Procédures modérées

Une prostration, une déshydratation sévère ou une perte de poids importante peuvent conduire à la mise à mort d'un poulet avant la fin de l'essai. 15 poulets âgés de onze semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués une fois leur réponse en anticorps obtenue. Ils sont infectés par voie orale par Salmonella Gallinarum, agent de la typhose aviaire, puis subissent jusqu'à neuf prises de sang d'environ 1 mL à la veine de l'aile, sans médication contre la douleur prévue. Leur sérum sert à fabriquer un témoin positif pour les contrôles sanitaires obligatoires des élevages, en quantité calculée, selon le porteur, "sur la base des données de production et de vente" pour couvrir cinq ans.

Objectifs

La pullorose et la typhose aviaire sont des maladies infectieuses qui peuvent être dues à certaines Salmonella, il s’agit de maladies septicémiques qui affectent principalement les poulets et qui présentent une obligation de déclaration, de surveillance et de certification. Ce projet consistera en un protocole d’infection expérimentale conduit en animalerie protégée sur poulets afin d’obtenir des sérums positifs contre Salmonella.

Bénéfices attendus

Cette procédure doit permettre la production d’un sérum de référence positif vis-à-vis de Salmonella Gallinarum chez le poulet. Ce sérum (qui sera constitué de l’ensemble des différents sérums individuels obtenus par infection expérimentale sur poulets) permettra de valider (témoin positif) les tests sérologiques pour la technique d'agglutination rapide sur lame réalisés dans les contrôles sanitaires des élevages par les laboratoires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention d'une durée inférieure à 5 minutes lors de l’inoculation par voie orale de S. Gallinarum, lors des pesées des animaux ou des prises de sang. Les prises de sang, au maximum neuf, consistent en un prélèvement d’environ 1 mL au niveau de la veine alaire. Les prélèvements seront réalisés en alternance sur les deux ailes afin de limiter les sollicitations répétées d’un même site de prélèvement. Ces actes seront réalisés par des personnels expérimentés, toujours les mêmes, pour limiter au maximum le stress et la douleur chez les animaux.

Impact sur les animaux

La pullorose et la typhose aviaire sont des maladies infectieuses dues à Salmonella enterica enterica serovar Gallinarum (biovar Pullorum ou Gallinarum respectivement). Ces maladies septicémiques affectent principalement les poussins, les jeunes dindonneaux et faisandeaux et sont responsables d’une mortalité en coquille ou après l’éclosion. La maladie est moins grave chez les oiseaux plus âgés, c’est pourquoi il a été choisi des animaux agés de 11 semaines dans cette procédure. Bien que la mortalité puisse être élevée, les signes cliniques peuvent etre d'intensité variable, chez les adultes. Les animaux contaminés peuvent présenter une baisse de l'activité, une diminution de la consommation d'aliment et d'eau, un retard de croissance, un plumage ébouriffé, de la diarrhée et une déshydratation. Cet essai provoquera une phase de stress et de douleur légère qui seront générées par l’inoculation de la souche de Salmonella Gallinarum et les prélèvements réalisés chaque semaine sur les animaux (prises de sang). Cette douleur légère et passagère sera directement liée à l'acte de piqure qui est subie par l'animal : aucun protocole de médication particulière n'est prévu. L’inoculation et les prises de sang seront réalisées par des personnels expérimentés dans la réalisation de ces actes pour limiter au maximum leur stress et la douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort lorsqu'ils auront développé une réponse sérologique spécifique de Salmonella Gallinarum à la fin de l’essai.

Remplacement

La production de sérums de référence est nécessaire pour la validation des contrôles sanitaires obligatoires effectués dans les élevages. Cette production de sérum positif Salmonella Gallinarum ne peut être réalisée que sur espèces cibles (poulets) car il n’existe malheureusement pas, à ce jour, de méthodes alternatives de production de sérums expérimentaux spécifiques.

Réduction

L’expérience acquise a permis de limiter le nombre d’animaux utilisés, ainsi que le nombre d’interventions sur ces animaux. La quantité d’animaux à utiliser a été calculée au plus juste pour produire une quantité de sérum positif suffisante pour 5 ans. Nous espérons récolter entre 8 et 10 ml de sérum par animal. Toutefois, les titres en anticorps sont variables d’un animal à l’autre, et dans certains cas les titres peuvent être trop faibles, voire nuls. Ainsi, sur la base des données de production et de vente, une infection expérimentale de 15 poulets permet de récolter environ 100 ml de sérum positif, quantité utilisée par les laboratoires sur une période de 5 ans. L’objectif de l’étude étant la production et la caractérisation d’un sérum positif de référence, celle-ci ne nécessite pas d’analyse statistique.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Les 15 poulets inclus dans cette procédure expérimentale seront hébergés à l'âge de 7 semaines dans leur nouvel environnement et bénéficieront d’une période d'habituation de 4 semaines afin de favoriser leur adaptation et de limiter le stress lié au changement d'environnement. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). En plus de la litière, qui sera maintenue sèche et friable (renouvellements d’air important), il sera ajouté des cordes suspendues et des plateformes de perchage en grillage. Un suivi des animaux sera mis en place pendant toute la durée de l’essai, les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge. Les paramètres zootechniques (pesées des animaux au démarrage de l’essai, avant l’inoculation et avant chaque série de prélèvement ; suivi de la consommation d’aliment et d’eau) seront pris en compte tout au long de l’essai. Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les pesées, les prises de sang et l’inoculation individuelle des animaux seront réalisées conjointement par deux personnes habilitées dans le but de réduire la durée de la contention et de l’intervention sur l’animal afin d’en diminuer le stress induit. Les points limites sont définis afin de prévenir toute souffrance importante. Une surveillance régulière des animaux permettra de détecter une aggravation de leur état. Les signes attendus d’intensité légère à modérée et transitoire (baisse d’activité, diminution de la consommation, plumage ébouriffé, diarrhée légère, déshydratation légère) seront surveillés. Une altération importante de l’état général, une prostration, une déshydratation sévère, une incapacité à s’alimenter ou à boire, une perte de poids importante ou tout signe de souffrance sévère constitueront des points limites et entraîneront une prise en charge adaptée, pouvant aller jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les poules (Gallus gallus) constituent l'espèce la plus pertinente pour la production de sérums positifs dirigés contre Salmonella Gallinarum, car elles représentent l'hôte naturel et la principale espèce cible de ce pathogène. Les animaux mis en place auront 7 semaines d’age, et la procédure commencera lorsqu’ils seront agés de 11 semaines, afin de permettre une réponse immunitaire des animaux suffisament importante, mais également de réduire les risques de symptomes et d’effets indésirables de la maladie chez ces animaux.

