Procédures modérées

1 404 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin de chaque procédure pour des analyses post mortem. Chacun subit une chirurgie du cerveau d'une heure trente à deux heures trente, garde parfois un dispositif fixé sur la tête, puis passe des tests de mémoire : un environnement associé à jusqu'à cinq stimulations "désagréablement ressentie", de nature non précisée, un apprentissage spatial en six à huit sessions, des tests d'interactions sociales et d'odeurs alimentaires, avec un rationnement pour les tests à récompense. Le but est de comprendre comment une région profonde du cerveau relaie les souvenirs entre deux autres zones. Le porteur écrit que "toute souffrance sera évitée", au motif que le "bien-être animal" est "essentiel pour garantir des données comportementales fiables".

Objectifs

Les recherches actuelles suggèrent que les souvenirs durables sont progressivement stockés dans différentes zones du cerveau. Cependant, on comprend encore mal comment un souvenir est attribué à des groupes précis de cellules nerveuses lors de son enregistrement. Des travaux récents montrent qu’une région profonde du cerveau sert de relais entre une zone impliquée dans la mémorisation des expériences récentes et une autre région participant au stockage des souvenirs à long terme. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment ces différentes régions cérébrales communiquent entre elles pendant la création des souvenirs chez le rat. Dans un premier temps, nous étudierons les connexions entre cette région relais et plusieurs zones du cerveau impliquées dans la mémoire. Ensuite, nous analyserons leur rôle en enregistrant leur activité ou en modifiant temporairement certaines communications entre ces régions. L’objectif est de déterminer plus précisément leur fonction chez le rat adulte soumis à différents tests de mémoire faisant appel à des odeurs, à l’environnement ou à l’orientation dans l’espace. Ces tests permettront d’étudier la formation des souvenirs à différents moments après l’apprentissage.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, à court terme, de mieux caractériser les connexions entre certaines régions du cerveau ainsi que leur rôle dans différents aspects de la formation des souvenirs. À moyen terme, ces résultats contribueront à mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans les troubles de la mémoire. À long terme, ce projet fondamental présente une perspective translationnelle en pouvant aider à identifier l’origine des amnésies et de l’oubli accéléré observés dans certaines maladies psychiatriques et neurodégénératives, et ainsi orienter de futures stratégies diagnostiques ou thérapeutiques.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à différentes interventions expérimentales. Intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale : 1 intervention par animal, durée de 1 h 30 à 2 h 30. Administration de substances nécessaires au protocole expérimental : une seule injection intrapéritonéale sera administrée par animal. Test de mémoire lié à l’environnement : 1 session de 8 minutes pouvant inclure jusqu’à 5 stimulations désagréablement ressentie ; puis 1 session de rappel d’environ 10 minutes. Test de mémoire spatiale : plusieurs sessions d’apprentissage (6 – 8 sessions) et de rappel (1 session), de 5 à 60 minutes selon les étapes. Test de mémoire lié aux interactions sociales et aux odeurs alimentaires : 1 à 2 sessions de 5 à 30 minutes. Mesure ou modulation temporaire de l’activité cérébrale pendant les tests comportementaux : 1 à 8, d’une durée identique à celle du test concerné (5 à 60 minutes).

