Procédures modérées

Toutes les souris subissent une chirurgie préliminaire de vingt minutes, puis deux séances de trente minutes de vidéo-oculographie sur animal éveillé pour mesurer leurs réflexes de stabilisation du regard. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole. Beaucoup sont sourdes et tournent en rond sans arrêt, ce que le porteur classe en "phénotype dommageable" tout en affirmant qu'elles sont "parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement" et ne demandent pas de soins particuliers. Le projet ne poursuit pas de question scientifique propre, il met une plateforme de mesure à disposition d'équipes extérieures qui y font phénotyper leurs lignées de souris sourdes ou vestibulaires.

Objectifs

Ce projet porte sur la quantification comportementale des réflexes vestibulaires et de souris présentant des suspicions de troubles vestibulaires et auditifs. Les pathologies vestibulaires sont caractérisées par des épisodes imprévisibles de vertiges accompagnés de déséquilibres oculomoteurs et posturaux. Les pathologies vestibulaires chroniques sont très invalidantes et conduisent à un isolement psychologique et social. La prévalence des vertiges en clinique est très importante, de l'ordre de 20 à 30%, et augmente avec l'âge. Les vertiges vestibulaires peuvent être liés à des atteintes du système nerveux périphérique et notamment des organes vestibulaires de l'oreille interne ou du nerf cochléo-vestibulaire. Les pathologies touchant l’oreille interne ont souvent des conséquences auditives et vestibulaires. Alors que les surdités partielles ou totales sont facilement identifiées et mesurées expérimentalement chez la souris, les troubles vestibulaires sont difficiles à identifier et rarement quantifiés. Chez l’homme, le meilleur test consiste à mesurer les réflexes vestibulo-oculaires par vidéo-oculographie, une pratique réalisée dans la plupart des centres ORL. Chez la souris, cette même technique qui permet la quantification des troubles vestibulaires est une expertise rare qui demande du matériel couteux. De nombreuses équipes travaillant sur des pathologies ORL nous contactent donc afin de bénéficier de notre expertise et de notre plateforme intégrée de vidéo-oculographie permettant de réaliser des tests comportementaux vestibulaires. Ce projet générique destinée à permettre le phénotypage de différentes souris sur notre plateforme expérimentale utilisera un total maximum de 720 souris sur 5 ans. Ce nombre permettra de couvrir les besoins d'au moins 7 études sur la période.

Bénéfices attendus

Les pathologies vestibulaires sont très invalidantes. De nombreuses pathologies congénitales d'origine génétiques conduisent chez l'enfant à des surdités qui sont détectées et traitées par des implants cochléaires, et depuis peu par thérapie génique. Dans la plupart des cas, seule la partie auditive de ces pathologies est prise en compte par l'entourage et les médecins, les aspects vestibulaires étant imparfaitement diagnostiqués et évalués. Alors que de nombreux modèles murins sont développés pour mimer les pathologies humaines et font l'objet de tests de thérapie génique, il est essentiel d'évaluer si ces thérapies peuvent également fonctionner sur les organes vestibulaires et permettre in fine une récupération des fonctions sensorimotrices et cognitives associées à ces déficits congénitaux.

Procédures

Tous les animaux (n=720) seront soumis à des chirurgies préliminaires d'une durée de 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont phénotypés à l'aide de tests sensorimoteurs: les réflexes de stabilisation du regard sont mésurées par vidéo-oculographie afin de mesurer précisément les fonctions vestibulaires et oculomotrices. Ces tests durent 2 fois 30 minutes et sont effectués chez la souris éveillée. Des tests locomoteurs et posturaux d'une durée totale de 6 minutes sont également effectués 2 fois chez la souris éveillée, afin de mesurer leur équilibre.

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement déficientes vestibulaires présentent parfois des hyper activités ou locomotion anormales (circling) ce qui constitue des nuisances les classant en phénotype dommageable. Elles sont également fréquemment sourdes ou mal entendantes. Elles sont cependant parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement et ne nécessitent pas de soins particuliers. Ces déficits auditifs et locomoteurs constitent un point d’attention pour la gestion et le cas échéant le suivi plus particulier de ces animaux. Le traitement spécifique pour réduire ces nuisances consiste en une restauration de la fonction vestibulaire par thérapie génique qui fait l'objet d'une partie de l'étude de phénotypage, mais qui ne s'appliquera qu'à une partie des lots.

Devenir

Les souris, le plus souvent mutants génétiques et sujets de thérapie génique, doivent être euthanasiées en fin de protocole. Le cas échéant, après la mise à mort, des analyses post-mortem validant les effets des traitements seront réalisés.

Remplacement

Afin d'évaluer les déficits sensorimoteurs associés à des pathologies de l'oreille interne et de tester l'efficacité de thérapie génique, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient ne pas compléter l'ensemble des tests. Le nombre de souris correspond à une estimation du maximum de souris qui pourraient être nécessaires, et une estimation des capacités maximales de tests offertes par notre plateforme, il est donc susceptible d'être revu à la baisse au cours du projet.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau des mammifères, c'est le modèle animal privilégié pour les études génétiques et la mise au point de traitement de thérapie génique. L'utilisation de lignées génétiquement altérées permet de reproduire les pathologies génétiques conduisant à des surdités et pathologies vestibulaires congénitales chez l'homme, afin de développer des thérapies ciblées. Les tests sensorimoteurs sont effectués sur des animaux plus âgés que 6 semaines. Les réflexes oculomoteurs et locomoteurs étudiés se développent en effet au cours des 4 premières semaines de développement post-natal, et sont considérés comme acquis et matures chez l'ensemble des individus après 6 semaines.

Greffées avec un fragment de sarcome humain sous anesthésie, des souris immunodéficientes reçoivent ensuite des injections trois fois par semaine et une chimiothérapie hebdomadaire, jusqu'à la fin de l'expérience. 525 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la tumeur. Le porteur indique que la croissance tumorale peut gêner la motricité aux stades tardifs et que la chimiothérapie fait maigrir les animaux. Ni la cible thérapeutique ni le candidat médicament ne sont nommés, le résumé mentionnant seulement un essai clinique "à l'étude" et des inclusions de patients au titre compassionnel.

Objectifs

Les sous-types de tumeurs étudiés constituent des maladies rares qui touchent environ 1000 personnes par an en France. Ils peuvent affecter une population plutôt jeune avec des réponses thérapeutiques faibles et un mauvais pronostic vital. Pour ces raisons, il convient d’identifier des alternatives de prise en charge thérapeutique. L’analyse de cohortes de patients atteints de ces pathologies a mis en évidence une expression soutenue de notre cible thérapeutique. L'objectif principal de notre projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec les standards de traitement sur le développement tumoral dans des modèles murins représentatifs de ces pathologies. Les expérimentateurs en charge des animaux sont expérimentés dans la mise en œuvre des modèles animaux présents dans les différentes procédures.

Bénéfices attendus

Notre hypothèse est que notre cible thérapeutique joue un rôle dans le développement de certains sous-types de sarcomes. Nous nous basons pour cela sur des éléments d'évaluation de son expression dans une cohorte de patients atteints de ces tumeurs. Nous évaluons l’effet anti-tumoral d’une thérapie ciblée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie. Un projet d’essai clinique portant sur le traitement de ces indications avec notre thérapie ciblée est actuellement à l’étude ainsi que l’inclusion de patients au titre compassionnel. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement du candidat médicament et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (durée : 5 min 1x). - Injections de produit (durée 30 sec /3x par semaine de l’inclusion des animaux dans les groupes de traitement à la fin d’expérimentation) - Injections de chimiothérapie (durée 10 sec /1x par semaine l’inclusion des animaux dans les groupes de traitement à la fin d’expérimentation) - Des injections supplémentaires de produit analgésiant seront réalisées sur les animaux dans le cadre des actes chirurgicaux (durée 10 sec, 2x et répétées en cas de souffrance) - Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe - Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (1 à 3 fois par semaine selon la progression tumorale).