Pour savoir si un élément issu d'anciens virus intégrés au génome freine la croissance des tumeurs, 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une implantation de cellules tumorales, puis, pendant six semaines au plus, deux mesures de la tumeur et deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine, avec épilation de la zone. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une tension de la peau, une baisse de mobilité et une dissémination à d'autres tissus. Les souris sont mises à mort plus tôt en cas de tumeur trop volumineuse, d'ulcération, de perte de poids ou de douleur.

Objectifs

Certains éléments présents dans notre génome proviennent d’anciens virus intégrés au cours de l’évolution. Ces éléments sont généralement inactifs, mais certains peuvent encore produire des molécules capables d’influencer le comportement des cellules. Nos travaux suggèrent que l’un de ces éléments pourrait jouer un rôle protecteur en limitant certaines propriétés des cellules tumorales. L’objectif de ce projet est de déterminer si la restauration de cet élément dans des cellules tumorales modifie leur capacité à former une tumeur et à progresser dans un organisme vivant. Pour cela, des cellules tumorales de souris seront modifiées en laboratoire, puis implantées chez des souris. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps par des mesures externes et par une méthode d’imagerie permettant de suivre les mêmes animaux de manière répétée. Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent influencer la progression tumorale et les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre certains mécanismes biologiques qui influencent la croissance et la progression des tumeurs. En particulier, il vise à déterminer si certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent contribuer à limiter le développement tumoral. Les résultats attendus pourraient apporter de nouvelles connaissances sur les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans l’organisme. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de recherche pour mieux comprendre les mécanismes qui freinent ou favorisent la progression des cancers.

Procédures

Tous les animaux recevront une seule implantation de cellules tumorales, réalisée sous anesthésie brève. Cet acte durera environ 5 à 10 minutes par animal, incluant l’anesthésie, l’implantation des cellules et la surveillance immédiate du réveil. La croissance des tumeurs sera ensuite suivie deux fois par semaine pendant 6 semaines maximum. Ce suivi comprendra une mesure externe de la tumeur, d’une durée d’environ 1 à 2 minutes par animal. Les animaux seront également suivis par imagerie deux fois par semaine. Pour cette imagerie, ils recevront un agent permettant de visualiser les cellules tumorales, puis seront placés sous anesthésie brève pendant l’acquisition des images. La durée totale d’une session d’imagerie sera d’environ 30 minutes par animal, incluant l’administration de l’agent d’imagerie, l’anesthésie, l’acquisition des images et la surveillance du réveil. Une épilation locale pourra être réalisée afin d’améliorer la qualité de l’imagerie. Elle sera limitée à la zone nécessaire et ne sera renouvelée qu’en cas de repousse gênant l’acquisition du signal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des cellules tumorales, aux manipulations répétées nécessaires au suivi, aux anesthésies brèves réalisées pour l’imagerie, ainsi qu’au développement de la tumeur. Les animaux pourront présenter une gêne transitoire au moment de l’implantation des cellules ou lors des manipulations. Le suivi par imagerie pourra entraîner un stress modéré lié à la contention, à l’anesthésie et aux manipulations répétées. Une irritation locale de la peau pourra également survenir après l’épilation limitée à la zone à imager. La croissance de la tumeur pourra provoquer une gêne locale, une tension de la peau, une masse palpable, une diminution de la mobilité selon la taille et la localisation de la tumeur, ou plus rarement une altération de l’état général. En cas de progression tumorale importante, une dissémination à d’autres tissus pourrait également contribuer à une dégradation de l’état général. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation. Cette mise à mort est nécessaire car le projet repose soit sur le suivi complet de la croissance tumorale, soit sur le prélèvement des tumeurs et de certains tissus pour réaliser des analyses biologiques. Ces prélèvements permettront d’étudier les caractéristiques des tumeurs, leur organisation, leur activité moléculaire et leurs interactions avec leur environnement dans l’organisme. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés dans un autre projet. Les animaux seront mis à mort au plus tard 6 semaines après l’implantation des cellules tumorales, ou plus tôt pour les groupes destinés à des prélèvements à des temps définis. Ils seront également mis à mort avant la fin prévue de l’étude si des critères d’arrêt sont atteints, notamment en cas de tumeur trop volumineuse, d’ulcération, de perte de poids, de douleur, de gêne locomotrice ou d’altération importante de l’état général.

