnes meurent des conséquences directes ou indirectes de l’alcool. L’alcoolisme est donc un problème de santé majeur pour lequel aucun traitement satisfaisant n’existe actuellement. Le projet présenté ici a pour objectif de mettre en place un modèle murin de consommation d’alcool et d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans le cadre d’une prestation proposée à des laboratoires privés ou académiques. L’alcoolisme chronique, appelée alcoolodépendance, est le fait de présenter une addiction à l’alcool sous la forme d’une alcoolisation quotidienne et régulière tout au long de la journée pour maintenir un taux constant d’alcool dans le sang. Tout comme la drogue, la dépendance à l’alcool est définie comme le besoin d’en consommer pour maintenir un état auquel l’organisme s’est habitué. Cette dépendance s’installe souvent sur le long terme et de manière insidieuse. L’objectif de ce projet sera : 1) de mettre en place un test murin de consommation chronique d’alcool. 2) d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments, ayant déjà démontré leur pertinence sur la dépendance liée à la consommation d’alcool grâce à d’autres tests réalisés en amont de ce projet (in vitro, organoïdes ou autres). Actuellement, il existe plusieurs traitements de première intention, utilisables dès que possible après l'arrêt de la consommation d'alcool dans l'objectif de réduire l'appétence pour l'alcool et ainsi les risques de rechute. S’ils ont une efficacité démontrée, ils ont un effet d’une amplitude modérée et présentent de nombreux effets indésirables (nausées et/ou vomissements, céphalées, sédation ou insomnie, anxiété, nervosité...). Ce projet est donc pertinent pour le développement de nouveaux candidats médicaments pouvant améliorer la qualité de vie des personnes dépendantes de l’alcool.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence l’efficacité de potentiels nouveaux candidats médicaments dans un modèle murin d’alcoolisme. Les résultats obtenus, s’ils sont positifs, permettront la poursuite du développement de ces candidats médicaments dans la lutte contre l’alcoolisme.

Procédures

Chaque étude aura pour durée maximale 17 semaines. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration). La fréquence d'administration dépendra des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments, au maximum 2 administrations par semaine pour la voie intraveineuse sur 9 semaines, 2 administrations par jours pour la voie orale sur 4 semaines ou 1 administration par jour pour les voies orales, intrapéritonéales, ou sous cutanées sur 9 semaines. Dans le cas d’une demande précise du donneur d’ordre, les animaux (à la fin de l’étude) peuvent être soumis à une perfusion intracardiaque (entre 5 et 20 min selon le débit de perfusion) sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Des prélèvements sanguins submandibulaires sur animaux vigiles (1 fois toutes les deux semaines maximum) ou intracardiaque sur animaux anesthésié (1 seule fois en fin d’étude) pourront être réalisés.

Impact sur les animaux

Les animaux sont stabulés individuellement dès leur arrivée dans nos locaux et jusqu’à la fin de l’étude soit au maximum 17 semaines. Ce mode d’hébergement est nécessaire à la mesure précise de la consommation individuelle d’alcool. La consommation d’alcool peut engendrer des signes comportementaux d'intoxication (non attendu dans le projet, les animaux ayant en permanence de l’eau à disposition). Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Avant de réaliser des études dans le cadre de ce projet, nous nous assurerons auprès du demandeur que des études in vitro et/ou vivo auront été préalablement réalisées afin que les candidats médicaments soient administrés à des doses ne présentant pas de toxicité. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents modes d’administration. Une administration (per os, sous-cutanée, intrapéritonéale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress. Pour une administration Intraveineuse effectuée dans la veine caudale, les souris seront placées dans un tube de contention induisant un stress pour l'animal. Les animaux pourront être soumis à un prélèvement de sang submandibulaire réalisé sous anesthésie générale. Si le donneur d'ordre souhaite réaliser des études complémentaires sur les organes des animaux (ex : histologique), une perfusion intracardiaque sera réalisée sur des animaux anesthésiés et ayant reçu au préalable un analgésique.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses complémentaires, l'ensemble des animaux sont soumis à la fin de l’expérience à des prélèvements sanguins ou d’organes.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier la consommation d’alcool. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière fiable. Etant donné la variabilité de la consommation d’alcool chez la souris, 12 animaux par groupe sont prévus afin d'assurer une analyse statistique pertinente. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Une attention particulière sera portée aux enrichissements du milieu pour réduire au maximum les effets de l’isolement. De plus, les animaux sont stabulés sur des portoirs conventionnels en cages transparentes, de cette façon les animaux peuvent voir les congénères des cages adjacentes et ne sont pas isolé olfactivement. Toutes les expériences seront réalisées après une période d’acclimatation de 14 jours. Une observation quotidienne sur des caractéristiques spécifiques (physiologie clinique, aspect général, comportement...) sera effectuée durant la période d’expérimentation par du personnel formé au soin. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs critères prédéterminés (repérés le plus précocement possible grâce à l'observation et à l'appui d'une grille du bien-être animal) sera mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est largement utilisée pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer de façon fiable les doses administrables à l'homme dans le cadre d’essais cliniques ultérieurs. Le choix de la souris C57bl/6 a été fait suite à une étude bibliographique approfondie qui démontre que cette lignée de souris à une appétence naturelle pour l’alcool. Elles consomment spontanément l’alcool qui leur est proposé contrairement à d’autres lignées (comme DBA/2 ou BALB/C) qui le rejettent. Cette préférence stable permet de modéliser la consommation volontaire, un aspect essentiel pour reproduire le comportement humain vis-à-vis de l’alcool. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux âgés de plus de 3 semaines et de 24 mois maximum. Les modèles sont susceptibles d’être utilisés pour l’étude de produits potentiellement actifs chez le jeune, l’adulte ou la personne âgée.

