Procédures modérées

Une partie des souris utilisées est privée d'ovaires ou de testicules avant de recevoir de la testostérone ou de l'œstrogène sous la peau de la nuque. Elles sont 186, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La cornée est abrasée pour reproduire une blessure, atteinte dont le porteur écrit qu'elle peut causer pendant 72 heures une douleur comparable à celle d'un grain de sable dans l'œil. Les yeux sont prélevés après la mise à mort pour examiner la cornée et ses annexes, seule façon selon lui d'évaluer l'effet des hormones sur la cicatrisation.

Objectifs

L'œil est protégé par une surface transparente : la cornée. Il s’agit du tissu contenant le plus de nerfs du corps humain. L’extrémité des nerfs se trouve à la surface de la cornée afin de capter les stimulations et agressions extérieures. Ces nerfs confèrent une grande sensibilité à la cornée qui est elle-même protégée par les larmes (rendant la surface de l'œil en permanence humide). Tous ces éléments fonctionnent ensemble formant un équilibre fragile. La moindre atteinte de cet équilibre peut entraîner des défauts de la cornée pouvant eux-mêmes rendre aveugle le patient. Cette situation se déroule typiquement dans la maladie que l’on appelle la kératite neurotrophique, une maladie neuro-dégénérative rare touchant 5 personnes sur 10 000 en Europe. Elle entraîne la mort des nerfs et donc à terme une perte de sensibilité et de vision. A l’heure actuelle, les traitements disponibles sont limités (gouttes) et les formes sévères de la maladie nécessitent une greffe de cornée. Or, la greffe reste une intervention lourde avec un taux de rejet élevé en plus d’une efficacité souvent temporaire. On se trouve en impasse thérapeutique où le manque de connaissances sur le fonctionnement de la cornée et son environnement constitue un frein majeur à l’avancée scientifique. Une étude préliminaire menée par notre équipe a mis en évidence une différence significative de sensibilité cornéenne entre souris mâles et femelles. Notre projet vise donc à explorer cette différence de la cornée due au sexe et à en évaluer les conséquences sur la fonctionnalité cornéenne, en particulier sur les mécanismes de cicatrisation. L’objectif à long terme est de mieux comprendre les interactions neurones/hormones dans la cornée afin de contribuer au développement de nouveaux traitements plausibles.

Bénéfices attendus

La kératite neurotrophique étant en impasse thérapeutique, comme d’autres pathologies de la cornée, notre projet a pour but de déterminer et mettre en place de nouvelles thérapies innovantes. La première étape de cet objectif est de mieux comprendre et détailler le fonctionnement de la cornée, notamment dans les différents sexes. En étudiant l’impact des hormones sur la cicatrisation de la cornée, le projet permet alors de développer des nouvelles thérapies en médecine personnalisée. On s’adapterait ainsi au patient et à ses conditions (sexe, grossesse, variations hormonales).

Procédures

Manipulées par nos soins, les souris, même si aucune douleur n’est causée lorsqu’elles sont simplement tenues, risquent d’éprouver du stress. Seront limitées au maximum les anesthésies, les durées et le nombre des manipulations. La testostérone (hormone masculine) et l’oestrogène (hormone féminine) seront injectées juste sous la peau de la nuque chez des souris endormies à l’aide d’un gaz. C'est une intervention très rapide qui prend moins d'une minute par souris. Celle-ci peut légèrement influencer le comportement des animaux : agressivité mineure, hyperactivité faible.

Impact sur les animaux

La modélisation d’une blessure de la cornée chez la souris pourra impliquer une douleur passagère dans les 72h suivant la manipulation, douleur comparable à une sensation d’irritation causée par la présence d’un grain de sable dans l'œil. Aussi, le stress d’être manipulé peut être retenu.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’effet de la maladie sur les structures de l’œil : la cornée et ses annexes.

Remplacement

Les systèmes de cellules isolées ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organe entier qui dépend des hormones, ce qui rend indispensable l’utilisation d’un modèle animal, en particulier la souris, notamment grâce à l’utilisation de souris sans organes génitaux primaires : ovaires et testicules +/- traitées à la testostérone et l’oestrogène.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux et de respecter la règle des 3R, un calcul est réalisé à l’aide d’un logiciel. Cette analyse nous permet d’optimiser la quantité d’animaux tout en garantissant un nombre suffisant de souris par condition pour effectuer par la suite les tests statistiques nécessaires. Cette estimation rigoureuse vise à assurer la robustesse des résultats tout en évitant la reproduction inutile des expériences.

