Procédures modérées
Caractérisation du rôle de CalHM6 dans l’homéostasie énergétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Un virus injecté dans une zone précise du cerveau et une canule reliée à une pompe osmotique implantée sous anesthésie, en trente minutes d'opération, puis dix-huit semaines de tests métaboliques avec injections dans l'abdomen et prises de sang sur animal vigile. 1 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, nourries dès cinq semaines d'un régime enrichi en graisses et isolées en cage individuelle quand la prise alimentaire doit être mesurée. Le porteur annonce des variations du comportement alimentaire "sans entraîner de souffrance" et des effets indésirables "modérés et transitoires", tout en décrivant des jeûnes, une perte de poids et une mobilité réduite après l'opération. Toutes finissent par une chirurgie terminale sans réveil, pour que leur cerveau soit prélevé.
Objectifs
Nous étudions comment le cerveau contrôle la faim et le poids. Certaines cellules du cerveau aident le corps à savoir quand manger. Dans ces cellules, une protéine appelée CaMK1D joue un rôle clé pour réguler l’appétit. Si cette protéine est trop active, elle peut favoriser l’obésité et le diabète. Nous avons identifié un autre acteur important dans cette même voie, appelé CALHM6, qui agit agir comme un frein naturel : lorsqu’il est très présent, il envoie des signaux chimiques qui ralentissent l’activité des cellules qui stimulent la faim, ce qui aide à réduire l’appétit. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre ce mécanisme pour savoir comment il régule la prise alimentaire et l’équilibre énergétique : Observer ce qui se passe quand CALHM6 est absent : nous voulons voir si les souris mangent plus ou moins et comment leur métabolisme est affecté. Comprendre comment CALHM6 agit : en modifiant l’activité de cette molécule, nous voulons savoir comment elle influence la faim et le comportement alimentaire des souris. En résumé, ce projet vise à découvrir les signaux qui contrôlent la faim, ce qui pourrait aider à mieux comprendre l’obésité et les troubles liés au métabolisme.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau contrôle la faim et l’équilibre énergétique. Nous étudions une molécule appelée CALHM6 et son lien avec une protéine appelée CaMK1D, ainsi que les signaux chimiques qu’elles envoient pour réguler l’appétit. À court terme, nous voulons savoir quel est le rôle de CALHM6 dans différentes zones du cerveau impliquées dans la faim, et comment sa modification influence la quantité de nourriture consommée et le métabolisme des souris. À long terme, ces recherches pourraient aider à trouver de nouvelles pistes pour traiter l’obésité et d’autres troubles liés au métabolisme, en particulier ceux causés par un dérèglement du contrôle de l’appétit par le cerveau. Enfin, ce projet pourrait améliorer notre compréhension des liens entre cerveau, alimentation et maladies chroniques, avec des retombées positives pour la santé publique.
Procédures
Les animaux subiront, sous anesthésie générale, des interventions chirurgicales afin d’injecter des virus expérimentaux dans une zone spécifique du cerveau et d’implanter des canules reliées à une pompe osmotique. La durée totale de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est d’environ 30 minutes. Avant et après ces interventions, les animaux seront soumis à des tests métaboliques réguliers pour suivre leur alimentation et leur métabolisme pendant 18 semaines. Pour chaque test, plusieurs injections intrapéritonéales seront réalisées rapidement (durée = 10 secondes). Par ailleurs, des prélèvements sanguins seront effectués sur les animaux vigiles avant la chirurgie et à un mois de suivi afin d’évaluer différents paramètres biologiques. Certains animaux seront soumis à un régime enrichi en graisses pour observer l’impact sur la prise de poids et le métabolisme. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel qualifié, sous anesthésie, et conformément aux règles de bien-être animal afin de limiter toute souffrance ou stress inutile.
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux utilisés dans ce projet sont principalement liés aux manipulations expérimentales et au modèle métabolique étudié. Les souris pourront présenter une perte de poids transitoire lors de périodes de jeûne ou à la suite d’injections expérimentales visant à moduler l’appétit. Des variations du comportement alimentaire sont attendues selon les modèles utilisés, sans entraîner de souffrance. L’implantation de canules ou de pompes osmotiques peut engendrer un stress modéré ou une réduction temporaire de la mobilité pendant la période post-opératoire, mais une surveillance rapprochée et des soins adaptés seront assurés. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer un stress ponctuel lié aux manipulations et aux prélèvements sanguins, mais leur fréquence et leur durée seront limitées. Globalement, les effets indésirables attendus sont modérés et transitoires, et feront l’objet d’un suivi clinique rigoureux pour assurer le bien-être des animaux tout au long du protocole. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages afin de garantir des mesures précises. Les procédures expérimentales se termineront avec une chrirugie terminale sans réveil pour prélever les organes.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques
Remplacement
Ce projet cherche à comprendre comment certaines cellules du cerveau contrôlent la faim et l’équilibre énergétique. Les expériences faites uniquement sur des cellules ou par ordinateur ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, où interagissent le cerveau, les hormones, le métabolisme et le comportement alimentaire. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser des souris génétiquement modifiées, afin d’observer comment la modification d’un gène précis influence la faim, le poids et le métabolisme. Ces modèles permettent de relier directement des changements dans le cerveau à leurs conséquences sur l’organisme. Comme il n’existe pas d’alternative équivalente, l’expérimentation animale est indispensable, mais elle sera réalisée dans le respect du principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner).
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un total de 1 180 souris. Ce nombre a été déterminé pour s’assurer que les observations réalisées soient fiables et comparables entre différents groupes expérimentaux, tout en respectant strictement le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Lorsque cela est possible, plusieurs manipulations expérimentales seront réalisées sur les mêmes groupes de souris, avec un temps de récupération approprié pour chaque animal. Certaines interventions chirurgicales permettent d’introduire des substances dans des zones spécifiques du cerveau afin d’étudier leur rôle dans la régulation de la faim et du métabolisme. Toutes les données seront ensuite analysées pour comprendre comment ces interventions influencent le poids, la consommation alimentaire et d’autres aspects du métabolisme des souris, dans le respect du bien-être animal.
Raffinement
Les animaux sont logés dans des cages enrichies systématiquement fournies en matériau de nidification et en éléments manipulables en carton afin de favoriser les comportements naturels et réduire le stress La litière est renouvelée hebdomadairement ou plus fréquemment si nécessaire pour maintenir une hygiène optimale Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie multimodale préventive et postopératoire selon des protocoles validés par le vétérinaire responsable Les interventions stéréotaxiques se déroulent en conditions strictement aseptiques avec matériel stérile et opérateurs formés spécifiquement à cette technique Pendant la phase de réveil les animaux sont placés sur des dispositifs de maintien thermique et surveillés en continu jusqu’à reprise d’une activité normale Un protocole de surveillance clinique standardisé est appliqué après toute manipulation invasive avec des observations rapprochées dans les 24 premières heures puis au minimum une fois par jour ensuite Un score de bien-être comportemental et physiologique est utilisé pour détecter précocement douleur, déshydratation, perte d’appétit ou immobilité et déclencher une prise en charge vétérinaire ou un critère d’euthanasie si nécessaire L’habituation des animaux à la manipulation est systématique plusieurs jours avant les manipulations expérimentales par du personnel qualifié pour réduire la réactivité au contact humain Les manipulations stressantes pouvant nécessiter isolement sont réalisées en minimisant la durée d’isolement et en utilisant des cages transparentes pour maintenir la visibilité des congénères Les soins postopératoires incluent administration d’analgésiques selon un calendrier prescrit, surveillance de la plaie, contrôle du poids et réhydratation si besoin. Les actes invasifs sont limités.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet en raison de la disponibilité de nombreux modèles permettant d’étudier le rôle de certaines molécules dans le cerveau. Son système de régulation de l’appétit et de l’énergie présente de nombreuses similitudes avec celui de l’humain, ce qui permet de transposer les résultats. Sa petite taille, son cycle de reproduction court et la connaissance approfondie de sa physiologie en font un modèle de référence pour l’étude du métabolisme et du comportement alimentaire. Certaines souris subiront des interventions chirurgicales permettant d’introduire des substances dans des zones spécifiques du cerveau, afin d’étudier leur rôle dans la régulation de la faim et du métabolisme. Ces interventions seront réalisées lorsque les animaux auront atteint un âge où leur cerveau est pleinement développé. Les animaux seront nourris avec une alimentation riche en graisses dès l’âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids adaptée pour les expériences.
