Procédures modérées
Évaluation des effets bénéfiques d’un anticorps anti-X dans deux modèles murins de maladie rénale chronique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système urogénital
Deux chirurgies rénales à une semaine d'intervalle pour 80 souris, un régime enrichi en adénine pendant sept semaines pour 48 autres, et pour 32 d'entre elles une ration quotidienne calquée sur ce que mange le groupe témoin pendant quatre semaines. 160 souris sont utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale après anesthésie. S'y ajoutent une perforation de l'oreille, quatre injections hebdomadaires, un jeûne de six heures et le port d'un capteur pendant une heure sur animal vigile. L'anticorps testé a été développé par un laboratoire pharmaceutique contre la dénutrition dans un autre domaine, et le porteur justifie le passage par l'animal en invoquant la réglementation, qui "impose de disposer de résultats précliniques solides avant d'autoriser un essai chez l'Homme".
Objectifs
La maladie rénale chronique (MRC) est un problème de santé publique. Elle touche environ 10 % de la population mondiale et près de 6 millions de personnes en France. Elle correspond à une perte progressive et irréversible du fonctionnement des reins et s’accompagne de nombreuses complications cardiovasculaires, métaboliques et nutritionnelles (perte de poids et notamment de muscles). Des analyses récentes ont montré que plus la MRC est sévère, plus le taux dans le sang d’une certaine protéine (appelée ici X) est élevé. Dans un autre domaine de recherche que la MRC, un laboratoire pharmaceutique a développé un anticorps contre cette protéine pour lutter contre la dénutrition et la perte de muscles. Grâce à une collaboration avec ce laboratoire, nous souhaitons tester si cet anticorps peut aussi prévenir la dénutrition et la perte de muscles dans deux modèles de MRC chez la souris : • Le modèle adénine où un régime alimentaire spécifique entraîne la formation de cristaux dans les reins provoquant des lésions. • Le modèle chirurgical où une partie du rein est retirée. La partie restante doit alors travailler beaucoup plus ce qui finit par l’abîmer. Nous testerons deux façons d’utiliser l’anticorps : 1. Traitement précoce : l’anticorps est donné en même temps que l’induction de la MRC. 2. Traitement curatif : l’anticorps est donné après que la MRC a commencé à se développer, avec ou sans un régime pauvre en protéines. Ce type de régime est souvent utilisé pour ralentir la progression de la maladie, mais il peut augmenter le risque de dénutrition. Nous vérifierons donc si l’association anticorps + régime pauvre en protéines apporte un bénéfice supplémentaire par rapport à chaque stratégie prise séparément. Comme l’anticorps pourrait aussi augmenter naturellement l’appétit, nous utiliserons une méthode appelée pair-feeding. Cela signifie qu’un groupe de souris traitées recevra exactement la même quantité de nourriture qu’un groupe non traité. Cela permettra de savoir si les effets observés viennent vraiment de l’anticorps et non simplement d’une augmentation des apports alimentaires. Objectif principal : déterminer si l’anticorps peut améliorer les problèmes majeurs liés à la MRC — baisse de la fonction rénale, dénutrition et perte de muscles —, qui sont également des complications importantes chez les patients humains.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet servira à vérifier si un traitement avec l’anticorps anti-X, donné dans à stade précoce de la maladie ou pour soigner quand la maladie est déjà installée, peut améliorer le fonctionnement des reins et réduire les complications de la maladie rénale chronique (perte de poids et de muscles). Pour l’instant, on ne sait pas encore quels sont les effets de cet anticorps dans cette situation. Si les résultats sont bons, ils représenteront une étape importante vers la préparation d’une étude clinique chez l’Homme. À plus long terme, ces recherches pourraient permettre de développer une nouvelle façon de traiter la maladie rénale chronique, afin d’améliorer le fonctionnement des reins, l’état nutritionnel et la qualité de vie des patients.
Procédures
Les 160 animaux seront identifiés une fois par une perforation de l’oreille (≈1 mm, 20 sec avec contention). Induction de la maladie rénale : – 1ère étude (modèle adénine) : 48 souris recevront une alimentation enrichie en adénine, quotidiennement (sauf week-ends) pendant 7 semaines. – 2nde étude (modèle chirurgical) : 96 souris recevront 4 injections anesthésiantes (1 anesthésie générale + 1 locale à chaque chirurgie,
Impact sur les animaux
L’identification des animaux par une petite perforation de l’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée. Le régime alimentaire riche en adénine, utilisé pour provoquer la maladie rénale, réduit l’appétit et ralentit la prise de poids des animaux. Cela peut entraîner un inconfort. La méthode qui consiste à donner une quantité précise de nourriture à un groupe pour qu’il mange autant que le groupe contrôle peut créer une frustration, de la fatigue ou du stress, car les animaux ne peuvent pas manger autant qu’ils le souhaitent. De même, un régime pauvre en protéines peut entraîner une perte de poids. Les pesées régulières représentent un petit stress momentané. Les injections, que ce soit pour administrer l’anticorps, un placebo ou des produits d’anesthésie/analgésie, provoquent un stress court et une douleur légère. Aucune nuisance n'est attendue suite à l'injection de l'anticorps anti-X. Les deux opérations nécessaires dans le modèle chirurgical peuvent entraîner une douleur après l’intervention, du stress temporaire et un risque classique de complications liées à la chirurgie ou à l’anesthésie. Dans nos expériences précédentes, la mortalité associée à cette procédure était inférieure à 5 %, et survenait surtout dans les 24 à 48 h suivant la seconde chirurgie. Les mesures de composition corporelle nécessitent de placer brièvement la souris dans un petit tube pendant moins de deux minutes ; cela peut provoquer un stress léger. L’évaluation de la fonction du rein implique une courte anesthésie gazeuse pour l’injection du produit et la pose du capteur, puis le port du capteur pendant environ une heure. Cela peut entraîner un inconfort temporaire. La période de jeûne de six heures, indispensable pour étudier le métabolisme du glucose, peut générer un inconfort modéré. La petite prise de sang au niveau de la queue provoque une gêne brève et légère. Aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires dans notre laboratoire. Toutes les procédures sont réalisées par un personnel formé, avec une surveillance adaptée, afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.
Devenir
Les 160 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le traitement par l’anticorps anti-X doit d’abord être testé chez l’animal avant d’être donné à l’être humain. Cette étape est nécessaire pour vérifier s’il est efficace et pour repérer d’éventuels effets indésirables. La réglementation impose de disposer de résultats précliniques solides avant d’autoriser un essai chez l’Homme. Les tests chez l’animal sont donc indispensables pour justifier l’utilisation de ce traitement chez les patients atteints de maladie rénale chronique.
Réduction
Le traitement par l’anticorps anti-X n’a encore jamais été testé dans la maladie rénale. En revanche, il a déjà été utilisé chez la souris pour d’autres maladies, ce qui nous laisse penser qu’il pourrait avoir un effet et limite le risque d’utiliser des animaux sans raison valable. Le nombre de souris nécessaires dans chaque groupe a été déterminé grâce à un calcul statistique. Ce calcul s’appuie sur nos résultats obtenus dans des études précédentes chez des souris avec une maladie rénale. Selon ce calcul, 16 animaux par groupe sont nécessaires pour détecter une différence réelle. Nous avons également choisi des méthodes non invasives (analyse de la composition corporelle et mesure de la fonction rénale) qui peuvent être faites deux fois sur les mêmes animaux : avant et après le traitement. Cela permet de réduire le nombre total d’animaux. Enfin, un maximum de tissus sera collecté au moment de la mise à mort et conservé. Ces échantillons permettront de répondre à d’autres questions scientifiques ou d’être utilisés dans des collaborations, évitant ainsi de refaire des expériences et de réutiliser des animaux inutilement.
Raffinement
Toutes les manipulations seront réalisées par trois expérimentateurs expérimentés afin de garantir des gestes rapides et précis. Les animaux seront manipulés avec douceur, dans un environnement calme, et observés cinq fois par semaine. La prise alimentaire et hydrique sera mesurée deux fois par semaine par cage, et le poids individuel suivi deux fois par semaine. Pour la composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au tube de mesure (un entraînement à l’entrée dans le tube une semaine avant la mesure), ce qui réduira le stress durant la séance. Dans le cadre de la restriction alimentaire, plusieurs mesures limiteront le stress : rations ajustées tous les deux jours selon la consommation du groupe contrôle, distribution à horaire fixe, nourriture répartie en plusieurs points, et enrichissement supplémentaire des cages. L’alimentation enrichie en adénine sera interrompue chaque week-end pour limiter la perte de poids sans compromettre l’induction de la maladie. Les croquettes seront préparées avec du cacao pour maintenir une bonne appétence. Les volumes d’injection (anticorps, placebo, anesthésiques, analgésiques) seront réduits au minimum nécessaire. Pour la mesure de la fonction rénale, une anesthésie gazeuse légère et brève facilitera l’injection du produit et la pose du capteur ; un collyre anesthésique sera appliqué. Pendant l’enregistrement (≈60 min), les animaux resteront vigiles, dans leur cage, sous surveillance rapprochée. Les chirurgies rénales seront réalisées par du personnel expérimenté. L’anesthésie générale sera adaptée au poids et surveillée en continu, complétée par une anesthésie locale. Des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention. Au réveil, les animaux seront placés au chaud et surveillés jusqu’à récupération complète, puis feront l’objet d’un suivi post-opératoire renforcé. La planification en deux étapes réduit la sévérité de chaque chirurgie et permet une induction progressive de la maladie. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour un prélèvement de sang, puis mis à mort par dislocation cervicale. Des points limites précis permettront une détection précoce de toute souffrance ou dégradation de l’état général.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour étudier la maladie rénale chronique. Les deux méthodes utilisées pour induire la maladie entraînent une forme modérée qui reproduit les principales atteintes observées chez l’Homme. Ces modèles sont bien connus et largement utilisés. Le choix de cette espèce permet aussi de comparer nos résultats avec nos travaux précédents menés chez la souris avec un régime pauvre en protéines. Par ailleurs, l’anticorps anti-X a déjà montré une efficacité dans d’autres modèles murins, ce qui renforce la probabilité d’obtenir un effet dans les modèles utilisés ici. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, elles ont terminé leur croissance, ce qui assure des réponses plus homogènes. Le régime enrichi en adénine est bien toléré et les deux chirurgies sont correctement supportées. La maladie rénale induite à cet âge est bien caractérisée et reproductible.