Une injection de chlorure de lithium qui provoque une nausée, une fenêtre ouverte dans le crâne et jusqu'à vingt et un jours en cage individuelle : 1 942 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent aussi une injection de virus dans le cerveau, une fixation de la tête et une restriction d'eau pour les motiver à une tâche gustative. Le projet étudie comment une région du cortex traite les informations sensorielles du goût. Toutes sont tuées pour des analyses d'électrophysiologie ou d'anatomie.

Objectifs

L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H - L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours. MODIFICATION LES ANIMAUX SERONT MAINTENUS EN HEBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT 21 JOURS MAXIMUM

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.

Devenir

Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence.Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

Rendues obèses et diabétiques, 63 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit onze à treize injections sous-cutanées et une dizaine de prélèvements de sang à la queue, l'étude étant limitée aux mâles pour ne pas doubler les effectifs. Elle est menée en prestation contractuelle pour un industriel qui teste cinq formulations à libération prolongée d'un médicament. Le bénéfice avancé, une injection mensuelle plus confortable pour de futurs patients, reste conditionné à un passage en clinique encore lointain.

Objectifs

En 2021, 537 millions de personnes dans le monde étaient touchées par le diabète de type 2 tandis que 800 millions d’adultes souffraient d’obésité. Ces chiffres alarmants concernent deux “maladies du siècle” qui dépendent de plusieurs facteurs génétiques, environnementaux ou alimentaires. Cette prévalence inquiétante s'accompagne en outre d'une mortalité importante: on attribut directement à l'obésité et au diabète de type 2 associé environ 3,5 millions de décès par an au niveau mondial. Face ce contexte, l'armada thérapeutique s'avère particulièrement pauvre, et s'accompagne de posologies contraignantes et d'effets secondaires non négligeables. Récemment, des médicaments ciblant les récepteurs du GLP-1 ont été autorisés sur le marché afin de traiter à la fois l'obésité et le diabète de type 2. Néanmoins, bien que très efficaces, ces traitements s'administrent par voie sous-cutanée et des recherches actives sont en cours afin d'améliorer la posologie et de réduire la fréquence d'administration de ces traitements. L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre d’une prestation contractuelle pour le compte d’un industriel pharmaceutique qui développe des composés thérapeutiques dans le domaine des troubles métaboliques. Cet industriel a notamment développé une nouvelle forme de galénique (matrice sous-cutanée) permettant une libération lente et prolongée du médicament X. Des études précédentes ont montré que cette galénique améliore largement la biodisponibilité du médicament X sur le long terme et diminue largement les effets de pics plasmatiques. Elle aurait ainsi l'avantage de permettre une réduction drastique des prises pour le patient (une administration par mois) améliorant ainsi largement son confort de vie. La matrice à libération prolongée de notre client a été testée in sillico et in vitro et sa bonne tolérance locale au niveau sous-cutané a également été démontrée. Au total, 5 formulations différentes à libération prolongée du médicament X ont été développées et l'objectif du présent projet vise ainsi à démontrer que, sous ces nouvelles formes galéniques, le médicament X conserve son efficacité. La procédure du présent projet se limitera ainsi à une administration des formulations à libération prolongée du médicament X et du médicament X sous sa galénique initiale suivies de pesées de poids corporel et de dosage glycémique.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sont positifs, les formulations du médicament X pourront entrer en phase d'étude clinique et être ensuite autorisé à être mis sur le marché en tant que traitements anti-obésité et antidiabétiques, et dont la posologie serait bien moins contraignante pour les patients traités que le médicament actuel. Par ailleurs, un meilleur contrôle de la biodistribution du médicament X du fait de sa libération prolongée pourrait également améliorer l'efficacité des traitements actuels.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (19 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Injection des traitements (11 ou 13 administrations selon le groupe d'animaux; durée : 1 minute); 3) Prélèvements d'une goutte de sang pour mesure de la glycémie (10 prélèvements; durée du prélèvement : 1 minute).