Evaluation de la pharmacocinétique et/ou de la pharmacodynamie de produits de santé
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Lapins : 200
Chiens : 200
Cochons : 200
La moitié des animaux repart vers d'autres études et l'autre moitié est tuée pour que les tissus au contact du dispositif implanté soient examinés au microscope. 200 porcs, 200 chiens, 200 lapins et 200 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections le plus souvent sans anesthésie, se font implanter sous la peau des dispositifs comme une pompe à insuline lors d'une opération d'environ trente minutes, et portent parfois un cathéter permanent pour les prélèvements sanguins répétés, avec des risques de douleur post-opératoire de trois à cinq jours, d'infection, d'hématome et d'hypoglycémie. Le porteur écrit que l'utilisation d'animaux est "requise par la réglementation" et qu'aucune méthode ne permet aujourd'hui de se passer d'un "organisme entier" pour suivre l'élimination d'un produit.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la façon dont des molécules (l’insuline par exemple dans des cas de traitement du diabète) agissent sur le corps et en combien de temps ces molécules sont éliminées par le corps. De plus, certains composants doivent être implantés sous la peau (par exemple : pompe à insuline). Dans cas-là, une analyse au niveau des tissus est réalisée, pour savoir comment les tissus réagissent en contact de ce composant qui a été implanté sous la peau.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) des produits de santé. Ces études permettront le développement de nouveaux traitements et d’améliorer le confort des patients par optimisation des modalités d’administration des traitements. Ainsi, il est possible d'analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché.
Procédures
Les animaux seront mis en contact avec la molécule à tester par injection. Ces injections durent quelques secondes et sont faites sur animaux non-anesthésiés la plupart du temps ou sur animal anesthésié dans le cas d’injection d’un produit visqueux par exemple. De plus une implantation sous la peau peut être réalisée pour certains type de dispositifs (environ 30 minutes -pompe à insuline par exemple). Une fois la molécule mise en contact avec l’animal, des prélèvements sanguins seront réalisées afin de pouvoir évaluer la présence de la molécule dans le sang. Un cathéter permanent ou temporaire pourra être mis en place en cas de prélèvements répétés. Tout au long des périodes de prélèvement, les animaux sont observés afin de détecter les points limites précoces. A la fin des prélèvements les animaux sont soit gardés en vie, soit mis à mort afin de réaliser une analyse sur les tissus qui étaient en contact avec le dispositif afin de voir si ce dernier est bien toléré dans le corps.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie (maximum 3 à 5 jours (le plus souvent 1 à 2 jours)). (Implantation de cathéters ou implantation/injection du produit à tester) - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant maximum 3 à 5 jours (le plus souvent 1 à 2 jours). (nuisance légère) - risque infectieux lié à la chirurgie, dans la semaine qui suit l’implantation des cathéters. - hématome ou œdème au niveau du site opératoire/de prélèvement dans la semaine qui suit l’implantation des cathéters. - Nuisance en cas d’effet secondaire du produit à tester (par exemple : risque d’hypoglycémie après injection d’insuline) pendant quelques heures après injection du produit.
Devenir
Les animaux n’ayant pas d’évaluation de la tolérance du tissu dans le corps pourront être ré-utilisés. Les animaux pour lesquels une évaluation de la tolérance doit être effectué seront mis à mort, car cette analyse est une analyse post-mortem avec analyse histologique des tissus.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise par la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) des produits de santé. De plus pour l’évaluation du devenir du produit, au vu des phénomènes physiologiques en jeu (par exemple l’élimination dans les urines), avoir recours à un organisme entier est nécessaire.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Des études préliminaires peuvent permettre également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre avant de lancer des études réglementaires a plus grandes échelles et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le fait de coupler les études de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) et les évaluations de la tolérance locale permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : avant la chirurgie, si nécessaire, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. - Les enrichissements présents dans l’environnement des animaux sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…), si cela n’impacte pas les résultats de l’étude. En cas de besoin, ajout d’aliments de soutien (gel, pâtée,…). - La douleur des animaux : en phase post-opératoire, les suivis sont renforcés. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Des points limites précoces sont mis en place.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez le rat et le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez les porcs/miniporcs et chiens. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai et par la quantité de sang nécessaire à l’analyse (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière (exemple : molécule à destination pédiatrique), le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs domestiques Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où le choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social, la taille et le poids, et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet. En cas de besoin d’utilisation d’animaux non-adultes pour le projet (hormis pour les porcs), le groupe en charge du bien-être animal au sein de notre structure (Structure du Bien Être Animal).
Impact de l’activation immunitaire maternelle sur les infections congénitales par le cytomégalovirus – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une injection chez la rate gestante, un prélèvement de sang trois heures plus tard, puis une opération de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour atteindre les embryons et injecter le cytomégalovirus dans leur cerveau. Les ratons naissent, sont tatoués aux pattes le premier jour, pesés et testés chaque jour pendant deux semaines par le réflexe de retournement et celui d'éloignement du vide, le porteur ayant déjà observé chez eux des hyperextensions des membres et des crises d'épilepsie généralisées déclenchées par la manipulation. Vers le trentième jour, certains reçoivent une électrode implantée sous anesthésie et sont enregistrés trente minutes éveillés, d'autres passent à l'âge adulte des tests d'anxiété, de mémoire spatiale et de sociabilité. 1 828 rats sont concernés, dont 120 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les mères étant tuées faute de pouvoir être réutilisées et la descendance mise à mort pour analyses. L'ajout de deux traitements à étudier a fait passer l'effectif déclaré de 996 à 1 828 animaux.
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, pouvant notamment causer surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle, etc. Une influence sur la survenue ultérieure d'autisme ou de schizophrénie a aussi été évoquée. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, les mécanismes des troubles neurologiques liés aux infections congénitales au CMV restent peu étudiés et mal connus. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez le rongeur, et utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche indispensable pour appréhender ces mécanismes évolutifs, liés aux développements respectifs du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et à leurs interactions réciproques, dans un contexte ou gestation et statut immunitaire maternel doivent aussi être pris en compte. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact de l’immunité maternelle sur les conséquences de l'infection du cerveau en développement par le CMV, à différents niveaux d’analyse : aux niveaux moléculaire et cellulaire, au niveau des conséquences neurologiques pendant la période postnatale précoce, et à plus long terme sur la cognition, le comportement et la survenue d'activités épileptiques. MODIFICATION : L’étude de deux traitements supplémentaires nécessite une modification du projet initial, avec l’ajout de 832 animaux.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés, et l'impact à long terme notamment reste mal connu. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces conséquences, tout en ouvrant la possibilité de les prévenir en ciblant des altérations précoces du cerveau en développement.
Procédures
Une injection périphérique est pratiquée chez des femelles gestantes puis un prélèvement sanguin est réalisé 3h après l’injection. Après plusieurs jours de récupération, les mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le CMV dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Autour du 30e jour postnatal, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter une électrode permettant d’enregistrer les activités corticales précoces. Ces enregistrements sont réalisés chez l’animal éveillé pendant environ 30 minutes, puis sous anesthésie générale légère pendant au maximum 2 heures. Au stade adulte, d’autres animaux sont évalués au cours de test cognitifs et comportementaux non-invasifs, sans restriction d'eau ni de nourriture (anxiété, reconnaissance et mémoire spatiales, sociabilité). Des sessions d’entrainement sont réalisées afin de minimiser le stress. Une fois ces tests terminés, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter un système sans fil permettant d’enregistrer les activités corticales. Ces explorations fonctionnelles (durée 72h) sont réalisées une semaine après la chirurgie chez l’animal vigile en activité dans sa cage. MODIFICATION : Deux traitements supplémentaires visant à éliminer un type cellulaire précis dans les cerveaux en développement sont pratiqués mais ils ne modifient pas les nuisances décrites ci-dessus : d’une part, un composé ajouté à la nourriture est administré pendant 4 jours consécutifs aux femelles gestantes ; d’autre part un composé est mélangé au CMV pour injection dans les cerveaux embryonnaires.