Raffinement

Pendant la période d’acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiens par les soigneurs, hébergement en groupe d’au moins deux individus, et mise en place d’un environnement adapté et enrichi. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie répétée. Pendant le traitement à la testostérone, les souris ne sont pas maintenues entre nos mains. Elles sont simplement anesthésiées à l’aide d’un gaz, ce qui permet de réaliser l’injection sans induire de stress important. L’administration sous-cutanée permet une libération prolongée, limitant les pics hormonaux et les manipulations répétées. L’état général, le poids, et le comportement des animaux seront suivis régulièrement pour détecter toute anomalie. Si nécessaire, un animal présentant des signes de souffrance ou d’effet secondaire sera retiré de l’expérimentation et pris en charge conformément aux recommandations vétérinaires. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’abrasion cornéenne, avec l’administration de médicaments anti-douleur et anesthésiques appropriés. L’animal est suivi les heures et jours suivant la procédure ainsi en cas de signes de douleur, il sera pris en charge immédiatement. L'œil est formé de telle manière qu’une abrasion superficielle comme celle-ci n’impactera en rien l’intégrité de l'œil, mais simplement la couche la plus superficielle de la cornée.

Choix des espèces

La lignée de souris utilisée présente une grande variabilité génétique en raison de l’absence de consanguinité, ce qui en fait un modèle proche des lignées sauvages. Elle permet ainsi d’étudier l’impact des hormones sur le microenvironnement cornéen en étant un modèle très satisfaisant pour la reproductibilité chez l’Homme. Nous débutons nos traitements hormonaux sur des souris âgées 6 et 9 semaines, car c’est à cet âge que la cornée est mature ce qui permet d’éviter des fluctuations hormonales susceptibles de fausser les résultats.

Livrées à l'animalerie à l'âge de 23 mois, 75 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 91 administrations du composé testé, subit 27 pesées, deux prélèvements sanguins en boîte de contention et trois tests d'endurance de trente à quarante-cinq minutes sur tapis roulant. Le RNT ne précise pas comment les souris sont amenées à courir jusqu'au bout de ces tests. Le porteur écrit que l'étude in vivo est une "étape règlementaire incontournable" pour le dossier de son client avant les premiers essais chez l'humain, et espère une mise sur le marché contre la perte musculaire liée à l'âge.

Objectifs

Le composé testé a été initialement développé comme un médicament visant les fibres musculaires dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire liée à l'âge. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du composé X et de tester notamment ses effets sur la masse et la force musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris âgées.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter la faiblesse musculaire liée à l'âge chez l'humain. Bien que de nombreux traitements aient été testés au cours des vingt dernières années, il n’existe toujours pas de médicament capable de guérir la sarcopénie. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la perte musculaire. .

Procédures

Au cours de l'étude, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (27 mesures ; durée de la mesure : 1 minute) ; 2) Administration du candidat médicament (91 administrations ; durée : 1 minute) ; 3) Analyse non invasive de la composition corporelle (3 mesures ; durée de la mesure : 2 minutes) ; 4) Prélèvements sanguins (2 prélèvements ; durée du prélèvement : 5 minutes) ; 5) Analyse des échanges respiratoires sur un tapis roulant (1 mesure ; durée : max. 48 minutes); 6) Test d'endurance sur un tapis roulant (3 mesures ; durée moyenne : 30-45 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de courte durée. Les tests réalisés sur tapis roulant constitueront une nuisance d'isolement sur les animaux qui garderont toutefois un contact visuel avec leurs congénères. L’anesthésie peut également générer un stress de courte durée chez l’animal.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus près euthanasie pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles musculaires. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel et la prise alimentaire) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages collectives et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront réalisés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans l'appareil de mesure permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures et seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs. Avant chaque test sur tapis roulant, les animaux seront également habitués à être sur un tapis roulant à une faible vitesse. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. A la réception, les 75 animaux seront âgés de 23 mois. Le stade de développement de ces animaux correspond ainsi à la population cible du composé développé.

Une perte de poids trop importante ou une immobilité totale suffit à arrêter l'expérience, un score clinique supérieur à 8 pouvant y mettre fin. 4 442 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est provoquée par injection, puis des composés sont administrés jusqu'à deux fois par jour par gavage ou par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire ou intradermique, avec des prélèvements sanguins allant jusqu'à 12 % du volume sanguin total. Le porteur décrit œdèmes, difficultés locomotrices, posture prostrée et douleur, et précise que la fréquence des prélèvements relève de "l'appréciation du client".