Impact sur les animaux

L'hébergement en cage individuelle sera source de stress du fait d'un isolement partiel des animaux qui garderont néanmoins des contacts visuels et olfactifs. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les prélèvements de sang en bout de queue occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

Un prélèvement sanguin sera prévu pour des analyses ultérieures après mis à mort de l'ensemble des animaux .

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la glycémie dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques)

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 9 animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au sexe mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les mesures glycémiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux sexes. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux sexes.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages de glycémie (un seule goutte de sang prélèvée en bout de queue). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris obèses nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques.

Non pour répondre à une question scientifique mais pour maîtriser les gestes d'anesthésie et de chirurgie, 6 lapines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une ovariectomie d'une à deux heures sous anesthésie, avec pose de cathéters et prélèvements de sang et d'urine. Le projet prépare un futur modèle de ménopause destiné à étudier les troubles cardiaques des femmes. Le porteur présente cette étape comme une mise en main du matériel et des bonnes pratiques avant une vraie étude.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que certains troubles du rythme cardiaque tels que la fibrillation auriculaire (FA) et l’insuffisance cardiaque (IC) diffèrent entre les femmes et les hommes. Les femmes sont plus âgées au moment de l'apparition de la FA (typiquement de 10 ans) et elles présentent des symptômes plus marqués et plus durables, avec un risque plus élevé et d'issues graves, notamment d'accident vasculaire cérébral. Peu d'attention scientifique a été accordée aux différences entre les femmes et les hommes, d'où un manque de connaissances et de sensibilisation dans la communauté des chercheurs et dans le public. Les mécanismes à l’origine des changements de la fonction cardiaque suite à la perte de signalisation des hormones sexuelles féminines sont encore peu connus. Un modèle animal chez le lapin nous présente l’opportunité d’étudier les mécanismes fondamentaux responsables de la sensibilité des femmes au développement de pathologies cardiovasculaires, en lien étroit avec la diminution des hormones sexuelles. Ce projet vise à encadrer la mise en place de ce nouveau modèle de ménopause, avec le but de maitriser les gestes et les bonnes pratiques d’anesthésie, de chirurgie et de suivi.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de maitriser les procédures et les bonnes pratiques sur un modèle de ménopause, pour, dans un deuxième temps, mieux comprendre le rôle des hormones sexuelles dans la survenue des maladies cardiaques, notamment de la fibrillation auriculaire et l’insuffisance cardiaque, pour permettre, à terme, une meilleure prise en charge des pathologies cardiaques chez les femmes et une meilleure prévention.

Procédures

Dans ce projet, 6 animaux seront traités. Chaque animal sera soumis à une opération chirurgicale. L’intervention sera réalisée en une seule fois (environ 1h-2h) sous anesthésie générale. Toute la procédure sera effectuée sous surveillance des paramètres vitaux. Au cours de la procédure expérimentale, des prélèvements sanguins (artère et veine) et urinaires seront réalisés sur chaque animal et sous anesthésie générale. Chaque prélèvement sera réalisé via la pose d’un cathéter adapté en fonction de l’abord artériel, urinaire et de l’abord veineux choisi, et ne durera que quelques minutes. Chaque animal fera ainsi l’objet d’un prélèvement urinaire, d’un prélèvement artériel ainsi que d’au moins un prélèvement veineux à trois reprises. Il s’agira donc de réaliser 1 prélèvement sanguin et urinaire en début de la phase 1, puis 1 prélèvement sanguin et urinaire en début et 1 prélèvement sanguin et urinaire en fin de la phase 2 de la procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels d’intensité modérée, peuvent apparaitre pendant la période intra-opératoire (1h- 2h), liés à l’anesthésie (hypoventilation, hypotension, hypothermie) et à la chirurgie (sensation de douleur, hémorragie; 1j-7j), ou pendant la période post-opératoire (désorientation, réactivité réduite, infection, réouverture de la plaie chirurgicale; 3j-15j). Les arrêts de transit peuvent être relativement fréquents en post-opératoire chez cette espèce, et seront pris en charge. De plus, des effets indésirables d’intensité modérée, peuvent survenir en post- opératoire, liés à l’implantation des équipements médicaux (réouverture de la plaie chirurgicale, infection; 3j-15j).