Effets de vésicules extracellulaires provenant de bactéries à propriétés anti-inflammatoires sur le développement normal et pathologique de l’intestin chez des rongeurs
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Rats : 320
Des rates sont mises en gestation pour fournir des ratons utilisés dès la naissance, puis renvoyées à l'animalerie pour y servir de nouveau : ce sont les 80 seuls animaux du projet à ne pas être tués. 1 580 animaux non-humains sont utilisés en tout, 1 280 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger. Les souris reçoivent un gavage deux fois par semaine pendant seize semaines, une bague posée dans l'oreille au sevrage, des prises de sang à la queue et des mesures de motricité intestinale sous anesthésie pouvant durer trois heures, à l'endoscope ou à la bille. Le porteur numérote quatre tests comportementaux sans en nommer aucun, et affirme qu'aucun effet indésirable des vésicules bactériennes n'est rapporté dans la littérature chez les rongeurs.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde et a pour cause principale le vieillissement. Aucun traitement efficace n’existe pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et entraîne une perte progressive des neurones au niveau du cerveau. Un des signes physiopathologiques majeurs de la MA est l’accumulation dans le cerveau d’un peptide appelé Abeta qui à la longue altère la connectivité des neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives pouvant se manifester de façon très précoce, avant qu’apparaissent les premiers signes cérébraux. De plus, les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Enfin, il a été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du microbiote intestinal ainsi que de la quantité de métabolites produits par ce microbiote. L’inflammation est aussi une composante majeure de la pathologie et a été montrée comme stimulant la production de l’Abeta. Ce projet vise à apporter la preuve de concept qu’une approche thérapeutique utilisant des vésicules extracellulaires (VEs) bactériennes : 1) favorise le développement fonctionnel de l’intestin ; 2) prévient les altérations intestinales et/ou cérébrales chez un modèle murin de vieillissement accéléré évoluant vers une MA, ce qui pourrait ouvrir la voie à des traitements innovants ciblant le système nerveux entérique dans la MA. Les VEs seront produites à partir de bactéries à Gram+ ayant des propriétés anti-inflammatoires connues telles que Propionibacterium freudenreichii, une bactérie propionique laitière utilisée dans l’industrie agroalimentaire, et Faecalibacterium prausnitzii, une bactérie présente naturellement dans le microbiote intestinal. Du fait de leurs rôles ubiquitaires et leur biodisponibilité, les VEs sont perçues comme des acteurs et outils majeurs dans des approches thérapeutiques visant la santé humaine. De plus, des travaux récents montrent des effets bénéfiques de ces VEs dans des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Ce qui nous a permis d’émettre l’hypothèse que ces VES pourraient améliorer les fonctions et communications des neurones entériques et de la barrière épithéliale intestinale, baisser ou bloquer la neuro-inflammation intestinale et prévenir de ce fait les altérations des fonctions intestinales observées dans la MA.
Bénéfices attendus
Le déclin cognitif et digestif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (MA). Le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones et/ou de la paroi intestinale. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale au niveau intestinal pourrait aussi positivement impacter ceux du cerveau. C’est ainsi qu’une étude récente montre qu’une approche de supplémentation en probiotique montre des effets bénéfiques sur l’intestin et le cerveau dans un modèle murin de MA. Il apparait donc pertinent de penser qu’une approche utilisant des probiotiques non vivants comme les VEs provenant de bactéries ayant des propriétés anti-inflammatoires, aurait des effets bénéfiques sur le développement fonctionnel de l’intestin, mais aussi pourrait contrecarrer les effets délétères de la protéine responsable de la MA. Ainsi, la capacité de VEs d’intérêt à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action dans le développement fonctionnel normal et pathologique de l’intestin reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.
Procédures
1. Elevage des souris transgéniques - pose de la bague d’identification au moment du sevrage bague avec crème analgésique, sur l’oreille de l’animal (20 sec/pose de bague) 2. Étude du développement intestinal - pesée quotidienne (10 sec sur la balance pendant 21/22 jours) - - administration quotidienne de VEs à la pipette (20 sec pendant 21/22 jours)- mesure du temps de transit total (apparition crotte rouge, 4h maximum) - mesure du temps de transit colique (8 prélèvements maximum de selles toutes les 15 min, 2h au total) - mesure de la perméabilité intestinale in vivo : - contention + gavage 2 fois/semaine avec les VEs (30 sec, pendant 16 semaines) - mesure de motricité in vivo (3h max de l’anesthésie au réveil) 3. Étude de vieillissement pathologique évoluant vers des pertes de mémoire caractéristiques de la MA - pesée 2 fois/semaine (10 sec sur la balance, pendant 16 semaines) - contention + gavage 2 fois/semaine (30 sec, pendant 16 semaines) - mesure du temps de transit total (apparition crotte rouge, 2h maximum) - mesure du temps de transit colique (8 prélèvements maximum de selles toutes les 15 min, 2h au total) - mesure de la perméabilité intestinale in vivo : contention + gavage (30 sec) + prélèvement de sang à la queue sur animal vigile (1*30 sec) - test comportemental 1 (5 min à 2 mois et à 6 mois) - test comportemental 2 (10 min à 2 mois et à 6 mois) -- test comportemental 3 (30 min + 10 min + 10 min à 2 mois et à 6 mois) - - test comportemental 4 (10 min + 5 min à 2 mois et à 6 mois) - mesure de motricité in vivo avec un endoscope (3h max de l’anesthésie au réveil à 2 mois et à 6 mois) - mesure de motricité in vivo avec une bille (30min max de l’anesthésie au réveil à 2, 3, 4, 5 et 6 mois)
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant l’administration de VEs bactériennes chez les murins. La technique du micropipette-guided drug administration devrait permettre de limiter le stress lié à l’administration de vésicules exracellulaires. Le gavage des souris est limité à 2 fois par semaine pour limiter le stress et la douleur liés à au gavage, bien que cet acte soit pratiqué par un personnel entraîné.
Devenir
Mise à mort de tous les ratons et toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour analyser les protéines, l’expression des gènes et les tissus. Les rates gestantes utilisées pour produire les ratons seront réutilisées à l’animalerie.
Remplacement
L’étude des effets bénéfiques de postbiotiques comme les vésicules extracellulaires sur l’intestin dans un contexte physiopathologique nécessite une étude in vivo non seulement des fonctions intestinales, mais aussi des capacités comportementales qui ne peuvent, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.
Réduction
Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier les vésicules extracellulaires d’intérêt parmi plusieurs types de vésicules extracellulaires bactériennes, réduisant de manière significative le nombre d’animaux nécessaire. Parallèlement, des expérimentations similaires menées chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et de réduire le nombre minimum d’animaux par groupe. Pour étudier l’effet des vésicules extracellulaires bactériennes sur le développement intestinal, nous avons réduit au nombre minimum le nombre d’animaux nécessaires pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les rates gestantes seront seules dans leur cage avec de l’enrichissement (frisottis, tubes) leur permettant de déchiqueter, de jouer, se cacher et préparer leur nid. Les ratons seront gardés avec leur mère jusqu’à la fin de l’expérience. Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. L’ensemble des animaux sera également surveillé quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les animaux seront habitués à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.
Choix des espèces
Pour l’étude des effets de vésicules extracellulaires sur le développement fonctionnel de l’intestin en condition physiologique, le raton nouveau-né constitue un bon modèle adapté du fait de la facilité d’administration de composés par la technique d’administration à la pipette à partir de la naissance et la possibilité d’effectuer des études fonctionnelles après le sevrage. Le modèle de souris choisi est un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car c’est un modèle de vieillissement spontané puisqu’il ne présente aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, il se prête bien à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec des vésicules extracellulaires envisagée dans ce projet. Les travaux menés au sein du laboratoire in vitro ont également montré que ce modèle est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la maladie d’Alzheimer. Les souris seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon chronique par gavage jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les rats seront utilisés dès la naissance pour pouvoir évaluer les effets bénéfiques sur le développement fonctionnel de l'intestin et sur la barrière épithéliale intestinale. En effet, la mise en place des mécanismes fonctionnelles de l’intestin telle que la motricité se fait très tôt et une intervention au-delà de cette fenêtre de temps risque de ne pas être efficace.
Evaluation du potentiel souche des kératinocytes épidermiques sur un modèle de substituts de peau de nouvelle génération pour la régénération cutanée
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
192 souris vont être utilisées, chacune privée de ses congénères pendant seize jours pour qu'elles ne grattent pas les greffons des autres, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur retire un morceau de peau du dos sous anesthésie et on y greffe une peau humaine reconstituée en laboratoire, opération de quinze à vingt minutes qui peut entraîner une douleur modérée et une déshydratation pendant quatre jours. Toutes sont tuées pour que le greffon soit analysé. Le porteur revendique un milieu de culture sans sérum animal, mis au point pour répondre aux exigences réglementaires du médicament, et annonce des bio-pansements pour les grands brûlés, 3 500 cas graves par an en France, comme retombée à venir.
Objectifs
En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément. L’étendue de la brûlure et le risque élevé d’infection associé peut engager le pronostic vital de l’individu. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base sur l’utilisation de substituts de peau préparés avec les cellules du patient. Cependant, la longueur du procédé de fabrication peut mettre en jeu la vie du patient. La présence et le maintien de cellules souches épidermiques sont nécessaires à la bonne prise de greffe et à l’efficacité de recouvrement à long terme. Pour cela, nous avons développé et optimisé un milieu de culture sans sérum animal, permettant le maintien du potentiel de croissance in vitro de ces cellules à long terme et de leur capacité à former une peau reconstituée. L’objectif du projet est de valider l’efficacité in vivo et sur le long terme d’un substitut de peau humain préparé in vitro dans ces conditions optimisées correspondant aux exigences réglementaires d’un médicament et donc susceptible de servir de bio-pansements lors de greffe de peau.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d’évaluer le devenir et le maintien à long terme de cellules souches dans un greffon cutané humain pour favoriser une bonne prise de greffe, la maturation de la peau et son auto-renouvèlement tout au long de la vie d’un patient. Cette étape permettrait une avancée significative vers la conception de nouveaux substituts cutanés pouvant servir de bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés avec 3500 cas graves par an en France).