Remplacement

Avant d’envisager cette étude chez l’animal, les cellules tumorales sont étudiées en laboratoire afin de caractériser leurs propriétés et de sélectionner les conditions les plus pertinentes. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas d’étudier correctement la croissance d’une tumeur dans un tissu, ses échanges avec les cellules environnantes, son accès aux nutriments, ni ses interactions avec le système immunitaire. Ces éléments sont pourtant essentiels pour comprendre comment une tumeur se développe et progresse dans l’organisme. Il n’existe donc pas, pour cette question, de méthode alternative permettant de remplacer complètement l’utilisation d’animaux. Le recours à la souris est nécessaire pour valider les observations obtenues en laboratoire dans un contexte biologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables, tout en évitant l’utilisation d’effectifs excessifs. Les groupes ont été dimensionnés afin de comparer plusieurs types de cellules tumorales et de tenir compte de la variabilité naturelle de la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sera suivie plusieurs fois chez les mêmes animaux, grâce à des mesures externes et à une méthode d’imagerie répétée au cours du temps. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux, car elle évite de constituer de nouveaux groupes uniquement pour suivre l’évolution des tumeurs à chaque étape. Une première série d’animaux permettra de définir les moments les plus pertinents pour les prélèvements biologiques. Cette stratégie évite de multiplier inutilement les temps d’analyse dans la seconde série et limite ainsi le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début de l’expérience afin de réduire leur stress. Les actes susceptibles d’être inconfortables seront réalisés sous anesthésie brève, avec protection systématique des yeux pendant l’anesthésie. Après chaque anesthésie, les animaux seront surveillés jusqu’à récupération d’un comportement normal, puis replacés dans leur cage d’origine. La croissance tumorale sera suivie régulièrement pendant 6 semaines maximum, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt. L’état général des animaux, leur poids, leur mobilité, leur alimentation, l’aspect de leur pelage et l’aspect de la tumeur seront contrôlés tout au long de l’étude. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas de perte de poids modérée ou de diminution de l’alimentation, une aide alimentaire sera mise en place. Si l’état de l’animal se dégrade ou si un critère d’arrêt est atteint, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle permet d’étudier le développement d’une tumeur dans un organisme vivant complet. Ce modèle permet de prendre en compte des éléments qui ne peuvent pas être correctement reproduits en culture cellulaire, comme l’organisation des tissus, les interactions entre la tumeur et les cellules environnantes, l’accès aux nutriments et les interactions avec le système immunitaire. Les cellules utilisées dans ce projet sont des cellules de souris. Les implanter chez des souris permet donc d’étudier leur comportement dans un environnement biologique adapté, sans introduire de différence d’espèce qui pourrait fausser l’interprétation des résultats. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune, à partir de 6 semaines. À cet âge, les souris sont sevrées, suffisamment développées pour permettre des manipulations reproductibles et disposent d’un système immunitaire fonctionnel. L’utilisation d’animaux plus jeunes serait moins adaptée en raison de leur développement encore en cours, de leur plus petite taille et de la difficulté accrue des manipulations répétées. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines maximum après l’implantation des cellules tumorales, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt.

Un microbiote administré par la bouche au premier jour de vie, puis le parasite Eimeria tenella vers deux semaines d'âge : 128 poussins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à J14 ou J21 pour prélever leurs cæcums. Le projet compare trois microbiotes face à la coccidiose, et le bénéfice attendu pour les poussins supplémentés se mesure en "meilleures performances zootechniques", pour une filière qui chiffre ses pertes à plus de 1,5 milliard d'euros par an. Le résumé mentionne aussi une pose de puces sous anesthésie, sans dire où ni pourquoi. Le porteur justifie le choix du poulet par le parasite, qui n'infecte que cette espèce.

Objectifs

Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques (>1,5 milliards d’euros/an dans le monde). Ces maladies sont provoquées par des parasites, Eimeria. La prophylaxie repose sur l’utilisation d’anticoccidiens et sur la vaccination. Le coût élevé des vaccins, l’apparition de résistances aux anticoccidiens et la demande des consommateurs pour limiter l’utilisation des anticoccidiens et des antibiotiques nécessitent le développement de nouveaux moyens de lutte plus naturels. Dans cet objectif, notre ambition est d'utiliser la modulation du microbiote pour atténuer la sévérité de la pathologie liée à l'infection par Eimeria. Comme nous l’avons décrit précédemment, nos résultats mettent en évidence un rôle du microbiote et/ou ses métabolites sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella incluant le développement du parasite E. tenella et sur la réponse inflammatoire associée à l’infection. La nature des bactéries et/ou leur métabolites impliqués dans cet effet restent encore à déterminer.Dans ce projet, nous comparerons différents microbiotes (témoin, adulte, commercial) sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella. Nous évaluerons l'effet de ces différentes compositions microbiennes caecales sur le développement des parasites, la formation de lésions et la réponse inflammatoire. La composition du microbiote et du métabolome seront déterminés avant l’infection expérimentale. Ensuite, les corrélations entre la composition du microbiote, ses fonctions et des paramètres d'infection seront déterminées pour détecter quel(s) microorganisme(s) sont impliqués dans le cas de pathologies plus ou moins sévères. Ce projet fournira des indications pour le développement d'un microbiote limitant les conséquences négatives de l'infection.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que les animaux supplémentés résistent mieux à l’infection (effet anticoccidien) et présentent par conséquent de meilleures performances zootechniques, moins de lésions, moins d’inflammation, moins développement parasitaire. Si l’administration d’un microbiote ne présente pas d’effet, les animaux présenteront des charges parasitaires et des paramètres lésionnels similaires à ceux du groupe témoin.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux administrations orales : une de microbiote et une du parasite Eimeria. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux. Chaque intervention dure environ 30 secondes à 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. Une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite, ni des signes cliniques sévères. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux.

Devenir

A J14 et J21, l'euthanasie des animaux est prévue pour des prélèvements des caeca et mesures de différents paramètres (parasitaire, inflammatoire, microbiote, métabolites).

Remplacement

L’agent pathogène Eimeria tenella responsable de la coccidiose a un spectre d’hôte restreint : il infecte exclusivement le poulet Gallus gallus. L’étude de l’influence du microbiote sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella nécessitent des expérimentations in vivo pour lesquelles des analyses des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, et du microbiote intestinal seront réalisées.

Réduction

Le nombre de 128 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Les effectifs sont basés sur les études de la littérature portant sur les analyses de microbiote lors de supplémentations pour avoir une différence significative.