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de caractériser à l’échelle tissulaire, cellulaire, moléculaire et biochimique les effets du remodelage cardiaque obtenu par la ménopause et/ou l’induction de la fibrillation auriculaire et de l’insuffisance cardiaque.

Remplacement

Le projet prévoit dans un premier temps, la réalisation des procédures chirurgicales sur des cadavres de lapines, permettant aux expérimentateurs d’acquérir une première maîtrise technique sans recours à l’animal vivant. En revanche, les processus d’anesthésie et d’analgésie ne peuvent être reproduits de manière satisfaisante sur des tissus inertes ou modèles cellulaires in vitro, et nécessitent le recours à un modèle animal vivant. En effet, les mécanismes physiologiques sont complexes dans leur globalité et nécessitent d’avoir recours à un modèle animal pour cette étude. S’y ajoute qu’il n'existe pas à ce jour de modèle de modélisation numérique pour répondre aux objectifs souhaités.

Réduction

Nous avons estimé un effectif total de 6 animaux pour l’ensemble de cette étude. L’ensemble des animaux sera mobilisé pour permettre la prise en main du matériel et l’acquisition des gestes peropératoires indispensables, notamment pour les techniques d’anesthésie et de chirurgie. La mise en place de ce nombre a été fixée de manière à permettre des ajustements expérimentaux et des vérifications de faisabilité, tout en limitant le recours aux animaux au strict nécessaire. Il s’agit du nombre minimal d’animaux requis à la fois pour maitriser, d’après notre expérience, les gestes chirurgicaux, ainsi que pour estimer, au bout de la procédure, la variabilité des paramètres physiologiques et cardiaques mesurés entre chaque animal. Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux et dans le cadre d’une DAP scientifique suivante, nous allons quantifier les changements de la fonction cardiaque et la concentration de molécules d’intérêts et les comparer par des tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress. L’ensemble des animaux est hébergé par deux, entre animaux socialement compatibles, ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils disposent d’enrichissements adaptés (bâtonnets à ronger et/ou foin ajoutés dans les cages, etc.). D’autre part, l’intervention chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Des moyens pour éviter ou minimiser l’impact sur l’animal seront mis en place (protocole anesthésique et analgésique approprié, apport d’oxygène pendant toute la procédure, et contrôle de la voie aérienne, mise à disposition de tapis chauffants, maîtrise des saignements et vérification de ligatures et sutures et antibiotiques administrés pour prévenir l’infection). Pour faciliter le réveil, les animaux seront placés dans un environnement calme, chauffé et sous surveillance, afin de détecter rapidement toute complication éventuelle. Un suivi particulier sera porté à la bonne cicatrisation de la plaie pendant le post- opératoire (au moins 7 jours). Un examen clinique avec évaluation de l’état général, de la prise d’aliment, de l’activité et de la présence de la douleur sera réalisé pendant la période post-opératoire afin de détecter des possibles complications et de mettre en place les mesures thérapeutiques adaptées. Des critères d’alerte précis et des effets adverses seront évalués et surveillés. Si un point limite est atteint, des mesures adéquates seront mises en place dans le plus court délai (administration d’un traitement contre la douleur ou bien augmentation des doses si un traitement est déjà en cours). Parallèlement, le responsable du projet, le responsable du bien-être et le vétérinaire désigné seront contactés pour la prise de décisions dans le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proches de l’homme (brebis, porc, chèvre, chien, lapin), le lapin a été identifié comme le plus adéquat en tant que modèle animal bien connu et largement caractérisé dans des domaines variés de la recherche : •Cet animal présente également un fonctionnement cardiaque très proche de celui de l’être humain, notamment en termes de morphologies et de structures des cavités cardiaques et de réponse liée à l’activité électrique du cœur. Cette similarité en fait un modèle pertinent pour étudier les mécanismes d’action de différentes substances médicamenteuses sur le système cardiovasculaire. •Pour finir, notre étude inclut des femelles de 6 mois, car à cet âge elles permettent de reproduire de façon contrôlée une situation comparable à la ménopause chirurgicale chez la femme.