Impact sur les animaux

Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées, des traitements, le suivi de la croissance tumorale mais avant tout une procédure de chirurgie d’implantation du greffon sous anesthésie. Ces manipulations peuvent entrainer du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil) lors de la chirurgie. Les suites chirurgicales peuvent entrainer des douleurs notamment au niveau de la plaie et des sutures. Les piqures lors des traitements peuvent entrainer un stress physique et une douleur légère inférieure à 1 minute. Le développement tumoral peut à des stades tardifs entrainer une entrave à la motricité. La chimiothérapie peut entrainer un amaigrissement des animaux des animaux. Aucune activité métastatique n'est décrite dans le modèle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de procéder aux prélèvements biologiques tumoraux nécessaires aux maintien du modèle ou à l'analyse des mécanismes d'action de la thérapie ciblée étudée.

Remplacement

Certains sous-types tumoraux nous intéressent pour leur plasticité cellulaire. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension des mécanismes d’action de notre thérapie ciblée. Les modèles retrouvés dans la littérature montrent que cette plasticité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires mais uniquement dans les modèles greffés chez la souris. Concernant d’autres sous-types tumoraux d’intérêt, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou in vivo alternatif aux modèles ici présentés et obtenus dans le cadre d’une collaboration.

Réduction

Le taux de prise tumorale moyen est de 60% lors d’une décongélation et de 90% dans le cadre du passage du modèle. Lors des passages des modèles, une tumeur permet d’obtenir une quinzaine de greffons de qualité suffisante pour la réimplantation. Pour cette raison, les décongélations et passages sont réalisés avec 5 souris. Par la suite, les effectifs des animaux inclus dans les 4 groupes ont été calculés grâce au logiciel permettant d'évaluer le nombre de souris nécessaires au regard des tests statistiques à réaliser. Ainsi, les effectifs calculés sont de 15 souris par groupe. En dernier lieu, un principe de Go/No Go sera appliqué de manière à réduire le nombre d’animaux. Ainsi, les modèles et/ou les sous-groupes de traitement ne montrant pas d’efficacité thérapeutique ne seront pas repris pour l'étude du mécanisme d'action.

Raffinement

Méthodes utilisées pour réduire la douleur : - Anesthésie générale prévue lors de la chirurgie liée à la greffe du modèle (5min) - Les nuisances post-chirurgicales (douleurs au niveau de la plaie) sont diminuées par la mise en place d'une analgésie spécifique et d’un suivi régulier permettant de l’ajuster en cas de besoin Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux à l'aide d'une grille de scoring. Cette évaluation sera mise en place entre 1 et 3x/semaine selon le stade de développement tumoral. Tous les gestes techniques et le suivi des animaux sont réalisés par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux. Des mesures d'enrichissement du milieu permettant un réchauffement des individus seront mises en place afin de limiter l’apparition d’hypothermies. De la nourriture semi-liquide sera mise dans la cage en cas de perte de poids.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est la plus appropriée pour greffer du tissu humain afin d’éviter les rejets tout en permettant de faire des suivis d'efficacité anti-tumorale dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux. Les schémas d'administration des anticorps et chimiothérapies sont bien standardisés chez la souris contrairement à d'autres modèles. De plus, cette espèce constitue le seul hôte pour les modèles concernés. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans toutes les procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge. L'utilisation de femelles sera privilégiée en cas de modèle tumoral dont l'origine est gynécologique. Les mâles seront utilisés dans les cas où les modèles sont issus de tumeurs prélevées chez des patients hommes.

Dépourvues de système immunitaire fonctionnel pour ne pas rejeter des tumeurs humaines, 2 500 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur prélevé chez un patient est greffé sous leur peau, la tumeur est laissée croître jusqu'à 1 200 mm3, et l'animal peut être gardé jusqu'à un an. Le projet ne cherche aucun résultat scientifique propre, il alimente une banque de tumeurs congelées destinée à des études pharmacologiques autorisées séparément. Chaque tumeur récoltée sur une souris tuée est découpée en fragments regreffés sur de nouvelles souris, jusqu'à cinq passages successifs, et le porteur évalue la possibilité de greffer deux tumeurs par animal.

Objectifs

Le cancer est une maladie qui touche des millions de personnes à travers le monde. Il s'agit d'une prolifération anormale de cellules qui peuvent envahir les tissus environnants et se propager à d'autres parties du corps. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), il y a environ 18 millions de nouveaux cas de cancer chaque année dans le monde, et ce chiffre est en augmentation. En France, environ 400 000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année. L’objectif de ce projet est de constituer une banque de tumeurs solides d’origine humaine. Pour se faire, les tissus biologiques initialement prélevés en de très petites quantités chez le patient seront amplifiés chez la souris afin de disposer rapidement de matériel tumoral congelé ou frais pour réaliser des études in vitro ou greffer des souris en vue d’études pharmacologiques. Ce projet s’inscrit dans un large programme de recherche de nouvelles thérapies visant à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses. Il s’agit d’un projet dédié uniquement à l’amplification et au maintien de tumeurs solides « in-vivo ». Pratiquement, l'échantillon du patient est greffé sur la souris. La tumeur obtenue est ensuite prélevée, découpée en fragments puis greffée à nouveau sur de nouveaux animaux. Ce process permet d'amplifier le matériel tumoral permettant ainsi de congeler des échantillons tumoraux en quantité suffisante pour réaliser une banque ou pour greffer des animaux afin de réaliser une étude pharmacologique si un besoin est identifié. Ces études de pharmacologie font l’objet d’une autre autorisation de projet.

Bénéfices attendus

Malgré les progrès dans le traitement du cancer, certains restent difficiles à traiter et des patients ne répondent pas ou deviennent résistants aux traitements existants. La recherche contre le cancer reste encore un défi majeur de santé publique. Les avancées médicales, incluant la recherche de nouvelles thérapies, sont cruciales pour réduire l'impact de cette maladie et offrir de meilleures perspectives aux patients. Les PDX (Patient Derived Xenograft ou xénogreffes dérivées de patients) offrent des modèles proches du patient d’origine. Ces modèles sont généralement utilisés en phase préclinique avancée pour consolider la connaissance des maladies, vérifier l'efficacité des thérapies chez la souris et ainsi en augmenter la transposabilité chez l'homme. Une banque de PDX est constituée de modèles de tumeurs humaines implantées chez des animaux, ici des souris. Ces modèles sont créés en greffant des échantillons de tumeurs prélevés chez des patients sur des souris immunodéficientes permettant une tolérance à la greffe la plus optimale possible. Ces banques sont importantes dans la recherche sur le cancer pour plusieurs raisons : -Représentation fidèle des tumeurs humaines : Les PDX conservent les caractéristiques des tumeurs originales. -Validation des cibles thérapeutiques : Les PDX sont utilisés pour confirmer la pertinence et l'efficacité des nouvelles cibles thérapeutiques. -Recherche et développement de nouveaux traitements : Les banques de PDX offrent des modèles précieux et pertinents pour tester de nouveaux médicaments et thérapies. -Compréhension des mécanismes de résistance : Les PDX permettent d'étudier la résistance aux traitements en analysant les changements génétiques et biologiques. En intégrant des modèles PDX répondant aux besoins des projets dans notre infrastructure de recherche, nous pourrons renforcer nos capacités de développement de nouveaux traitements anticancéreux et améliorer les chances de succès clinique, tout en contribuant à des avancées scientifiques significatives dans le domaine de l'oncologie. Ces banques visent à répondre aux problématiques de nos projets in-vivo et in-vitro pour la recherche de candidats médicaments. Les échantillons générés pour ces banques pourront également être utilisés à des fins de développement de nouvelles méthodes pour cultiver in vitro des PDX ouvrant ainsi la possibilité de disposer de nouveaux modèles alternatifs ou préalables aux études chez l’animal.

Procédures

Chirurgie unique pour implantation d’un fragment tumoral sous la peau de la souris sous anesthésie gazeuse (durée maximale d’environ 10 minutes) Les souris reçoivent deux administrations d’anti-douleur, préalablement et consécutivement à la chirurgie (contention de 30s et administration d’environ 10s).