Objectifs

Plus de 200 maladies rhumatismales sont recensées et se manifestent sous différentes formes avec des atteintes au niveau des os et des articulations, des ligaments, des cartilages, des muscles et des tendons des membres inférieurs et supérieurs. On distingue quatre principaux types de rhumatismes : les rhumatismes inflammatoires (arthrite rhumatoïde, spondylarthropathies...), les rhumatismes dégénératifs (arthrose...), les affections des parties molles (fibromyalgie...) et les affections osseuses (ostéoporose...). Parmi les rhumatismes inflammatoires, l’arthrite rhumatoïde (AR) fait partie des maladies articulaires inflammatoires chroniques de l'adulte les plus fréquentes. En effet, elle concerne plus de 300 000 personnes en France et peut réduire l’espérance de vie des personnes atteintes. Bien que l’AR puisse se manifester à tout âge, elle apparaît généralement à l’âge adulte entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans et une incidence deux à trois fois plus élevée chez les femmes. Les répercutions psychologiques, fonctionnelles, professionnelles et sociales, de la pathologie sont importantes et en font un enjeu économique de santé majeur. En effet, la douleur est souvent le symptôme le plus contraignant pour les patients car elle peut persister malgré la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. Ainsi, bien que certains traitements soient proposés aux patients, ils n’en restent pas moins uniquement symptomatiques et parfois peu efficaces sur l’évolution de la pathologie et la gestion de la douleur. A ce jour, il est donc impératif de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Depuis ces dernières années, le développement de traitements pour les maladies articulaires a permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Même si certaines de ces stratégies s’avèrent efficaces dans l’amélioration des symptômes et permettent parfois une rémission complète et prolongée, le pronostic d’évolution de la pathologie reste mauvais pour de nombreux patients. En effet, les déformations articulaires ainsi que la destruction des tendons contraignent parfois les médecins à avoir recours à la chirurgie orthopédique. Par ailleurs, de part leurs comorbidités, certains traitements ne peuvent être proposés à certains patients. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un suivi plus personnalisé et d’aboutir à une rémission complète de tous les patients. Ce projet permettra donc de tester l’efficacité et de mieux définir les fenêtres d’action thérapeutiques (doses, période optimale de traitement…) de différents candidats médicaments dans les maladies articulaires.

Procédures

1) Induction de la pathologie : les animaux pourront être soumis à une ou plusieurs injections afin de mettre en place le modèle (1 minute maximum). Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale (5min) ou non selon le mode d’injection décrit dans la procédure. 2) Administrations répétées de composés client (2 fois par jour au maximum): les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront environ une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). 3) Prélèvement de sang : A l’appréciation du client (maximum 2 fois par semaine pour des petits prélèvements inférieurs à 8% du volume sanguin total, 1 fois pour ceux supérieurs à 8%), un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal. Exemple de différents prélèvements qui pourront être effectués sur un animal de 25g. - Veine de la queue sur animal vigile : 10 μL – à la joue sur animal vigile : 135 μL - sinus retro-orbital sur animal anesthésie : 135 μL Les différents modes de prélèvements dureront maximum 1 minutes.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées à la pathologie pourront être observées sur les animaux telles que : - Perte de poids - Posture prostrée - Absence d’hygiène corporelle : poil hérissé - Difficultés locomotrices - Douleur - Œdèmes et atteintes des articulations - Stress lié à l’isolation des animaux en cages individuelles pendant 24 à 60h (activmètre) - Stress et douleur liés à l'utilisatuon d'un test de douleur. De plus, l’injection de certains inducteur de la maladie peut provoquer une inflammation au niveau de la queue. La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra également générer un stress chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.