Non pour produire des connaissances mais pour former des expérimentateurs à la chirurgie du cerveau, 320 souris et 320 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une opération stéréotaxique d'environ 45 minutes puis des injections, réalisées par les stagiaires sous supervision. Le porteur affirme que vidéos et animaux artificiels ne remplacent pas l'entraînement sur un animal vivant anesthésié. Les animaux formés sont tués pour vérifier la qualité du geste sur leur cerveau, les surnuméraires étant réutilisés pour d'autres enseignements ou projets.

Objectifs

La technique d’injection dans le cerveau (ou chirurgie stéréotaxique) faisant l’objet de ce projet de formation est une technique utilisée en médecine humaine. Elle est employée dans un cadre thérapeutique pour soigner des zones du cerveau en les stimulant ou en injectant des molécules thérapeutiques. Dans les laboratoires de recherche en neurobiologie, cette technique est également utilisée pour comprendre comment fonctionnent les cellules du cerveau et comprendre avec quelles autres cellules elles communiquent. Des cartographies du cerveau qu’on appelle atlas ont été établies pour permettre aux expérimentateurs de cibler très précisément les différentes zones du cerveau. Mais l’utilisation de ces atlas et la réalisation de la technique demande une formation spécifique . Cette formation donnée par des expérimentateurs chevronnés permettra au stagiaire de mener à bien une chirurgie stéréotaxique sur la souris ou le rat. Cette formation s’adresse aux techniciens, ingénieurs, doctorants et chercheurs ayant déjà validé deux formations réglementaires et qui souhaitent apprendre ou se perfectionner dans cette technique de pointe de la neurochirurgie. Le stage allie cours magistraux d’une part, démonstrations et travaux pratiques d’autre part. Les cours magistraux (qui n’impliquent pas d’animaux) apportent les connaissances nécessaires à la mise en œuvre de la technique, des soins donnés aux animaux avant pendant et après la réalisation de cette technique. Ils abordent aussi les bases de l’anatomie du cerveau et les principes de la stéréotaxie. La partie consacrée à la pratique permet au stagiaire de mettre en œuvre cette technique avec succès. Pour atteindre cet objectif, le stage se dote d’un fort taux d’encadrement de ces travaux pratiques (maximum de 2 stagiaires par formateur) qui permet un guidage personnalisé pour chacune des étapes de l’opération et pour surmonter efficacement toute difficulté éventuelle et assurer une prise en compte constante du bien-être animal.

Bénéfices attendus

A l’issue de la formation, les stagiaires auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir une qualité d’exécution de la chirurgie stéréotaxique et le maintien du bien-être animal dans le cadre de leur expérimentation. L’anticipation et la prise en charge de la douleur, la mise en place de la chirurgie et de ses appareillages, l’utilisation fine d’un matériel hautement fragile, la réalisation d’un geste technique précis, l’identification des signes cliniques des animaux et le bon suivi post-opératoire sont autant d’éléments permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés pour l’investigation.

Procédures

Chaque animal subira au cours des procédures 2 injections d’anesthésiant local et général (1 minute) + 1 intervention chirurgicale (45 minutes) + 2 injections terminales (2 minutes). Les injections seront réalisées dans la cavité abdominale. Chaque chirurgie réalisée par le stagiaire sera contrôlée par le formateur qui veillera au respect du bien-être animal.

Impact sur les animaux

L’anesthésie par injection peut induire un stress léger ainsi qu’une légère douleur de courte durée. Une douleur peut apparaitre en post opératoire au niveau de la suture. Une légère perte de poids, réversible, peut être observée le lendemain de la procédure.

Devenir

Après le suivi post-opératoire les animaux qui auront été utilisés pendant la formation seront euthanasiés pour permettre le prélèvement du cerveau. Celui-ci sera étudié pour vérifier la qualité de la réalisation technique du stagiaire. Les animaux surnuméraires seront pris en charge par la plateforme de zootechnie pour une réutilisation (enseignement ou projet de recherche).