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress et/ou de douleur peut provenir des deux administrations de l’anti-douleur en couverture de la chirurgie. Les phases d’administration des antidouleurs peuvent générer un stress et une douleur légère de très courte durée. L’implantation sous la peau par chirurgie du fragment tumoral peut générer une douleur légère au réveil et en période post-opératoire. La croissance de la tumeur peut dans certains cas engendrer une perte de poids. Elle peut également, selon la nature du fragment tumoral créer des métastases. Les souris implantées seront conservées sur une durée maximale d’un an. Afin de favoriser la pousse des tumeurs humaines issues de patients, des souris immunodéprimées sont utilisées. Elles possèdent un système immunitaire très restreint et peu fonctionnel qui limite le rejet de la souris envers un élément considéré comme du « non-soi ». Ces souris immunodéprimées présentent un phénotype que l’on peut considérer comme dommageable, mais qui est maitrisé grâce à des conditions d’hébergement strictes qui permettent de protéger ces animaux fragiles de l’environnement extérieur.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les souris seront euthanasiées pour différentes utilisations : - Prélèvement (Tumeurs, sang…) à des fins d’analyses histologiques ou ex-vivo (pour caractériser les modèles). - Prélèvement de la tumeur pour en préparer des fragments soit pour la réimplantation (à des fins d’amplification pour le prochain passage ou d’études de pharmacologie) soit pour de la congélation (à des fins de stockage pour de futures études de pharmacologie ou analyses)

Remplacement

Les biopsies tumorales humaines collectées en très petites quantités chez le patient nécessitent une étape d’amplification in vivo, aucune méthode in vitro ne permettant de conserver les propriétés tumorales les plus natives. La croissance ainsi effectuée dans un organisme vivant complexe permet de maintenir les conditions natives les plus proches des caractéristiques de progression du cancer chez le patient et ainsi de bénéficier d’un matériel le plus pertinent possible pour les études dédiées à la recherche de candidats traitements. Cette approche in vivo utilisant des souris est également nécessaire pour la croissance de tumeurs ne pouvant être implantées directement à partir des approches classiques de lignées cellulaires cultivées in-vitro. En effet, certaines tumeurs nécessitent un fragment pour amorcer leur croissance. Dans ce cas, la tumeur doit être préalablement amplifiée et maintenue chez des animaux en réalisant des passages successifs (5 au maximum) au préalable de la préparation d’études pharmacologiques. Enfin, ce projet dédié à amplifier et constituer des banques de tissus tumoraux proches du patient vise à préparer des études pour évaluer l’activité et l’efficacité de nos composés. Malgré de nombreux modèles in vitro qui vont permettre de sélectionner en amont les candidats médicaments les plus prometteurs, ces études ne peuvent à l’heure actuelle être menées que dans un modèle intégrant toute sa complexité biologique et physiologique, afin de pouvoir mettre en évidence un effet fonctionnel et confirmer le potentiel anti-tumoral ou anti-métastatique d’un composé. Il est donc essentiel que le modèle de souris mime au mieux la pathologie cancéreuse.

Réduction

La première implantation de fragments tumoraux chez des souris immunodéficientes se fait sur 1 à 5 animaux puis une amplification est faite dans le but de congeler le plus rapidement un nombre conséquent de fragments et de tester la condition congelée permettant de lancer plusieurs études pharmacologiques et de collecter des échantillons pour des analyses ultérieures ou in vitro. À chaque passage, des caractérisations biochimiques sont réalisées pour vérifier la qualité du tissu tumoral. L’amplification est arrêtée en cas de dérive importante (génétique, morphologique, expression de certaines protéines…). La congélation des fragments tumoraux est évaluée dès les premiers passages pour permettre des arrêts dans l’amplification. Le projet prévoit de greffer 500 souris par an (soit 5 PDX), représentant 2500animaux sur 5 ans. Ces phases d’amplification permettent de définir les conditions optimales de greffe et la croissance tumorale, en vue d’études d’efficacité et de pharmacodynamie. Cela contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés en optimisant les protocoles expérimentaux. Le département biostatistique déterminera le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étude d’efficacité ou de pharmacodynamie ultérieure (demande d’autorisation de projet différente). L’opportunité de réaliser deux greffes par animal (approche bilatérale) sera évaluée lors des premières phases d’amplification, avec l’accompagnement de la SBEA et des expérimentateurs. Cette analyse visera à prendre en compte simultanément les risques potentiels pour le bien-être animal et les bénéfices attendus en termes de réduction du nombre d’animaux utilisés. Les résultats permettront de statuer de manière argumentée sur la pertinence ou non de mettre en œuvre cette approche. La souche de souris choisie sera la plus immunodéprimée possible pour maximiser la prise de greffe de cellules humaines, sans tester différentes souches de souris, ce qui réduit le nombre d’animaux par modèle tumoral. Enfin, le matériel tumoral issu de ces amplifications servira à développer des modèles in vitro (2D/3D), permettant de valider leur potentiel comme méthodes alternatives à l’expérimentation animale pour la sélection de candidats médicaments et de modèles tumoraux pertinents. À terme, cela permettra, nous l’espérons, de réduire significativement le nombre de modèles testés in vivo.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale par pied à coulisse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Elle permet une mesure rapide et régulière au cours du temps chez la souris vigile. Les tumeurs sont mesurées plusieurs fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. Pour des raisons scientifiques et de qualité du tissu qui est amplifié, la tumeur en cas de greffe unique sera récoltée à un volume maximum inférieur aux standards classiquement appliqués, soit 1200mm3 au lieu de 2000mm3 et/ou si application d’un point limite. La technique de chirurgie pour l’implantation du fragment tumoral sous la peau de la souris est choisie pour être une technique peu douloureuse et peu invasive. Elle est réalisée sous anesthésie générale avec la mise en œuvre de conditions per-opératoires (antidouleurs en particulier) qui permettent de réduire la douleur ressentie par les souris. Les souris font l’objet d’une observation clinique et de soins adaptés le cas échéant, tout au long de l’étude, particulièrement dès les 1ers signes de croissance tumorale. Des points limites sont définis et seront appliqués tout au long du projet. Afin de favoriser la pousse des tumeurs humaines issues de patients, des souris immunodéprimées (système immunitaire quasi inexistant) seront utilisées. Ces souris fragiles et sensibles sont protégées des pathogènes de l’environnement extérieur grâce à des conditions d’hébergement strictes.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : les tumeurs PDXs sont davantage déployées chez la souris que chez le rat. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines et jusqu’à l’âge de 13 mois correspondant à la durée maximale d’une étude. Il est préférable d’utiliser de jeunes souris lors de l’implantation des fragments car il a été démontré qu’elles acceptent mieux la greffe (moins de risques de rejets). De plus, cela permet d’assurer une période d’observation pour la croissance tumorale plus longue (jusqu’à 13 mois) sans atteindre un âge avancé pour la souris. Ces modèles tumoraux d’amplification de PDX permettent de déterminer des paramètres in vivo (taux de prise, effet de la tumeur sur l’état général de la souris etc…) et ainsi définir les conditions optimales de greffe.

Des cellules tumorales sont injectées dans le ventre de souris femelles pour qu'elles y produisent un liquide d'ascite, récolté sur leur cadavre et versé tel quel dans des réactifs de tests de diagnostic de la toxoplasmose et de la rubéole. 3 000 souris vont être utilisées sur deux ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur abdomen gonfle pendant les deux semaines d'incubation, et le porteur présente comme un raffinement l'absence d'injection préalable d'huile minérale. Il indique que la lignée cellulaire ne survit pas à la congélation, ce qui la maintient conservée dans le corps de souris vivantes, et que des essais de substitution sont "en cours d'étude".

Objectifs

La production de ce liquide d'ascite (produit dérivé) entre dans la formulation de tests de diagnostics de maladies infectieuses tel que la recherche de Toxoplasmose et de Rubéole. Il est utilisé dans son entièreté sans purification préalable et amène une stabilité aux tests.

Bénéfices attendus

Cette ascite issue de la multiplication de la cellule TG 180 est utilisée directement dans nos diluants, sans étape de purification préalable et a un rôle de stabilisant et de ballast. Cela améliore ainsi la spécificité et la stabilité des tests de diagnostics de maladies infectieuses.