Raffinement

Aucune étude in vitro n’a été réalisée en amont de ce projet, la pathologie étudiée et le cycle parasitaire ne pouvant être reproduits de manière pertinente qu’in vivo. Les poulets seront hébergés dans des conditions environnementales contrôlées et disposeront d’un enrichissement social et comportemental (dans des petites salles séparées au sol : petites rondelles en inox suspendues ou du bolduc suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans, des perchoirs qui apporte un enrichissement qui fait partie du comportement naturel et de la litière favorisant le grattage (litière de miscanthus pour éviter les poussières). Ils seront hébergés en groupe de 32 poussins, au sol, dont la température est régulée (ajout le lampe chauffante) avec aliment et eau ad libitum ainsi qu’un éclairage 12h/24h. Pour la pose de puces, l'anesthésie gazeuse flash dure quelques minutes et récupération très rapide des animaux, qui sont remis en lot dans la foulée. Pas de gène visible, ni de modification d’interactions entre les poussins. Limitation des nuisances sur le bien-être animal : Évaluation de l’état de santé des animaux deux fois par jour par le personnel de la plateforme expérimentale. Si atteinte du point limite : euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Les poussins à statut sanitaire protégé et contrôlé seront utilisés et seront l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. L'éclosion constituant une fenêtre unique pour l'implantation de bactéries et l'amélioration précoce des fonctions intestinales, l'implantation de bactéries pour améliorer précocement les fonctionnalités de l'intestin sera réalisée juste après l’éclosion (1er jour d’âge). Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à environ 2 semaines d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire.

Tous tués à l'issue, 1 500 rongeurs, 1 200 souris et 300 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des anticancéreux sur des tumeurs greffées dans le pancréas. Une partie subit une irradiation totale du corps avant la chirurgie qui implante la tumeur, puis jusqu'à quatre administrations par jour et des prises de sang répétées à la jugulaire, à la saphène ou à la queue. La tumeur peut provoquer une occlusion intestinale, un envahissement de l'abdomen et de l'ascite, et le gavage, rarement, une détresse respiratoire jusqu'à la mort. Le porteur juge le statut immunodéprimé de ces rongeurs "indispensable" à la greffe de cellules tumorales humaines, et ne donne aucune raison à leur mise à mort, annoncée en une phrase de quatre mots.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. Le cancer du pancréas, bien que ne représentant que 2.6% des diagnostics chaque année, est le sixième plus mortel et présente un très fort taux de mortalité (plus de 490 786 décès en 2024 pour environ 531 318 nouveaux cas) selon l’organisation mondiale de la santé (WHO). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer pancréatiques, les plus prédictifs possible, en condition orthotopique (présentant l’avantage d’inclure le microenvironnement tumoral aux études) afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs pancréatiques chez l’humain. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme afin d’arriver, avant les essais cliniques chez l’humain, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’Homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Le cancer du pancréas est le onzième cancer le plus diagnostiqué mais il est le sixième en termes de mortalité. Cette maladie très meurtrière nécessite donc un développement important de nouvelles stratégies pour la prise en charge des patients. Cela nécessite l’établissement de nouveaux modèles précliniques plus prédictifs afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme. Environ 90% des tumeurs pancréatiques présente une mutation dans le gène KRAS. L’essor récent des inhibiteurs de KRAS en clinique ouvre de nouveaux espoirs dans la prise en charge de cette maladie. Cependant, des mécanismes de résistance se développent et nécessitent d’être compris afin d’adopter des stratégies pour surpasser ces phénomènes de résistance. Dans ce contexte, le développement de nouveaux modèles précliniques, tout particulièrement orthotopiques, est incontournable pour le développement de futures molécules en préclinique puis en clinique chez les patients. L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Les études précliniques sur l’animal permettront d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique et de développer de nouvelles stratégies pour contourner ces phénomènes de résistance. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie dans le but de stimuler le système immunitaire contre le cancer. Cela pourrait permettre d’évaluer des immunothérapies dans le cancer du pancréas ce qui n’est pour le moment pas une pratique clinique approuvée.

Procédures

Différents types d’interventions sont prévus: • Irradiation totale avant induction tumorale: nécessite le transport des animaux et leur déplacement temporaire (1 à 2 fois par étude ; inférieur à 4h) • Induction tumorale : sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). • Imagerie non invasive (sous anesthésie pour une durée maximale d’1 heure. • Traitements par différentes voies d’administration (limité à 4 administrations par jour) : o Orale sur animaux vigiles (moins d’1 min) o Sous-cutanée sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intramusculaire sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intrapéritonéale sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intraveineuse sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) • Prélèvements sanguins effectués par voies : o Jugulaire (3 prélèvements par jugulaire/jours) (moins d’1 min) o Saphène (3 prélèvements par coté sur 24h) (moins d’3 min) o Caudale (2 prélèvements / 24h), (moins d’1 min) • Volume tumoral évalué par palpation des tumeurs nécessitant la contention des animaux (inférieur à 30 secondes) • Prélèvements d’urine réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention.