Remplacement

L’utilisation de vidéos d’enseignement ou d’animaux artificiels ne peuvent pas remplacer la démonstration et l’entrainement sur un animal vivant et anesthésié. La réalisation d’une telle technique nécessite dans le même temps l’apprentissage des bonnes pratiques pour garantir le maintien de la bonne santé de l’animal tout au long de la procédure et après.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été optimisé pour permettre les démonstrations des formateurs et l’entrainement complet de chaque stagiaire.

Raffinement

Les souris et rats destinés au stage sont maintenus en groupe sociaux avec des éléments d’enrichissement dans leur cage et ils bénéficient d’un suivi de leur état comportemental et physiologique au quotidien. Seuls les formateurs procèdent à la manipulation des animaux éveillés et à leur anesthésie dans un environnement calme. Au cours des opérations, si malgré la couverture antalgique et le monitoring de l’état d’anesthésie, un animal donne le moindre signe de mal être (insensibilité à la médication), il sera mis à mort avec une surdose d’anesthésique. Les animaux feront l’objet d’un suivi post-opératoire. En cas d’atteinte de points limites strictes, l’animal sera immédiatement euthanasié. Ces points sont : l’ouverture de la plaie, l’infection du site opératoire, les signes neurologiques aigus (convulsions, paralysie, léthargie extrême), l’incapacité à s’alimenter.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles de choix en neurobiologie expérimentale. De nombreuses lignées génétiquement modifiées ont été générées pour étudier la biologie de ces mammifères et par extension celle de notre espèce. Il est donc important pour une formation pertinente d’utiliser le modèle sur lequel le stagiaire sera amené à travailler. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car c’est à cet âge que les atlas qui permettent une bonne localisation de la zone à injecter peuvent être utilisés.

Des points limites gradés déclenchent l'arrêt de la procédure, mais 72 souris vont d'abord être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant douze semaines de régime, elles subissent des gavages, deux prises de sang à la queue, une injection intrapéritonéale, des jeûnes et des isolements répétés. Les tissus sont prélevés après la mise à mort pour étudier l'effet de la vitamine D sur le microbiote. Le porteur précise qu'aucune analgésie n'est prévue pour ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant de mieux comprendre l’impact de la vitamine D sur la santé, et les conséquences d’une carence en vitamine D sur la santé métabolique et le microbiote. Afin de prendre en compte de possibles effets liés au sexe, des souris mâles et femelles seront nourris pendant 12 semaines avec un régime contrôle, déficient ou non en vitamine D, ou un régime riche en lipides et en sucres, déficient ou non en vitamine D. Les souris carencées seront étudiées et comparées aux souris non carencées pour le suivi de l'evolution pondérale, la prise alimentaire, et l’impact sur le microbiote. Au total, l'etude portera donc sur 8 groupes d'animaux. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9ème semaine et un test de tolérance au glucose à la 10ème semaine. Les fèces seront également récoltées et le microbiote des animaux sera analysé. Les animaux seront mis à mort après les 12 semaines de régime afin d'étudier l’inflammation, l’expression et l’activation de la voie de signalisation de l’insuline dans des organes à forte activité métabolique (foie, muscles, tissus adipeux), l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux, et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’impact de l’interaction entre la vitamine D et le microbiote intestinal sur la santé métabolique ainsi que sur la composition du microbiote. Ce travail est essentiel pour mieux comprendre le rôle du statut en vitamine D dans la réponse à l’alimentation, notamment dans le contexte d’un régime riche en lipides. Il permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives, en particulier en ce qui concerne les recommandations relatives à la supplémentation en vitamine D chez l’Homme.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé la 6ème semaine. Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test oral de tolérance au glucose et un test de tolérance à l'insuline seront pratiqués respectivement en 9ème et 10ème semaine. Ces tests nécessitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérance au glucose, et une injection lors du test de tolérance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur valeur de glucose dans le sang. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors de tolérance au glucose et à l'insuline et du recueil de fèces. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose, ou une dose de colorant visant à etudier la perméabilité intestinale, et lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles. Lors des tests, les animaux seront soumis à des restrictions alimentaires afin de réaliser les tests sur animaux à jeun (4h ou 6h). De même, la vielle au soir de l'euthanasie, les animaux seront mis à jeun. Les souris subiront deux gavages durant le protocole, deux prises de sang à la veine caudale et une injection intrapéritonéale, qui pourraient engendrer des douleurs temporaires et reversibles. Contention des animaux à plusieurs reprises lors des tests.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques, séquencage) et de démontrer les effets métaboliques de la modulation en vitamine D dans l’alimentation, à la fois sur le microbiote et sur la santé métabolique.