Procédures
Les animaux seront hébergés individuellement 2 jours avant la chirurgie et pendant toute la durée de l’expérience (14 jours). Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à une greffe de peau reconstituée sur le dos pour une durée moyenne de chirurgie de 15 à 20 minutes par souris.
Impact sur les animaux
L’anesthésie par injection peut provoquer chez les animaux une légère apathie au réveil pendant une ½ journée. Le retrait d’un morceau de peau et la greffe peuvent entrainer chez les animaux une douleur modérée et une légère déshydratation pendant 4 jours. Un stress peut être induit par la nécessité de placer les animaux en hébergement individuel le temps de la procédure (14 jours) pour éviter que les souris endommagent les greffons de leurs congénères, notamment par grattage. Il y a un risque d’infection de la plaie qui conduit à la sortie de l’animal de l’étude.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux inclus dans l’étude est nécessaire pour analyser au niveau histologique, cellulaire et moléculaire les substituts de peau greffés. Ces analyses viendront compléter les observations visuelles de la plaie et permettre de conclure à l’efficacité du substitut cutané.
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules et des reconstructions de substituts de peau humaine en 3 dimensions, les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe et des processus de cicatrisation ne peuvent être reproduits en laboratoire. Par exemple, les modèles de cicatrisation ex vivo qui reproduisent plus fidèlement la peau humaine sont limités par exemple par l’absence de mécanismes de coagulation ou d’inflammation. Le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n’est ainsi pas possible ici car seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire à long terme à la suite d’une xénogreffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études in vitro de culture cellulaire en 3 dimensions ont été effectuées pour valider la non toxicité et la fonctionnalité biologique de la peau greffée préparée dans des milieux de culture de composition compatible avec les critères d’exigence d’une future utilisation en clinique. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera assuré par l’utilisation de moyens d’enrichissement du milieu de vie des animaux par une visite quotidienne et la mise en place d’une anesthésie et analgésie avant, pendant et après la chirurgie. Pour pallier l’éventuelle perte de poids des animaux, une alimentation riche sous forme gélifiée sera placée au fond de chaque cage. En cas de déshydratation, des injections sous cutanées de liquide physiologique seront réalisées. En cas d’absence d’amélioration de leur état général, les animaux seront euthanasiés. Afin de réduire la souffrance animale. Une grille de suivi des animaux est mise en place et des points limites sont définis pour guider la mise en place de traitements adaptés ou la décision d’euthanasier les animaux.
Choix des espèces
Les souris seront utilisées au stade du jeune adulte (8 semaines). Ce choix résulte d’un compromis pour utiliser des souris à un stade de développement suffisamment avancé pour s’affranchir du cycle de croissance des souris (pouvant entrer en jeu dans les processus de greffe et de cicatrisation) mais suffisamment jeune pour s’affranchir des processus de vieillissement de la souris. Dans un premier temps, nous avons choisi l’espèce de souris sans thymus car c’est un modèle largement décrit dans la littérature pour évaluer la greffe et la cicatrisation de la peau humaine. De plus, ce choix vise à standardiser ce modèle de greffe de peau entre plusieurs laboratoires impliqués dans un projet de recherche commun. Le choix d’une deuxième lignée de souris pour rechercher une possible amélioration de notre modèle de greffe est basé sur des publications montrant le succès de greffes de substituts cutanés dans cet autre modèle.
Etude de la régulation du pH cérébral par le flux sanguin dans un contexte sain et pathologique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à quinze séances d'imagerie de trois heures par animal, précédées pour une partie d'entre eux de deux chirurgies de quarante-cinq minutes et d'une heure : 548 souris vont être utilisées, dont 404 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur inclut dans son calcul d'effectif environ 20 % de mortalité par groupe. L'objet est de comprendre comment le flux sanguin cérébral évacue le CO2 et régule le pH du cerveau, chez des souris saines, vieillissantes, puis porteuses d'une angiopathie amyloïde, avec un prolongement vers la rétine pour tester si l'œil pourrait servir de fenêtre de diagnostic. Les souris du modèle pathologique sont utilisées entre six et dix-huit mois, âge auquel les plaques amyloïdes sont installées, et leur état en fin de procédure, avec une implantation crânienne lourde, exclut selon le porteur tout replacement.
Objectifs
L’objectif général du projet est de mieux comprendre le rôle du flux sanguin dans la régulation du pH et du CO2 cérébral dans un contexte sain et pathologique. Le CO2 est un déchet métabolique produit par l’activité cellulaire. Il doit être éliminé du cerveau via la circulation sanguine pour préserver l’homéostasie du pH tissulaire, car une accumulation de CO2 conduit à une acidose, qui perturbe le fonctionnement neuronal. Le CO2 est donc un régulateur majeur du débit sanguin cérébral. Toutefois, la façon dont le CO2 est échangé à travers la paroi des différents types de vaisseaux du cerveau et le rôle des cellules de l’unité neurovasculaire dans cette régulation demeurent non élucidé car les techniques pour étudier ces phénomènes manquaient jusqu’à présent. De récents travaux ont permis de développer des biosenseurs ou colorants fluorescents sensibles au pH ainsi que des approches méthodologiques pour étudier le rôle de la vascularisation cérébrale dans l’élimination du CO2. Ce phénomène sera étudié chez des souris saines, au cours du vieillissement, et dans un modèle murin d’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), une pathologie cérébrovasculaire fréquemment observée chez les individus atteints de la maladie d’Alzheimer, qui se caractérise par une accumulation de plaques amyloïdes au niveau des vaisseaux du cerveau. En effet, il semblerait que la régulation du pH cérébral soit altérée dans la maladie d’Alzheimer et l’AAC pourrait en être une des causes en perturbant l’intégrité et la fonction vasculaire. Les astrocytes sont des cellules de l’unité neurovasculaire impliquées dans la régulation du pH cérébral. Nous étudierons leur rôle dans la régulation des échanges de CO2 et de pH à travers la barrière hémato-encéphalique en modulant de manière génétique (souris transgéniques spécifiques) ou pharmacologique des transporteurs ou canaux de ces cellules impliqués dans le transport d’ions. Finalement, les résultats obtenus dans le cerveau seront également étendus à la rétine afin de vérifier si l’imagerie de l’œil pourrait être utilisé comme biomarqueur des pathologies cérébrovasculaires.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet pourraient avoir un impact majeur sur la compréhension de la neurophysiologie et la neuropathologie. Il est en effet fondamental de caractériser comment le cerveau régule son pH tissulaire, élimine le CO2 et réagit aux changements de pH et de CO2, et quelle est la contribution du flux sanguin cérébral et des astrocytes dans ce phénomène d’homéostasie. Cette caractérisation permettra ensuite de mieux comprendre les processus neuropathologiques des maladies cérébrovasculaires, plus particulièrement de l’angiopathie amyloïde vasculaire qui touchent les petites artères cérébrales par l’accumulation de dépôts de protéines. Enfin, les résultats sont concluants, ils pourraient mettre en lumière un nouveau biomarqueur pour ces pathologies qui pourraient être évaluées de manière non invasive avec l’imagerie rétinienne.
Procédures
Une partie des animaux recevra un traitement par injection (sans anesthésie) durant 3 jours consécutifs durant moins d’une minute. Une partie des animaux sera soumis à deux interventions chirurgicales (d’environ 45 minutes et 1 heure) à 5 jours d’intervalle minimum, sous anesthésiesie générale et analgésie. Tous les animaux seront observés au microscope biphotonique ou en imagerie ultrasonore sous anesthésiesie ou sous sédation durant 3 heures maximum ou éveillé durant 1 heure maximum et ce, au total 15 fois maximum durant le projet, toute imagerie et tout état confondu. Une partie des animaux recevra une injection de colorant (sans anesthésie) la veille de l’expérience d’imagerie durant moins d’une minute (une fois toutes les deux semaines maximum). Une partie des animaux pourra recevoir une injection de colorant juste avant l’imagerie, sous anesthésie durant moins de 10 minutes, maximum 4 fois, avec un intervalle de minimum 1 mois entre chaque injection. Durant les expériences d’imagerie, les animaux pourront recevoir une injection unique (durant moins d’une minute) ou une perfusion lente de colorants ou agent de contraste (durant le temps de l’expérience soit au maximum 3 heures), sous anesthésie. Les animaux observés éveillés suivront au préalable une habituation de deux semaines au poste d’imagerie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront régulièrement manipulés par les expérimentateurs, ce qui pourra provoquer un stress. Les animaux recevront des injections pouvant provoquer un stress et une légère douleur chez l'animal éveillé au moment de l’introduction de l’aiguille. Les expériences d’imagerie de la rétine peuvent dans des cas très rares causer une lésion oculaire. Certaines injections pourront provoquer une douleur locale et transitoire au site d’injection et dans de rares cas des lésions locales. Les animaux sont exposés à un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie ou d’hypoventilation durant les expérimentations sous anesthésie ou sédation. Une partie des animaux subiront des procédures chirurgicales, sous anesthésie générale, qui peuvent provoquer une douleur transitoire et une perte de poids les 3 jours suivants. Les animaux pourront être observés éveillés sous le microscope après une période d’habituation qui peut être stressante au début de l’apprentissage. Une partie des animaux recevra une perfusion de colorant (sous anesthésie ou sous sédation), durant l’expérience d’imagerie, ce qui peut provoquer parfois provoquer une douleur et un saignement transitoire.
Devenir
La condition des animaux en fin de procédure (âgés et avec une implantation chirurgicale importante) ne nous permettant pas de procéder à un replacement, ces derniers seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire. Le cerveau sera prélevé post-mortem sur 100 animaux pour des analyses histochimiques complémentaires.