Impact sur les animaux

Les opérations réalisées sous anesthésie générale, impliquant une intervention au niveau du cerveau et la pose de petits dispositifs, peuvent entraîner un impact négatif temporaire sur le bien-être des animaux pendant les heures ou les jours suivant l’intervention. Après certaines opérations, les animaux porteront un petit dispositif fixé sur la tête pour maintenir le matériel en place ; malgré sa petite taille, il peut occasionner une légère gêne. Certains tests comportementaux peuvent entraîner un inconfort ou un stress passager chez les animaux, sans conséquence durable sur leur bien-être. Pour certains tests fondés sur une récompense alimentaire, un rationnement alimentaire sera mis en place afin de maintenir la motivation des animaux, avec un impact limité sur leur bien-être. Certaines procédures nécessitent des injections de substances. Celles-ci peuvent entraîner un risque de douleur transitoire au site d’injection, bien que les produits utilisés ne soient pas considérés comme douloureux. La manipulation nécessaire pour maintenir l’animal peut également provoquer un stress modéré et une gêne passagère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder aux études post mortem.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, les approches basées sur la modélisation du fonctionnement du cerveau sont utiles, mais restent complémentaires des approches expérimentales in vivo, qui permettent de tester et de valider les prédictions des modèles.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données fiables et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour comparer rigoureusement les résultats, tout en tenant compte des pertes éventuelles au cours de l’étude. Le recours à des méthodes temporaires permettant d’activer ou d’inhiber certaines zones du cerveau de manière réversible permet également de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. De plus, les différentes procédures seront réalisées dans un ordre logique afin de ne poursuivre les expérimentations que sur les voies présentant un intérêt confirmé par les étapes précédentes, ce qui contribuera à réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales fiables, toute souffrance sera évitée. Les protocoles chirurgicaux ont été optimisés afin de limiter au maximum l’inconfort et la douleur. Les animaux seront observés quotidiennement ; dès qu’un problème est détecté, l’expérimentateur interviendra pour prodiguer les soins nécessaires ou, si besoin, mettre fin à la procédure. Des critères d’arrêt et des mesures de prise en charge adaptés ont été définis afin de garantir une gestion optimale de la douleur et de l’inconfort. Les tests comportementaux susceptibles de provoquer un inconfort temporaire seront réalisés selon des conditions strictement encadrées et limitées au minimum nécessaire pour obtenir les observations attendues. L’objectif recherché est une réaction passagère, sans effet durable sur l’animal.

Choix des espèces

De manière générale, les rongeurs constituent un modèle pertinent pour l’étude du système nerveux. Les grands principes d’organisation et de fonctionnement des circuits neuronaux sont largement conservés au cours de l’évolution. De plus, de nombreuses épreuves comportementales validées permettent d’évaluer chez le rat des fonctions cognitives complexes. Enfin, les processus de développement cérébral et les mécanismes neurobiologiques sous-jacents présentent de fortes similitudes avec ceux des autres mammifères, ce qui permet d’extrapoler les résultats obtenus à la compréhension du fonctionnement cérébral humain. Les animaux utilisés pour ce projet seront des rats jeunes adultes âgés d’environ 8-9 semaines (250-275 g) au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une bonne reproductibilité des positions utilisées lors des chirurgies cérébrales.

Les souris subissent une ou deux chirurgies de trente minutes pour des injections dans le cerveau, et 72 d'entre elles reçoivent en plus, éveillées et sous contention, une injection dans l'abdomen. 538 souris, dont des souris génétiquement modifiées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leur cerveau soit analysé. Le projet porte sur des neurones d'une région cérébrale liée à la mémoire et aux émotions, avec des retombées médicales renvoyées au plus long terme. Le résumé ne nomme ni cette région, ni ce qui est injecté dans le cerveau, ni ce que vivent les souris entre la chirurgie et leur mise à mort.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les propriétés et le rôle de certains neurones, des cellules du cerveau, situés dans une région essentielle à la mémoire et à la régulation des émotions.

Bénéfices attendus

À court terme, le projet permettra de mieux comprendre les caractéristiques de ces neurones. À moyen terme , ces résultats permettront de mieux comprendre comment ces cellules participent à la mémoire, aux apprentissages et aux émotions. À plus long terme, ces connaissances pourront contribuer à mieux comprendre certaines maladies qui affectent ces fonctions cérébrales et guider de futures recherches médicales.

Procédures

Les animaux seront soumis soit à une chirurgie (sous anesthésie, 30 minutes ; 256 animaux), soit à une chirurgie (sous anesthésie, 30 minutes) suivie d’une injection dans la cavité abdominale associée à une contention de l'animal (animaux vigiles, environ 30 secondes) (72 animaux), soit à deux chirugies (sous anesthésie, 2 × 30 minutes ; 210 animaux).

Impact sur les animaux

La principale nuisance susceptible d’être subie par les souris est la douleur associée à la chirurgie réalisée lors des injections intracérébrales. Une douleur légère et de courte durée pourra également être induite par les injections réalisées dans la cavité abdominale.