Procédures

Selon le protocole chaque souris recevra 1 seule injection de cellules sans injection préalable d'un activateur du système immunitaire. Cette injection dure quelques secondes. L'incubation dure 2 semaines maximum. Durant cette phase de developpement de la cellule, un suivi quotidien est réalisé (à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur afin de d'avoir une objectivité sur l'apparition d'éventuels points limite). La récolte de l'ascite est réalisée stérilement sur les animaux préalablement euthanasiés.

Impact sur les animaux

La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d'ascite. Cela engendre un gonflement de l'abdomen de l'animal. Ce gonflement de l'abdomen fait l'objet d'une surveillance quotidienne. Cependant pour ce protocole, il n'y a pas de phase d'amorce intra péritonéale (pas d'injection d'adjuvant de type huile minérale). Cette absence de phase réduit considérablement la sévérité du protocole.

Devenir

Les animaux dédiés ne sont utilisés que pour ce protocole. A la fin de celui-ci, le liquide d'ascite est récolté post mortem.

Remplacement

La cellule permettant la production de cette ascite est à ce jour conservée in vivo uniquement et il n'y a pas à ce jour d'alternative fiable utilisable en routine pour remplacer cette cellule en l'état, car une perte de viabilité de la cellule très importante est constatée lors des cycles congélation/décongélation. Cela empêche donc la conservation de la cellule en in vitro. Cependant des essais de faisabilité du retrait ou de la substitution de cette ascite sont en cours d’étude.

Réduction

La quantité d'animaux nécessaire est déterminée sur la base de prévisions de fabrication des tests utilisant l'ascite. Afin de réduire l'utilisation de cette ascite, la totalité des cas d'emplois à été répertorié. Chaque cas d'emploi a été analysé afin d'identifier la possibilité d'un retrait ou de substitution de l'utilisation de cette ascite. La réduction de certains cas d'emploi est déjà acquise (arrêt produits et arrêt d'un cas d'emploi). Pour les autres références la faisabilité est en cours d'analyse en travaillant prioritairement sur les plus gros consommateurs de liquide d'ascite. Le développement des nouvelles références se fait systématiquement sans usage de liquide ascite. Développement en cours d'un lignée cellulaire stabilisée congelée afin d'essayer de substituer le mode de conservation in vivo actuel.

Raffinement

Le raffinement sera obtenu par l'application de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, cependant, le protocole ne nécessite pas d'amorce intrapéritonéale (pas d'injection de pristane) et cela fait diminuer considérablement la sévérité du protocole. De plus, les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. La mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet au technicien d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer. Les animaux sont en hébergés en cages équipées d'enrichissement de type "maison".

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé du fait de l'origine des cellules à multiplier Pour ce protocole, nous utilisons des animaux adultes âgées à minima de 8 semaines. Il est possible également d'utiliser des femelles dites réformées sans impact sur la production de cette ascite. Le choix d’utilisé des femelles âgé de 8 semaines ou plus est selon la disponibilité d’animaux chez le fournisseur. A ce stade, les animaux sont assez matures et robustes pour supporter l'unique injection de cellules sans mortalité en cours d'expérimentation.

Des souriceaux de un à cinq jours reçoivent deux injections quotidiennes d'un produit inflammatoire dans l'abdomen, sans anesthésie ni sédatif, puis une électrode leur est implantée dans la nuque et ils sont séparés de leur mère une heure et demie. 308 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur signale que ces injections peuvent provoquer une hémorragie abdominale interne ou la mort dans 5 à 10 % des cas, tout en les décrivant comme un acte peu douloureux ne nécessitant pas d'anesthésie. Tous les souriceaux sont tués à cinq ou huit jours de vie pour des analyses moléculaires, après une heure d'enregistrement pendant laquelle ils respirent de l'air enrichi en gaz carbonique puis appauvri en oxygène.

Objectifs

La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. On sait aujourd'hui qu'une infection maternelle peut déclencher un accouchement prématuré. L'inflammation du cerveau chez le bébé prématuré est appelée encéphalopathie du prématuré. Ceci est lié à un risque élevé de troubles du développement comme les troubles du spectre autistique. Nous avons identifié chez le souriceau une altération des voies moléculaires régissant le rythme circadien (cycle jour/nuit). Des études récentes suggèrent que lorsque ce rythme est perturbé, le cerveau devient plus vulnérable aux effets de l'inflammation. Le sommeil et le rythme circadien pourraient ainsi jouer un rôle dans l'apparition des troubles. Nous testerons l’hypothèse selon laquelle l’architecture du sommeil et/ou le rythme circadien sont perturbés dans un modèle murin de lésion cérébrale du prématuré. Nous essayerons de confirmer les modifications moléculaires, d’étudier les corrélations avec le rythme circadien, de caractériser le sommeil des animaux et d’évaluer l’impact sur le contrôle ventilatoire, une fonction qui suit un rythme circadien.

Bénéfices attendus

L’apparition du trouble du sommeil et du rythme circadien durant la maturation cérébrale peut avoir des répercussions sur la santé physique et mentale des enfants. Le sommeil peut être un marqueur pertinent du risque d’évolution vers un trouble psychiatrique. Cette dimension est particulièrement notable dans les troubles du neurodéveloppement, où les altérations du sommeil sont fréquentes. De plus, la perturbation du rythme circadien peut augmenter la susceptibilité aux réponses inflammatoires dans le cerveau. Cette étude permet d’appuyer l’importance du sommeil et du cycle circadien dans la prise en charge notamment des enfants prématurés. Chaque année, environ 13 millions de naissances prématurées sont recensées dans le monde. Environ 40 % des naissances prématurées se produisent dans un contexte inflammatoire (infection maternelle, septicémie néonatale) d’où la nécessité d’identifier les mécanismes communs pour développer des stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Il n'y a pas de prélèvements sur animaux vivants sans anesthésie ni sédatif (vigiles). Pour induire l'inflammation, on applique un protocole validé : Injections bi-quotidienne de P1( un jour de vie) à P4 et injection unique à P5 de produit induisant l'inflammation pour le groupe traité et injection du solvant pour le groupe contrôle. L'injection dure moins de 30 secondes par animal. Insertion sous anesthésie (moins de 10 min) d'électrodes pour l'enregistrement de l'activité du muscle de la nuque à P5 ou à P8. Séparation maternelle d'1h 30 à P5 ou à P8 pour l'enregistrement des paramètres évaluant l'architecture du sommeil et la ventilation. L’enregistrement dure une heure au cours duquel es animaux respirent de l'air pendant 30 min + de l'air enrichi en gaz carbonique CO2 (hypercapnie) pendant 5 min + retour en air (normoxie) pendant 15 min + de l'air appauvri en oxygène (hypoxie) pendant 3 min et un retour en air pendant 7 min (total 1h).

Impact sur les animaux

Les injections réalisées sur les souriceaux durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation avec leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Les injections de produit induisant l'inflammation peuvent causer une déshydratation, les souriceaux peuvent montrer un retard de croissance par rapport aux souris contrôles. Les injections en général peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie abdominale interne chez les souriceaux, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre P1 et P5. L’implantation d’électrodes pour l’enregistrement de l’activité du muscle de la nuque génère également un stress et une douleur à l’installation (moins de 10 minutes). Implantation une seule fois par animal à P5 ou à P8 pour la procédure 1.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés (Jour 5 ou 8/9) pour les analyses moléculaires, pour fin des procédures ou en cas de points limites terminaux.

Remplacement

L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral requiert l’utilisation d’un organisme vivant. Il est important de maintenir l’activité de l’organisme dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude à plusieurs stades de développement. Ainsi, nous pourrions comprendre les dysfonctionnements dans un contexte anormal ou morbide suite à une perturbation, comme l'inflammation par exemple. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence biologique statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Procédure 1 : Pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle des mesures des paramètres ventilatoires, nous avons déterminé un lot expérimental de 20-30 animaux soit 4 portées par groupe d'injection. Nos études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 20-30 animaux pour obtenir une puissance statistique satisfaisante. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires un effectif plus faible permet de tester les hypothèses. Pour la procédure 2 : enregistrement vidéo par une caméra infrarouge de l’activité de la mère et de sa portée pendant 24h à P5 à la fin de la dernière injection puis à P8. Réutilisation des mêmes animaux sur les deux âges.