Remplacement
Notre étude porte sur l’étude du cerveau, un organe très complexe, composé de nombreux types cellulaires, encore mal connu, et dont il n’existe pour le moment aucun modèle de remplacement fiable et pertinent pour répondre à notre question précise, qui est la régulation du pH cérébral. Par ailleurs nous étudions le flux sanguin cérébral, qui est absent dans tous les modèles in vitro et ex vivo. Finalement, notre étude de neurophysiologie nécessite de travailler à l’échelle d’un organisme entier afin de préserver la communication entre les différents organes et le système cardio-respiratoire (cerveau, cœur, poumons, …).
Réduction
Pour ce projet, nous utiliserons 548 animaux. Nous avons réduit le nombre d'animaux au maximum tout en s’assurant de l’obtention de données statistiques robustes d'après nos expériences passées sur ces modèles et en prenant en compte une certaine marge d’erreur inhérente aux aléas expérimentaux, dont environ 20% de mortalité par groupe Notre expertise d’imagerie fonctionnelle in vivo a un avantage considérable : elle permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos études car nous réalisons nos expériences d’imagerie sur des animaux vivants et en bonne condition physiologique. Nous pouvons ainsi réutiliser le même animal plusieurs fois au cours de l’étude. Aussi, nous pouvons étudier le cerveau et la rétine au sein du même animal, ce qui permet non seulement de réduire le nombre d’animaux, mais aussi d’augmenter considérablement la puissance statistique (analyses pairées) de nos observations et de nos corrélations en analysant des données de ces deux organes différents au sein du même animal.
Raffinement
Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec divers enrichissements (bâtons en bois à ronger, cotons pour nidation, et igloo et roue), avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure du bien-être animal (SBEA) pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. Durant les procédures, les animaux bénéficieront d’anesthésie ou sédation et d’analgésie adaptée à chaque acte réalisé. Durant l’anesthésie et la sédation, un gel ophtalmique est déposé sur les yeux, un suivi de température est réalisé et l’animal reçoit un apport d’air oxygéné. La chirurgie sera effectuée en condition stérile, sous anesthésie générale, analgésie et anti-inflammatoire ainsi que des anesthésies locales adaptés. Après la chirurgie et l’imagerie, les animaux recevront un antidote de l’anesthésique pour leur permettre de retrouver rapidement leurs capacités physiologiques et seront placés dans une cage de réveil chauffée et oxygénée jusqu’à leur réveil complet. Ils recevront une gelée nutritive après la chirurgie et un suivi postopératoire méticuleux de 3 jours avec pesée quotidienne sera mis en place. Les animaux observés éveillés suivront avant toute expérience un protocole d’habituation au poste d’imagerie et à l’expérimentateur pour diminuer le stress lié à cette procédure.
Choix des espèces
La souris est une espèce de mammifère dont la génétique et la physiologie est relativement proche de l’Homme, et chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Pour étudier l’impact de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser des animaux âgés, chez lesquels la pathologie amyloïde est bien installée. Aussi, pour la lignée transgénique pathologique et les contrôles, nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 18 mois afin de suivre l’évolution de la maladie dans le cerveau et la rétine et d’analyser les paramètres physiologiques à différents stades de la maladie (stade précoce, modéré et avancé). Pour les autres lignées, les souris seront utilisées à l’âge adulte, soit entre 2 mois et 12 mois maximum, car il est nécessaire d’observer des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.
Validation d’implants neuronaux, neurophysiologie, comportement et neuroanatomie fonctionnelle cérébrale de la vocalisation chez le mini-porc
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Vingt-cinq des 60 mini-porcs de ce projet sont destinés à l'adoption, parfois avec des morceaux d'implants laissés au contact de leur cortex parce que les retirer mettrait leur vie en danger. Vingt-sept autres sont tués pour que soit examinée la réaction de leur cerveau aux électrodes, et huit sont opérés puis stimulés sous anesthésie sans être réveillés. Les animaux gardés vivants subissent jusqu'à dix anesthésies en vingt-quatre mois, des séances d'IRM d'une à deux heures, une chirurgie d'implantation crânienne suivie d'un isolement d'au moins vingt-quatre heures, et portent un capot fixé sur la tête, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente le mini-porc comme une "alternative éthique aux Primates Non Humains" et retient son cerveau parce qu'il bouge beaucoup, ce qui permet de tester la stabilité d'implants destinés à des personnes privées de parole.
Objectifs
Cinq millions de personnes dans le monde ont un déficit sévère de la parole suite à des traumatismes, lésions vasculaires, ou des maladies neurodégénératives. L’objectif des interfaces cerveau-machine pour la parole (BCI parole), est de permettre à certaines personnes de communiquer à nouveau grâce au contrôle d’une synthèse vocal à partir de leur activité cérébrale enregistrée à l’aide d’implants cérébraux. Afin d'optimiser les BCIs parole, ce projet vise à comprendre la dynamique cérébrale de la production de vocalisations et à valider de nouveaux implants corticaux capables d’enregistrer et de stimuler de façon stable et précise l’activité cérébrale sur le long terme avant leur utilisation chez l’homme. Le premier objectif est l’étude des bases corticales de la vocalisation chez le miniporc. Les BCIs parole chez l’homme utilisent des algorithmes nécessitant l’identification de caractéristiques pertinentes des signaux cérébraux liés à la production vocale et des zones cérébrales impliquées. Des implants à haute densité couvrant de manière extensive le cortex permettront de préciser finement la dynamique spatio-temporelles corticale spécifique du contrôle volontaire de vocalisations chez le miniporc libre de ses mouvements et en interaction avec ses congénères. Ces données serviront de références pour le décodage de la parole chez l’homme. Des méthodes d’imagerie préciseront les voies anatomo-fonctionnelles impliquées. Le second objectif est de valider sur plusieurs mois la performance d’enregistrement/stimulation et la biocompatibilité de nouveaux implants cérébraux. Après validation in-vitro et chez le rat, des tests chez le miniporc viseront à déterminer leur performance et leur acceptabilité par le tissu cérébral dans une situation proche de l’homme. Contrairement au rat, le porc est très sensible aux infections, permettant de valider l’efficacité et la compatibilité des protocoles de stérilisation. De plus, la taille du cerveau permet de valider des dispositifs similaires à ceux qui seront utilisés chez l’humain. Enfin, les mouvements importants du cerveau de miniporc permettront de valider la stabilité des implants.
Bénéfices attendus
À court terme, cette étude servira à vérifier que les nouveaux types d’électrodes implantées dans le cerveau n’occasionnent pas de lésions ou d’effets indésirables, garantissant ainsi la sécurité et la tolérance des dispositifs implantés chez l’homme. Elle apportera également des connaissances nouvelles sur le cerveau du miniporc, dont la structure reste encore mal connue. Elle permettra enfin d’observer comment ces animaux communiquent et interagissent entre eux à travers leurs vocalisations et comportements sociaux. À long terme, ce projet de recherche s’inscrit dans un projet plus vaste destinés à développer des interfaces cerveau-machine pour redonner la capacité de communication à des personnes présentant un déficit sévère de la parole. Pour y parvenir, il est essentiel de mieux comprendre comment le cerveau produit la parole et d’identifier les zones précises impliquées dans ce processus. Cela permettra de savoir où placer les électrodes afin d’enregistrer les signaux électriques liés à la production de sons et de mots. Des premiers résultats préliminaires ont déjà montré que certaines régions du cerveau activées lors de vocalisations chez le miniporc sont similaires à celles activées lors de la production de la parole chez l’humain, ce qui rend le miniporc particulièrement intéressant comme modèle d’étude.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Avant la chirurgie, des séances d’imagerie IRM (environ 1 à 2h) et scanner (environ 30 minutes en plus du transport) seront réalisées sous anesthésie après injection. Pour le transport entre la zone d’hébergement (stabulation) et le service d’imagerie, les animaux seront anesthésiés par injection. La chirurgie d’implantation sera effectuée sous anesthésie gazeuse ou fixe. L’induction sera réalisée par 2 injections préalables d’anesthésiques, les animaux seront ensuite intubés ou maintenus au masque. Une perfusion sera également mise en place. Des traitements antalgiques et analgésiques seront administrés pendant la chirurgie ainsi qu’en période post-opératoire pendant une semaine. Après l’opération, si certains soins nécessitent une immobilité totale, des anesthésies de courte durée (2 heures) pourront être réalisées par injection. Les animaux subiront au maximum 10 anesthésies pour l’ensemble des procédures sur 24 mois. Des substances fluorescentes seront également injectées chez 4 mini-porcs. Pendant les anesthésie, des stimulations pourront être délivrées au niveau du cortex pour localiser les zones impliquées dans le contrôle des muscles impliqués lors des vocalisations.
Impact sur les animaux
Nuisances associées : - au transport : les animaux seront transportés dans des véhicules réglementaires pour les IRM et scanner. La durée de chaque transport n’excèdera pas 30 minutes. - à la chirurgie d’implantation : o hypothermie, douleurs si l’anesthésie et l’analgésie sont mal dosées pendant la chirurgie et les stimulations électriques o des douleurs, un inconfort du fait de la présence d’un capot sur leur tête, un risque d’infection au niveau de la zone d’implantation pendant quelques jours après la chirurgie. o l’isolement physique de l’animal durant environ 24h pourra également générer un stress après l’intervention chirurgicale - Au rejet ou un mauvais positionnement des implants
Devenir
Nous ferons en sorte que le maximum d’animaux puisse bénéficier d’une adoption (notamment lorsqu’un animal sera utilisé seulement pour évaluer la performance et la longévité des implants et non leur biocompatibilité). En pratique nous estimons que cela concernera au maxium 25 animaux sur les 60 prévus dans l’étude. Avant adoption, les connecteurs des implants seront retirés, ainsi que la chambre de protection et le ciment de fixation. Il est possible que certaines parties des implants (zones des électrodes au contact du cortex) ne puissent pas être retirées sans mettre en danger la vie de l’animal ou nécessiter une chirurgie lourde. Dans ce cas, nous chercherons à faire adopter l’animal avec les résidus d’implants non retirés si ceux-ci ne risquent pas de mettre en danger sa santé, et ce une fois que la peau recouvrant le crâne aura cicatrisé (environ 3 semaines). En général les animaux seront adoptés à un âge allant de 12 à 24 mois. Une partie importante de l’étude concerne la biocompatibilité des implants. Afin d’étudier la structure du cerveau de cochons qui ont été implantés de façon chronique ainsi que le comportement des implants, ces animaux devront donc être mis à mort (soit 27 animaux). 8 animaux serviront à des études de stimulation électrique sous anesthésie. Ces animaux ne seront pas réveillés après la chirurgie.