Impact sur les animaux

En cas d’irradiation, le transport peut engendrer un stress modéré pendant quelques heures (moins de 4h). La greffe tumorale peut engendrer une douleur et un stress modérés sur 1-2j. Lors de l’induction tumorale, un risque de phase septique à la réalisation des sutures est possible pouvant entrainer des douleurs abdominales et un stress pendant 3-4 jours. L’évolution de la tumeur peut entraîner une douleur généralement modérée (d’intensité variable selon chaque individu), une gêne, une occlusion intestinale, un envahissement de la cavité abdominale, de l’ascite et une perte de poids. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral peuvent entraîner un faible stress qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela peut engendrer un stress de 1-2j. Des effets locaux liés aux voies d’administration des traitements par piqûre peuvent survenir. Selon la voie utilisée, ce peut être : irritation / inflammation / œdème / rougeur / sensibilité / douleur transitoire / hématome ou plus rarement nécrose / une ulcération. Lors d’un gavage oral, une irritation de la cavité buccale, de l’œsophage ou de l’estomac, peut être observée. L’intensité de ces effets dépend de la dose administrée, du composé et de la fréquence. Les administrations répétées peuvent entraîner un stress cumulatif, généralement limité à la durée de la phase expérimentale. Le gavage oral peut provoquer un stress aigu temporaire et, rarement, une détresse respiratoire voir le décès de l’animal. Les administrations répétées peuvent majorer ce stress sur plusieurs jours à plusieurs semaines. Les prélèvements sanguins, peuvent induire une gêne ou une douleur légère de courte durée au point de prélèvement. Des prélèvements répétés peuvent entraîner un stress cumulatif et un impact physiologique limité. Les prélèvements d’urine et de fèces sont considérés comme peu invasifs et associés à un stress modéré lié à l’isolement temporaire. Les prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie comportent un risque anesthésique ponctuel limité à la durée de l’intervention. Les procédures seront réalisées dans des conditions contrôlées, avec une surveillance adaptée, l’application de points limites précoces et des mesures visant à réduire la douleur, la détresse et toute souffrance inutile.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais ne sont pas suffisantes.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. Il est estimé que 40 études seront réalisées sur 5 ans. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 10 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés minimum 2 fois par semaine. Le volume tumoral sera estimé, minimum 2 fois par semaine par palpation ou 1 fois par semaine par imagerie. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids sera supérieure à 10%. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages. La greffe de tumeur sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse avec administration préalable d’un analgésique opiacé. L’implantation de la greffe nécessitera l’incision de la peau, la chirurgie sera réalisée de façon aseptique et les animaux recevront une injection d’anti inflammatoire non stéroïdien en préopératoire ainsi que le lendemain, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Toutes les procédures invasives et la plupart des procédures peu invasives, seront réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés dont les compétences ont été validées. Les administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire et intradermique) seront réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal sera mis en observation et un traitement sera mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, (souris et rats) ont été choisis en raison de leurs caractéristiques physiologiques bien documentées et de leur utilisation largement reconnue en recherche préclinique. De plus ce sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Également, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique chez l’humain. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront des animaux adultes ou ayant atteint un stade de développement compatible avec les procédures expérimentales, avec une première manipulation réalisée à partir de 7 semaines d’âge. Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets de la chirurgie, les effets secondaires des composés à tester et les effets du développement tumoral.

196 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes celles opérées sont tuées pour prélever leur cerveau. Avant quatre jours de vie, les souriceaux reçoivent une injection de virus dans le cerveau, séparés de leur mère jusqu'à deux heures, puis une seconde injection cérébrale de trente à quarante-cinq minutes entre 24 et 28 jours. Le projet vise à démontrer chez un mammifère un mode de transport des vésicules dans les neurones, surnommé "Sushi-go-round", et ses retombées sur les maladies du système nerveux restent au conditionnel. Le porteur désigne le "cannibalisme maternel" comme le "plus gros problème" de ses procédures, et le résumé ne dit pas ce que deviennent les mères.

Objectifs

Comment les cellules du cerveau (les neurones) peuvent-elles réagir si rapidement aux signaux, alors qu'il faut parfois des minutes, voire des heures, pour que les molécules voyagent d’une cellule à l’autre? Grâce à l’utilisation de techniques in vitro et à la modélisation mathématique, nous avons découvert un nouveau mode de transport cellulaire expliquant comment le signal se transmet de façon rapide et efficace le long des connections cérébrales. Ces résultats, obtenus in vitro sur culture cellulaire de neurones, nécessitent maintenant d’être validés in vivo afin de démontrer la pertinence physiologique de ce nouveau mécanisme dans le cerveau de mammifère. Pour cela, nous proposons d’exprimer une molécule fluorescente dans le cerveau de souris adultes qui sera transportée le long des connections cérébrales. Nous bloquerons ensuite le mécanisme de transport en injectant un inhibiteur que nous avons identifié. Nous analyserons ensuite la localisation de la molécule fluorescente après fixation des tranches de cerveau. Si le nouveau mode de transport que nous avons découvert existe in vivo, nous devrions observer une accumulation de la molécule fluorescente au niveau des points de contact avec les neurones cibles. Ces travaux permettront ainsi de démontrer comment les neurones gèrent leur communication pour la transmission rapide et efficace du signal à travers le cerveau.

Bénéfices attendus

Le transport des vésicules dans les neurones est un processus essentiel qui permet de déplacer des protéines importantes du corps cellulaire vers les zones de communication entre les neurones, appelées synapses. Dans une étude précédente, nous avons découvert un nouveau mode de transport que nous avons surnommé "Sushi-go-round", qui joue un rôle dans la régulation de ces communications. Ce projet va nous permettre de prouver l'exitence de ce mode de transport chez les mammifères, ce qui nous aidera à mieux comprendre comment les neurones communiquent et s'adaptent. Ces découvertes pourraient avoir des implications majeures en neurosciences, en nous aidant à mieux saisir le fonctionnement du cerveau et en ouvrant de nouvelles voies pour comprendre les maladies qui affectent le système nerveux.

Procédures

Dans cette étude, des souris, qui n'ont même pas encore quatre jours de vie, vont recevoir une injection de virus dans une zone du cerveau. Cette opération dure entre 10 et 20 minutes. Pendant ce temps, les souriceaux seront séparés de leur mère pour un maximum de deux heures. Ensuite, quand ils seront âgés entre 24 et 28 jours (après sevrage), ils subiront une autre injection dans une autre partie précise de leur cerveau. Cette deuxième opération prendra un peu plus de temps, entre 30 et 45 minutes. Après un temps défini dans l’étape 0 du projet, les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux pour analyse.

Impact sur les animaux

- stress : Les souris nouveau-nés (P0-P4) et leurs mères seront séparés momentanément (120min maximum) donc cela engendrera du stress. -anesthésie : risque de déshydratation, dépression cardio-vasculaire et respiratoire, hypothermie. Après l’injection des nouveaux nés, un suivi de l’animal sera mis en place tous les jours pendant une semaine pour vérifier l’apparition de signes de souffrance (peau de couleur bleutée, vocalisation, changement de la respiration abdominale). Concernant les animaux sous chirurgie, un suivi postopératoire sera également mis en place pendant les 4h de traitement (Agité ou très immobile, vocalisation ou automutilation, Augmentation de la fréquence et de la respiration abdominale), jusqu’à leur mise à mort. Un traitement analgésique en sous cutané sera utilisé en présence de signes de souffrance.