Raffinement

On optimisera l’acceptation des souriceaux par la mère en enrichissant l’hébergement avec du papier doux absorbant pour le nid. L’injection pour l’induction de l’inflammation est effectuée dans l'abdomen sur animal vigile (sans sédatif ni anesthésie), c’est un acte peu douloureux ne nécessitant pas d’anesthésie. Des points limites suffisamment prédictifs sont proposés. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera l’apparence de la peau/du corps, la recoloration des extrémités après injection, et le tonus ; à distance de l'inflammation on réalisera une surveillance régulière de la prise de poids, de l'absence de troubles du comportement (isolement). Procédure 1 : Pour l’enregistrement de l’activité nucale, les souriceaux sont anesthésiés puis l’électrode est insérée au niveau de la nuque sécurisée grâce à un matériau d’empreinte. L’induction est rapide et la récupération est d’environ 10min. Après la récupération à l'anesthésie (10 min), les paramètres ventilatoires, l’activité musculaire de la nuque et l’activité motrice sont mesurés pendant une heure à la température ambiante de 32-34°C. Pour la procédure 2 : enregistrement vidéo par une caméra infrarouge de l’activité de la mère et de sa portée pendant 24h à P5 à la fin de la dernière injection puis à P8.

Choix des espèces

Ce modèle a été choisi car il présente les lésions du cerveau et des troubles du comportement similaires à ceux observés chez les enfants prématurés atteints de troubles du développement cérébral. Il a l'intérêt de modéliser le cerveau en développement d'un prématuré de moins de 28 semaines, car un souriceau à 1 jour de vie correspond à un prématuré de 28 jours, par ailleurs, cette correspondance a l'avantage de ne pas impliquer d'intervention in utero. Induction pour le modèle d'inflammation : P1 à P5 (période équivalent au 3ème trimestre de grossesse d'un point de vue neurodevelopmental chez l'humain) Mesure de la ventilation, de l'activité nucale et de l'activité circadienne des souriceaux à P5 et à P8. P5 pour la période aigüe de l'inflammation P8 : début de résolution progressive de l'inflammation Ces âges permettent d'étudier l'architecture du sommeil dans un contexte inflammatoire et à la résolution progressive de celle-ci.

Tuées pour que leurs yeux soient prélevés et l'innervation de leur cornée examinée, 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral leur est injecté dans la glande lacrymale et dans la cornée, avec des sutures posées dans la joue, puis un mois plus tard la surface de leur œil est abrasée ou le nerf cornéen sectionné pour mimer une blessure. Le porteur indique que les souris se frottent et peuvent perdre deux ou trois points de suture par joue, ce qui augmente le risque d'infection, et compare la douleur des 72 heures suivant l'abrasion à celle d'un grain de sable dans l'œil. Il conclut que la souris est "le seul modèle" permettant d'explorer cette maladie rare dans son ensemble.

Objectifs

L'œil est protégé par une surface transparente : la cornée. Il s’agit du tissu contenant le plus de nerfs du corps humain. L’extrémité des nerfs se trouve à la surface de la cornée afin de capter les stimulations et agressions extérieures. Ces nerfs confèrent une grande sensibilité à la cornée qui est elle-même protégée par les larmes (rendant la surface de l'œil en permanence humide). Tous ces éléments fonctionnent ensemble formant un équilibre fragile. La moindre atteinte de cet équilibre peut entraîner des défauts de la cornée pouvant eux-mêmes rendre aveugle le patient. Cette situation se déroule typiquement dans la maladie que l’on appelle la kératite neurotrophique, une maladie neurodégénérative rare touchant 5 personnes sur 10 000 en Europe. Elle entraîne la mort des nerfs et donc à terme une perte de sensibilité et de vision. A l’heure actuelle, les traitements disponibles sont limités (gouttes) et les formes sévères de la maladie nécessitent une greffe de cornée. Or, la greffe reste une intervention lourde avec un taux de rejet élevé en plus d’une efficacité souvent temporaire. On se trouve en impasse thérapeutique où le manque de thérapies innovantes constitue un frein majeur à l’avancée scientifique. L’objectif du projet serait donc d’aider à la croissance de ces nerfs contenus dans la cornée qui auront été altérés par la maladie. Or, la repousse des nerfs une fois altérés est un processus long (plusieurs semaines). Le but ici est d’accélérer ce processus en se focalisant sur le facteur responsable de la repousse des nerfs. L’hypothèse de l’équipe repose sur la stimulation de la production d’un facteur particulier déjà contenu dans les larmes mais en quantité limitée. Pour atteindre une production satisfaisante et un effet bénéfique sur les nerfs de la cornée, la technique utilisée est l’injection du facteur en question dans la glande lacrymale (responsable de la production des larmes) ainsi que l’injection de son récepteur dans la cornée. Ainsi, en produisant les larmes, la glande lacrymale produira une grande quantité du facteur d’intérêt qui sera contenu dans les larmes. Ces dernières, une fois à la surface de l'œil, permettront au facteur de se lier directement à son récepteur qui aura été injecté au préalable dans la cornée. On parle donc de double injection (ou de double thérapie génique).

Bénéfices attendus

Dans ce contexte, notre approche innovante de thérapie génique ciblant à la fois la glande lacrymale et l’innervation de la cornée vise à induire la repousse des nerfs de la cornée. Ce travail pourrait ainsi ouvrir la voie à une stratégie thérapeutique curative pour la kératite neurotrophique (KN), en s’attaquant directement au manque d’innervation à l’origine de la maladie rare. Enfin, ce travail devrait aboutir à des publications scientifiques dans des revues à comité de lecture, et potentiellement à un ou plusieurs dépôts de brevet, assurant ainsi une valorisation scientifique et technologique du projet.

Procédures

Un vecteur viral est comme une petite « enveloppe » qu’on utilise pour transporter un message (le gène qu’on veut introduire) vers une cellule afin de soigner une maladie. Celui-ci va être injecté dans un organe cible, c’est ce qu’on appelle la thérapie génique. Dans notre cas, on réalise une injection dans la glande lacrymale, qui sécrète les larmes, couplée à une injection dans la cornée, communément réalisée chez l’Homme avec des antibiotiques. Pour cela, les animaux seront anesthésiés puis recevront une dose d’antidouleur. Les injections se réalisent en une fois pour une durée totale de 7 minutes environ. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil. Un mois après l’injection, on vient réaliser une blessure sur l’œil afin de mimer une maladie ou un accident : l’abrasion ou l’axotomie. Ces deux techniques (5min environ) ne traversent par la barrière protectrice de l'œil, elles restent donc des méthodes n’impliquant pas de défauts profonds à l'œil. Celles-ci sont réalisées en une seule fois sur animaux également endormis ayant à leur tour reçu une dose d’antidouleur. Les souris sont suivies de façon journalière après les procédures afin de prévenir les risques. Les prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne sont effectués en amont et en aval des chirurgies. Le test de sensibilité est réalisé 3 jours consécutifs afin d’avoir une moyenne la plus juste. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention.

Impact sur les animaux

Des résultats antécédents au projet ont montré que l’injection dans la cornée n'entraîne pas de traumatisme au niveau de la cornée. Toutefois, la qualité des injections peut varier en fonction de l’expérimentateur ; les souris seront donc scrupuleusement surveillées dans les jours suivant la chirurgie. En revanche, les sutures effectuées au niveau de la joue de la souris peuvent entraîner des sensations de tiraillement, malgré la réalisation minutieuse des points. Il arrive que les souris se frottent, ce qui peut provoquer la perte de deux ou trois points par joue, augmentant ainsi le risque d’infection de la plaie. C’est précisément pour cela que les animaux sont sous surveillance pendant les jours qui suivent l’opération. La modélisation d’une blessure de la cornée chez la souris pourra impliquer une douleur passagère dans les 72h suivant la manipulation, douleur comparable à une sensation d’irritation causée par la présence d’un grain de sable dans l'œil. Aussi, le stress d’être manipulé peut être retenu. L’axotomie quant à elle ne détruit pas la surface de la cornée, la dégénérescence des fibres au centre de la cornée n’induit pas de douleur mais au contraire une perte de sensibilité. Pour le test de sensibilité cornéenne, les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 min, une fois par jour, pendant 3 jours consécutifs sur plusieurs semaines afin d’évaluer la régénération de l’innervation (4 +/- 1 semaines).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet des procédures sur l’innervation de la cornée.