Remplacement
Avant tout test chez l’animal, les performances des implants seront d’abord évaluées in vitro dans des solutions tampon. Cela permettra de vérifier les propriétés électriques et électrochimiques des électrodes afin d’en optimiser le mode de fabrication. Une fois leur fabrication optimisée, des dispositifs seront alors testés chez l’animal pour évaluer leur performance in vivo dans le temps. Ce projet trouve 3 justifications à l’utilisation d’animaux : 1) Tester de nouveaux types d’implants avant leur utilisation chez l’homme nécessite une validation préclinique in-vivo. 2) L’étude des bases corticales de la vocalisation chez le miniporc est un sujet complètement inexploré et présente donc par lui-même un intérêt de recherche fondamentale important. 3) Les « BCIs parole » chez l’homme utilisent des algorithmes décodant les signaux corticaux afin de prédire la parole produite. Analyser ces signaux directement chez l’homme est possible chez des patients implantés pour des raisons médicales (épilepsie) mais le nombre et l’étendue de la couverture corticale des implants n’est pas contrôlable. Ici nous préciserons finement cette dynamique en couvrant de manière extensive le cortex avec plusieurs implants dans des zones spécifiques afin d’identifier les meilleurs signaux pertinents au décodage des vocalisations, ce qui pourra s’étendre au décodage de la parole chez l’homme.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux utilisés à chaque étape permettra d’obtenir des résultats utiles et reproductibles. Afin de réduire le nombre d’animaux, le même animal sera utilisé pour plusieurs protocoles à chaque fois que ce sera possible.
Raffinement
Durant leur séjour à l’animalerie, tout sera mis en œuvre pour que les animaux préservent au maximum une interaction sociale afin de diminuer leur stress. Pour tous les mini-porcs, une période d’acclimatation, essentielle pour réduire le stress lié au transport et à l’introduction dans un nouvel environnement, et ainsi améliorer leur bien-être durera au minimum 2 semaines. Au cours de cette période, les animaux seront habitués au personnel et aux routines et préparés aux procédures expérimentales en utilisant des jeux et un renforcement positif. Toutefois, après la chirurgie d’implantation, les animaux devront être isolés au moins 24h. Pour améliorer leur bien-être, ils cohabiteront dans la même pièce que leurs congénères mais dans un box différent avec des séparations transparentes ; cela leur permettra quand même d’interagir visuellement et auditivement quand ils sont séparés. Des jeux et/ou animations seront mis à disposition des animaux afin de leur créer un milieu enrichi (ballons, sons, etc.). Pour le bien-être des animaux, un traitement post-opératoire (antibiothérapie et antalgiques / analgésiques) sera administré systématiquement. Les animaux seront observés quotidiennement ou plus fréquemment si apparition de signes cliniques. Des points limites spécifiques découlant de l’utilisation d’une grille de scoring et d’un arbre décisionnel ont été définis afin d’éviter toute souffrance inutile. Pour la réalisation des examens d’imagerie, les animaux seront anesthésiés. Ils seront transportés dans un véhicule climatisé, à l’intérieur de cages de transport adaptées et conformes aux autorisations sanitaires en vigueur. L’anesthésie sera maintenue en continu depuis le départ de l’animalerie jusqu’au retour.
Choix des espèces
Outre son alternative éthique aux Primates Non Humains, le modèle porcin est beaucoup plus pertinent que le rat pour plusieurs raisons 1) Le mini-porc produit un nombre important de vocalisations différentes de manière spontanée, ce qui permettra de faciliter l’étude des zones corticales de la vocalisation. Par ailleurs, le porc est un animal social permettant d’étudier ces activités lorsque plusieurs animaux interagissent. 2) Le mini-porc est pertinent pour évaluer la biocompatibilité des implants et leur capacité à enregistrer l’activité neuronale et la stimuler électriquement de manière stable sur le long terme. Le miniporc est plus pertinent que le modèle rat car son cerveau est plus grand permettant de valider des dispositifs semblables à ceux qui seront ensuite utilisés chez l’homme. Par ailleurs, le cerveau de miniporc produit des mouvements importants, sources principales de l’instabilité des signaux chez l’homme et des contraintes d’implantation. Enfin, il présente les mêmes contraintes en termes d’asepsie, de stérilité et de chirurgie que pour l’homme. La chirurgie sera effectuée préférentiellement sur des animaux âgés de 3 à 6 mois à cause de contraintes anatomiques empêchant une implantation à des stades plus tardifs.
Elevage d’une lignée de souris mutantes, modèle du syndrôme de Hermansky-Pudlak
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Les souris homozygotes de cette lignée saignent plus longtemps que les autres, faute de plaquettes en nombre suffisant, et vivent moins longtemps : c'est ce phénotype dommageable qui fait l'objet du projet. 315 souris vont être utilisées, 165 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 150 un niveau léger. Le seul acte décrit est une prise de sang d'une minute sur les animaux homozygotes, entre six semaines et neuf mois d'âge, le reste de l'effectif relevant de l'entretien de la lignée, soit 55 mutantes et 50 témoins par an. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever des organes et de la moelle osseuse, et le porteur précise que les homozygotes ne seront pas croisées entre elles afin d'éviter les mises bas.
Objectifs
Les maladies rares d’origine génétique peuvent nous en apprendre beaucoup sur le fonctionnement du corps humain. En les étudiant, les chercheurs découvrent des informations précieuses sur les gènes, les protéines et les mécanismes essentiels de la vie. Ces découvertes peuvent aussi aider à mieux comprendre des maladies plus courantes. Dans notre recherche, nous nous intéressons à une maladie appelée syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP). C’est une maladie rare qui touche plusieurs organes et se manifeste notamment par une forme d’albinisme (peau et yeux très clairs) et une tendance aux saignements. Chez certains patients atteints de cette maladie, nous avons découvert des anomalies dans un gène. Ces anomalies pourraient expliquer certaines difficultés de défense contre les infections (déficit immunitaire) ainsi que des troubles du sang, en particulier un manque de plaquettes – des cellules qui aident à arrêter les saignements – et des problèmes dans leur fonctionnement. Le but de notre projet est d'étudier les effets de cette anomalie génétique, en utilisant un modèle de souris spécialement conçu pour porter cette mutation. Nous allons nous concentrer sur l’étude du sang, et plus particulièrement sur les plaquettes. Pour cela, nous maintiendrons la lignée de souris portant la mutation et nous réaliserons des prises de sang sur des souris saines et sur des souris porteuses de la mutation, afin d’analyser les différences et mieux comprendre les conséquences de cette modification génétique.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est l'étude de système immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare syndrome de Hermansky-Pudlak, nous souhaiterons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène d’intérêt et son effet sur la thrombopénie (réduction de nombre de plaquettes) ainsi que les dysfonctionnements de ces plaquettes.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure, un prélèvement de sang sera réalisé sur certains animaux (homozygotes) au plus tôt à 6 semaines d'âges et au plus tard à 9 mois d’âge. Ce geste dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux homozygotes présentent un phénotype qui se présente sous la forme d'une thrombopénie (réduction du nombre de plaquettes). Ce phénotype implique un temps de saignement plus long et à une incidence sur la coagulation des animaux. La durée de vie de ces animaux est inférieure à la moyenne. L’animal va ressentir un stress lors de la contention pour la prise de sang et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille pour le prélèvement.
Devenir
En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte d'organe, de la moelle ossuse, afin de l'analyser.
Remplacement
Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude. Vu l'expérience que nous avons sur les études précédentes, la génération de 55 animaux mutants et 50 animaux contrôles par an sont nécessaires pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, la posture, la présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat (présence de matériel pour la construction du nid et un tube). Des soins locaux (Dermidine ou autre produit selon les recommandations vétérinaires) seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique déterminé par le service vétérinaire pourra être administré. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local (Coalgan ou équivalent préconisé par notre service vétérinaire) afin d’atteindre l’hémostase. Le phénotype étant dommageable (thrombopénie), les animaux recevront des soins appropriés notamment en cas de blessures. En cas de bagarres récurrentes, les animaux seront séparés pour éviter les blessures. Les animaux homozygotes ne seront pas croisés afin d'éviter les mises bas pour les mêmes raisons.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons du modèle porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Le modèle de souris est notamment très utilisé pour étudier les fonctions immunitaires, où un large panel d’outils d’analyse est disponible. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Le prélèvement sera réalisé sur les animaux au plus tôt à 6 semaines et au plus tard à 9 mois car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses. Plus tardivement, le phénotype dommageable pourrait entrainer des effets importants. A ce stade, le système immunitaire est mature.
Étude d’un gène, facteur de protection de la maladie d’Alzheimer, chez la souris EU2/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
226 souris vont être utilisées, dont 202 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, les reproductrices et reproducteurs âgés étant réformés et tués eux aussi. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue, puis une injection dans le cerveau sous anesthésie, dont le porteur écrit qu'elle provoque une douleur aiguë "modérée à sévère" liée à l'incision, au forage et à l'inflammation locale, alors qu'aucune procédure du projet n'est déclarée sévère. À sept et dix mois, les animaux passent un test de reconnaissance d'objet et un test de mémoire en labyrinthe, les mâles le matin pour que la présence des femelles ne biaise pas les résultats. L'objet est de tester si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de la protéine Tau, et le porteur compte parmi ses mesures de réduction le fait que la lignée soit déjà disponible sur place.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.
Procédures
Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.
Remplacement
Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau
Réduction
Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.
Choix des espèces
Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.