Remplacement

Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux ne pourra pas être évitée. En effet, comme vu précédemment, les maladies articulaires telles que l’arthrite rhumatoïde présentent des origines diverses (facteurs immunologiques, environnementaux, hormonaux, génétiques). Les modifications physiopathologiques liées à ces pathologies sont très complexes et nécessitent la mobilisation de nombreux effecteurs cellulaires et moléculaires ainsi que la rupture dans la coordination de leur intervention au niveau systémique. Il s’agit de maladies évolutives qui, une fois déclenchées, s’aggravent progressivement et s’étendent à d’autres articulations. La douleur est un problème majeur chez les patients car elle persiste bien après la prise en charge thérapeutique par des anti-inflammatoires par exemple. Il est donc inévitable d’utiliser les modèles animaux dans l’étude de l’efficacité de nouvelles thérapies qui doivent impérativement prendre en compte le paramètre de la douleur. Par ailleurs, l’analyse de l’efficacité d’un candidat médicament nécessite de prendre en compte le caractère systémique afin d’appréhender son action sur les différentes complications dont la contribution dans la pathologie peut influencer positivement ou négativement l’impact thérapeutique. Nous devons être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, lorsque cela est possible, l’impact in-vitro ou ex-vivo des candidats médicaments sera initialement évalué en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux minimum seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63 en unités individuelles ventilées avec enrichissement de l’environnement (igloo et carrés de ouate). L'état de santé des animaux sera évalué selon des critères en accord avec le comité́ de suivi du bien - être animal de notre établissement. L’expérimentateur sera alors prévenu et une dégradation trop importante de l'état de santé (au-delà d'un score de 8 selon les critères détaillés dans les procédures, score 1) pourra entrainer l'arrêt immédiat de l'expérimentation. Par ailleurs, dès lors que la pathologie sera induite, les expérimentateurs procéderont à un suivi quotidien des animaux (le suivi du week-end sera effectué par le personnel de la zone d'expérimentation) afin d’identifier les atteintes spécifiques à la pathologie (grilles de score spécifiques permettant de définir les points limites). Certains critères suffiront à eux seuls pour acter l'arrêt de l'expérience, tels qu'une perte de poids trop importante ou une immobilité totale. Par ailleurs, dès lors qu’une inflammation d’une articulation et/ou une difficulté de mobilité seront observées, de la nourriture humidifiée et de l’eau gélifiée seront ajoutés dans la cage.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement d’arthrite rhumatoïde compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la réponse inflammatoire. L’ensemble des modèles décrits dans ce projet nécessite l’utilisation de souris adultes car l’arthrite rhumatoïde apparaît généralement entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans. Le modèle de développement de l’arthrite rhumatoïde nécessite l’utilisation d’animaux âgés de 6 semaines, c’est-à-dire un âge auquel la sensibilité au développement de la pathologie est optimale. Le modèle d’induction de l’arthrite rhumatoïde par transfert de sérum nécessite d’une part, des souris présentant les premiers signes de développement de la pathologie à partir de 8 semaines et permettant de fournir le sérum nécessaire à l’injection et, d’autre part, des souris âgées de 6 à 10 semaines qui recevront le sérum. Les autres modes d’induction nécessiteront l’utilisation d’animaux âgés de 6 à 10 semaines.

40 souris porteuses de la mutation Fmr1 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies du cerveau sous anesthésie générale, l'une d'environ une heure pour une injection intracérébrale, l'autre pour implanter une canule et une fibre optique, puis reçoit des injections répétées et passe trois tests d'interaction sociale de dix minutes dans une arène. Le porteur cherche à savoir laquelle de deux voies nerveuses porte l'amélioration du comportement social observée quand une région du cerveau est stimulée. Il écrit que la mise à mort "constitue la solution la plus éthique et la plus conforme aux exigences scientifiques", après avoir précisé que les canules et les modifications cérébrales interdisent toute réutilisation des animaux.

Objectifs

Une petite région du cerveau joue un rôle important dans la régulation des interactions sociales chez la souris. Chez certaines souris qui présentent des difficultés sociales similaires à celles observées dans l’autisme, stimuler cette zone du cerveau améliore nettement leurs interactions. Cette zone reçoit des informations venant de deux endroits différents du cerveau. Nous voulons comprendre lequel de ces deux endroits est responsable de cette amélioration. Pour le savoir, nous allons d’abord empêcher l’un de ces deux chemins de fonctionner. Ensuite, nous activerons très précisément l’autre chemin grâce à une petite molécule qui peut être contrôlée par la lumière. Si l’amélioration disparaît lorsque le premier chemin est bloqué, cela voudra dire que c’est le plus important. Si l’amélioration est toujours là, alors c’est l’autre chemin qui joue le rôle principal. Nous réalisons cette expérience uniquement sur les souris présentant des difficultés sociales, car ce sont les seules qui permettent de répondre clairement à cette question.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à comprendre comment le cerveau contrôle les comportements sociaux chez des souris qui présentent des difficultés proches de celles observées dans certains troubles du développement. Deux zones du cerveau pourraient être responsables de ces difficultés, et notre objectif est d’identifier laquelle joue le rôle principal. Pour cela, nous comparerons l’influence de deux chemins différents du cerveau et déterminerons lequel est indispensable pour améliorer le comportement social lorsque nous stimulons une région précise. Les résultats de ce travail permettront de mieux comprendre ce qui, dans le cerveau, contribue aux difficultés sociales observées dans ce modèle de trouble du développement. À long terme, ces connaissances pourraient aider à orienter des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour les personnes présentant des troubles du spectre autistique.