Remplacement

La souris comme modèle de pathologie humaine, telle que la kératite neurotrophique, est un excellent système intégrant la complexité des interactions entre les différents éléments de la cornée (nerfs, cellules de surface et larmes). Ces intéractions, à l’origine de l’équilibre naturel de l’œil, se mettent en place durant des mois, et impliquent de nombreux types de cellules, elles ne peuvent donc pas être mimées in vitro (hors organismes vivants, c'est-à-dire dans des boîtes de pétri). Seuls les mammifères présentent la diversité des échanges cellulaires et moléculaires entre les structures de l'œil. Le modèle souris présentant une atteinte des nerfs de la cornée est donc le seul modèle qui permet d’explorer la maladie de la KN dans son ensemble (morphologie, aspect, chimie…). Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour étudier la complexité du projet et la pathologie. Le modèle murin présente l’avantage d’être peu coûteux et de se développer rapidement. Les souris que nous utiliserons présentent une forte variabilité génétique, reflétant celle observée chez les patients humains.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux et de respecter la règle des 3R, un calcul est réalisé à l’aide d’un logiciel. Cette analyse nous permet d’optimiser la quantité d’animaux (ici 189 souris) tout en garantissant un nombre suffisant de souris par condition pour effectuer par la suite les tests statistiques nécessaires. Cette estimation rigoureuse vise à assurer la robustesse des résultats tout en évitant la reproduction inutile des expériences.

Raffinement

Pendant la période d’acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiens par les soigneurs, hébergement en groupe d’au moins deux individus, et mise en place d’un environnement adapté et enrichi. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie répétée. Puisque les animaux seront soumis à des manipulations et contentions journalières rapides (≤2min) nécessaires aux expérimentations, nous mettrons en place une période d’habituation afin de limiter l'angoisse et familiariser les animaux aux expérimentateurs. L’état général, le poids, et le comportement des animaux seront suivis régulièrement pour détecter toute altération. Si nécessaire, un animal présentant des signes de souffrance sera retiré de l’expérimentation et pris en charge conformément aux recommandations vétérinaires. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée des injections, de l’abrasion cornéenne, et de l’axotomie avec l’administration de médicaments anti-douleur et anesthésiques appropriés. Un suivi quotidien avec la grille de scoring permettra qu’en cas de douleur l’animal soit immédiatement pris en charge. L'œil est formé de telle manière qu’une abrasion superficielle comme celle-ci n’impactera en rien l’intégrité de l'œil, mais simplement la couche la plus superficielle de la cornée. Nos précédentes expériences ont montré qu’une marge supplémentaire de 5 % est nécessaire afin de pallier les pertes potentielles liées à l’anesthésie, ainsi qu’aux complications post-opératoires telles que le développement d’ulcères cornéens. Les animaux développant de telles complications sont retirés de l’étude, les points limites sont décrits dans la procédure. Les animaux en sus seront intégrés aux expérimentations en cours, permettant ainsi d’augmenter la puissance statistique des analyses.

Choix des espèces

La lignée de souris utilisée présente une grande variabilité génétique en raison de l’absence de consanguinité, ce qui en fait un modèle proche des humains. Nous étudions des souris âgées de 12 semaines car c’est à cet âge que la cornée est mature et que l’animal a dépassé la puberté.

376 souris génétiquement modifiées pour développer un glaucome vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque jour pendant 28 jours, elles reçoivent un collyre conservateur dans les yeux, avec des prélèvements de larmes et des mesures de sensibilité cornéenne répétées trois jours de suite sur animaux vigiles, puis elles sont tuées pour que leurs yeux soient analysés. Leurs yeux peuvent grossir jusqu'à empêcher la fermeture des paupières, et l'animal est alors tué immédiatement. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne suffisent pas et que l'action du conservateur doit être observée sur un œil complet et fonctionnel, ce qui rend selon lui ces expériences "indispensables".

Objectifs

Les collyres, ou gouttes pour les yeux, sont très utilisés pour traiter certaines maladies comme le glaucome. On y ajoute souvent des conservateurs pour que le produit reste efficace et sans danger plus longtemps. Le glaucome est une maladie fréquente après 40 ans, qui touche jusqu’à 10 % des personnes après 70 ans. Elle abîme lentement le nerf optique, ce qui réduit le champ de vision, jusqu’à la cécité si elle n’est pas traitée à temps. Le traitement repose sur l’usage quotidien de collyres dont beaucoup contiennent des conservateurs. Mais au bout de quelques mois, beaucoup de patients ressentent une gêne : la surface de l’œil devient moins sensible, et les opérations deviennent plus difficiles à cause d’une inflammation. Nos recherches ont montré que les conservateurs peuvent abîmer les nerfs de la cornée, la surface transparente de l'œil, ralentissant la régénération naturelle de cette zone fragile. Cela rend l’œil plus vulnérable, et peut aller jusqu’à former des plaies (ulcères), nécessitant parfois une greffe de cornée : une opération lourde, avec des résultats souvent temporaires. Notre objectif est de mieux comprendre les effets de ce conservateur sur la cornée dans un contexte de glaucome. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris qui développe la maladie de façon naturelle et progressive, comme chez l’humain. Nous mesurerons différents indicateurs, comme la sensibilité de la cornée, la pression dans l’œil, ou encore la qualité des larmes. D’autres examens, comme des photos du fond de l’œil ou des tests de réponse à la lumière, permettront de suivre l’évolution de la maladie. Grâce à cette étude, nous espérons mieux évaluer les effets secondaires des collyres avec conservateurs et, à terme, améliorer les traitements pour les patients atteints de glaucome.

Bénéfices attendus

Dans le glaucome, surtout lorsque les patients sont traités avec des collyres contenant des conservateurs, la perte de vision peut évoluer lentement. Cela donne un certain délai pour agir, mais une fois les lésions installées, elles sont irréversibles. Aujourd’hui, les options de traitement restent limitées : certains collyres permettent de contrôler la pression dans l’œil au début de la maladie, mais quand celle-ci progresse, la vision peut être fortement altérée. Dans certains cas, les collyres irritants abîment aussi la surface de l’œil, ce qui complique les soins. Cela peut mener à des atteintes de la cornée graves, parfois nécessitant une greffe. Mais cette solution reste lourde, avec un risque de rejet et un bénéfice souvent temporaire. Notre projet vise à mieux comprendre les effets des conservateurs présents dans les gouttes et du glaucome sur la cornée. En identifiant les changements précoces au niveau cellulaire, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements plus ciblés et mieux tolérés. Ces recherches pourraient donner lieu à des publications scientifiques et peut-être à des dépôts de brevets, valorisant les résultats du projet à l’échelle médicale et technologique.

Procédures

Les souris génétiquement modifiées sont génotypées à l'aide d'un morceau de queue de moins de 2mm prélevé avant l’âge de 10 jours, le prélèvement dure environ 1min. Le projet implique ensuite l’administration quotidienne de gouttes (pendant 28 jours), ainsi que la réalisation de prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne avant et après traitement, sur des animaux vigiles. La mesure de la sensibilité se fait sur 3 jours afin de faire une moyenne des résultats. Ainsi, ces procédures sont de courte durée. Les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 minutes maximum par animal, mais leur caractère répété nécessite une attention particulière. Afin de limiter le stress induit par la contention, les souris seront habituées progressivement à la manipulation dès le sevrage. Cette habituation permet de réduire considérablement les réactions de défense, en favorisant une meilleure tolérance aux gestes techniques. Les traitements oculaires sont appliqués de manière non-douloureuse, avec une goutte de collyre déposée délicatement sur chaque œil pendant 30 secondes. Les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté, afin d’assurer une gestuelle rapide et précise, minimisant l’impact sur les animaux. Les animaux seront mis à mort pour prélever les yeux qui seront ensuite analysés. Aucun prélèvement invasif ne sera effectué sur animaux vivants.