Remplacement

L’impact d’une modulation en vitamine D sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de Student, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton ainsi que du coton de nidification. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 9 semaines à l’achat et d’environ 10 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à des animaux adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

Pour tester un traitement censé préserver les muscles pendant un amaigrissement médicamenteux, 82 souris rendues obèses vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une quarantaine d'administrations, des courses forcées sur tapis roulant, des tests de force et des prélèvements sanguins, dont deux mesures de force musculaire sous anesthésie avec réveil. Les muscles sont prélevés après la mise à mort. Les bénéfices annoncés, des traitements "plus sûrs et mieux tolérés" pour les patients, restent au conditionnel alors que l'amaigrissement forcé et les tests sont, eux, immédiats.

Objectifs

L’obésité constitue un problème majeur de santé publique, avec une augmentation importante de sa prévalence au niveau mondial depuis plusieurs décennies. Selon l’Organisation mondiale de la santé, plus d’un milliard de personnes étaient concernées en 2022. Malgré l’existence de traitements récemment autorisés, tels que la sémaglutide, certaines limitations ont été rapportées, notamment une perte concomitante de masse musculaire, susceptible d’aggraver la faiblesse musculaire chez les sujets obèses. Cette étude a pour objectif d’évaluer, chez la souris, l’efficacité d’un traitement expérimental destiné à protéger les muscles lors d’une perte de poids induite par un médicament. En situation d’obésité, la perte de poids peut s’accompagner d’une diminution de la masse musculaire et de ses capacités fonctionnelles, ce qui peut avoir des conséquences négatives sur la santé. Le projet vise à déterminer si ce traitement permet de préserver la masse et la fonction musculaires tout en conservant les effets bénéfiques de la perte de masse grasse. Cette étude contribuera également à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la fragilisation des muscles lors d’une perte de poids, dans le but de développer à terme des stratégies thérapeutiques plus sûres et plus efficaces.

Bénéfices attendus

L’obésité représente un problème majeur de santé publique, souvent associé à des complications graves. Certaines stratégies de perte de poids peuvent entraîner une diminution de la masse et de la force musculaires, ce qui peut fragiliser les patients et limiter les bénéfices du traitement. Ce projet vise à identifier une approche thérapeutique permettant de préserver ou de restaurer les muscles tout en maintenant les effets positifs de la perte de masse grasse. Les résultats attendus pourraient contribuer au développement de traitements plus sûrs et mieux tolérés, améliorant ainsi la capacité fonctionnelle et la qualité de vie des personnes concernées.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (24 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (6 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Administration de traitements (49 administrations; durée : 1 minute); 4) Mesures de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes), 5) Prélèvements sanguins (2 prélèvements, durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de l'endurance sur tapis roulant (2 mesures; durée du test : 20 à 30 minutes); 7) Test de force de préhension (2 mesures; durée du test : 2 minutes); 8) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle, les prélèvements sanguins, le test de force de préhension et les administrations des traitements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitements et les prélèvements sanguins occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Les mesures de force musculaire nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Les mesures de l'endurance des animaux pourront être source de stress du fait du caractère forcé de la course, ainsi que d'une fatigue musculaire. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les muscles pour analyses.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, et les paramètres de performance musculaire dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés à l'aide d'une sonde avec embout souple et par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Une crème analgésiante sera appliquée sur la queue des animaux 30 minute avant chaque prélèvement sanguin et seront limités au volume minimum nécesaire aux dosages ultérieurs. Durant la phase d'habituation les animaux seront habitués aux tubes de contention nécessaire à la mesure de composition corporelle et aux prélèvements sanguins ainsi qu'aux tapis de course (à faible vitesse) utilisés pour les tests d'endurance. Les mesure de force musculaire in vivo seront réalisées sur animal anesthésié et une attention particulière sera apportée pendant la phase de réveil. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée. Il est a noter que des études préalables de toxicité seront réalisée avant chaque étude par le laboratoire développant les candidats médicaments afin de déterminer une dose de composé non toxique à employer pour chaque étape du présent projet.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.