Procédures

Les animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première consiste en une chirurgie (environs 1h) d’injection dans le cerveau. La seconde consiste en une chirurgie d’implantation d’un dispositif permettant des injections et des stimulations ultérieures. Au cours du protocole, les animaux recevront plusieurs injections de médicaments. Certaines injections seront réalisées par voie intrapéritonéale, d’autres seront effectuées localement dans le cerveau à l’aide du dispositif implanté. Les animaux seront également manipulés pour être connectés à un dispositif optique et participer à des tests de comportement social réalisés dans une arène dédiée. Les animaux réaliseront trois tests de comportement de 10 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont globalement modérés et transitoires. Après les chirurgies, les animaux peuvent présenter une douleur légère, une diminution d’activité ou de l’appétit pendant 3 à 4 jours, ainsi qu’un faible risque d’inflammation locale ou d’infection au niveau de la plaie. La présence de la canule peut entraîner une gêne mécanique durant quelques jours. Les injections intracérébrales peuvent théoriquement provoquer une réaction inflammatoire limitée, bien que jamais observée dans nos travaux précédents. Les manipulations (contention, connexion à la fibre optique, injections) peuvent générer un stress ponctuel, de très courte durée. Les injections intrapéritonéales peuvent causer une petite gêne immédiate au point d’injection. Les anesthésies comportent un risque faible d’hypothermie ou de ralentissement respiratoire, maîtrisé par une surveillance adaptée. L’ensemble de ces effets est généralement réversible en moins d’une semaine.

Devenir

À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés conformément aux méthodes réglementaires en vigueur. Cette étape est indispensable car les analyses finales nécessitent l’examen du cerveau pour vérifier la bonne localisation des injections, l’efficacité du knock-down et l’implantation correcte du matériel. Ces vérifications histologiques sont essentielles pour interpréter correctement les résultats et garantir la validité scientifique du projet. Par ailleurs, la présence des canules et les modifications cérébrales induites ne permettent pas de réutiliser les animaux dans un autre protocole. L’euthanasie constitue donc la solution la plus éthique et la plus conforme aux exigences scientifiques.

Remplacement

Pour mieux comprendre l’autisme et trouver de nouvelles pistes de traitement, les chercheurs ont besoin de modèles qui permettent de reproduire certains aspects de cette condition. Les souris utilisées dans ce type d’étude présentent des difficultés sociales qui ressemblent à celles observées chez certaines personnes autistes. Observer leur comportement est la seule façon de savoir si ces modèles sont fiables et s’ils peuvent réellement aider la recherche. C’est aussi la seule manière de tester si un traitement potentiel fonctionne : pour l’autisme, il n’existe pas de prise de sang, d’analyse ou de mesure biologique permettant d’évaluer l’amélioration. Tout repose sur le comportement. C’est pour cette raison que l’étude doit être faite sur l’animal entier, qui peut montrer toute la palette de ses comportements sociaux, d’exploration et d’interaction. Ces observations sont indispensables pour faire avancer la compréhension de l’autisme et le développement futur de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été choisi pour être le plus faible possible, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables, conformément aux recommandations éthiques. De plus, toutes les manipulations seront réalisées exclusivement sur des souris mutantes, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés en évitant l’inclusion de groupes supplémentaires non nécessaires.

Raffinement

«Nous mettrons en œuvre des mesures de raffinement visant à limiter au maximum la douleur, l’inconfort et le stress des animaux tout au long du protocole. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie adaptée, et une analgésie sera mise en place afin de réduire la douleur péri- et post-procédurale. Une surveillance clinique renforcée sera assurée après les interventions et au cours des manipulations, avec l’application de points limites adaptés permettant d’interrompre la procédure ou de mettre en œuvre les mesures appropriées si l’état de l’animal le nécessite. Après la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (quatre souris par cage) et bénéficieront d’un enrichissement du milieu (matériel de nidification, cabane en carton). Les animaux seront habitués et manipulés quotidiennement par le même expérimentateur afin de réduire le stress lié aux manipulations. Comme l’autisme touche aussi bien les hommes que les femmes, nous utiliserons des animaux des deux sexes. Enfin, l’optopharmacologie constitue un raffinement supplémentaire, car elle permet d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle grâce à l’activation et l’inactivation réversibles du composé par la lumière, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaires.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, ce qui permet d’étudier facilement les difficultés d’interaction, un symptôme important observé dans l’autisme. Elles disposent aussi d’un répertoire de comportements variés, ce qui permet d’évaluer d’autres aspects liés à cette pathologie. Les troubles observés chez les souris utilisées comme modèle d’autisme sont suffisamment marqués pour vérifier que le modèle est pertinent et pour tester si certains traitements peuvent améliorer leur comportement. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), moment où leurs comportements sont pleinement développés et où les difficultés sociales sont bien établies.

Proposés à l'adoption par une association après six mois d'utilisation, dix lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fois par semaine, chacun est attaché pendant que plusieurs centaines de poux de corps humains d'élevage se nourrissent de son sang, la séance pouvant durer environ deux heures pour les cinq stades du parasite. Le porteur décrit une irritation passagère et un inconfort lié à la contention, et prévoit une mise à mort seulement en cas de maladie grave ou d'impossibilité de placement. Il affirme que le lapin est la seule espèce sur laquelle ces poux, sélectionnés il y a plusieurs décennies, peuvent survivre, et que ce nourrissage reste "nécessaire" le temps de mettre au point une alternative in vitro.

