Procédures modérées

Un gavage de quelques secondes, une seule fois dans la vie de l'animal, suffit à justifier l'utilisation de 360 souris. Elles sont 900 en tout, toutes tuées pour prélever leurs organes, 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 180 un niveau modéré, ces dernières subissant une chirurgie d'une vingtaine de minutes sous anesthésie générale. L'objet est de cartographier dans les tissus les formes actives de la vitamine A grâce à des sondes chimiques, méthode que l'équipe a déjà validée en culture cellulaire. Le porteur affirme qu'un remplacement est impossible et retient des souris de quatre semaines, âge qui selon lui limite aussi la durée d'élevage en captivité.

Objectifs

La vitamine A est indispensable au développement et à la physiologie des organismes vertébrés. Les données de nombreuses études scientifiques ont révélé des fonctions extrêmement complexes des formes actives de cette vitamine, dans quasiment tous les types de tissus composant notre organisme. Un déséquilibre de sa signalisation est associé à diverses pathologies, y compris des déficits immunitaires, visuels, et des maladies neurodégénératives. On connait encore peu de choses sur les mécanismes sous-tendant le transport, la biodisponibilité et/ou le stockage des formes (molécules) actives de la vitamine A ou rétinoïdes dans les cellules de l’organisme. Il s’agit de petites molécules qui, à la différence des protéines, sont impossibles à détecter par les méthodes classiques d’analyses de cellules et tissus en histologie et microscopie. Notre équipe a consacré plusieurs années à développer une méthode novatrice pouvant permettre une telle détection. Brièvement, elle repose sur une méthode développée dans le domaine de la chimie du vivant, récompensée par un récent Prix Nobel de chimie. Dans notre cas, et en collaboration avec une équipe de pointe en chimie du vivant, nous avons produit par synthèse chimique des formes modifiées de la vitamine A, et avons prouvé que ces formes réagissent avec des molécules sondes détectables, par exemple, par fluorescence. Cette méthode a été validée en particulier dans des systèmes de culture cellulaire. Le projet va maintenant permettre, pour la première fois, de détecter et de cartographier ces molécules rétinoïdes dans l’organisme au niveau cellulaire grâce à l’histologie et à la microscopie à très haute résolution. De plus, il sera possible de déterminer les formes moléculaires précises de rétinoïdes produites in vivo dans les tissus, en analysant ces molécules capturées dans des extraits tissulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'identifier de nouvelles molécules bioactives à fort potentiel pour le traitement ou le diagnostic de diverses maladies neurologiques. Les nouveaux outils validés dans le cadre de ce projet seront essentiels pour déterminer leur localisation avec une résolution au niveau de la cellule. De telles connaissances permettront d'étudier et de faire progresser de manière significative notre compréhension de la physiolopathologie de plusieurs troubles neurologiques dont la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington. En effet, des travaux scientifiques ont indiqué un lien possible entre la voie des rétinoïdes et les causes possibles de ces maladies. L’amélioration des connaissances sur le métabolisme et la distribution des rétinoïdes au sein des tissus de l’organisme pourraient donc aboutir (en agissant sur cette voie biologique) à des stratégies pour la prévention ou le traitement de ces maladies. Au-delà des connaissances spécifiques sur ces maladies, les données obtenues devraient faire progresser les connaissances sur l'absorption et la signalisation des vitamines. Les techniques et outils spécifiques validés dans le cadre de ce projet devraient être applicables à toutes petites molécules biologiques et à leur analyse dans un organisme vivant.

Procédures

Des souris non-génétiquement modifiées âgées de 4 semaines recevront l’administration d’un soluté par gavage oral. Cet acte ne sera réalisé qu’une fois pour chaque animal, et ne durera que quelques secondes. Etant donné le nombre de molécules (solutés) et les temps post-administration à analyser, cet acte concernera 360 souris. D’autres souris seront soumises à des injections intra-péritonéales : 180 souris recevront une seule injection, 360 recevront une injection supplémentaire pour anesthésie générale, entraînant un endormissement rapide pour effectuer chirurgie terminale sans réveil et des prélèvements d'organes sans réveil. Chaque injection (seringue fine de type insulinique) ne durant que quelques secondes. Un acte chirurgical sera réalisé sur 180 animaux sous anesthésie générale. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les administrations de solutés par voie orale ou intra-péritonéale peuvent générer un stress de courte durée et un inconfort pour les animaux. Les procédures n’ayant qu’une durée totale de 1 heure (minimum) à 24 heures (maximum), les animaux pourront être surveillés pour tout signe d’inconfort. Les solutés injectés ne comportent pas de principe (molécule) directement actif, ils ne sont pas de nature à avoir un effet indésirable dans le laps de temps précédant la mise à mort de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort, en vue du prélèvement et de l’analyse d’organes par des techniques de pointe.