Impact sur les animaux

Le glaucome est une maladie chronique de l’œil qui évolue lentement et peut entraîner une perte totale de la vue s’il n’est pas traité. Dans le cadre de ce projet, nous étudierons un modèle de souris génétiquement modifié qui présente une mutation sur le gène jouant un rôle essentiel dans le développement de l’œil. Ce modèle est bien connu grâce à des recherches précédentes. Les souris glaucomateuses présentent une perte progressive de la vue, mais cela n’affecte ni leur santé générale ni leur espérance de vie. Chez la souris, la vue n’est pas le sens principal, et cette baisse de vision n’a pas de conséquences visibles sur leur comportement : elles continuent à manger, interagir normalement et prendre soin de leurs petits. Les souris peuvent développer une augmentation anormale de la taille des yeux, comme cela peut arriver chez les personnes atteintes de glaucome. Si les yeux deviennent tellement gros que l’animal ne peut plus fermer les paupières, il ne poursuivra pas l'expérimentation et sera euthanasié immédiatement pour éviter toute souffrance. Les traitements utilisés lors de cette étude sont couramment utilisés chez l’humain, agissant uniquement sur l’œil et n’étant pas douloureux. Toutes les expériences seront menées sur des animaux jeunes (moins de 5 mois), avant que la perte de vision ne devienne importante. Les souris recevront quotidiennement des collyres et seront manipulées brièvement pour ces soins. Ces gestes peuvent générer un peu d’angoisse, mais un programme d’habituation est prévu pour qu’elles s’y adaptent en douceur. Les manipulations seront aussi espacées et limitées dans le temps, afin d’éviter un stress inutile ou des anesthésies répétées, en accord avec les bonnes pratiques en matière de bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet du conservateur sur les différentes structures du segment antérieur (cornée, iris, cristallin).

Remplacement

Il est encore très difficile de reproduire toute la complexité d’un organe comme l’œil en laboratoire, notamment ses différentes structures et leur fonctionnement coordonné. C’est pourquoi les tests uniquement réalisés « in vitro » (c’est-à-dire sur des cellules en culture) ne suffisent pas pour étudier certaines maladies oculaires. Dans notre projet, nous utilisons un modèle animal qui développe le glaucome. Ce modèle est essentiel car il permet de mieux comprendre comment la maladie évolue dans un organisme vivant. De plus, les conservateurs présents dans les collyres peuvent avoir des effets secondaires sur l’œil. Pour les étudier de manière fiable, il est nécessaire d’observer leur action dans un contexte réel, c’est-à-dire sur un œil complet et fonctionnel, avec tous ses mécanismes de défense, d’irrigation et de régulation. C’est pour cela que les expérimentations doivent se faire sur un organisme vivant : elles sont indispensables pour comprendre précisément l’impact de ces substances dans un cadre pathologique comme celui du glaucome.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour ce projet a été soigneusement réfléchi. Il a été calculé à l’avance afin d’avoir assez d’animaux pour obtenir des résultats fiables sur le plan scientifique, tout en évitant de multiplier inutilement les tests. Cela permet de limiter le nombre d’animaux tout en garantissant que les expériences n’auront pas besoin d’être répétées. Les analyses prévues permettront de comparer les différents groupes traités de manière rigoureuse, en utilisant des méthodes statistiques adaptées. Au total, sur toute la durée du projet (42 mois), un maximum de 376 souris sera utilisé, avec une petite marge de sécurité de 16 animaux supplémentaires, pour pallier d’éventuelles pertes imprévues. Par ailleurs, des souris mâles et femelles seront incluses afin d’assurer une bonne représentativité dans les résultats.

Raffinement

Pendant la période d’adaptation, les souris seront suivies chaque jour par les soigneurs, logées par petits groupes (au moins deux par cage) et bénéficieront d’un environnement confortable et stimulant. La mise en place de points limite permet de retirer les animaux de l'expérimentation afin d'éviter toute forme de souffrance (physique et psychique). Pour les examens comme le fond d’œil, la mesure de la pression oculaire, les animaux seront endormis grâce à une anesthésie générale. Ils ne ressentiront donc ni douleur ni gêne pendant les procédures. De plus, les souris ne seront pas gardées au-delà de 16 semaines, ce qui permet d’éviter les effets tardifs du glaucome, notamment la perte de vision qui apparaît habituellement vers 8 mois.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car c’est un modèle bien connu, couramment utilisé en recherche médicale, notamment pour les maladies de l’œil. Sa petite taille, sa reproduction rapide et le fait qu’elle partage de nombreuses similarités génétiques avec l’être humain en font un outil précieux pour mieux comprendre certaines pathologies. Dans notre étude, nous utilisons des souris transgéniques porteuses d’une mutation connue pour provoquer un glaucome, une maladie oculaire fréquente chez l’humain. Ce modèle a déjà été bien étudié et permet de reproduire les signes du glaucome de manière fiable. Les expériences seront réalisées sur des souris jeunes, âgées de moins de 16 semaines. À cet âge, les animaux sont en bonne santé, ne présentent pas encore de perte de vision liée à la maladie, et les examens seront effectués sans douleur, sous anesthésie. Ce choix permet également de limiter le stress et d’éviter toute souffrance liée à l’évolution de la maladie. Ainsi, ce modèle permet d’étudier de manière précise l’impact de certains traitements sur l’œil, dans un cadre contrôlé, tout en garantissant des conditions éthiques et respectueuses du bien-être animal.

Mesurer si l'exposition des parents à une eau chaude se répercute sur leur descendance conduit ici à chauffer l'eau de 26 à 33 °C, par paliers d'un degré toutes les deux heures. 96 poissons medaka, 56 femelles et 40 mâles, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leurs ovaires et leurs testicules. Le porteur attend un stress thermique léger, avec réduction de l'exploration, repli dans les coins et nage désorganisée, tout en indiquant que les études antérieures du centre n'ont jamais rapporté de tels changements. Il qualifie de "non invasive" la collecte de sperme obtenue en pressant l'abdomen des mâles anesthésiés, geste répété au début puis à la fin du projet.

Objectifs

Au cours des dernières décennies, le changement climatique et le réchauffement global ont eu des impacts profonds et étendus sur les écosystèmes aquatiques, affectant particulièrement la physiologie et la biologie moléculaire des poissons. De nombreuses études ont démontré que l'augmentation de la température de l'eau peut compromettre le succès reproductif des poissons en perturbant l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et en modifiant la signalisation hormonale. Cependant, des hypothèses émergentes suggèrent que l'exposition parentale au stress avant la fertilisation pourrait influencer la descendance par des mécanismes d'héritage non génétique. Ces mécanismes, qui n'impliquent pas de modifications de la séquence ADN ni de transmission d'allèles génétiques, pourraient jouer un rôle significatif dans la transmission de traits à la fois avantageux et délétères à la génération suivante. Les recherches chez les mammifères, notamment les rongeurs, ont fortement appuyé ce concept en démontrant que le stress paternel peut engendrer des effets durables sur le comportement et la physiologie de la descendance via un héritage non génétique.