Objectifs

L'infestion de la peau et des cheveux par des poux touche des millions de personnes dans le monde et est toujours très fréquente en France, notamment chez les enfants scolarisés. Les poux représentent un problème de santé publique et un coût financier non négligeable pour les populations touchées. Afin de lutter contre ces parasites, il est important de tester l'efficacité des nouveaux produits antipoux avant leur mise sur le marché. Cependant, il est très difficile de se procurer des poux sur les humains. C'est la raison pour laquelle, des poux d’élevage sont utilisés avec l'avantage d'être disponibles en grande quantité à tout moment de l'année. Ce sont des poux de corps humains sélectionnés il y a plusieurs décennies, pour leur capacité à se nourrir du sang de lapin pour assurer leur survie. Le lapin est la seule espèce animale disponible pour l'élevage de poux. L'objectif du projet est de maintenir l'élévage de poux en les nourrissant sur des lapins puis de tester sur ces poux, l’efficacité de produits capables de tuer poux et lentes, ou de répulsifs développés par l'industrie pharmaceutique. De par cette expertise sur les poux et les antipoux, le deuxième objectif est de diffuser les connaissances nécessaires à la lutte contre la pédiculose auprès des étudiants, des services scolaires (interventions dans les écoles) et du grand public (conseils aux familles, expertise auprès des médias), confrontés à cette infestation.

Bénéfices attendus

Les résultats du projet permettront d'orienter le développement de produits antipoux et répulsifs efficaces et de conseiller leurs utilisateurs.

Procédures

Les animaux subiront la piqûre de poux une fois par semaine pendant 6 mois.

Impact sur les animaux

Les lapins seront hébergés individuellement en box de 1,3 m x 0,5 m, avec contacts visuels et auditifs entre congénères et non collectivement pour éviter les conflits. La contention du lapin nécessaire pendant le nourrissage des poux peut engendrer du stress. Les lapins pèsent plusieurs kilos et il est indispensable de les attacher pour assurer leur sécurité, ce qui peut provoquer un inconfort le temps de la procédure. Les liens sont en tissu et ne provoquent pas de blessures, irritations ou dépilation. Les poux des différents stades (adultes et 4 stades larvaires) ne doivent pas être mélangés. Les poux mettent environ 15-20 minutes à prendre un repas complet, ce qui fait une durée totale d’environ 2 heures pour le nourrissage des 5 stades en prenant en compte leur dépôt et leur ramassage. Si la quantité de poux est faible, deux stades peuvent être déposés côte à côte, ce qui diminue cette durée. Le nourrissage des poux (plusieurs centaines) peut entraîner une irritation passagère qui disparaît après quelques minutes.

Devenir

A l'issue de la procédure hebdomadaire, les animaux sont hébergés à l'animalerie. Après une période de 6 mois d'utilisation, tous les animaux seront proposés à l'adoption en famille d'accueil par l'intermédiaire d'une association. Les animaux ne seront mis à mort qu'en cas de pathologie grave indépendante de la procédure, de blessure grave accidentelle ou d'impossibilité de les placer en fin de projet. La décision de mise à mort sera préalablement soumise aux responsables du projet initial et au vétérinaire référent.

Remplacement

Le nourrissage des poux sur animal vivant est le seul moyen à ce jour de garantir la survie des poux, insectes hématophages stricts à tous les stades (adultes et larves), et le maintien du cycle (reproduction et pontes). Le lapin est le seul animal sur lequel les poux humains ont été adaptés il y a plusieurs décennies. Ces poux d’élevage meurent en cas d’ingestion de sang humain, puisqu’ils ne sont plus capables de le digérer. Le nourrissage sur lapin est nécessaire le temps de mettre en place un mode de nourrissage in vitro des poux sur sang de lapin permettant l'obtention d'une colonie conséquente et viable sur plusieurs générations.

Réduction

Le nourrissage des poux se fait par roulement sur 4 lapins. Afin de réduire les contraintes individuelles, la durée d’utilisation de ces lapins sera limitée à 6 mois, soit 8 lapins pour la durée du projet. Deux animaux supplémentaires sont prévus pour compenser l'éventuelle sortie prématurée d’animaux du projet.