Devenir

Tous les animaux ayant subis une chirurgie seront mis à mort pour les prélèvements.

Remplacement

Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une recherche précédente qui a été réalisée dans notre laboratoire, où nous avons découvert un nouveau moyen par lequel les cellules nerveuses peuvent communiquer rapidement entre elles. . Ces résultats proviennent d’analyse à partir de culture de cellules de souris. Maintenant, nous devons vérifier si ce même processus se produit dans un organisme vivant, la souris. C'est pourquoi nous ne pouvons pas nous passer de ce modèle animal pour nos prochaines étapes de recherche.

Réduction

Pour réaliser nos expériences, nous devons déterminer combien de souris nous avons besoin. Cette décision est basée sur des études précédentes, ce qui nous aide à garantir que nos résultats seront fiables et reproductibles. Nous avons prévu d'utiliser 15 souris par groupe pour certaines analyses, en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour une autre partie de notre étude, qui concerne l'activité électrique des neurones, nous utiliserons 10 souris par groupe. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires tout en assurant que nos résultats soient cohérents, nous allons d'abord tester les paramètres d'injection des virus. Cela nous permettra d'optimiser nos méthodes avant de commencer les expériences principales.

Raffinement

Lors de la chirurgie, les souriceaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. La croissance pondérale est le principal marqueur de bonne santé chez les nouveau-nés puisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir et que la mère s'occupe bien de lui. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).

Choix des espèces

Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle du transport axonal. Nous utiliserons des souris C57/BL6J. Les injections seront réalisées à deux stades de développements : 1/ Cerveau immature : injection de virus avant les 4 jours de vie du souriceaux 2/ Cerveau mature : injection après 21 à 24 jours de latence (après expression du virus) d'un inhibiteur du transport, pour visualiser l'accumulation de vésicules ( petites sacs) au niveau des prolongements des cellules nerveuses qui se trouve dans la zone du cerveau qui relie les deux hémisphères.

Après deux injections, dont celle de cellules de lymphome qui envahissent la rate et les ganglions, des souris sont pesées trois fois par semaine et prélevées de sang chaque semaine pendant cent jours au plus, certaines recevant en plus une injection quotidienne pendant quatorze jours. Au total, 6 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la maladie peut réduire leur activité et leur mobilité pendant une à deux semaines. Le projet cherche à savoir si la façon dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influe sur la réponse aux cellules CAR-T, avec des retombées pour les patients au conditionnel. Les lots décrits totalisent 5 580 souris, et le résumé ne dit rien des 1 080 autres.

Objectifs

Le lymphome est un cancer du sang agressif et fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très hétérogène, ce qui explique qu’environ 40 % des patients ne répondent pas durablement au traitement de référence. Pour certains de ces patients, une thérapie innovante peut être proposée : la thérapie par cellules CAR-T. Cette thérapie est un traitement révolutionnaire contre le cancer qui consiste à modifier génétiquement les propres cellules immunitaires du patient pour les transformer en « super-soldats » capables de repérer et de détruire les cellules cancéreuses. Malgré l’efficacité remarquable de cette thérapie chez certains patients atteints de lymphome, environ la moitié d’entre eux ne répondent pas ou rechutent rapidement, notamment au cours de la première année. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui déterminent l’efficacité de cette thérapie afin d’identifier de nouvelles stratégies permettant d’améliorer la réponse au traitement. Les cellules de lymphome peuvent utiliser différentes sources d’énergie pour se multiplier. L’objectif de ce projet est de déterminer si la manière dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influence leur sensibilité au traitement.

Bénéfices attendus

À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux identifier les patients susceptibles de répondre aux traitements et à développer de nouvelles stratégies permettant d’améliorer l’efficacité de cette thérapie chez les patients résistants.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur des animaux vigiles : Lots 1 à 3 : 2 340 souris : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 4 : 360 souris : mise à disposition ad libitum d’un régime alimentaire pendant une durée maximale de 100 jours, associée à deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 5 : 2 880 souris : : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Une injection par jour pendant 14 jours et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson à volonté pendant 5 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : 1/ un stress transitoire et un inconfort léger liés aux contentions, auxquels peuvent s’ajouter, selon les procédures, les manipulations nécessaires à l’administration des traitements ; 2/ les effets liés au développement de la tumeur : après leur injection, les cellules tumorales se multiplient principalement dans la rate et les ganglions lymphatiques, qui jouent un rôle important dans le fonctionnement du système immunitaire. La progression tumorale va entraîner une gêne légère à modérée et, à un stade plus avancé de la maladie, une diminution de l’activité ainsi qu’une mobilité réduite. Ces effets sont attendus environ 3 à 4 semaines après l’injection des cellules tumorales et peuvent persister pendant 1 à 2 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les organes et de réaliser les analyses in vitro nécessaires à l’obtention des résultats scientifiques.

Remplacement

Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement. Des études in vitro ont été menées en amont afin d’identifier et de sélectionner les mécanismes métaboliques les plus pertinents à étudier. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict minimum, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables. Nous avons utilisé un outil informatique, basé sur nos premières données, pour calculer le nombre d’animaux réellement nécessaires. Après la fin des expériences, nous recueillerons également plusieurs organes et tissus afin de réaliser un maximum d’analyses complémentaires avec les mêmes animaux. Enfin, le projet est organisé par étapes. En fonction des résultats obtenus au laboratoire et chez l’animal, certaines expériences pourront ne pas être réalisées si elles ne sont plus nécessaires.