Remplacement

Il n’est ici pas possible de remplacer le modèle animal, l’essence même du projet étant de pouvoir cartographier par une méthode novatrice, dans l’organisme et en condition de vie réelle - potentiellement jusqu’à l’échelle sub-cellulaire - les molécules et métabolites d’une voie de signalisation impliquée dans divers processus physiologiques ou pathologiques. Les données obtenues seront transposables et amélioreront les connaissances de ces processus dans l’espèce humaine.

Réduction

Dans notre projet nous utilisons un faible effectif d’animaux permettant toutefois d’effectuer des analyses statistiques (n=5). Ces effectifs ont été déterminés en fonction des données de la littérature et des procédures en vigueur dans l'animalerie. De plus, si l’une des deux voies d’administration des molécules rétinoïdes s’avérait plus efficace, elle sera immédiatement privilégiée, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les injections seront exercées par un manipulateur expérimenté. Ici, nous ne nous attendons pas à engendrer une douleur aux animaux lors des administrations orales ou injections de solutés. Il s’agira de plus d’actes isolés ou répétés seulement 1 ou 2 fois pour les injections en vue d’anesthésie générale. Les procédures chirurgicales sont ainsi réalisées sous anesthésie générale par injection d’un mélange d’anesthésie et d’analgésique afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie des précautions sont prises pour protéger les yeux des animaux d’un éventuel dessèchement. Les animaux sont préservés du refroidissement généré par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Finallement, des points limites ont été définis et seront appliqués. A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort par un personnel expérimenté.

Choix des espèces

La souris est une espèce mammifère dont les processus physiologiques sont dans l’ensemble proches voire comparables à ceux de l’homme. Il s’agit aussi, et ceci est particulièrement important, d’un modèle pour lequel de nombreuses lignées génénétiquement modifiées ont été créées, modèles de mutations et/ou de processus pathologiques affectant les humains. Les résultats de notre étude pourront immédiatement servir de base pour une exploration des voies biologiques impliquant la vitamine A dans n’importe lequel de ces modèles, si les données de la recherche le justifiaient. Les procédures concerneront des animaux âgés de 4 semaines, âge auquel le développement post-natal des organes (particulièrement le cerveau) peut être considéré comme complet. Ceci minimisera la durée d’élevage des animaux en captivité.

Quatre injections intrapéritonéales sur animal vigile et une injection dans le muscle releveur de la patte sous anesthésie : 138 souris transgéniques vont être utilisées, 108 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 30 un niveau léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles. L'objet est d'identifier la fonction d'une protéine liant l'ADN au cours de la réparation musculaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut se substituer à ce modèle et que ces résultats n'auraient pas pu être obtenus sur lignées cellulaires. La lésion musculaire, qui fonde tout le protocole, n'apparaît pas dans la liste des procédures et le produit injecté pour la provoquer n'est pas nommé.

Objectifs

Les muscles squelettiques composent près de la moitié de la masse totale d’un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires, de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu conjonctif. Suite à une blessure, les cellules souches résidentes du tissu musculaire s’activent, prolifèrent et réparent le tissu musculaire lésé. Ce processus implique une communication avec les cellules voisines afin de reconstruire les fibres musculaires de façon optimale. Le projet de recherche consiste à étudier le contrôle de la réparation musculaire en identifiant les fonctions d'une protéine se liant à l'ADN dans différents types cellulaires musculaires au cours de la régénération. Nous développerons deux approches, la première consistera à isoler et étudier des cellules primaires d’animaux modèles aux différents types cellulaires. La deuxième approche nous permettra d’évaluer la régénération du tissu musculaire, mais cette fois-ci in vivo, à partir de ces mêmes modèles de souris. Dans le contexte de la régénération musculaire, ce projet de recherche nous permettra d’identifier les voies de communication entre cellules qui sont essentielles à la réparation musculaire.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats du projet permettront de comprendre précisément comment la régulation d'acteurs interagissant avec l'ADN se fait dans différents types cellulaires, et contrôle le processus de régénération musculaire. En plus d’augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules qui participent à la réparation du muscle squelettique, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative.