Devenir

Tous les animaux injectés seront mis à mort car leurs cerveaux sont récupérés pour les analyses.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucune méthode utilisant uniquement des cellules en laboratoire ou des simulations informatiques permettant de reproduire la complexité de cette région du cerveau. Cette étude ne peut donc être réalisée que chez l'animal.

Réduction

Nous utiliserons le plus petit nombre de souris possible afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux a été calculé pour répondre aux objectifs scientifiques tout en évitant toute utilisation inutile. Les méthodes expérimentales ont été optimisées grâce à notre expérience afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Des souris mâles et femelles seront incluses dans l’étude. Enfin, l’élevage des souris génétiquement modifiées sera planifié en fonction des besoins de chaque expérience afin d’éviter la production d’animaux en excès.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les souris seront surveillées afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de souffrance. Des mesures adaptées seront mises en place si nécessaire, comme l’administration de traitements contre la douleur, l’adaptation des soins ou une surveillance renforcée, et ce en accord avec le vétérinaire. Les interventions chirurgicales seront réalisées avec des méthodes d’anesthésie et de prise en charge de la douleur appropriées, ainsi qu’un suivi attentif après l’intervention. Des outils d’évaluation objective de l’état général des animaux (poids, apparence et comportement) permettront d’adapter les soins à chaque situation. Si l’état d’un animal ne s’améliore pas malgré ces mesures, il sera retiré de l’étude afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris, car cette étude fait suite à un précédent projet réalisé chez cette même espèce. La région cérébrale étudiée produit des neurones depuis la période embryonnaire jusqu’à l’âge adulte. Les analyses seront réalisées chez des souris âgées de 12 ou 24 semaines, permettant d’étudier respectivement des neurones formés au cours de la vie embryonnaire ou à l’âge adulte lorsqu’ils ont atteint un stade de maturation. Ces âges ont été choisis afin de permettre une comparaison directe avec les résultats obtenus dans le projet précédent.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Éveillées et maintenues dans un système de contention, elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue, puis développent des nodules dans les poumons, que le porteur dit susceptibles de provoquer difficultés respiratoires, amaigrissement et "une douleur modérée". Le projet sert à vérifier si cette méthode d'induction fait apparaître des structures immunitaires dans les tumeurs, et le porteur prévoit qu'en cas d'échec les recherches s'orienteront vers d'autres méthodes. Il affirme qu'un "modèle animal immunocompétent est indispensable", les organoïdes et cultures en 3D ne reproduisant pas selon lui le tissu tumoral.

Objectifs

Le projet vise à étudier la formation et les caractéristiques de structures fonctionnelles induites dans les tumeurs pulmonaires, appelées les structures lymphoïdes tertiaires (TLS). Ces structures permettent de mettre en place localement une réponse immunitaire antitumorale. Pour cela, un modèle murin d’adénocarcinome pulmonaire sera établi par injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires. Ce modèle permettra d’induire le développement de nodules tumoraux pulmonaires reproduisant certains aspects du cancer pulmonaire humain. Les tumeurs seront ensuite analysées afin d’identifier la présence, l’organisation et la composition cellulaire des TLS, ainsi que leur association avec la progression tumorale et les réponses immunitaires locales. Les objectifs sont les suivants: - Établir et valider un modèle murin d’adénocarcinome pulmonaire par injection intraveineuse de cellules tumorales. - Déterminer si ce modèle induit la formation de structures lymphoïdes tertiaires dans la tumeur. - Caractériser la composition cellulaire et l’organisation des TLS (cellules immunitaires). Explorer le rôle potentiel des TLS dans la réponse immunitaire antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le cancer du poumon. Ces structures immunitaires sont associées à une meilleure réponse aux immunothérapies dans plusieurs cancers, mais leurs mécanismes de formation restent encore mal connus. Ce travail permettra d’établir et de valider un modèle murin pertinent pour étudier les TLS dans le microenvironnement tumoral pulmonaire. Les résultats obtenus permettront de déterminer si ce modèle reproduit la formation de TLS observée chez l’Homme. Si ce modèle est validé, il pourra être utilisé dans de futurs projets visant à mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la formation et la fonction des TLS. À l’inverse, si aucune formation de TLS n’est observée, ces résultats permettront d’orienter les recherches vers d’autres modèles expérimentaux plus adaptés. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à l’identification de nouveaux biomarqueurs et au développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie dans le cancer du poumon.