Raffinement

Les lapins seront hébergés en accord avec les directives européennes, individuellement en box de 1,3 m x 0,5 m, avec contacts visuels et auditifs entre congénères, afin d’éviter les conflits en hébergement collectif. Le sol des box sera recouvert de copeaux de bois pour un plus grand confort et muni d'une tablette leur permettant de grimper ou de se cacher. De plus, leur environnement sera enrichi d’une balle en plastique pour jouer et régulièrement d'un bouchon de fibres pour se faire les dents. Des enrichissements seront ajoutés ponctuellement pour varier leur quotidien ("rabbit relaxer" par exemple). Une grille scorée basée sur l'échelle d’évaluation des expressions faciales éditée par le National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research (NC3Rs) sera utilisée pour évaluer l’état sanitaire des lapins. Les signes pris en compte seront la contraction orbitaire, l’aplatissement des joues, la position « tombante » du museau, des moustaches et des oreilles avec les scores absent (0), modéré (1) et évident (2). Une acclimatation d’une semaine est prévue à l’arrivée des lapins et une habituation à la procédure est mise en place sur plusieurs jours avant le tout premier nourrissage des poux. A chaque étape d'habituation et après chaque nourrissage des poux, le lapin recevra de la carotte de culture biologique en renforcement positif. A la fin du projet, les lapins seront proposés à l’adoption en famille d’accueil par l’intermédiaire d’une association.

Choix des espèces

Le lapin est la seule espèce sur laquelle les poux de corps humains d’élevage peuvent se nourrir et assurer leur survie sur plusieurs générations. Les adultes sont préférables pour avoir une surface de peau la plus grande possible et ainsi réduire la durée de nourrissage des poux.

Capturées, anesthésiées, ouvertes pour recevoir un émetteur acoustique ou un capteur enregistreur, puis remises à l'eau après moins de quinze minutes d'opération : 200 jeunes truites de mer sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le suivi porte sur leurs trajectoires en mer et sur leur passage dans les parcs éoliens en mer. Le porteur retient cet effectif en tenant compte d'une mortalité naturelle de plus de 90 % entre le départ vers la mer et le retour en rivière, sur une population de smolts estimée entre 8 000 et 10 000 individus. Les truites recapturées porteuses d'un capteur enregistreur sont tuées, le tissu cicatriciel formé autour du matériel rendant son extraction incompatible avec leur survie.

Objectifs

Les poissons migrateurs sont pour la plupart en déclin en raison notamment de l’impact des activités anthropiques qui interviennent sur l’ensemble des habitats du continuum terre/mer. Dans les eaux côtières, les captures accidentelles et la présence des parcs éoliens offshores sont autant de pressions qui sont susceptibles de fragiliser un peu plus ces espèces en causant des mortalités et/ou modifications de leurs parcours migratoires. La connaissance de l’utilisation des eaux marines côtières par ces espèces est cruciale pour déterminer les zones et périodes où elles sont susceptibles d’être en interaction avec ces pressions, mais elle reste à ce jour très incomplète. Un précédent programme de recherche a toutefois permis des avancées notables dans la compréhension des trajets migratoires des salmonidés en mer. Entre 2018 et 2019, 105 truites de mer au stade juvénile ont été équipées d’émetteurs acoustiques. En parallèle l’estuaire du fleuve étudié avait été équipé de récepteurs qui a permis d’analyser la dynamique de dévalaison des individus et d’évaluer la mortalité estuarienne. Depuis lors, de nombreux autres récepteurs ont été déployés au sein des parcs éoliens offshores et au niveau d’autres infrastructures, l’ensemble étant intégré dans le cadre d'un réseau européen de récepteurs. Ce réseau offre l’opportunité de mettre en place un suivi par télémétrie acoustique au-delà de la zone estuarienne afin de fournir des informations sur les trajectoires marines des individus et d’identifier des zones de mortalité. De plus, pour les individus les plus grands, un double marquage émetteur acoustique et capteurs-enregistreurs (température et de pression) permettent de reconstruire plus finement les trajectoires marines. L’objectif est double : 1- produire des connaissances sur l’écologie des truites de mer au stade juvénile et 2- évaluer le niveau de fréquentation des parcs éoliens offshores.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : Les phase marines des populations de poissons migrateurs effectuant des migrations entre milieu marin et eau douce, populations globalement menacées par différentes pressions d’origine anthropique, restent très mal connues. Cette méconnaissance complique leur gestion. Ce projet vise à produire des connaissances sur les trajectoires de migration marine des juvéniles de truites de mer à large échelle en mer et il viendra compléter d’autres projets concernant les adultes. Par ailleurs, dans le contexte de développement des énergies marines renouvelables (parcs éoliens offshore), les données permettront une première évaluation du recouvrement des trajectoires des truites de mer et des parcs éoliens. Compte-tenu de sa dépendance au milieu côtier, la truite de mer pourrait être fortement exposée aux nombreuses pressions (bruit, modification des champs électro-magnétiques, etc.) exercées des parcs éoliens offshore. Les impacts de ces pressions récentes, qui s’additionnent aux autres, doivent être évaluées dans le cadre des politiques publiques.