Procédures

4 injections intrapéritonéales sur animaux vigiles non anesthésiés (138 animaux). Chaque injection prend moins de 3 secondes. Une injection intramusculaire dans le muscle releveur de la patte sur animaux anesthésiés (108 animaux). Cette intervention dure moins de 5 secondes. Les animaux sont mis en contentions lors des injection de tamoxifène et d'anesthésique.

Impact sur les animaux

Les trois modèles de souris transgéniques, qui seront utilisés dans le projet, ne présentent pas de phénotype dommageable à l’état basal. Les injections intrapéritonéales de tamoxifène n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal, aux doses et fréquences utilisées. L’utilisation d’analgésique et d'anesthésique au cours de la lésion musculaire garantit l’absence de douleur chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu’elles ne montrent pas de signes de douleur pendant les jours suivants.

Devenir

Les animaux sont mis à mort et les muscles sont prélevés.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour l’étude de la régénération du muscle via l’activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats n'auraient pas pu être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de notre projet utilisant des modèles transgéniques murins

Réduction

L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlé à l'aide d’analyses statistiques adaptées. Le nombre d'animaux a été déterminé afin d'obtenir un échantillon réduisant le nombre d'animaux au maximum tout prenant en compte la variabilité biologique des individus ainsi que la variabilité des individus à répondre au traitement effectué. Cela permet d'obtenir des groupes qui vont pouvoir être comparés les uns par rapport aux autres via des données qui vont permettre d'apporter des informations sur la significativité de ces différences.

Raffinement

Avant le début de chaque experimentation, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Les animaux seront pesés deux fois par semaine jusqu’à leur mise à mort. Anesthésiques et analgésiques sont utilisés afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés 2 fois par semaine afin de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d’interaction sociale, tout changement pourrait refléter souffrance, douleur ou stress, même minime, chez l’animal. Si ces changements sont relevés pendant plus de 24h, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d’améliorer les conditions de vie de l’animal et d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l’Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l’analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. De plus, la souris permet l'utilisation de modèles transgéniques permettant la délétion d’un gène d’intérêt dans un type cellulaire et à un temps donné. Les expériences menées sur ces modèles ont permis d’obtenir des résultats fondamentaux et novateurs qui n'auraient clairement pas pu être établis à l'aide de lignées cellulaires. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 8 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.

2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs intestins et leurs fèces, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, cinq jours d'injections quotidiennes d'une molécule bloquant un gène, une irradiation de cinq minutes et un prélèvement de sang sous anesthésie. Les souris nées dans l'élevage et non retenues pour les procédures sont tuées elles aussi. Le porteur attend de ce travail sur les cellules souches de l'intestin des traitements nutritionnels "à plus long terme" et justifie l'effectif de 2 064 animaux en une phrase, les effectifs étant "déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les effets de l’alimentation sur le maintien et l’autorenouvellement des cellules souches intestinales. Ces cellules permettent un renouvellement permanent de l’épithélium intestinal, essentiel pour maintenir l’équilibre du tissu intestinal et réparer les lésions causées par divers stress. Au cours du projet, l’irradiation provoque une accélération du renouvellement des cellules souches intestinales. Ainsi, il devient possible d’explorer comment les modifications du métabolisme des lipides entrainées par des changements alimentaires jouent sur cet équilibre. La flore intestinale joue également un rôle important dans le maintien de ce tissu. Un traitement antibiotique permet également d’évaluer la contribution de cette flore au phénotype observé.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d'identifier les mécanismes impliqués dans les effets de l’alimentation sur l'intestin. Ces recherches devraient enrichir la compréhension de la biologie des cellules intestinales mais aussi ouvrir, à plus long terme, de nouvelles perspectives de traitements utilisant des approches nutritionnelles.

Procédures

1 biopsie de queue : 10 secondes. 1 contention pour injection de de molécule bloquant l’expression d’un gène: 20 secondes, (1X/jour pendant 5 jours). 1 irradiation : 5min. 1 contention pour injection d’anesthésique: 20 secondes. 1 prélèvement sanguin : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une douleur légère et de courte durée lors de la biopsie et un stress lors de la contention et des injections. Potentiellement certains traitements peuvent conduire à une perte de poids temporaire. L’irradiation peut provoquer une perte de poids et un stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus l’expérimentation, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.