Bénéfices attendus

Ce projet explorera comment l’exposition des poissons parents à des températures élevées durant le développement des gamètes affecte le succès reproductif. Nous étudierons ces effets à la fois aux niveaux phénotypique et moléculaire, en mettant l’accent sur l’héritage non génétique — notamment les modifications de la composition et de l’expression des petits ARN dans les œufs, qui agissent comme des médiateurs clés des signaux environnementaux à travers les générations chez les vertébrés aquatiques. Les objectifs principaux du projet sont : 1. Évaluer la capacité du poisson medaka à s’adapter de manière transgénérationnelle aux températures élevées et identifier les vulnérabilités possibles dans la reproduction ; 2. Identifier les signaux moléculaires sensibles à la chaleur et les facteurs régulateurs chez les parents qui sont transmis via les gamètes à la génération suivante ; 3. Fournir des preuves mécanistiques démontrant comment les petits ARN contribuent à la transmission des effets environnementaux à la génération suivante ; 4. Identifier les voies moléculaires et épigénétiques induites par la température qui impactent la reproduction. Les résultats amélioreront notre compréhension de l’impact du réchauffement climatique sur l’écologie reproductive et la dynamique des populations aquatiques, tout en proposant des stratégies pratiques de gestion thermique en aquaculture. En définitive, en explorant la transmission épigénétique de l’information environnementale, notamment via les miARN, ce projet vise à améliorer les prévisions du potentiel d’adaptation chez les espèces aquatiques et à soutenir le développement de pratiques d’élevage plus résilientes face au réchauffement global.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : augmentation progressive de la température de l’eau pour les animaux des lots exposés: la température de l’eau passera progressivement de 26–27 °C à 32–33 °C, avec une augmentation d’environ 1 °C toutes les deux heures. Transfert des poissons entre les réservoirs : Le transfert des poissons du réservoir principal vers d’autres réservoirs d'une durée inférieure à 2 secondes. Collecte de sperme (1 fois au début du projet et une fois en fin de projet): pour l’échantillonnage du sperme, les mâles reproducteurs seront d’abord anesthésiés. Ensuite, en appliquant une pression douce sur la région abdominale, un petit volume de sperme (environ 1 à 2 microlitres) sera prélevé. Cette procédure est très brève (moins d’une minute) et non invasive. Prélèvement des gonades (testicules et ovaires): À la fin de l’expérience, tous les poissons de chaque groupe de température seront d’abord anesthésiés puis euthanasiés. Leurs testicules et ovaires seront soigneusement prélevés et conservés pour des analyses histologiques et moléculaires.

Impact sur les animaux

Le stress, de manière générale, peut entraîner des modifications du comportement chez les poissons. Dans ce projet, les poissons exposés à une température de l’eau de 32 à 33 °C peuvent présenter un stress thermique léger par rapport à ceux maintenus à la température témoin de 26 à 27 °C. Ce stress thermique peut influencer le métabolisme énergétique, la prise alimentaire, ou une modification du niveau de curiosité et d’activité. Par « modification de la curiosité et de l’activité », on entend l’apparition de comportements tels qu’une réduction de l’exploration de l’environnement, un repli dans les coins, ou une nage désorganisée, qui peuvent être interprétés comme des indicateurs d’un niveau accru de stress thermique ou d’anxiété comportementale. Ces comportements seront suivis systématiquement tout au long de l’étude, à titre d’indicateurs observables de stress thermique. Ces mesures ont un caractère préventif, car les études précédemment menées sur le medaka dans ce centre, en réponse à une augmentation progressive de la température, n’ont jamais rapporté de modifications comportementales associées à un stress thermique.

Devenir

la réalisation d’analyses moléculaires et histologiques, des échantillons d’ovaires et de testicules sont nécessaires. Par conséquent, après l’évaluation du phénotype reproducteur, tous les poissons seront euthanasiés afin de prélever leurs ovaires et testicules.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets non génétiques de l’augmentation de la température de l’eau sur les réponses transgénérationnelles. Il est donc essentiel d’utiliser un modèle animal capable de répondre directement aux variations de température. Les poissons, en tant qu’organismes poïkilothermes (c’est-à-dire dont la température corporelle varie en fonction de l’environnement et qui ne peuvent pas réguler leur température interne), présentent des fonctions physiologiques et comportementales très sensibles aux changements de température environnementale. Cette caractéristique rend les poissons plus pertinents que les mammifères homéothermes (animaux à sang chaud capables de maintenir une température corporelle relativement constante, tels que les souris ou les lapins) pour l’étude des effets des variations de température. De plus, l’étude des effets transgénérationnels nécessite des espèces avec un cycle reproductif court, permettant l’observation de plusieurs générations dans un délai raisonnable. Les espèces poissons comme le medaka sont adaptées en raison de leur maturation rapide. À ce jour, aucune alternative adéquate, tels que les modèles in vitro, ne peut pleinement aborder l’impact de la température élevée sur les phénotypes au niveau de l’organisme, tels que le succès reproductif, ainsi que les aspects transgénérationnels de cette étude avec une pertinence et une exhaustivité comparables.

Réduction

Un total de 96 poissons (56 femelles et 40 mâles) sera utilisé pour évaluer les phénotypes reproducteurs sous deux conditions de température. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche, le sperme et les oeufs seront d’abord prélevés chez les poissons reproducteurs mâles et femelles afin d’évaluer leur phénotype reproducteur. Après cette étape, les mêmes poissons reproducteurs seront utilisés pour le prélèvement des ovaires et des testicules Le nombre d’animaux a été déterminé afin de garantir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives entre les groupes, en utilisant des tests appropriés tels que le test t.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions optimales spécifiques à l’espèce, incluant une photopériode appropriée, une qualité de l’eau adaptée, une densité contrôlée et une gestion sanitaire rigoureuse. La seule exception concernera le groupe exposé à 32–33 °C, température qui, selon la littérature, n’induit pas de mortalité chez le medaka. Afin d’améliorer le bien-être animal, les aquariums seront enrichis avec des plantes artificielles. Les poissons seront maintenus dans des aquariums de 10 litres avec une densité maximale de 24 poissons par bac. Toutes les manipulations animales — y compris l’induction de la ponte, la collecte des œufs et du sperme — seront réalisées par du personnel compétent avec soin et rapidité afin de minimiser le stress. Le personnel portera des gants en nitrile et les poissons seront transférés à l’aide d’épuisettes de petite taille, en limitant au maximum le temps de manipulation. La collecte des œufs sera effectuée de manière douce, rapide et non invasive. La collecte du sperme et des gonades (ovaires et testicules, prélevés en fin d’expérience), qui nécessite une manipulation précise, sera réalisée sous anesthésie afin de limiter l’inconfort. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel formé de l’animalerie pour surveiller leur état de santé et leur comportement. Tout poisson présentant des signes d’infection ou des troubles de santé sera examiné par la personne responsable désignée du laboratoire, qui déterminera les soins appropriés, incluant l’euthanasie si nécessaire. Par ailleurs, l’unité est dotée d’une structure Bien-Être Animal de l’établissement, et qui est consultée pour chaque demande d’autorisation de projet garantissant l’application continue des techniques de raffinement les plus récentes. Celles-ci comprennent notamment l’enrichissement de l’environnement, comme l’ajout de plantes artificielles, afin d’optimiser les conditions d’élevage. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel qualifié, formé spécifiquement pour l’espèce et mettant régulièrement à jour ses compétences afin de maintenir des standards élevés de soins aux animaux.

Choix des espèces

Le poisson medaka (Oryzias latipes) a été choisi comme espèce modèle en raison de ses avantages biologiques et expérimentaux en accord avec les objectifs du projet. Le medaka possède un temps de génération court (environ 3 mois), ce qui permet une évaluation rapide des effets intergénérationnels et épigénétiques. Sa reproduction continue et quotidienne offre un accès répété à des œufs à différents stades, idéal pour les analyses moléculaires et phénotypiques. La fécondation et le développement embryonnaire externes permettent un contrôle strict de l’environnement après la fécondation, réduisant les effets maternels confondants et favorisant une investigation précise des facteurs pré-fécondation. De plus, le medaka bénéficie d’un génome entièrement séquencé et de ressources moléculaires importantes (par exemple, bases de données bioinformatiques), ce qui en fait un modèle puissant pour l’étude des interactions gène-environnement. Ces caractéristiques rendent le medaka un modèle fiable, reproductible et éthiquement gérable pour les études multigénérationnelles. Dans cette étude, les poissons sont à l’état adulte afin d’évaluer précisément le phénotype reproducteur, de collecter les œufs et de réaliser les analyses moléculaires nécessaires.