Impact sur les animaux
Le composé injecté aux femelles gestantes peut déclencher une réaction transitoire (hyperthermie, hypoactivité, et hypophagie) qui se normalise après 24h. Un prélèvement sanguin est réalisé à 3h post-injection. Après plusieurs jours de récupération, ces mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, une inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures. Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques. La majorité des femelles gestantes (>97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de phénotypes est attendu. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide et le test de retournement. A plus long terme, nous anticipons des altérations fonctionnelles et comportementales chez les rats infectés par le CMV in utero, e.g. des activités épileptiques spontanées, des troubles du cycle veille/sommeil, des troubles cognitifs (mémoire spatiale) et des troubles de la sociabilité, mais cela doit être exploré et validé.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neuropathologiques des infections congénitales par le CMV reposent sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle du système immunitaire cérébral, ceci dans un contexte de grossesse et d'un statut immunitaire maternel modifié. Il est évident que la plupart de ces évènements, leur évolution, ainsi que leur complexité et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des cérébroïdes, et encore moins in silico. Cette constatation est évidente pour les études cognitives et comportementales. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (coupes cérébrales), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car un animal jeune adulte passera à la fois les tests cognitifs et comportementaux, puis les enregistrements EEG ; les tissus cérébraux étant prélevés à l'issue de ces analyses. Ceci aura de plus l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques adaptés, y compris les weekends et jours fériés, qui sont consignées dans un registre (avec une fiche de suivi post-opératoire pour les femelles gestantes, qui permet d'établir un score, et une fiche de suivi des cohortes de ratons injectés au CMV). Chaque rate et sa portée est hébergée dans une cage avec nourriture et eau à volonté. L’environnement est enrichi avec des matériaux souples (papier foisonnant, litière en carrés de cellulose vierge) et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid. Les femelles gestantes subissent une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire des animaux est surveillé en permanence, et une injection intra-péritonéale de sérum physiologique est réalisée en fin d’intervention. Après leur réveil, les femelles sont placées sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Un suivi post-chirurgical est réalisé : surveillance de la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si détérioration), d’absence d'hémorragie vaginale, de la mise bas (euthanasie si retard de la mise bas supérieur à 24h), de la perte de poids (euthanasie si > à 20%), de l'hypothermie (froid au touché), des signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). En fonction du score obtenu, une injection d'analgésique ou d’anti-inflammatoire peut être pratiquée. Les ratons sont également suivis avec notamment une surveillance de leur état général et de leur prise de poids, et de l’apparition des phénotypes caractéristiques de notre modèle. Ces mesures sont quotidiennes pendant les 2 premières semaines postnatales. Au delà, seul le poids sera mesuré, d’abord quotidiennement jusqu’au 20e jour postnatal, puis 1 fois par semaine jusqu’au sevrage (au 30e jour postnatal). Ensuite, les animaux seront regroupés par sexe à 2-3 individus par cage dans un environnement enrichi (rouleaux de papier foisonnant et tunnel en carton). Le poids sera suivi une fois par semaine. Au stade adulte, les tests comportementaux seront effectués, ils seront précédés de plusieurs sessions d’habituation pour minimiser les effets du stress.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études électrophysiologiques, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro sera réalisée autour du 15e jour postnatal, période classique où le cerveau immature, correspondant à la période néonatale chez l'homme, présente une plus forte susceptibilité aux activités épileptiques. Les enregistrements des activités corticales précoces seront réalisés autour du 30e jour postnatal, une période classiquement utilisée pour ce type d’enregistrements. La recherche d'effets à plus long terme du CMV sera réalisée chez des jeunes rats (40e jour postnatal et au delà), permettant la réalisation efficace de tests cognitifs et comportementaux, ainsi que des enregistrements électro-encéphalographiques sur plusieurs jours consécutifs.
Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de méningites bactériennes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Âgées de trois semaines, les souris utilisées servent à reproduire la méningite de l'enfant, et certaines lignées génétiquement déficientes portent un risque accru d'infection. 3 700 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit une injection bactérienne sous anesthésie générale d'environ trois minutes, puis jusqu'à deux injections supplémentaires de trente secondes, le porteur indiquant que l'infection peut provoquer douleur, prostration et retrait du groupe social pendant seize heures au plus. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et analyser la réponse inflammatoire, seul moyen selon le porteur d'identifier les molécules qui abîment le cerveau au cours de l'infection.
Objectifs
La méningite est une infection du cerveau qui est associée à un taux de mortalité élevé ou laisse chez 30 à 50 % des survivants, des séquelles neurologiques. Lorsqu'un microorganisme envahit le cerveau, une réponse immunitaire est déclenchée afin de combattre l’infection. Cependant,cette réponse peut aussi causer des dommages au cerveau responsable en partie des séquelles neurologiques. Notre objectif est de caractériser la réponse immunitaire du cerveau lors de l’infection et d’identifier des molécules inflammatoires qui pourraient jouer un rôle néfaste sur le cerveau.
Bénéfices attendus
L'identification de ces molécules inflammatoires impliquées dans les dommages au cerveau lors de la méningite accélérera le développement de thérapies visant à réduire les séquelles neurologiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront infectés par injection sous anesthésie générale (1 injection pour une durée totale d'environ 3 min). Des injections supplémentaires permettant l'administration de traitement ou d'anesthésie seront réalisées (jusqu'à 2 injections/animaux durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections causent un stress de courte durée (quelques secondes). L'infection est susceptible de générer douleur, prostration, et une mise en retrait du groupe social (16h maximum). Certaines souris génétiquement déficientes qui seront élévées présentent un risque accru de développer une infection.
Devenir
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire la complexicité du cerveau et du système immunitaire in vitro. L'analyse de la réponse inflammatoire du cerveau nécessite le prélevement des organes justifiant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas l'étude de la réponse inflammatoire du cerveau qui peut mettre en jeux de nombreux types de cellules. Aussi, le modèle animal est indispensable à ce projet qui permettra d'identifier l'ensemble des cellules et molécules inflammatoires impliquées dans ce processus et également d'analyser l'impact de l'inflammation systémique sur le déclanchement de la neuroinflammation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum mais suffisant pour permettre une analyse statistique fiable. Chaque expérience indépendante comportera au moins un groupe témoin d'animaux et un groupe test et les différences entre les souris test et les témoins seront analysées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L’infection se fera sous anesthésie générale. Les animaux bénéficieront d’un hébergement adapté et d'un milieu enrichi. Nous avons optimisé les inocula bactériens et les temps d’étude de manière à minimiser les effets de l’infection sur les animaux. Ce protocole inclut des points limites spécifiques au projet qui permettront d'évaluer les animaux, à l'aide d'une grille de score. En cas de point limite atteint, les animaux seront mis à mort de façon anticipée. Dans le cas où certains animaux peuvent être malades, des croquettes imbibées d’eau sont systématiquement introduites directement dans la cage pour favoriser la prise alimentaire. Pour les souris immunodéprimées, un hébergement sans orgganismes pathogène sera mis en place;
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la physiopathologie de l'infection tels qu’ils peuvent se développer chez l'enfant. Nous utiliserons des souris juvénile de 3 semaines qui constituent notre modèle d'étude de méningite. D’autre part, les modèles animaux comme la souris offrent la possibilité d’investiguer des cibles spécifiques in vivo à l’aide d’animaux génétiquement modifiés, ce qui permet d'approcher ou d'élucider de plus près les mécanismes impliqués
Création de lignées murines originales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies animales
19 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs vivent cinq ans en isolement intermittent, ne rejoignant des femelles qu'une nuit à la fois, et sont tués au gaz carbonique avant leurs douze mois. Les donneuses reçoivent deux injections hormonales à quarante-huit heures d'intervalle puis sont tuées par dislocation cervicale pour la récolte des embryons, les receveuses subissent un transfert d'embryons sous anesthésie générale et sont tuées en fin de procédure, un second transfert leur étant refusé. Le porteur reconnaît que l'isolement peut générer de l'anxiété chez un animal social, et présente cette plateforme de création de lignées comme un moyen d'obtenir des souris modifiées "en utilisant peu d'animaux".
Objectifs
Les équipes des instituts de recherche utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées sous une forme similiaire chez des patients humains, à évaluer des stratégies thérapeutiques adaptées en conséquence. La plateforme a pour objectif la génération de tels modèles murins transgéniques sur site, par approche Crispr/Cas 9.
Bénéfices attendus
L'application du système Crispr/Cas9 à l'embryon de souris permet l'obtention de souris d'intérêt génétiquement modifiées dans des délais courts, en utilisant peu d'animaux (de part l'efficacité des réactifs utilisés), et ce directement dans un fonds génétique d'intérêt donné. Les lignées génétiquement modifiées créées par notre plateforme sont des modèles de choix pour la communauté scientifique. En effet, ce sont des modèles pour la recherche fondamentale, mais aussi des modèles de pathologies humaines servant à mieux comprendre les processus de développement de ces maladies et voire même à tester des molécules/médicaments afin de valider (ou invalider) des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs seront herbergés en situation d'isolement sur 5 ans. Les femelles donneuses seront soumises à une stimulation hormonale (2 injections intra-péritonéales (durée inférieure à 5 secondes) à 48h d'intervalle). Les femelles receveuses recevront des embryons par transfert d'embryons dans l'oviducte sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 40min). Les souriceaux fondateurs seront suivis pour de potentiels phénotypes dommageables. Les souriceaux issus des accouplements des fondateurs seront suivis pour de potentiels phénotypes dommageables.
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement, ces accouplements n'ayant lieu que sur des périodes courtes (une nuit) pour permettre le contrôle et la synchronisation de l'initiation des pseudo-gestations (dans le cas des mâles vasectomisés) ou pour permettre la production d'embryon un jour donné (dans le cas des mâles reproducteurs). L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons. Les animaux issus de ces manipulations peuvent potentiellement avoir un phénotype dommageable. Une fiche de suivi sera attribuée à chacun d'entre eux.
Devenir
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs en situation d'isolement seront mis à mort par inhalation de CO2 via un système dédié avant qu'ils aient 12 mois. Les femelles donneuses sont mises à mort par dislocation cervicale afin de récolter les embryons post-mortem. Les femelles receveuses ne peuvent pas être sujettes à un deuxième transfert d'embryons, elles sont donc mises à mort par inhalation de CO2 via un système dédié en fin de procédure.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l'utilisation de ces animaux, la génération de nouveaux modèles murins transgéniques impose l'utilisation d'animaux donneurs/receveurs d'embryons.
Réduction
La création de nouvelles lignées transgéniques sera limitée aux lignées qui ne sont pas disponibles, que ce soit sous forme respirante, d'embryons congelés, ou de semence congelée. L'estimation des nombres maximum d'animaux à utiliser dans ce projet a été faite en se basant sur la litterature scientifique. La grande effiacité des réactifs utilisés et des techniques de reproduction permettent de diminuer drastiquement le nombre d'animaux utilisés pour la génération d'une lignée
Raffinement
La potentielle douleur liée à la procédure de transfert d'embryons est prise en charge par une injection d'analgésie, et fait l'objet d'un suivi étroit des animaux.