Procédures

Les animaux vigiles dans un système de contention adapté recevront une administration unique de cellules tumorales (durée de l’acte technique : 2 minutes). À la fin de l’expérimentation, une procédure chirurgicale sans réveil sera réalisée sous analgésie et anesthésie générale (durée de l’acte : environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection intraveineuse, incluant un stress léger lors de la contention ainsi qu’une douleur légère ou un petit hématome localisé au niveau de la queue en cas d’irritation liée à l’injection. Le développement des tumeurs pulmonaires pourra entraîner une perte de poids progressive, des signes respiratoires tels qu’une augmentation de la fréquence respiratoire (polypnée), une difficulté respiratoire (dyspnée) ou une respiration abdominale, ainsi qu’une diminution de l’activité générale. Les animaux pourront présenter une douleur modérée liée au développement tumoral pulmonaire, pouvant s’accompagner d’une altération de l’état général, incluant hypoactivité, posture anormale, poil hérissé, diminution de la prise alimentaire ou isolement. Les nuisances potentielles liées à l’anesthésie comprennent notamment une hypothermie et une dépression respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des poumons et la réalisation des analyses histologiques et immunologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet, notamment l’identification, la quantification et la caractérisation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) au sein du microenvironnement tumoral. Le maintien en vie des animaux n’est pas envisageable, car les données expérimentales reposent sur l’analyse ex vivo des tissus tumoraux pulmonaires. Par ailleurs, cette stratégie permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque animal grâce à la réalisation d’analyses multiples (histologie, immunohistochimie, analyses cellulaires), contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre du projet et des études futures.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives non animales permettant de reproduire de manière satisfaisante la complexité du microenvironnement tumoral pulmonaire et la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS). Ces structures résultent d’interactions dynamiques entre cellules tumorales, cellules immunitaires et stroma, au sein d’un tissu organisé et vascularisé, ce qui ne peut être modélisé de façon adéquate par des approches in vitro (cultures cellulaires 2D/3D, organoïdes) ou in silico. Bien que certaines approches ex vivo ou de modélisation puissent apporter des informations partielles, elles ne permettent pas d’étudier l’initiation, l’organisation spatiale et la maturation des TLS dans un contexte physiologique intégré, ni les interactions systémiques impliquées dans la réponse immunitaire antitumorale. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal immunocompétent est indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Ce projet constitue par ailleurs une étape préalable visant à valider la pertinence du modèle, permettant d’éviter le recours à des animaux dans des études ultérieures si celui-ci s’avérait inadapté.