Remplacement

L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des points limites spécifiques sont établies. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permettent d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le maintien et le renouvellement de l'épithélium. Des souris adultes âgées de 2 à 4 mois, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.

Vérifier si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de protéine Tau dans l'hippocampe : 226 souris sont utilisées pour cela dans le troisième des trois établissements de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souris Tau22 développent des lésions cérébrales et des pertes de mémoire à partir de six à neuf mois, après une injection de vecteur de thérapie génique dans le cerveau et deux tests de mémoire passés à sept et dix mois. La mise à mort passe par une ouverture du thorax sous anesthésie profonde, le porteur écrivant qu'une perfusion réalisée après le décès abîmerait les mitochondries qu'il veut observer. Les reproducteurs âgés sont réformés et tués eux aussi, aucun animal génétiquement modifié ne pouvant être placé ni relâché.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.

Procédures

Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.

Remplacement

Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau

Réduction

Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.

Raffinement

Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.

Choix des espèces

Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.

Une souris dont le score combinant l'état de l'oreille et l'état général atteint le point limite est mise à mort. 978 souris vont être utilisées dans ce projet sur la dermatite atopique, 815 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse de la peau, des ganglions, de la rate et de la moelle. Une substance appliquée sur les oreilles y déclenche une inflammation et des démangeaisons pendant dix à douze jours, l'épaisseur de l'oreille étant mesurée chaque jour, avec un prélèvement de sang sous la mâchoire sur animal éveillé. Le porteur reconnaît que les démangeaisons seront "notamment très présentes" chez les souris recevant le seul véhicule, et situe le bénéfice attendu, une crème plus efficace, dans cinq à dix ans.

Objectifs

La dermatite atopique (DA) est l’inflammation cutanée chronique la plus courante. Les traitements actuels, comme les glucocorticoïdes topiques, ont des effets secondaires et perdent en efficacité avec le temps. De nouvelles thérapies soulageant les symptômes et ciblant les mécanismes de la DA avec moins d'effets indésirables sont requises. Nous avons identifié une cible thérapeutique dont le blocage permet de réduire l'inflammation cutanée dans différents modèles. Nos collaborateurs ont mis au point un inhibiteur de cette cible, qui peut être appliquée sur la peau directement. Son efficacité est toutefois limitée par sa dégradation rapide et son passage limité de la barrière cutanée. Nous avons créé et sélectionné 4 dérivés de cet inhibiteur, plus stables et très efficaces in vitro, et que nous souhaitonsà présent comparer in vivo pour identifier le plus efficace pour limiter l’inflammation cutanée dans des modèles de DA. Nous souhaitons également identifier les mécanismes qui expliquent l’efficacité de ces composés et les bénéfices possibles de leur utilisation conjointe avec une application cutanée de corticoïdes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise répond à un manque important de traitements locaux efficaces pour la DA. Il pourrait permettre de développer un nouveau traitement appliqué directement sur la peau, agissant sur une cible précise, avec des bénéfices attendus à moyen terme (d’ici 5 à 10 ans). Ce nouveau traitement pourrait aussi être utilisé en complément des crèmes à base de corticoïdes déjà existantes. Cette association pourrait renforcer l’effet anti-inflammatoire tout en permettant de réduire les doses de corticoïdes, et donc leurs effets indésirables et le recours à des traitements généraux plus lourds, souvent coûteux et associés à davantage d’effets secondaires. Notre approche repose sur des résultats scientifiques antérieurs montrant que notre cible joue un rôle dans l’inflammation de la peau et même si l’efficacité de notre stratégie de blocage n’est pas encore prouvée avec certitude, les données disponibles sont suffisamment encourageantes pour justifier des études précliniques.