Choix des espèces
Pas d’autres possibilités que l’utilisation de souris pour la production de lignées de souris génétiquement modifiées. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses,les males vasectomisés et les mâles reproducteurs, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubéres (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation.
Identification de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique dans un modèle murin – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
1 642 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs reins et leur foie, dont 1 052 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant six semaines d'un produit qui provoque la fibrose, puis des gavages quotidiens par cycles de sept jours ou des injections de traitement deux fois par semaine, avec pesées bihebdomadaires et prélèvement sanguin sous anesthésie avant la mise à mort. Trente d'entre elles sont hébergées vingt-quatre mois pour vieillir, et une lignée déficiente pour le gène col4a3 perd l'audition vers six à huit semaines avant de développer une fibrose rénale. Le porteur écrit que neuf souris par groupe suffisent et que le nombre total estimé s'élève à 986 animaux, alors que le projet en déclare 1 642.
Objectifs
La fibrose est définie comme une cicatrisation anormale des tissus constatée après agression de ces derniers. Cette affection est irréversible et s'aggrave au cours du temps. Ce phénomène peut affecter la plupart des organes dont les poumons, les reins, le foie ou encore le coeur et représente un problème majeur de santé publique. En effet, 45% des décès dans les pays industrialisés seraient liés à la présence d’une composante fibrotique. Cependant, les mécanismes à l'origine de ce processus restent actuellement largement méconnus. De ce fait, un des enjeux majeurs de ces dernières années consiste à mieux appréhender les causes et les mécanismes de cette maladie afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les modèles cellulaires ne permettant pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, le recours à l'animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrotique d'un candidat médicament. Les objectifs de notre projet sont les suivants : - Identifier de nouvelles molécules présentant un potentiel anti-fibrotique dans des modèles murins de fibrose hépatique et rénale. Ces molécules ont été sélectionnées préalablement dans notre laboratoire à la suite de tests in vitro. Pour cela, nous utiliserons différents modèles murins couramment décrits dans la littérature scientifique permettant d'induire (ou développant spontanément) des lésions de fibrose hépatique ou rénale. De plus, la fréquence de la plupart des pathologies fibrotiques étant fortement augmentée après 50 ans, nous inclurons dans notre étude des souris âgées pour être plus représentatifs de la pathologie humaine. - Confirmer le rôle instrumental d’un gène, miR-21, dans la fibrose dans un modèle de souris déficientes pour ce gène. En effet, les résultats préliminaires obtenus in vitro nous ont permis de démontrer l'implication de ce gène dans la fibrose. Nous souhaitons donc confirmer nos résultats dans un modèle complexe.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel anti-fibrotique de 5 molécules dont l’intérêt a été démontré in vitro au préalable en utilisant à la fois des souris jeunes et âgées. A terme, ce projet devrait permettre d’obtenir la preuve de concept de l’utilisation de ce type de molécules dans la prise en charge des patients atteints de fibrose, pour lesquels les options thérapeutiques restent à l’heure actuelle très limitées.
Procédures
Partie 1 : 30 souris hébergées pour étudier leur vieillissement subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 24 mois Partie 2 : 360 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 2 injections par semaine pendant 3 semaines du traitement ou de son contrôle (30 sec/intervention). 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage par jour (60 sec/intervention) pendant 1 cycle de 7 jours, répété 2 fois avec un intervalle de 2 semaines entre les 2. 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage (60 sec/intervention). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 4, 6 ou 7 (en fonction du groupe) semaines (1 min/pesée) et subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 7 semaines. Partie 3 : 360 souris recevront 1 injection de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 2 injections par semaine pendant 3 semaines du traitement ou de son contrôle (30 sec/intervention). 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage par jour (60 sec/intervention) pendant 1 cycle de 7 jours, répété deux fois avec un intervalle de 2 semaines entre les 2. 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage (60 sec/intervention). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 5, 7 ou 8 semaines (en fonction du groupe) (1 min/pesée) et subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 8 semaines. Partie 4 : Étape 1 : 224 souris recevront 2 injections ou non / sem. pendant 6 semaines (30 sec). Étape 2 : 668 souris recevront 2 injections ou non / sem. pendant 6 semaines (30 sec) puis seront isolées pendant 16h pour le recueil passif des urines (répété 3 ou 4 fois en fonction des groupes). Un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) sera réalisé sur l'ensemble des souris avant leur mise à mort. Durée totale = 9,5 semaines à 24 mois en fonction des groupes.
Impact sur les animaux
Notre projet implique l’induction de lésions de fibrose hépatique ou rénale chez la souris. De plus, les souris déficientes pour le gène col4a3 présentent à 6-8 semaines une perte auditive neurosensorielle modérée et développent à 10 semaines une glomérulosclérose associée une fibrose rénale.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes (reins et/ou foie) dans le but d’étudier la fibrose et la sénescence dans ces organes.
Remplacement
Des résultats préliminaires in vitro obtenus au sein de notre laboratoire nous ont permis de : - démontrer l’implication de certains gènes tel que miR-21 ou de processus cellulaires comme la sénescence dans la fibrose. - pouvoir sélectionner 5 candidats médicaments pour nos évaluations de potentiel anti-fibrotique. Cependant, les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le développement des lésions de fibrose. En effet, le processus de fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier et de ce fait nécessite de recourir à l’expérimentation animale.
Réduction
Nos études in vitro effectuées en amont au laboratoire nous ont permis de réduire significativement le nombre de molécules d’intérêt à tester et de ce fait, de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour notre recherche. En ce qui concerne le nombre d’animaux utilisés dans notre étude, en émettant l'hypothèse d'une fréquence de l'événement de 10% sans traitement et de 75% avec traitement, il est nécessaire d'inclure 7 souris par groupe. Du fait de la variabilité de réponse pouvant être observée lors du processus de fibrose, nous envisageons d’utiliser 9 souris par groupe expérimental. De plus, les modèles utilisés dans ce projet sont complémentaires et utilisent des procédures déjà mises au point et couramment décrites. Les différentes procédures mises en œuvre pour ce projet ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Pour la mise en œuvre de ce projet qui durera 5 ans, le nombre total d'animaux estimé est de 986 souris.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi avec des cotons de nidification, et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin de réduire leurs stress et angoisse. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur mise à mort. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparences reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole et mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle murin constitue un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire de par notamment les nombreuses similitudes avec la pathologie observée chez l’homme. Le choix des lignées utilisées est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature. La fréquence de la plupart des pathologies fibrotiques étant fortement augmentée après 50 ans, nous inclurons dans notre étude des souris jeunes adultes et âgées pour être plus représentatifs de la pathologie humaine. Seul le modèle de fibrose rénale spontanée inclura de jeunes souris de 4 semaines en raison du développement précoce des lésions de la pathologie.
Pharmacocinétique : Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à 365 administrations de composés et 52 prélèvements de sang par animal : 900 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués pour analyses immunologiques et histologiques. La plupart des gestes se font sur animaux vigiles, sous contention, le porteur décrivant des hématomes aux points de piqûre et une douleur brève à chaque injection. Ces études de pharmacocinétique servent à mesurer où va une molécule dans le corps et à quelle vitesse elle en sort, étape que les autorités de santé exigent avant tout essai chez l'être humain. Le projet pourra comporter dix études, et le bénéfice annoncé pour les patients reste renvoyé à d'éventuels essais cliniques ultérieurs.
Objectifs
La phase préclinique consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur sain est une étape essentielle dans le développement de médicaments et de vaccins. Ce projet a pour but de vérifier l'innocuité (absence de toxicité) et de déterminer la biodisponibilité de nouvelles molécules thérapeutique. La pharmacocinétique a pour but d'étudier le devenir d'une substance, contenue dans un médicament, dans l'organisme après son administration selon différentes voies d'administration. Ce projet a pour but d’étudier le devenir des agents pharmacologiques in vivo chez le rat sain qui est une étape essentielle dans le développement d’un candidat médicament afin d'étudier sa bio-distribution et biodisponibilité dans un organisme vivant. La pharmacocinétique est le devenir du médicament, depuis son entrée jusqu'à sa sortie de l'organisme, l'évolution en fonction du temps de son absorption, sa biodisponibilité, sa distribution, son métabolisme, et son excrétion. En effet pour développer un composé, il est indispensable d’étudier sa pharmacocinétique et de vérifier l’absence de toxicité sur un modèle animal. Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Cette caractérisation des paramètres pharmacocinétiques permet par la suite de déterminer entre autres les voies d’administration et la posologie.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique (PK) chez l'animal sont nécessaires et demandées par les autorités de santé afin de pouvoir réaliser des études cliniques avec un maximum de sécurité. Elles permettent de déterminer les doses, la fréquence des administrations et de calculer la marge de sécurité. Ce projet pourra comporter 10 études et permettra de générer des données scientifiques robustes chez l’animal afin de pouvoir passer ultérieurement aux essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 52 prélèvements (30 secondes/rat) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/rat). Administrations de composés : maximum 365 administrations, durée : 30 secondes/injection.