Procédures

1- procédure chirurgicale : Insertion par chirurgie de capteurs-enregistreurs ou d'émetteur (réalisée sous anesthésie). Durée inférieure à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Insertion par chirurgie du matériel scientifique est réalisée sous anesthésie : les nuisances potentielles (douleurs, saignements, infection) sont limitées par l'utilisation de mesures prophylactiques et des traitements adaptés et définis avec la collaboration d'un vétérinaire spécialisé. Cette intervention est considérée comme « modérée ». Les individus sélectionnés auront une gamme de poids (min-max) qui leur permettra de supporter l'insertion du matériel scientifique selon les recommandations de la littérature en termes de ratio masse du matériel/masse de l’individu.

Devenir

Après la procédure chirurgicale, tous les individus sont relâchés dans leur milieu naturel pour être suivi. En cas de recapture d’individus marqués avec des émetteurs acoustiques, ceux-ci seront relâchés après contrôle de leur état et mesure (taille, masse). En cas de recapture d’individus équipés de capteurs-enregistreurs contenant des données à récupérer, ceux-ci seront mis à mort. Les individus développent un tissu conjonctif autour du matériel lors du processus de cicatrisation, leur extraction n’est pas compatible avec la survie de l’animal.

Remplacement

L'objectif de l'étude est de produire des connaissances sur l’écologie de la truite de mer (comportement dans le milieu naturel). Le modèle biologique ne peut être substitué par des alternatives non animales.

Réduction

L’effectif de truites de mer au stade jvénile à marquer (200) est choisi en fonction des connaissances actuelles sur la mortalité naturelle de ces individus entre leur départ et leur retour de mer (>90-95%). Les données de géolocalisation des poissons par les hydrophones permettront de retracer les trajectoires et l’histoire de l’ensemble des poissons marqués qui pourront être analysées seules ou en combinaison avec les données issues des capteurs-enregistreurs quand les poissons auront les deux types de marques, et ce, même en cas de mortalité avant le retour en rivière. La taille d’échantillon résulte ainsi d’un équilibre entre minimisation de l’impact sur la population de smolts de truite de mer (estimée entre 8000 et 10000 individus lors de la saison 2023/2024 dans le fleuve étudié) et qualité et quantité de données acquises. L’échantillon recueilli au final sera de taille modeste, mais les données haute-fréquence acquises seront très informatives et permettront de produire des connaissances nouvelles notamment évaluer les habitats utilisés par les smolts, les trajectoires en mer et les zones de mortalité.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après la chirurgie et la limitation des risques d'infection postopératoire. La combinaison d'utilisation de produits anesthésiques de concentration adaptée (1- concentration pour l'anesthésie pré-opératoire et 2- pour le maintien de l'anesthésie pendant l'opération) et d'antalgiques limitent directement l'angoisse et la douleur pendant et après l'opération et l'administration d'antibiotiques limite les risques d'infections liés à l'opération. Les mesures prophylactiques classiques (désinfection du matériel) limitent également les sources d'infection pouvant induire des nuisances post-opératoires. Les opérations de chirurgie seront effectuées par du personnel habilité et spécifiquement formé par un vétérinaire. Le protocole opératoire est co-construit avec un vétérinaire. Pendant l’opération, un tube alimenté en eau sera introduit dans la bouche des poissons pour maintenir un bon niveau d’oxygénation des branchies. L’eau utilisée sera celle du milieu naturel et sa température sera contrôlée pendant toute la durée de l’opération. Après l’opération, les individus seront gardés en observation en vivier alimenté en eau de rivière le temps de contrôler la façon dont ils récupèrent de l'anesthésie et seront relâchés lorsqu'ils auront retrouvé un comportement actif normal (équilibre dans la colonne d'eau, nage). Les volumes des viviers permettent aux individus d'évoluer confortablement.

Choix des espèces

La truite de mer et plus précisément son comportement dans le milieu naturel, est l’objet même de l’étude, il ne s’agit pas d’un modèle biologique utilisé pour tester une hypothèse. Compte-tenu de sa dépendance au milieu côtier, la truite de mer pourrait être fortement exposée aux nombreuses pressions (bruit, modification des champs électro-magnétiques, etc.) exercées des parcs éoliens offshore. Les impacts de ces pressions récentes, qui s’accumulent aux autres, doivent être évaluées dans le cadre des politiques publiques. Les individus concernés sont des juvéniles en cours de migration vers la mer, appelés smolt, dont on veut étudier la migration marine. La taille de ces juvéniles, dans la population étudiée, varie entre 100 et plus de 300mm.