Raffinement

Nous avons établi des critères d’arrêt précis, précoces et adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de limiter toute souffrance animale, tout en conservant une exploitation optimale des résultats scientifiques. Nous serons particulièrement attentifs à toute modification du comportement et de l’aspect physique des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. En absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.

Opérés sous anesthésie pendant trente à quarante-cinq minutes pour retirer la thyroïde et les parathyroïdes, puis pour certains réopérés afin d'implanter une minipompe, des rats reçoivent chaque jour, pendant quinze jours au plus, un candidat-médicament ou un placebo, avec des prises de sang à l'éveil. 345 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'hypocalcémie provoquée pouvant entraîner des tremblements, une baisse d'activité et une perte de poids. Le porteur prévoit cinq rats par groupe pour en inclure trois dans l'étude, sans dire ce qu'il advient des deux autres. Tous sont tués à la fin pour prélever leurs organes, ou plus tôt si l'hypocalcémie produit des "effets marqués".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de candidat-médicaments sur la régulation du calcium chez le rat ayant subi une thyroïdectomie préalable. L'hypoparathyroïdie est un déficit en hormone parathyroïdienne. Chez l'homme, elle est souvent causée par une maladie auto-immune ou des suites d'une chirurgie au niveau des glandes thyroïdes ou parathyroïdes. L'hormone parathyroidienne, ou parathormone, est principalement impliquée dans le métabolisme du calcium de l'organisme et dans la régulation de la calcémie. Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont liés à une hypocalcémie et comprennent des fourmillements dans les mains ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Le traitement comprend en première intention une supplémentation en calcium et en vitamine D. Ce traitement ne répond pas correctement sur tous les patients et ne permet pas une régulation très fine de la calcémie au cours de la journée (pics d'hypercalcémie suivis de phases d'hypocalcémie). Il ne permet pas de diminuer le risque de complications à long terme de l'hypoparathyroïdie (p. ex., hypercalciurie, diminution de la densité minérale osseuse). Dans ce cas des traitements à base de parathormone recombinée sont nécessaires. Aucun traitement de ce type n'est approuvé à ce jour.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer les effets bénéfiques de nouveaux médicaments pour traiter l'hypoparathyroïdie, une pathologie humaine touchant 40 personnes pour 100000 et pouvant avoir une application également en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

Ce projet nécessite différents types d'interventions. Dans un premier temps, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée sur certains animaux afin de réaliser une ablation de la thyroïde et des parathyroïdes (durée: 30-45min). Certains animaux pourront subir une seconde chirurgie afin d'implanter un dispositif (minipompe) permettant la délivrance d'un produit en perfusion continue (durée: 15-20 min). Les animaux opérés seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la/les chirurgies, les candidat médicament ou le placebo seront administrés tous les jours aux animaux par voie sous-cutanée (bolus ou perfusion) (durée 1-2minutes) pendant un maximum de 15 jours. Des prélèvements sanguins seront effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile (durée des prélèvements: moins de 3min).

Impact sur les animaux

Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont connus et clairement identifiés chez l'homme, et consistent en des fourmillements dans les extrémités ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Ces effets sont liés à une hypocalcémie et seront maitrisés par des apports quotidiens en calcium ou des traitements à base d'analogue de la parathormone endogène, partiellement ou totalement absente dans ce modèle. Les effets potentiellement indésirables du/des produit(s) font l’objet d’échanges avec les inventeurs du nouveau candidat médicament pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiperau mieux de potentiels signes cliniques. Chez le rat, l'hypocalcémie peut entrainer des tremblements, une diminution de l'activité locomotrice et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort en fin de procédure pour la réalisation de prélèvement d'organes ou suite à des effets marqués liés à l'hypocalcémie.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme et la régulation du calcium dans l'organisme sur des sujets atteints d'hypoparathyroïdie ou, si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est de mesurer les taux de calcium circulant dans le sang, et d'évaluer les mécanismes de régulation de ce dernier, ce qu'il n’est pas possible de mesurer sur des cellules ou organes isolés mais qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. 5 animaux par groupe seront utilisés pour en inclure 3 par groupe en étude et ce nombre a été montré suffisant pour répondre aux objectifs de l'étude.

Raffinement

Le raffinement de la procédure expériementale sera obtenu par un protocole anesthésique et analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire et un suivi post opératoire de l'état de santé des animaux (avec grille de scoring) avec des soins adaptés. Les animaux seront manipulés pour diminuer le stress lié aux contentions. Les animaux sont également suivis quotidiennement (suivi pondéral et signes cliniques). Des points limites adpatés sont définis et le recours à une supplémentation orale en calcium + vitamine D en cas d'hypocalcémie associée à des signes cliniques, ou à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets d’un produit sur la calcémie et le métabolisme du calcium dans l'organisme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

78 des 174 macaques à longue queue de ce projet doivent être gardés en vie puis réutilisés dans d'autres études, les 96 autres tués pour analyser leurs tissus infectés. Dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 144 d'entre eux sont colonisés par des bactéries hospitalières, parfois multirésistantes, et tous subissent jusqu'à sept anesthésies générales et neuf prises de sang par semaine, des lavages rectaux, des traitements et l'implantation d'une puce de télémétrie, certains des biopsies rectales et des gavages d'antibiotiques. Après l'inoculation, chaque macaque est logé seul, face à un congénère à deux mètres. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'usage de primates "reste nécessaire", malgré "les efforts pour privilégier ces alternatives", qu'il ne décrit pas.