Impact sur les animaux
Les contentions des animaux vigiles pour administrer les molécules thérapeutiques peuvent engendrer un stress mineur à l’animal. L’administration de molécules par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des molécules entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés ce qui peut générer du stress et de l’inconfort se traduisant par une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Aucun problème de toxicité n’a été relevé sur les composés testés lors du précédent projet.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet d’étudier la bio- distribution, biodisponibilité de nouvelle molécules thérapeutiques et vérifier l’innocuité de nouvelles thérapies in vivo chez le rat. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale (culture cellulaire, modélisation informatique) ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament. Ces tests sont nécessaires avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle substitutif n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la pharmacocinétique de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement (pour les études de plus de 24h) pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages et le vétérinaire en sera informé. Certains types de traitements seront effectués sous anesthésie ainsi que les prélèvements de sang. Un suivi et scoring quotidien seront effectués. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Pour les projets longs, au cours des précédents projet nous avons varié les enrichissements au cours de l’étude (tunnel, dômes, frisures de carton, cylindre de coton, morceau de bois à ronger) afin d’améliorer le bien-être des animaux (curiosité, diminuer l'ennui). Nous allons continuer de procéder ainsi dans ce projet.
Choix des espèces
Le choix du rat pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développé sur des fonds génétique de rat dont les génomes possèdent 90% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendu. - De nombreux outils génétiques, anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire chez le rat. - Le rat est l’autre espèce de rongeur utilisée en recherche biomédicale (en plus de la souris), même si son importance numérique est moindre que celle de la souris. C’est aussi une espèce de petite taille qui présente l’avantage, par rapport à la souris, d’être plus proche physiologiquement de l’homme, conférant ainsi aux résultats des recherches une meilleure comparaison inter-espèces. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Décontamination de lignées murines d’intérêt par transfert d’embryons
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Importées d'autres établissements ou déjà hébergées sur place, les lignées de souris concernées doivent changer de statut sanitaire, ce qui passe par la mort de toutes les femelles servant au transfert d'embryons. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les donneuses, âgées de quatre à six semaines, reçoivent deux injections hormonales à deux jours d'intervalle avant d'être tuées pour la récolte des embryons, les receveuses subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale puis partent chez un prestataire où elles sont tuées pour vérifier leur statut sanitaire. Celles chez qui la réimplantation échoue sont tuées faute de pouvoir être réutilisées, et le porteur affirme qu'un tel projet ne peut pas se faire sans souris, l'étude du cerveau étant selon lui hors de portée des modèles in vitro.
Objectifs
Les recherches réalisées dans l'établissement portent sur les maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson, Alzheimer, la sclérose en plaques et sur les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou les troubles de l’humeur. Ces projets de recherche visent à développer les connaissances sur ces sujets et identifier des axes thérapeutiques innovants pour améliorer la prise en charge des patients. Les lignées murines nécessaires pour ces projets sont élevées en interne. Afin de pouvoir importer de nouvelles lignées d’intérêt possédant des caractéristiques génétiques précises il est parfois nécessaire de les décontaminer, de même pour certaines lignées déjà hébergées sur place mais nécessitant un statut sanitaire plus strict, notamment pour leur élevage. La décontamination des lignées et leur hébergement dans une zone protégée (exempte d’agent pathogènes et opportunistes pour les souris, ou SOPF) permettra un meilleur contrôle de leur statut sanitaire et une amélioration de leurs conditions d’hébergement. La décontamination se fera par la technique de transfert d’embryons se basant sur le principe que l’embryon est protégé de tout contaminant présent chez sa mère. Les embryons à transférer seront récoltés, puis lavés et réimplantés chez une femelle dite receveuse (pseudogestante) dans la zone protégée de l’animalerie dans le but d’obtenir des souriceaux de statut sanitaire SOPF.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les conditions d’élevage des lignées murines concernées, grâce à un meilleur contrôle du statut sanitaire des animaux et de leurs conditions d’hébergement. En effet la zone protégée bénéficie d’un accès très restreint et donc un environnement plus calme, permettant aux animaux de ne pas être exposés au stress lié aux nombreux passages de personnes fréquentant l’animalerie, mais également aux pathogènes pouvant être amenés via ces mêmes personnes. Les animaux d’élevage seront donc placés dans des conditions optimales pour se reproduire. Les petits générés dans cette zone protégée pourront ensuite être récupérés par les chercheurs dans la zone expérimentale pour participer aux projets de recherche et donc contribuer à l’avancée de la recherche pour différentes pathologies du cerveau telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la sclérose en plaques, l’épilepsie, les tumeurs cérébrales, etc…
Procédures
Des souris femelles recevront 2 injections d’hormones à 2 jours d’intervalle (durée quelques secondes par injection, souris vigile) pour obtenir une superovulation. D’autres souris femelles auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réimplanter les embryons (durée environ 45 minutes, une fois).
Impact sur les animaux
Lors des injections les animaux ressentiront une légère et brève douleur au niveau des zones de piqûre. La chirurgie sera associée à un risque de douleur et d’inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale nécessaire pour la réaliser sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et plus rarement un risque de difficultés cardiaque et, ou respiratoire. Il est possible que certaines lignées à transférer soient à phénotype dommageable. Pour la majorité de ces lignées le phénotype dommageable ne s’exprimera qu’à partir de l’âge adulte (plus de 8 semaines, exemples : perte de poids, apparition de tumeurs, difficultés motrices, etc.), ici nous utiliserons des femelles jeunes (moins de 6 semaines), les phénotypes dommageables que nous prévoyons de rencontrer pour ces jeunes animaux pourraient consister en des tremblements, des anomalies cognitives ou une différence de poids par rapport aux souris non génétiquement modifiées.
Devenir
Toutes les souris utilisées pour la production des embryons seront euthanasiées pour pouvoir récupérer ces embryons. Les souris réimplantées avec succès seront transférées à un prestataire pour la confirmation de leur statut sanitaire, ceci nécessitera leur euthanasie afin de réaliser des prélèvements d'intérêt post-mortem pour les différentes analyses nécessaires à la validation du statut sanitaire. Les femelles pour lesquelles la réimplantation n'aura pas fonctionné seront euthanasiées car elles ne pourront pas être réutilisées.
Remplacement
Ce projet consistant à décontaminer des lignées murines il ne peut se faire sans l’utilisation de souris. Cette décontamination intervient dans le contexte de souris utilisées pour des projets de recherche dédiés à l’étude du cerveau. Ces études ne peuvent s'effectuer que sur des modèles animaux car les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas à représenter les interactions complexes mises en jeu au niveau cérébral. De plus lorsqu’il est nécessaire d’étudier des composantes comportementales ou motrices, notamment pour certaines maladies du système nerveux, il est indispensable de recourir à l’utilisation de modèles animaux car cela ne peut pas être représenté in vitro.
Réduction
Nous utiliserons au total 600 souris pour ce projet. Nous avons défini cet effectif par rapport à notre expérience de la technique et au taux de réussite de chaque étape. Ainsi nous avons estimé que 6 souris donneuses étaient nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’embryons fécondés et viables à réimplanter. Ces femelles recevront un traitement de stimulation hormonale pour augmenter le nombre d’embryons récoltés permettant ainsi de réduire le nombre de femelles donneuses nécessaires pour chaque transfert. Pour les femelles receveuses nous avons défini qu’il nous faudrait 4 femelles maximum afin de prendre en compte le risque lié à la chirurgie et le risque de perte de la portée lié aux aléas de l’élevage. Nous avons choisi une souche de souris spécifique comme receveuses car elle permet d’avoir un bon rendement de réimplantation et présente un comportement maternel fort permettant ainsi de réduire le nombre de femelles à réimplanter pour obtenir un nombre de souriceaux suffisants. Nous estimons que nous aurons au maximum 12 lignées à décontaminer par an. Les mâles vasectomisés ne sont pas soumis à déclaration dans ce projet, mais, à titre informatif ils seront conservés pendant 10 mois afin de participer à plusieurs sessions de transfert dans un souci de réduction plus global.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu avec un carré de coton et un bâtonnet de bois à ronger au minimum, complétés par une maisonnette pour les femelles gestantes. Les animaux en provenance extérieure bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum avant leur entrée en procédure. La chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter toute sécheresse oculaire. Leur température corporelle sera maintenue grâce à l’utilisation de chambres d’induction et de réveil chauffées et d’un tapis chauffant thermorégulé. Le réveil des animaux sera surveillé, et des croquettes et de l’hydrogel seront mis à disposition dans le fond de la cage pour faciliter leur récupération la première journée. Une évaluation de leur état général sera assurée en période post-chirurgicale. Tous les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie, celle-ci est transmise à la structure chargée du bien-être animal (SBEA), au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer la meilleure prise en charge des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance. Il est possible que certaines lignées à transférer soient à phénotype dommageable, pour les femelles génétiquement modifiées qui pourraient être impliquées dans ce projet (cas des mutations génétiques complexes) nous nous assurerons que le phénotype ne soit pas impactant pour la reproduction et, ou, qu’il ne soit pas encore exprimé. Nous utiliserons des femelles très jeunes à un âge auquel nous ne devrions observer (au maximum) que des signes cliniques légers en lien avec ces phénotypes dommageables.