Procédures

Nous effectuerons des applications cutanées de composés visant à induire la dermatite atopique (DA), puis des composés inhibiteurs à tester ainsi que de composés contrôles ou de leurs véhicules. Ces applications, qui prennent une à deux minutes seront quotidiennes pendant 12 jours ou réalisées certains jours (J0,1,5, 6,7,8,9) sur une période de 10 jours. Nous effectuerons des mesures quotidiennes de l’épaisseur des oreilles pendant la phase de suivi, et, dans certains protocoles, un prélèvement de sang sur animaux vigiles deux heures après la dernière application du traitement. Ce prélèvement implique une immunobilisation de l'animal pendant 20 à 40 secondes, pour un prélèvement qui dure de 10 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux seront légères à modérées. En effet, l’application de MC903 et de DNFB engendre une inflammation avec un gonflement plus ou moins important de l’oreille et des démangeaisons qui seront notamment très présentes dans les groupes traités avec le véhicule : nuisance légère (groupes contrôles sans DA ou avec DA traitée de façon optimale) à modérée (groupes DA). Un prélèvement de sang sera réalisé au niveau sous-mandibulaire sur animal vigile par un expérimentateur aguerri : nuisance légère. La manipulation des animaux et la prise de mesure d’épaisseur de l’oreille quotidienne peut engendrer une nuisance légère . Pour limiter autant que possible l’éventuelle douleur à l’application des composés et le stress chez les animaux, l’administration des différents composés sera réalisée sous anesthésie gazeuse et nous serons très vigilants pour limiter tout désagrément additionnel pour les souris. Le prélèvement de sang sera réalisé sur animal vigile par une expérimentateur aguerri.

Devenir

Suite à la dernière mesure d’épaisseur des oreilles, les souris seront euthanasiées pour analyse post mortem de la peau et des organes lymphoïdes (ganglions drainant la peau, rate, moelle).

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances, reproduire in vitro les mécanismes immunologiques complexes et intégrés responsables de la dermatite atopique et de l’hypersensibilité retardée et explorer les bénéfices potentiels de traitements ciblés sur cette pathologie n’est pas possible. Dans le cadre de ce projet, nous avons déjà réalisé de nombreux travaux in vitro pour pré-sélectionner les composés à tester et limiter leur nombre. A présent, nous disposons de quatre composés ayant un effet in vitro et avons pour objectif de sélectionner le meilleur d’entre eux puis de caractériser les mécanismes responsables de son efficacité, le cas échéant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire, en complément des autres approches déjà menées in vitro et in silico.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet, nous avons sélectionné les 4 composés à tester sur la base d’expériences réalisées in vitro et ex vivo sur des cellules primaires humaines. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été défini sur la base de travaux précédents, de sorte à assurer autant que possible l’identification de différences statistiques le cas échéant. Pour nous aider, nous avons utilisé des calculs de puissance. Nous avons de plus prévu des plans d'expériences qui permettront d'arrêter certains groupes rapidement si un composé ne fonctionnait pas, par exemple.

Raffinement

Dans le cadre de l’application des différents composés, nous limiterons le temps de contention et manipulerons les souris avec précaution pour réduire le stress, ce qui améliorera la reproductibilité des résultats. Ces applications seront réalisées sous anesthésie gazeuse, au niveau des oreilles Chaque protocole sera réalisé par les mêmes expérimentateurs, avec un expérimentateur qui appliquera les composés et prendra les mesures, et un second qui identifiera les souris et prendra les notes (mesures et toute observation utile pour chaque souris). La prise de mesure avec le micromètre étant très dépendante d’opérateur, nous privilégierons la prise de mesure par un même expérimentateur pour accroitre la robustesse de nos données. La surveillance quotidienne des animaux visera à vérifier des paramètres généraux révélateurs de l’état dénéral des souris (comportement, posture, allure de la fourrure, blessures éventuelles) au-delà des paramètres liés à l’expérience (léchage, grattage, oreille gonflée ou rouge). Une grille de scores combinés incluant des critères locaux et généraux sera utilisée pour grader l’éventuelle altération de l’état des animaux. Toute altération de l’état général d’une souris conduira à un suivi plus poussé avec pesées quotidiennes. Si le point limite, défini sur la base d'un score combinant les atteintes locales et l'état général, était atteint, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les mécanismes cellulaires impliqués dans la DA et l’hypersensibilité retardée ne peuvent pas être complètement reproduits in vitro à l’heure actuelle. Les modèles de DA et d’hypersensibilité chez la souris présentent des similitudes importantes avec la physiopathologie de ces atteintes chez l’homme, et le récepteur cible des inhibiteurs testés est très conservé entre homme et souris. Ceci soutient la pertinence de la réalisation de nos expériences chez la souris. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, dont le système immunitaire est pleinement mature. Elle seront issues du commerce ou de nos élevages, et agées de 6 à 14 semaines lors de leur entrée en protocole, pour nous permettre de constituer des groupes de souris d'effectif suffisant sans amplifier de façon excessive nos élevages.