Objectifs

L’étude des sepsis, c’est-à-dire des réactions anormales et excessives de l’organisme face à une infection, constitue un enjeu majeur de santé publique. Les sepsis engendrent une mortalité élevée, estimée à environ 11 millions de décès par an dans le monde, due à l’absence de traitements réellement efficaces. Les formes les plus sévères de sepsis sont le plus souvent liées à des bactéries retrouvées dans les intestins. Ces bactéries finissent par circuler dans les hôpitaux et représentent aujourd’hui une menace importante pour les systèmes de santé. De plus, la résistance aux antibiotiques développée par ces bactéries constitue un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale. Cette augmentation de la résistance aux antibiotiques rend le traitement des infections graves beaucoup plus difficile et accroît le risque de développer des sepsis sévères. Dans ce contexte, le développement de stratégies visant à prévenir l’infection en réduisant ou en éliminant, au niveau de l’intestin, les bactéries susceptibles de provoquer des infections chez les patients à risque apparaît comme une approche prometteuse contre à la fois le sepsis et la multirésistance aux antibiotiques. L’étude envisagée vise à mettre en place un modèle de colonisation digestive chez des primates non humains par des bactéries pertinentes du contexte hospitalier, multirésistantes ou non, afin d’évaluer, tester et optimiser des stratégies innovantes permettant d’éliminer ces bactéries.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le développement de modèles de colonisation intestinale par différentes bactéries d’intérêt pour tester de nouvelles stratégies de décolonisation intestinale pouvant être utilisées chez des patients à risque avant le développement d’infections sévères.

Procédures

- Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupées pour limiter leur nombre (1 à 7 fois par semaine, 174 animaux, 30-45 minutes). Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 9 fois par semaine, 174 animaux, 5 minutes - Récoltes de fluides rectaux/trachéaux ou nasaux (1 à 5 fois par semaine, 174 animaux 2 minutes). - Biopsies rectales, (2 fois maximum, 30 animaux, 30 minutes). - Lavages rectaux (1 à 2 fois par semaine, 126 animaux, 20 minutes). - Lavages broncho-alvéolaires (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 10 minutes). Interventions - Inoculation bactérienne (1 fois 144 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des molécules thérapeutiques (ou placebo) (jusqu’à 6 fois, 174 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des antibiotiques par gavage (4 fois 144 animaux, 5 minutes) - Imageries in vivo (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 45 minutes).

Impact sur les animaux

Les méthodes expérimentales ont été définies de manière à éviter toute souffrance lors des interventions (limitation des volumes sanguins prélevés, expositions et traitements réalisés sous anesthésie générale). Anesthésies, prélèvements de sang Perte d’appétit avec perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection au site d’injection possible dans les jours qui suivent le prélèvement (rare, quelques jours). Traitements Réaction locale, démangeaisons et/ou douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Perturbation de la flore intestinale, vomissement et/ou diarrhée transitoire. Colonisation L’étape de colonisation ne s’accompagne souvent d’aucun signe clinique particulier. Cependant, en cas de passage des bactéries dans le sang ou d’infections pulmonaires, des signes cliniques de l’infection bactérienne peuvent apparaitre : fièvre, perte d’appétit, difficultés respiratoires pendant quelques jours. Nuisances liées aux traitements antibiotiques L’altération de la flore intestinale peut causer des diarrhées et entérites (quelques jours) Implantation de puces de télémétrie Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Biopsies rectales : Des signes cliniques liés aux biopsies rectales : réaction inflammatoire au site de la biopsie, perte d’appétit, saignements, pendant quelques heures/jours Nuisances liées à l’hébergement individuel : Les animaux seront hébergés en groupe avant exposition et en hébergements individuels proches, permettant des interactions sociales pendant la phase d’expérimentation. Nuisances suite aux écouvillonnages : Saignement pouvant aller de quelques secondes à quelques minutes. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation de la trachée liée à l’intubation. Toux, difficultés respiratoires légères juste après le geste. Nuisance liée à la mise à jeun (

Devenir

Pour l’étude de mise en place de modèle : les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études compatibles après avis vétérinaire. Cependant, si les animaux montrent des signes d’infection, ils seront euthanasiés afin d’étudier l’infection dans les tissus. Dans l’étude d’évaluation de la sécurité des traitements, les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études après avis favorable du vétérinaire. Dans les études d’efficacité des traitements, tous les animaux seront euthanasiés, dans le but de faire des analyses des tissus infectés.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en place des modèles de colonisation intestinale par des bactéries souvent retrouvées chez des patients hospitalisés, afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques de décolonisation. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire, la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries de l’intestin. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Le primate non-humain, étant proche de l’humain au niveau anatomique, immunitaire et physiologique, permet de reproduire la complexité de ces interactions, nécessaires pour permettre une colonisation intestinale par des bactéries retrouvées chez les patients. Cela permet ainsi d’évaluer de façon fiable tout nouveau traitement avant son utilisation chez l’être humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Dans la phase de mise en place du modèle, les conditions optimales d’inoculation de la bactérie seront déterminées selon un procédé étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Cette méthode permet de réduire le nombre d’animaux, en évitant de multiplier les essais. Dans les études de tolérance et de distribution, seules les stratégies de décolonisation ayant déjà démontré une efficacité chez le petit animal (rongeurs) seront testées dans cette étude chez le primate non humain. Ensuite, pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter des différences statistiques entre les groupes.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire leur nombre. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. Les animaux seront hébergés en groupes puis en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales après inoculation bactérienne (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés de 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, et par renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, éviter une contamination croisée, et permettre d’associer le prélèvement d’excréments à l’animal. Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques liés au traitement afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux ainsi que leur alimentation (des points limites sont mis en place). Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, anti-douleurs localement). L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué, qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement anti-douleur sera appliqué avant la chirurgie.

Choix des espèces

Dans ce projet, le macaque a été sélectionné pour sa proximité génétique, anatomique et physiologique avec l’être humain. Son appareil digestif ressemble beaucoup à celui de l’être humain au niveau anatomique, mais aussi au niveau de l’environnement intestinal incluant le microbiote. Le macaque reproduit la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries naturellement présentes dans l’intestin. Cela en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la colonisation bactérienne par des bactéries retrouvées chez l’être humain et l’étude de la tolérance à de nouveaux traitements. Ces bactéries pouvant être retrouvées dans l’intestin de personnes de tout âge, nous envisageons de réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature et un microbiote intestinal stable.