Choix des espèces
Ce projet portant sur le transfert d’embryons de lignées de souris transgéniques, il est impératif de conserver la même espèce. Le choix de cette espèce sera justifié dans les différentes demandes d’autorisation de projet afférentes aux lignées utilisées dans ce projet. Les femelles donneuses d’embryons seront utilisées à un jeune âge de 4 à 6 semaines. A cet âge la maturité sexuelle n’est pas complète et la souris n’est pas cyclée. Ainsi le traitement hormonal déclenche une maturation folliculaire massive et une ovulation. Les femelles receveuses seront utilisées à un âge compris entre 2 et 8 mois afin d’être sexuellement matures mais pas trop âgées pour conserver de bonnes capacités reproductives et maternelles. Cet âge permet également à la femelle de bien supporter la chirurgie.
Recherche des expressions comportementales de la fatigue chez le chien
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Soumis à un effort soutenu sur tapis de course puis à des jeux cognitifs de difficulté croissante, six chiens enchaînent des sessions de deux heures au maximum, avec quatre prélèvements sanguins chacun. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et les chiens sont gardés en vie pour être réutilisés, après avis du vétérinaire et temps de repos. Le porteur cherche à repérer les signes comportementaux de la fatigue, dans l'idée de fournir aux vétérinaires, éducateurs et propriétaires des grilles d'observation. Il annonce des risques d'entorse, de boiterie et de contracture musculaire ainsi qu'une frustration possible en cas d'échecs répétés, justifie l'effectif de six animaux par le "strict minimum nécessaire" sans autre calcul, et ne précise ni l'origine des chiens ni les projets pour lesquels ils seront réutilisés.
Objectifs
L’objectif de notre étude est d’identifier les expressions comportementales de la fatigue chez le chien. Étant donné la nature subjective de la fatigue et les limites que cela implique en termes d’identification, de signes comportementaux potentiellement associés à la fatigue. Pour réaliser notre étude, nous soumettrons des chiens à un exercice physique intense et à des exercices cognitifs.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude pourraient contribuer à l’élaboration de grilles d’observation ou d’outils de détection comportementale de la fatigue, applicables sur le terrain par les vétérinaires, éducateurs ou propriétaires. À terme, cela pourrait améliorer la prévention du surmenage, la qualité de vie et le bien-être animal, en permettant d’adapter plus finement l’intensité des activités physiques ou cognitives proposées aux chiens.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests physiques et cognitifs d’une durée maximale de deux heures, en tenant compte du temps d’habituation prévu lors de la phase de pré-test. Chaque chien participera à une session de test physique et à une session de test cognitif. Avant chaque test, un prélèvement sanguin sera réalisé ; il s’agit d’un acte bref d’environ trois minutes. Au total, chaque chien fera l’objet de quatre prélèvements sanguins.
Impact sur les animaux
Plusieurs phases du protocole peuvent induire un stress léger à modéré, sans douleur ni souffrance durable. L’exposition à un effort physique soutenu sur tapis de course, bien que strictement encadrée, peut entraîner un inconfort transitoire. La participation à des jeux cognitifs de difficulté croissante est également susceptible de provoquer une légère frustration en cas d’échecs successifs. Les prélèvements sanguins effectués avant et après chaque test constituent un acte médical pouvant générer un stress momentané lié à la contention, sans douleur persistante. Enfin, de légères blessures musculosquelettiques (entorse, boiterie, contracture musculaire) pourraient survenir en lien avec l’exercice physique sur tapis roulant. Ce risque est limité grâce à une phase d’habituation progressive, un protocole d’effort standardisé, un encadrement permanent et une surveillance continue durant l’exercice.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative de remplacement : notre étude a pour objectif d’évaluer la fatigue sur les chiens.
Réduction
Au total, 6 animaux seront utilisés. Ce nombre a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes et fiables permettant d’évaluer la fatigue chez les chiens.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des chiens. Si nécessaire, la douleur musculosquelettique sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés (AINS). Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. Les testes seront associées à des interactions positives : les chiens seront caressés et recevront des récompenses.
Choix des espèces
L’étude est réalisée chez le chien, car il s’agit d’une étude préclinique dont l’objectif est d’évaluer la fatigue spécifiquement chez cette espèce. Des chiens adultes seront utilisés dans ce projet, car ils représentent la majorité de la population concernée par l’étude et présentent des caractéristiques physiologiques stables, nécessaires à une évaluation fiable de la fatigue.
Implantation d’un biomatériau régénératif comme stratégie thérapeutique innovante dans un modèle rat d’AVC. Suivi de l’évolution du tissu cérébral par IRM et histologie. EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le crâne ouvert deux fois, une heure pour créer la lésion cérébrale puis une heure pour poser l'implant, chaque rat passe ensuite trois IRM d'une heure sous anesthésie. 84 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une douleur aiguë liée à l'incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du tissu cérébral, des saignements intracrâniens possibles, des œdèmes cérébraux et des crises d'épilepsie soudaines, et compte pourtant parmi les bénéfices attendus une "réduction des interventions multiples" qui diminuerait le stress et la souffrance des animaux non-humains. Tous sont tués pour que leur cerveau soit analysé et le biomatériau observé en place.
Objectifs
L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à favoriser la régénération des voies nerveuses motrices après une lésion du cortex moteur. Les effets de cette approche seront évalués à la fois sur le plan tissulaire, par imagerie IRM et analyses histologiques, et sur le plan fonctionnel, au moyen de tests moteurs spécifiquement adaptés. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU)
Bénéfices attendus
Ce projet vise à démontrer l’intégration d’un nouveau biomatériau dans le tissu cérébral et à évaluer son potentiel à favoriser la récupération structurelle et fonctionnelle de la composante motrice. Les principaux bénéfices attendus sont : - Restauration tissulaire ciblée : le biomatériau pourrait stabiliser la matrice extracellulaire et soutenir la reconstruction des circuits corticospinaux. - Amélioration fonctionnelle : en favorisant la régénération neuronale et la réorganisation synaptique, il pourrait améliorer la mobilité et la coordination motrice. - Réduction des interventions multiples : un implant efficace limite le recours à des traitements répétitifs ou invasifs, réduisant le stress et la souffrance des animaux. - Avancée méthodologique : le suivi longitudinal par IRM et tests comportementaux permet d’observer l’évolution de la récupération chez le même animal, augmentant la robustesse des données et réduisant le nombre d’animaux nécessaires.- - Impact translational potentiel : les résultats pourraient guider le développement futur de thérapies régénératives pour les AVC ou traumatismes cérébraux, combinant implants biomimétiques, facteurs de croissance et thérapie cellulaire. En résumé, le projet allie compréhension fondamentale de la régénération cérébrale et perspective thérapeutique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à 2 chriurgies sous anesthésie (réalisation de lésion (durée 1h) puis pose de l'implant (durée 1h)) au niveau cérébral (EU 1/2). Une IRM cérébrale sous anesthésie (durée 1h) sera réalisée 3 fois aprés la lésion (EU 2/2). La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux (EU 1/2).
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la chirurgie: La procédure chirurgicale elle-même constitue une source importante de gêne pour l’animal. Elle peut provoquer une douleur aiguë immédiate liée à l’incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du tissu cérébral. Malgré l’utilisation d’anesthésie générale et d’analgésiques adaptés, un risque résiduel d’inconfort ou de douleur persiste, notamment lors de la phase de réveil. La chirurgie comporte également des risques de complications, tels que : - Saignements intracrâniens - Infections post-opératoires - Réactions inflammatoires locales - Œdèmes cérébraux pouvant altérer le bien-être de l’animal et interférer avec la récupération attendue Conséquences post-opératoires et facteurs additionnels de stress Après l’intervention, les animaux peuvent présenter un inconfort prolongé lié à la cicatrisation et à l’adaptation physiologique post-lésion. Cela peut se traduire par : - Altération de la motricité - Diminution de l’appétit - Modification du comportement exploratoire - Apparition de crises d’épilepsie soudaines Les premiers tests comportementaux réalisés après récupération peuvent également induire un stress psychologique, en raison de la nouveauté des situations expérimentales et de la contrainte de manipulation.
Devenir
La procédure se termine par la mise à mort des animaux afin de pouvoir étudier leurs tissus cérébraux. Cette étape est nécessaire pour observer directement comment le biomatériau s’intègre dans le cerveau, et pour mesurer la reconstruction des zones touchées et la récupération des cellules et des circuits moteurs. Les informations obtenues permettent également de mettre en relation les changements observés dans le cerveau avec les performances motrices mesurées chez l’animal, donnant ainsi une vision complète de l’efficacité du traitement.