Etude préclinique des déficits fonctionnels et de l’inflammation cérébrale dans différents modèles de traumatismes crâniens et dans une pathologie neurovasculaire associée : l’accident vasculaire cérébral (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un traumatisme crânien de quarante-cinq minutes, pour une partie des animaux suivi d'une ischémie cérébrale d'une heure trente, puis des séances d'IRM à sept jours, vingt et un jours, deux mois et trois mois : 760 souris vont être utilisées, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées par une chirurgie sans réveil qui permet le prélèvement des organes. Le porteur affirme que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Il annonce quatre tests comportementaux, en donne les durées à la seconde près, et ne dit pas lesquels.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) est un trouble neurologique majeur à l’échelle mondiale, encore mal pris en charge sur le plan clinique. Ils sont divisés en trois catégories selon leur gravité : léger, modéré et grave. Le TC induit une lésion émise par le choc initial qui peut provoquer ischémies et hémorragies, un dysfonctionnement immunitaire, une rupture de la barrière hémato-encéphalique ou encore une coagulopathie. Suite à un TC, une coagulation anormale est fréquemment observée chez les personnes touchées, menant à une aggravation des symptômes et du pronostic lors de la survenue de coagulopathies et pathologies neurovasculaires tel que l’accident vasculaire cérébral (AVC). Ce projet permettra d’étudier les déficits fonctionnels et inflammatoires dans différents modèles de TC chez un modèle murin et d’explorer a posteriori les modulations physiologiques potentielles qu’ils entraînent. Dans un second temps, cette étude se focalisera sur la caractérisation de l’inflammation cérébrale et des déficits fonctionnels chroniques sur des souris touchées par un AVC ischémique après un TC afin d'en analyser les mécanismes sous-jacents. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU).
Bénéfices attendus
Cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et des accidents vasculaires cérébraux qui peuvent en découler, et présentent un potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de possibles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Traumatisme crânien (45 minutes), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes ; 5 fois 15 minutes (deux tests joints) ; 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique et moléculaire (7 jours, 21 jours, 2 mois, 3 mois post-TC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. - Traumatisme crânien (45 minutes), modèle d’ischémie cérébrale (1h30), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes, 5 fois 90 minutes, 3 fois 15 minutes, 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’un traitement et/ou agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique (24h pré-AVC ; 8 minutes) et moléculaire (24h, 7 jours post-AVC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. L'ensemble des procédures chirurgicales, d'anesthésie et d'imagerie seront effectuées dans l'EU 1/2, et les tests comportementaux dans l'EU 2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéique.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage et n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et des points limites ont été établis pour permettre un arrêt de protocole si nécessaire. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation, réactivité et comportement de l'animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l’intervention, les 48h après chirurgie étant les plus critiques pour l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.
Impact de l’inactivation d’un isoforme de PI3K sur les propriétés anti-thrombotique et anti-inflammatoire de l’endothelium -MODIFICATION2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectées la veille, anesthésiées profondément le lendemain, puis maintenues sous anesthésie quatre à sept heures pendant que leurs vaisseaux sanguins sont observés, une partie des 178 souris de ce projet porte une forme inactivée d'une protéine de la coagulation. D'autres subissent la ligature d'un vaisseau sanguin abdominal au cours d'une chirurgie de quarante minutes, d'autres encore une injection déclenchant une inflammation généralisée. 54 relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 124 d'un niveau modéré, le porteur signalant des risques de saignement important, de réveil difficile et de paralysie transitoire des pattes arrière. Toutes sont tuées, par excès d'anesthésique ou dans les quarante-huit heures suivant la chirurgie, le porteur indiquant qu'elles ne pourraient pas survivre à ces interventions.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt sur les propriétés antithrombotique (inhibant la formation de caillot ou amas plaquettaires) et anti-inflammatoire des vaisseaux sanguins autres que ceux du cerveau. L’inhibition d’une protéine d'intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité des vaisseaux dans le contexte de l'accident vasculaire cérébral. L’inhibition d’une protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme agissant sur la conservation d’un état protecteur des vaisseaux sanguins. En effet au niveau cérébral le sang contenu dans les vaisseaux n’est pas capable de s’en échapper et les amas de plaquettes sont plus petit chez ses animaux. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisé sur deux établissements utilisateurs présents sur le même campus, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire des vaisseaux et sur les amas de plaquettes en temps reel. L’impact de cette molécule d’intérêt sera évalué grâce à des souris génétiquement modifiées et en utilisant des molécules inhibitrices candidates générées par nos collaborateurs.
Bénéfices attendus
Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également le développement et la solidité du thrombus (amas plaquettaire) ainsi que sa capacité à emboliser (à se détacher du vaisseau). Ces amas plaquettaires circulants sont critiques car ils sont à l’origine des obturations des vaisseaux cérébraux ou pulmonaire.Mieux comprendre l’impact de cette molécule est indispensable pour clarifier les mécanismes impliqués dans la thrombose et pour évaluer son potentiel en tant que cible thérapeutique. Cette étape est également cruciale pour envisager, à terme, le développement de molécules inhibitrices spécifiques.
Procédures
Trois types d’interventions sont réalisées sur des lots différents d’animaux : 1-Une injection intraveineuse la veille de l'expérimentation sera réalisée sur certains lots. L’intervention dure moins de 5 minutes dans EU1. Dans EU 2 Le lendemain Les animaux sont, sous anesthésie profonde, préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins, afin d’étudier la thrombose ou l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. 2- Dans EU2 Des lots différents sont exposés à un prélèvement sanguin sous anesthésie (5 minutes), à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés. 3- DAns EU2 Les derniers lots d'animaux sont soumis à une inflammation généralisée par une injection intrapéritonéale. 24h après cette induction les animaux sont anesthésiés et préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins et la réponse inflammatoire grâce à la mobilité des globules blancs. Ces animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et euthanasié après une heure d'expérimentation.
Impact sur les animaux
Les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intérêt sont viables et ne présentent aucun défaut morphologique apparent ni de reproduction. Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum7 heures et seront mis à mort par excès d’anesthésique. Concernant les procédures sévères : Lors de ces interventions, certains effets indésirables peuvent survenir. Par exemple, l’anesthésie peut parfois perturber la respiration des souris, la rendant irrégulière ou provoquant de courtes pauses. Il existe aussi un risque de saignement important au moment de l’intervention, notamment lorsqu’on sépare certains gros vaisseaux sanguins. Après l’opération, certaines souris peuvent avoir du mal à se réveiller ou ressentir de la douleur à l’endroit où l’incision a été faite. Dans certains cas, une faiblesse ou une paralysie transitoire des pattes arrière peut apparaître. L’induction du sepsis va entrainer une inflammation généralisée chez les souris. L’inflammation sera étudiée à 24h post induction puis les souris seront euthanasiées par excès d’anesthésique.
Devenir
Les procédures utilisées étant invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures car ils ne pourraient pas survivre aux interventions.
Remplacement
Le recours à l’espèce souris est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes et la nature des différentes cellules misent en jeu ne sont pas modélisables par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.
Réduction
Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas le lot en entier. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucune différence n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intêret, nous ne réaliserons pas les expériences avec les molécules inhibitrices.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture à volonté. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçus par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant si un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié. Pour les procédures necessitant un suivi: les souris reçoivent un traitement antidouleur régulier, des aliments enrichis en analgésiques sont mis à leur disposition, et leur état est évalué quotidiennement. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le modèle souris est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus (amas plaquettaire) et le développement d'une inflammation dans les souris est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Nos collaborateurs ont établi une lignée de souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt qui nous permet d’étudier spécifiquement son impact sur la thrombose et l’inflammation. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures
Formation à la chirurgie de mise en place d’implants télémétriques factices et fonctionnels, à leur calibration et à la vérification de leur fonctionnement dans le cadre de l’installation d’une plateforme de télémétrie rongeurs
- Formation professionnelle
L'objet du projet est l'acquisition d'un geste chirurgical par un service qui veut ensuite le proposer en prestation aux équipes de recherche, et 40 souris y sont utilisées, toutes tuées. Quinze d'entre elles, prises parmi des productions surnuméraires et des reproducteurs réformés, sont opérées sous anesthésie pour la pose d'implants factices et tuées avant tout réveil. Les vingt-cinq autres reçoivent un implant fonctionnel lors d'une chirurgie de moins de quarante-cinq minutes, puis subissent trois tests métaboliques précédés chacun de cinq heures de jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être tuées pour que la pose soit vérifiée par autopsie. Le porteur présente la télémétrie implantée comme un gain pour le bien-être des animaux non-humains puisqu'elle évite les prélèvements sanguins répétés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place une nouvelle technologie au sein de notre établissement. La technique sera apprise via une formation dispensée par le fournisseur de la technologie installée pour la pose d’implants télémétriques chez les rongeurs. Cette formation de 2 jours devra impérativement être complétée par un renforcement de l’apprentissage sur site de manière à être pleinement opérationnel et maitriser les gestes techniques complexes que nécessite cette approche technologique. Le but, maîtriser le geste au sein du service et pouvoir le mettre à disposition des usagers en tant que service d’accompagnement. Une étude pilote pour la validation de la chirurgie d’implantation, la maîtrise du geste et la réalisation de tests métaboliques permettront de s’assurer que l’ensemble des tests réalisés par la suite pourront être assuré par le service. La télémétrie interne implantable donne la possibilité de réaliser des études longitudinales sur animal conscient et non contraint, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisé, leur stress tout en participant au raffienement de leur bien-être. Il s’agit pour notre service de proposer une approche collaborative et de préstations aux équipes de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de proposer un service d’accompagnement aux utilisateurs sur le long terme. La mise en place de cette nouvelle technologie au sein du service favorisera l’amélioration du bien-être animal en réduisant le stress des animaux lié aux manipulations. En effet, elle permettra de collecter des données physiologiques, d'activité et de glycémie sur animal non contraint, libre de ses mouvements, maintenu dans sa cage et sans avoir à réaliser les prélèvements sanguins itératifs habituellement utilisés. Dans le cas de l’implant au glucose, les données seront collectées en continu par l’intermédiaire du capteur sur une durée de 6 semaines. Seul 1 prélèvement de sang à la queue réalisé 2 fois (à 2 et 4 semaines après la chirurgie) sur la période d'enregistrement est nécessaire afin d'assurer la recalibration du système. Ainsi, ce dispositif pourra être utilisé sur des modèles animaux (diabète, obésité ect.) qui seront utiles à la santé humaine. De plus une grande diversité d'implants télémétriques étant disponible, nous pourrons transposer la techniques à l'enregistrement d'un ensemble d'autres paramètres physiologiques (ECG, EMG, pression artérielle,...).