Remplacement
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une maladie grave causée par l’obstruction ou la rupture d’un vaisseau sanguin dans le cerveau, entraînant des séquelles neurologiques. Malgré les progrès de la recherche en laboratoire, les modèles actuels ne permettent pas encore de reproduire la complexité du cerveau humain, en particulier sa vascularisation et les réactions biologiques qui suivent un AVC. Pour mieux comprendre ces phénomènes et tester de nouvelles thérapies, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. Ce projet vise à évaluer une stratégie innovante basée sur l’implantation de biomatériaux dans la zone lésée du cerveau, afin de favoriser la régénération. Les effets seront suivis à la fois par des tests fonctionnels (motricité, force, comportement) et par imagerie cérébrale (IRM). Après avoir obtenu des résultats encourageants avec d’autres biomatériaux chez le rat, nous allons maintenant tester un nouveau biomatériau biodégradable, plus proche des conditions physiologiques humaines et offrant un meilleur potentiel régénératif.
Réduction
L’utilisation de méthodes non invasives comme l’IRM et les évaluations motrices permet de suivre les mêmes animaux dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires. Nous prévoyons d’utiliser 84 animaux adultes, mâles et femelles, sur une période de 5 ans, et nous réutiliserons, lorsque possible, les données d’animaux témoins provenant de protocoles antérieurs. Les animaux seront répartis en différentes catégories : animaux non lésés, animaux ayant subi une chirurgie factice (sham lésion), animaux avec implantation factice (sham-implant), et hémisphères sains des animaux lésés. Le suivi longitudinal de chaque animal permettra d’évaluer la récupération motrice ainsi que les changements observés à l’IRM et en histologie, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le principe fondamental des 5 libertés est strictement respecté tout au long de l’étude. Les rats sont hébergés dans des cages ventilées, par groupes de deux individus (espèce grégaire), dans une salle dédiée exclusivement à cette espèce. L’alimentation est disponible ad libitum, y compris pendant les phases d'entraînement et d’évaluation motrice, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l’état de santé général est assuré par les expérimentateurs et le personnel de zootechnie : les animaux sont pesés chaque semaine et bénéficient de contrôles vétérinaires réguliers. Une attention renforcée est portée aux animaux opérés, qui font l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel formé. Cette surveillance comprend l’observation de l’appétit, du poids, de la mobilité, de l’état du pelage, du comportement général, et s’appuie sur un score clinique. Ce score guide les décisions à prendre : mise en place d’un traitement visant à diminuer la douleur, renforcement du suivi, retrait de l’étude ou mise à mort si nécessaire. La prise en charge de la douleur repose sur des protocoles stricts et validés, en cohérence avec les principes de nociception et leur impact potentiel sur le bien-être animal et la qualité scientifique des données (cf. paragraphe sur les chirurgies). Un enrichissement environnemental est systématiquement mis en place, incluant des éléments cognitivement stimulants (tunnels, boules de fouille, boules traversantes, odeurs naturelles variées…) ainsi qu’une stimulation sociale via une arène de rencontre intercage. les animaux sont conditionnés de manière progressive aux tâches motrices, à l’aide de renforcements positifs. Cette procédure est conçue pour être peu anxiogène et respectueuse du bien-être animal. Le transport des animaux de l’EU 1/2 à l’EU 2/2 (trajet routier de 10 km) est également encadré avec attention. Les cages sont sécurisées pour le transport, les biberons sont retirés afin d’éviter l’humidification de la litière, les animaux ont accès à des croquettes et à une coupelle de nourriture molle, les couvercles sont scotchés pour prévenir toute ouverture accidentelle, les cages sont placées dans des sacs isothermes afin de limiter les variations thermiques, les chocs et les nuisances sonores.
Choix des espèces
Le rat constitue un modèle privilégié pour l’étude de la récupération fonctionnelle de la motricité du membre supérieur après lésion cérébrale et implantation de biomatériaux. En effet, la mobilité et la force du membre antérieur représentent des fonctions motrices essentielles, dont la récupération est déterminante pour l’autonomie des patients cérébrolésés dans les activités de la vie quotidienne. De plus, des tests comportementaux validés et adaptés chez le rat permettent d’évaluer l’amplitude des mouvements, la force musculaire ainsi que la sensibilité des membres supérieurs. Enfin, le suivi longitudinal de la progression tissulaire est réalisé grâce à des examens d’imagerie (IRM) non invasifs, indolores et pratiqués sous anesthésie, garantissant le bien-être de l’animal. Pour l'IRM, la taille du cerveau de rat est privilégiée par rapport à la souris. Les expériences sont conduites sur des animaux adultes âgés d’environ 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et se rapproche de la tranche d’âge à laquelle surviennent majoritairement les AVC ischémiques.
Mise en évidence de gènes clés dans la réplication du parasite responsable du paludisme.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 150
Injectés vigiles avec des globules rouges parasités, 2 822 souris et 150 rats sont ensuite piqués à la queue chaque jour pendant environ huit jours pour un prélèvement d'une goutte de sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur annonce une parasitémie faible et aucun signe clinique attendu, tout en indiquant que le paludisme cérébral peut provoquer des mouvements désordonnés, une paralysie partielle puis un coma irréversible. L'objectif déclaré est d'identifier les gènes qui commandent la multiplication du parasite, une centaine de gènes pouvant désormais être modifiés en une seule expérience. Tous sont tués à la fin de la procédure, leur sang étant prélevé après la mort pour récupérer les parasites.
Objectifs
Malgré de nombreux efforts depuis des décennies, le paludisme reste un problème de santé majeur dans le monde. Il touche environ 100 pays, et 40 % de la population mondiale vit dans des zones à risque. En 2020, on a recensé 241 millions de cas, entraînant 627 000 décès, principalement chez les enfants de moins de 5 ans. Le paludisme est causé par un parasite appelé Plasmodium, qui a besoin de deux hôtes pour survivre : un moustique du genre Anopheles et l’être humain, dans le cas du paludisme humain. Chez ce dernier, le parasite se multiplie dans les globules rouges, provoquant les symptômes de la maladie. Bien qu’il existe des médicaments, leur efficacité diminue à cause de l’apparition de résistances. Il est donc crucial de mieux comprendre ce parasite pour développer de nouveaux traitements. Notre projet vise à étudier comment le parasite contrôle son cycle de vie et se développe dans les globules rouges. Nous cherchons à identifier les gènes clés impliqués dans sa multiplication. Pour cela, nous allons créer des parasites fluorescents, puis les modifier afin de bloquer l’expression de certains gènes. Cela nous permettra de comprendre leur rôle et d’identifier de nouvelles cibles pour lutter contre le paludisme. Nous utiliserons Plasmodium berghei, un parasite qui infecte les rongeurs. Il est très similaire à Plasmodium falciparum, le plus dangereux pour l’Homme. De plus, il permet de mener des expériences en laboratoire qui sont impossibles à réaliser avec Plasmodium falciparum. Grâce à une technique innovante de transformation des parasites, nous pourrons réduire drastiquement le nombre d’animaux nécessaires, tout en obtenant des résultats robustes qui permettront d’ouvrir de nouvelles voies de lutte contre cette maladie toujours aussi dramatique.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels contre le paludisme ne sont plus assez efficaces, car les parasites deviennent de plus en plus résistants. Il est donc urgent de trouver de nouveaux médicaments pour éliminer cette maladie. Pour cela, il faut chercher des solutions innovantes et viser de nouvelles cibles afin de limiter l’apparition de résistances. Notre projet va aider à mieux comprendre la biologie du parasite responsable du paludisme, d’abord chez la souris, puis chez l’Homme.Cette meilleure compréhension pourrait permettre de découvrir de nouveaux moyens de lutter contre le paludisme, surtout dans les pays où la maladie est très présente et où les résistances augmentent.
Procédures
Dans chacune des procédures, les animaux seront infectés par injection de globules rouges parasités. Les animaux sont vigiles ; il s’agit d’une injection unique. Tout au long de l’infection, environ 8 jours, un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue sera réalisé, de manière journalière. Cette procédure ne prend que quelques secondes, et correspond à un prélèvement identique à celui de la glycémie. Finalement, à la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et un prélèvement total du sang sera fait de manière post-mortem. Au total, 2 822 souris et 150 rats seront injectés vigiles, monitorés par prélèvements sanguins et euthanasiés dans cette étude.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un léger stress lors de la contention ainsi qu’une légère douleur lors de l’injection ou du prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue, sur animaux vigiles. Lors de notre étude, nous atteindrons uniquement une faible parasitémie (correspondant au nombre de globules rouges infectés sur la totalité des globules rouges). À ce niveau-là, aucun signe clinique n’est à prévoir. Cependant, dans les cas rares de paludisme cérébral, la parasitémie reste faible, mais les souris peuvent développer des signes cliniques tels que : l’apparition de mouvements du corps désordonnés ou mal contrôlés, puis paralysie partielle allant jusqu’au coma irréversible.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures, pour récupérer le sang contenant les parasites pour la suite des analyses in-vitro.
Remplacement
Plasmodium falciparum est le parasite responsable du paludisme le plus dangereux pour l’Homme. Pour bien comprendre comment il vit et se développe, il faudrait l’étudier directement dans un organisme vivant, mais cela est très difficile. Cependant, il existe un parasite très proche, Plasmodium berghei, qui infecte les rongeurs et que l’on peut étudier de manière in vivo. Cela permet de mieux comprendre le cycle de vie du parasite et donc de pouvoir lutter plus efficacement contre la maladie. Pour cette étude, nous ne pouvons pas remplacer complètement l’étude sur les rongeurs, mais nous faisons d’abord le plus d’expériences possibles en laboratoire pour limiter le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Pour limiter l’utilisation d’animaux dans nos recherches, nous avons mis en place une méthode innovante permettant d’étudier plusieurs gènes en une seule expérience. Plutôt que de tester un gène à la fois, nous pouvons désormais modifier une centaine de gènes en une seule étape, en infectant un seul groupe de souris, réduisant considérablement le nombre d’animaux nécessaires. De plus, Plasmodium berghei infecte systématiquement les rongeurs, ce qui nous permet d’optimiser nos expériences en utilisant le strict minimum d’animaux. Le nombre de rongeurs est calculé en fonction de la quantité de globules rouges infectés dont nous avons besoin pour nos analyses.
Raffinement
Avant l’expérimentation, durant toute la période d'acclimatation d'une durée d'une semaine minimum, les souris sont manipulées de manière journalière pour éviter un stress lors de l'expérience. Lors des expérimentations, les animaux seront manipulés et injectés le plus rapidement possible, de manière à les remettre avec leurs congénères rapidement, et ainsi éviter un trop grand stress d’isolement. Lors de notre étude, nous nous limiterons à de faibles taux de parasitémie. Cela nous permettra d’obtenir une quantité de parasites suffisante pour une étude robuste, tout en évitant l’apparition de signes cliniques chez l’animal. Les animaux seront monitorés de manière journalière, l'observation de leur comportement ainsi qu'un examen clinique sera retranscrit sur une grille de score, que nous avons établi préalablement, et qui permettra de s'assurer de leur bonne santé. Cette grille comporte des critères considérés comme points limites, s’ils sont atteints les animaux seront immédiatement euthanasiés, afin d'éviter toute souffrance animale
Choix des espèces
Les recherches sur Plasmodium falciparum nécessitent généralement des modèles animaux complexes, comme certains singes ou des souris génétiquement modifiées, qui sont rares, difficiles à élever et très coûteux. Grâce à un génome très proche de ce dernier, nous pouvons utiliser Plasmodium berghei, qui infecte naturellement les rongeurs, pour mieux comprendre le paludisme humain. De plus, ces parasites murins ne présentent aucun risque pour l’Homme et ne se transmettent entre rongeurs que par la piqûre de moustiques Anopheles, absents en France métropolitaine. Nous utilisons des souris et des rats âgés de 8 à 12 semaines, car à cet âge, ils sont assez développés pour fournir un volume de sang suffisant pour nos analyses, tout en restant en bonne santé pour supporter l’infection.
Etablissement d’une lignée zébrafish mutante pour l’étude du rôle des immunoglobulines de type D dans la réponse immunitaire.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privés du gène de l'immunoglobuline D par ciseaux moléculaires, les poissons zèbres créés dans ce projet perdent une partie de leurs défenses et deviennent plus sensibles aux infections. 900 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit un génotypage par section d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, geste de moins de deux minutes qui peut réduire son activité de nage et modifier sa prise alimentaire dans la journée. Seuls 50 hétérozygotes de la première descendance sont maintenus pour produire la génération suivante, dont les œufs partiront vers un autre laboratoire pour y être infectés par des virus, les 850 autres étant tués.
Objectifs
Malgré la conservation évolutive dans le système immunitaire de l'immunoglobuline D (IgD), les fonctions spécifiques de cette Immunoglobuline restent une énigme. Le rôle précis de l'IgD lorsqu'elle est exprimée avec d'autres immunoglobulines à la surface des cellules immunitaire (cellules B) n'a été clarifié ni chez les poissons ni chez les mammifères. On pense que l’IgD joue un rôle important dans les muqueuses mais son rôle exact n’est pas encore bien compris. Pour mieux comprendre la fonction de l’IgD nous allons utiliser le modèle poisson zébrafish qui produit aussi ces immunoglobulines D au niveau des cellules immunitaires B. Pour cela, nous créerons deux lignées de poissons-zèbres dont le gène de l’IgD aura été inactivé grâce à la technique des ciseaux moléculaires : les Crispr/Cas9. Dans un deuxième temps et dans un autre laboratoire (nouvelle demande d'autorisation de projet), les poissons mutants seront soumis à des infections virales afin d’étudier les effets de l’absence d’IgD sur leur système immunitaire.
Bénéfices attendus
Malgré la conservation évolutive de l'IgD, les fonctions spécifiques de cette immunoglobuline restent une énigme. C'est pourquoi la génération de mutants de poisson zèbre dépourvus de l'expression de l'IgD serait un outil extrêmement précieux pour comprendre le rôle de l'IgD à la fois lorsqu'elle est sécrétée et lorsqu'elle est co-exprimée avec l'IgM à la surface des cellules. Plus précisément, cela nous permettrait de déterminer comment l'absence d'IgD affecte la réponse immunitaire aux agents pathogènes qui pénètrent dans l'hôte par les voies muqueuses et comment elle conditionne la réponse IgM. Le fait de disposer de ces poissons sera déterminant pour clarifier le rôle immunitaire de cette immunoglobuline énigmatique.
Procédures
Ce projet concerne uniquement la création de 2 lignées mutantes n'exprimant pas le gène de l'immunoglobuline. Pour l'établissement de ces lignées, une procédure de génotypage (section d'un fragment de nageoire caudal) sera réalisé sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l'anesthésie et de la récupération à l'anesthie du poisson compris.
Impact sur les animaux
L’inactivation du gène codant l’IgD peut entraîner une altération des fonctions immunitaires. Ainsi: la reconnaissance des microbes et la régulation des cellules immunitaires sont altérées.Les animaux pourraient être un peu plus sensibles aux infections ou au stress environnemental. Cependant, d’autres anticorps (comme l’IgM) peuvent compenser partiellement cette absence, donc les effets ne sont pas toujours graves, mais ils peuvent apparaître dans certaines conditions (infection, changement d’environnement, etc.). Le génotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l'activité de nage. L’anesthésie pratiquée pour le prélèvement de fragment de nageoire peut aussi entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.
Devenir
Ce projet vise à créer 2 lignées mutantes pour étudier le fonctionnement du système immunitaire après l’inactivation de l’Immunoglobuline D. Seuls les 2 x 25 animaux hétérozygotes de la première descendance seront maintenus en vue de la production de la descendance suivante.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du fonctionnement du système immunitaire. Il n’existe donc pas d’alternative à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène IgD dans la fonction des cellules B du système immunitaire et les interactions avec les autres cellules immunitaires.
Réduction
In fine, il s’agit de créer 2 lignées pures (dans la descendance de 2ème génération) présentant une inactivation du gène de l'immunoglobuline D. Pour cela, par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus de la porteurs de mutations intéressantes (génération fondatrice). Au maximum 150 de ces individus atteindront le stade adulte selon les chiffres habituels. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygotes (possédant des copies de gènes différentes) en descendance de 1ère génération lorsque les animaux fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype naturel. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes de la génération de 1ère descendance produira une descendance de deuxième génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif obtenu). Après validation de chacune des lignées, nous produirons et conserverons un minimum de poissons respectant dans le même temps la demande en œufs de cette descendance pure contenant 100 homozygotes mutants complets.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce. Les différents paramètres de suivi sont relevés quotidiennement. Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en densité optimale . Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique de IgD) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien-être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la SBEA sera immédiatement avertie. La procédure de génotypage (permettant d'estimer le taux de mutants) qui consiste en un prélèvement de fragment de très petite taille durera moins de 2 minutes, temps d'anesthésie et réveil du poisson compris.
Choix des espèces
La demande concerne la fourniture de 2 lignées zébrafish présentant une inactivation de gène en vue de test infectieux. Le zébrafish est un poisson osseux qui possède un système immunitaire adaptatif fonctionnel. Le zébrafish exprime les immunoglobulines communes aux mammifères. Dans le cas de zébrafish présentant une mutation de gène, cela permet de réaliser des cribles en conditions infectieuses à grande échelle, ce qui est non réalisable chez les mammifères. De plus, le poisson zèbre est une espèce chez laquelle les outils d’édition de génome peuvent être appliqués de manière simple en raison du très fort taux de fécondité chez cette espèce et du développement rapide : 1 animal mature sexuellement peut être obtenu en 3 mois. Il est possible de produire beaucoup d’individus avec un gène inactivé plus rapidement que chez d’autres modèles vertébrés. Les animaux seront utilisés au stade adulte (pour la génération fondatrice et les animaux de 1ère génération) pour la création de lignée puis les œufs de la 2ème génération seront fournis au demandeur pour la suite des expérimentations (tests ultérieurs d’infection virale non réalisés par notre laboratoire). Au préalable, une vérification du taux de transmission de la mutation sera faite sur des alevins de la 2ème génération âgés de 1 mois. Cela permettra aussi de vérifier la qualité phénotypique et comportementale des individus cette 2ème génération.