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une chirurgie permettant la pose d'un implant permettant l'enregistrement de paramètres physiologiques en temps réel. Immédiatement après la chirurgie les animaux seront remis dans leur cage d'origine sans aucun changement et il nous sera alors possible d'acquérir en temps réel sans la moindre contrainte supplémentaire pour l'animal, des données physiologiques nécessitant habituellement des interventions directes et plus ou moins lourdes pour l'animal selon les paramètres mesurés. La chirurgie pour la mise en place de l'implant sera réalisée sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique totale en pré, per et post-opération et durera moins de 45 minutes. Tous les animaux du projet seront soumis à cette procédure chirurgicale. Afin d'acquérir les gestes très précis et complexes que nécessite ce type d'expérimentation, un premier lot d'animaux sera implanté avec des implants factices (15 animaux au maximum) puis un fois le geste parfaitement maitrisé, un second lot dit "fonctionnel" comprenant 25 animaux maximum sera utilisé et implanté avec des implants fonctionnels. Ce lot sera séparé en sous-groupes de 5 animaux qui seront soumis à un test métabolique à 3 temps différents durant les 6 semaines d'activité de l'implant télémétrique. Pour ces tests métaboliques, une injection sera réalisée puis des prélèvements de sang (2 µL chacun) au bout de la queue seront pratiqués pour un volume total de moins de 30 µL par expérimentation. Ces prélèvements de sang permettront, par utilisation d'un lecteur de glycémie externe, de déterminer le taux de sucre sanguin et de le comparer à la valeur fournie par l'implant télémétrique. Les différents gestes réalisés en dehors de la pose de l'implant télémtrique auront des durées très courtes. Les injections par voie intrapéritonéales ou per os nécessiteront une contention d'environ 15 secondes durant laquelle l'injection sera réalisée sur une durée de moins de 5 secondes. Les prélèvements sanguins au bout de la queue se feront sur des animaux maintenus sur le fond de leur cage par la base de la queue pendant moins de 10 secondes juste pour limiter leur déplacement. Cette "préhension" permettra le prélèvement de la goutte de sang pour la mesure de la glycémie, ce prélèvement durera moins de 5 secondes. Enfin pour l'injection intraveineuse de glucose, celle-ci se fera sur animal sédaté à l'isoflurane afin de limiter le stress. La sédation durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une chirurgie pour la pose d’un implant de télémétrie. Les animaux peuvent alors ressentir de potentielles douleurs qui seront prises en charge par une couverture analgésique complète pré, per et jusqu’à 48h en post-opératoire. Pour valider la technologie et la fiabilité des dispositifs une fois implantés, les animaux seront soumis à un test métabolique en condition vigile dans le but de comparer les mesures obtenues par le capteur implanté à la réalité physiologique. Le test métabolique sera répété 3 fois durant les 6 semaines d’enregistrement du capteur. Pour ces tests, les animaux seront mis a jeun pendant 5 heures avant chaque test physiologique qui durera 3h. Une potentielle perte de poids consécutive à la mise à jeun peut être observée et sera surveillée de près. Afin de limiter cette possible difficulté, deux semaines de repos seront laissées entre chaque expérimentation. Le suivi de la glycémie sera réalisé durant ces tests par prélèvement d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue. Une potentielle douleur peut être ressentie lors du premier prélèvement, celle-ci sera couverte par un traitement analgésique réalisé 15 minutes avant l’acte. De plus, une asepsie de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement et après le dernier afin de limiter le risque d’infection Enfin, pour limiter le stress que pourrait induire la contention nécessaire (moins de15 secondes) aux différentes injections, une habituation des animaux à l’expérimentateur et aux pièces d’expérimentation sera réalisée plusieurs semaines avant le début des procédures. Les injections en elles-mêmes ne généreront pas une douleur supérieure à celle causée par la piqure d’une aiguille.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de valider la pose de l’implant par autopsie.
Remplacement
L’utilisation de cadavres issus d'autres projets en fin de procédure permettra d’étudier en détail l’anatomie, offrant ainsi un environnement sécurisé pour se familiariser avec les repères physiologiques et anatomiques sans risque pour les animaux et les manipulateurs. Toutefois, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour valider la maîtrise des gestes et la technologie, mais aussi pour assurer un personnel qualifié et compétent permettant ainsi de veiller au bien-être des animaux. De plus, un projet collaboratif visant à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du diabète de type 2 et nécessitant cette technologie est déjà planifié, il est donc important de réaliser ces gestes en amont sur animaux vivants et ainsi se confronter aux conditions physiologiques associées à cette méthode. Aussi, la formation spécifique dispensée par la société ayant installé le dispositif réduira le nombre d’animaux nécessaire sur site, puisque ce projet constituera un renforcement de la qualification du personnel.
Réduction
Dans un premier temps l'emploi d'animaux morts issus d'autres projets et la formation spécifique dispensée en amont de la réalisation de ce projet nous permettront de rédurire le nombre d'animaux nécessaires à la mise en place de notre plateforme. Dans l’objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons divisé les animaux en deux lots dont le premier sera constitué d’animaux implantés avec un dispositif factice. Le nombre maximal sera de 15 animaux et seront issus de reproductions surnuméraires, d’ancien(-nes) reproducteurs(-trices) ou d’animaux présentants des critères non adaptés. Pour le second lot, des mesures métaboliques seront pratiquées sur les animaux implantés, avec maximum de 35 animaux. Dans les deux cas, si un nombre moins important d’animaux nous permettait de valider la technologie, le projet sera considéré comme terminé. Ce nombre n'a pas été déterminé par approche statistique dans la mesure où il s'agit de l'acquisition d'un geste.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront optimisées afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle. Les animaux seront maintenus, au minimum, 3 par cage et maximum 5 pour éviter tout isolement social ou surpopulation. Tous les animaux bénéficieront d’un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum hormis durant les 9h de mise a jeun avant et pendant les tests métaboliques au cours desquelles seul l'accès à l'eau sera maintenu. Cette mise a jeun sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines sur 6 semaines donc 3 fois au total. Un suivi quotidien sera assuré, avant, pendant et après les manipulations, par le personnel soigneur et les responsables du projet. Lors de la réalisation des procédures, une surveillance clinique sera assurée par les manipulateurs. Si des signes de souffrance ou de stress, définis selon des critères préalablement établis, étaient constatés, le suivi des animaux serait renforcé. Parmi ceci, plusieurs signes indicatifs seront observés : comportement de l’animal (absence de toilettage, vocalisations, stéréotypies, léchage, automutilation, prostration, létargie, isolement …), apparence générale (état du poil, position des oreilles, gonflement des yeux, position des moustaches), variation du poids, plaies ou cicatrisation difficile. En cas d'apparition d'un de ces signes une prise ne charge médicamenteuse sera faite par utilisation d'anti-inflammatoires et d'analgésiques adaptés. La procédure de chirurgie, susceptible d’entraîner une douleur, sera réalisée sous anesthésie, avec une prise en charge de la douleur avant pendant et après la procédure par utilisation d'analgésiques spécifiques à chacun des gestes. Pour favoriser la récupération des animaux 2 semaines de repos minimum leur seront laissées entre chaque expérimentation. La prise en charge d’une potentielle douleur et/ou infection lors du prélèvement de gouttes de sang au niveau caudal sera assurée par une injection d’analgésiques 15 minutes avant et l’application d'un antiseptique et antimycosique avant et après le prélèvement. Pour limiter le stress lié à la contention durant les expérimentations une habituation à la salle d’expérimentation et à l’expérimentateur sera systématiquement réalisée en amont.
Choix des espèces
Les équipes utilisatrices du service de ressources biologique utilisent principalement des souris pour leurs études. L’objectif de ce projet étant de développer une plateforme de télémétrie rongeurs, dans la continuité d’une formation pratique dispensée sur modèle rongeur par un prestataire externe, le modèle souris sera alors utilisé et préféré au modèle rat. Les souris seront utilisées à des stades adultes, à partir de 8 semaines, toutefois l’âge des animaux n’impactera que peu le projet et il pourra ainsi être étendu de quelques semaines en fonction des animaux disponibles. Le sexe des animaux n'ayant pas d’incidence sur les procédures prévues, les animaux utilisés proviendront de fins de procédure d'élevage, de productions surnuméraires ou à critères non-adaptés, garantissant ainsi une sélection sans critère de sexe des animaux pour ce projet.
Étude de la compétence vectorielles des tiques des genres Ixodes et Dermacentor pour les virus Dugbe et Hazara
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par un virus puis exposées quatre à sept jours durant aux piqûres de tiques posées sur elles, 3 708 souris subissent en plus un prélèvement sanguin quotidien pendant quinze jours. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à l'âge de quatre semaines, choisi parce que les jeunes souris développent une infection lente et progressive qui laisse le temps aux tiques de se gorger au pic de virémie. Le porteur qualifie les piqûres de tiques d'indolores et reconnaît dans le même dossier qu'il lui est difficile d'anticiper les symptômes, l'approche étant exploratoire. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, le porteur écartant toute réutilisation ou adoption au motif qu'elles auront été infectées.
Objectifs
Le virus Hazara est un virus originaire du Pakistan de la région de Hazara et a pour réservoir une espèce locale de campagnol. Le virus est alors transmis par piqure de tique Ixodes redikorzevi. Le virus Dugbe quant à lui est un virus que l’on retrouve chez les bovins d’Afrique centrale et qui peut parfois toucher l’Homme de manière peu symptomatique. L’étude de ces deux virus et plus spécifiquement de leur transmission par les tiques de différents genres, présentes notamment en France, permettrait alors d’obtenir une première réponse quant à la transmission potentielle du virus objet du projet par ces mêmes tiques. Nous utiliserons des souris de différentes origines : des lignées standard, présentant une sensibilité accrue aux infections virales, ou dont la sensibilité à cette famille de virus a été précédemment montrée. Le but est d’identifier une lignée plus apte à s’infecter pour obtenir un modèle d’infection stable. Les souris montrées comme étant sensibles permettront d’étudier la transmission du virus via les piqûres de tiques infectées. Si au cours de ces expériences de transmission naturelle, les souris sensibles à l’infection par injection intradermique de virus venaient à ne pas s’infecter, alors nous pourrions supposer que le risque que le virus étudié se transmette par des tiques présentes en Europe est minime sinon nul.
Bénéfices attendus
L’étude de ces deux virus et plus spécifiquement de leur transmission par les tiques de différents genres, présentes notamment en France, permettrait alors d’obtenir une première réponse quant à la transmission potentielle du virus étudié par ces mêmes tiques. Nous allons aussi étudier si ces virus sont capable de passer d’une génération à l’autre de la tique par transmission trans-ovarienne mais aussi sa résistance dans la tique lors des différents passages de stade.
Procédures
Le virus sera injecté une fois en début de procédure. La durée de l’injection est de quelques secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés tous les jours pendant 15 jours consécutifs. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement sanguin final sera réalisé juste avant la mise à mort (30 secondes). Les souris seront exposées à des piqûres de tiques pendant 4-5 j pour les larves et les nymphes et environ 7 jours pour les adultes. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.
Impact sur les animaux
Il est difficile d’anticiper des symptômes spécifiques. Le début de projet est exploratoire et nous permettra de mieux évaluer l’état des animaux en fonction des doses de virus. Nous nous intéresserons donc aux signes génériques. Parmi les signes génériques, une perte de poids, une dégradation de la posture, de l’aspect général (poil hérissé, yeux fermés, grimaces).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par un virus. De plus, les organes seront prélevés pour analyse.
Remplacement
La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent. Les modèles d’infection in vitro sont imparfaits, les tiques ne se gorgent pas bien et peu parviennent aux stades suivants. D’autre part, l’utilisation de membranes de gorgement n’est pas satisfaisante car elle ne mime que très partiellement la transmission naturelle. Les études réalisées in vitro ne permettent pas actuellement de rendre compte de la complexité des interactions dans le cadre de la transmission d’une maladie par un vecteur à un hôte sensible. Il est donc nécessaire de se rapprocher des conditions naturelles de transmission en utilisant un modèle animal adapté. La souris est un modèle intéressant car il a déjà été montré qu’elle est sensible à l’infection par plusieurs virus de la famille du virus étudié.
Réduction
Dans un premier temps, nous chercherons à déterminer la cinétique de virémie de l’infection des souris par les virus. Le travail séquentiel que nous proposons et qui vise dans un premier temps à n’utiliser que les doses de virus les plus faibles notamment dans la procédure devrait permettre de réduire le nombre d’animaux si les résultats obtenus sont suffisants avec les premières doses. Dans certaines expériences des variations assez fortes du succès d'infection seront mis en évidence (par exemple, une variation de 20% à 50% du succès d'infection. Dans d’autres, le manque possible de puissance lié à l'utilisation de variables binaires sur des effectifs assez faibles sera étayé par des quantifications tout à fait complémentaires. Les analyses de puissance sont menées avec un logiciel adapté.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et bi-quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Plusieurs points limites généraux ont été définis basés sur la littérature (perte de poids, fièvre, atteinte hépatique, signes neurologiques). Lorsque l‘un de ces points limites sera atteint, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement important ou bien si leur mobilité diminue. Les animaux seront mis à mort lorsque les points limites terminaux seront atteints. Les résultats obtenus en début de projet où plusieurs lignées de souris seront testées permettront de mieux définir les symptômes et de sélectionner la lignée de souris la mieux adaptée à l’infection des tiques par la suite. Nous établirons également des points limites pertinents pour la suite du projet. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour l’apparition de signes cliniques jusqu’à 15 jours post-infection, notamment quand le modèle sera mis au point et les symptômes analysés. L'approche est exploratoire, en l'absence de connaissances précises dans le domaine, donc les animaux seront observés très précisément. De la nourriture semi-liquide sera mise à disposition des souris avant et après l’infection (les animaux contrôles suivront le même traitement). Si des symptômes apparaissent, les souris seront observées de façon biquotidienne. En l’absence de récupération, les souris seront mises à mort et leurs organes seront récupérés pour des analyses virologiques, histologiques et moléculaires. L’état de santé des souris sera surveillé de façon quotidienne ce qui permettra de détecter précocement tout signe de souffrance et l'atteinte éventuelle des points limites. De la nourriture semi-liquide sera mise à disposition des souris en cas de prostration ou dès lorsqu’une gêne même légère à la motricité sera observée.
Choix des espèces
Nous souhaitons posséder un modèle simple d’infection de tiques sur des souris. Il est nécessaire qu’il s’agisse d’un modèle proche de la réalité de la transmission vectorielle. Les souris sont potentiellement des réservoirs du virus Hazara. Les souris immunodéficientes s’infectent et meurent de l’infection lorsque des doses élevées sont utilisées. Les jeunes souris s’infectent avec le virus Dugbe, mais la sensibilité décroit avec l’âge. Il pourra s’avérer nécessaire d’utiliser d’autres souris présentant l’avantage d’avoir une grande variabilité génétique et certaines lignées ont déjà montré une plus grande sensibilité aux arbovirus. Les souris seront des mâles et femelles âgés de 4 semaines car il a été montré que les jeunes souris développaient une infection lente et progressive, permettant ainsi de pouvoir poser les tiques pour qu’elles soient en phase de gorgement idéalement au cours du pic de virémie.
Pathologie hépatique et infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Dix semaines de régime gras, puis un infarctus provoqué par une chirurgie de trente minutes : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur. S'y ajoutent une échocardiographie et des injections répétées, toutes les quarante-huit heures pendant dix jours ou trois fois par semaine pendant deux semaines. L'objet est de comprendre comment une maladie du foie gras aggrave la réparation du cœur après un infarctus, sur des lignées modifiées pour porter l'atteinte hépatique. Parmi les nuisances attendues, le porteur ne mentionne que l'inconfort de la contention, le stress de l'anesthésie et des douleurs post-opératoires transitoires, sans un mot sur ce que représente l'infarctus lui-même pour l'animal.
Objectifs
La maladie du foie gras, qui touche plus de 127 millions d'Européens, est fortement liée à un risque accru de complications cardiovasculaires, notamment l'infarctus du myocarde. Les décès chez les patients atteints sont d'ailleurs plus souvent d'origine cardio-vasculaire qu'hépatique. Le remodelage cardiaque est un déterminant essentiel du résultat clinique après un infarctus du myocarde impliquant des réponses biologiques complexes, notamment un engagement du système immunitaire. Cependant, le rôle causal précis de l'atteinte hépatique sur la réparation cardiaque reste non établi. Le projet a donc pour but de caractériser les effets de différents types d'atteintes tissulaires qui caractérisent la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque aux niveaux cellulaires et moléculaires, avec un accent particulier sur la réponse inflammatoire. Une approche thérapeutique sera testée pour limiter les dommages cardiaques délétères observés. Les objectifs de ce projet sont : 1. Caractériser les effets de la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde chez la souris. 2. Étudier l’impact sur la réponse immunitaire, par l’analyse dans le sang, la rate, la moelle osseuse et enfin dans le coeur. 3. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’atteinte cardiaque exacerbée associée à l'atteinte hépatique. 4. Etudier la contribution directe d'un type de cellules inflammatoires délétères: les neutrophiles.
Bénéfices attendus
À terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de communication cellulaire qui contrôlent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde, ainsi que le rôle de l’atteinte hépatique dans le contrôle de l’homéostasie du cœur défaillant. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du cœur infarci, prévenir ou freiner les atteintes cardiaques, et ainsi améliorer la survie des patients.
Procédures
Exposition diète riche en matières grasses - durée 10 semaines //chirurgie - durée 30 minutes // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // Injection - durée 1 minute, soit chaque 48h pendant 10 jours posterieures a la chirurgie, soit 3 fois par semaine durant 2 semaines postérieures à la chirurgie.
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires.
Devenir
À la fin de nos procédures, les animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Ces modèles d’animaux sont une étape indispensable pour étudier le dialogue pathogénique complexe entre le cœur et le foie, un phénomène qui implique de multiples types cellulaires et ne pourrait pas être entièrement reproduit par de simples modèles cellulaires. Le choix de modèles animaux qui permettent de modifier spécifiquement le foie repose sur des données préalablement observées, garantissant que les modèles reproduisent fidèlement les atteintes hépatiques souhaitées. De plus, l'utilisation de ces modèles pré-cliniques est un préalable nécessaire à la validation de toute stratégie thérapeutique future visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d'un infarctus du myocarde dans un contexte de maladie du foie gras.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle préclinique privilégié pour l'étude de la relation entre la stéatose hépatique et les maladies cardiovasculaires, en particulier après un infarctus du myocarde. Ce modèle est idéal pour plusieurs raisons : 1. génétique et mécanismes : Il permet de générer les lignées génétiquement modifiées nécessaires pour induire spécifiquement l'atteinte hépatique. Ceci est crucial pour décortiquer les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires du dialogue cœur-foie. 2. reproductibilité et rurveillance : L'utilisation de la souris garantit une homogénéité et une robustesse des résultats expérimentaux. De plus, elle offre la possibilité de surveiller l'évolution des complications cardiaques et vasculaires associées à la maladie du foie dans un délai de temps pertinent. 3. complexité biologique : Contrairement aux modèles in vitro, la souris permet d'étudier l'intégralité des interactions inter-organes (cœur et foie) impliquées dans le remodelage cardiaque post-infarctus. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 10 semaines minimum. Ce choix est fait pour s'assurer que le système cardiovasculaire est arrivé à maturité. Utiliser des souris plus jeunes risquerait d'introduire un biais, car elles n'auraient pas systématiquement atteint la puberté, et les hormones sexuelles sont connues pour jouer un rôle dans le remodelage cardiaque post-infarctus.