Réduction

Le nombre d’animaux (45), a été déterminé de manière à obtenir des résultats scientifiquement robustes tout en respectant le principe de réduction. Chaque expérience comportera 15 animaux recevant une injection intraveineuse de cellules tumorales. Ce nombre a été choisi comme le minimum nécessaire pour permettre l’observation fiable du développement tumoral et de la formation éventuelle de structures lymphoïdes tertiaires, en tenant compte de la variabilité biologique interindividuelle. Afin de garantir la reproductibilité des résultats et de permettre une analyse statistique appropriée, l’expérience sera répétée trois fois de manière indépendante, portant le nombre total d’animaux à 45. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, et sur la base de nos conncaissances en terme d'hétérogénité du système immunitaire chez la souris. Aucun groupe contrôle supplémentaire n’est nécessaire, l’objectif étant de valider l’établissement du modèle tumoral et la présence ou l’absence de TLS. Les effectifs ont été déterminés sur la base des données de la littérature, afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. La stratégie expérimentale repose sur une étude pilote visant à valider la pertinence du modèle, ce qui permet d’éviter l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux dans des projets ultérieurs si le modèle s’avérait non adapté. De plus, les analyses seront optimisées afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal (analyses histologiques et immunologiques multiples sur les mêmes tissus), limitant ainsi le recours à des animaux supplémentaires. Enfin, les données obtenues seront exploitées de manière rigoureuse à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été conçues afin de minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux à chaque étape du projet. Les animaux bénéficieront d’un temps d'acclimatation de 8 jours avant le début des procédures. Ils seront hébergés en groupes de 5 animaux par cage dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec un environnement enrichi favorisant leur bien-être et offrant un espace adapté à leurs déplacements. Les injections seront réalisées par du personnel expérimenté afin de limiter les échecs et les manipulations répétées. Une attention particulière sera portée à l’accès à l’alimentation, avec la mise à disposition, si nécessaire (en cas d’amaigrissement ou de difficulté d’alimentation), de nourriture enrichie sous forme de gelée et l’ajout de croquettes. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique régulière, comprenant une surveillance quotidienne par le personnel animalier ainsi qu’un suivi régulier par les expérimentateurs (2 à 3 fois par semaine). Ce suivi inclura le contrôle du poids, du comportement et des signes respiratoires, permettant une détection précoce de toute altération de l’état général. Dès l’apparition des tumeurs, la fréquence de surveillance sera renforcée, avec notamment des pesées régulières (2 à 3 pesées hebdomadaires) et une évaluation attentive des signes cliniques (amaigrissement, posture anormale, difficultés respiratoires) pour rechercher des signes d’altération de l’état général. Des points limites stricts et précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les conditions d’hébergement respecteront les standards en vigueur, avec enrichissement du milieu pour favoriser le bien-être des animaux. L’ensemble du personnel impliqué est formé aux bonnes pratiques en expérimentation animale, garantissant une prise en charge adaptée et respectueuse des animaux tout au long de l’étude.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie comme modèle expérimental en raison de sa large utilisation et de sa pertinence pour l’étude du cancer du poumon et du système immunitaire. Elle permet le développement de modèles syngéniques immunocompétents indispensables à l’étude des interactions entre cellules tumorales et système immunitaire, notamment dans le cadre de la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), structures formées dans les tumeurs et permettant la génération d'une réponse antitumorale locale. De plus, la souris offre un large éventail d’outils génétiques permettant, dans des projets ultérieurs, d’étudier de manière ciblée le rôle de gènes d’intérêt dans des cellules telles que les lymphocytes B. Enfin, aucune autre espèce ou méthode alternative ne permet actuellement d’étudier de manière intégrée la tumorigenèse pulmonaire et la formation des TLS dans un organisme entier, justifiant le recours à ce modèle animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes jeunes, âgées de 7 à 9 semaines au moment du début des procédures expérimentales. A ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature, indispensable pour l’étude des interactions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires, notamment dans le cadre de la formation des TLS.

Les souris reçoivent jusqu'à onze injections dans l'abdomen, ou une injection dans la veine située derrière le globe oculaire sous anesthésie gazeuse, et subissent jusqu'à douze prises de sang à la mâchoire. 600 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes, dont la rate, soient prélevés. Le porteur indique que la réaction immunitaire déclenchée entraîne une altération de leur état général, pour produire des lignées de cellules sécrétant des anticorps monoclonaux. Le résumé ne nomme aucune cible ni aucune application, et le porteur présente l'effectif comme "une estimation des projets à venir".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.

Bénéfices attendus

Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

[MODIFICATION] Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection, 11 INJECTIONS MAXIMUM SUR L'ENSEMBLE DU PROTOCOLE) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (12 AU MAXIMUM) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.

Une partie des souris porte un déficit immunitaire, le déficit en DOCK8, qui les expose selon le porteur à des manifestations allergiques plus fréquentes et plus sévères, et à des infections par des virus et des champignons. 1 056 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour déclencher un eczéma, leur peau rasée est arrachée en surface au ruban adhésif ou enduite de calcipotriol, puis couverte d'un patch de staphylocoque, six fois en douze jours, ce qui provoque démangeaisons, lésions de grattage et œdème. Des souriceaux sont aussi rasés et enduits chaque jour dès deux semaines d'un émollient enrichi en sucre du lait maternel avant de subir ce protocole. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour que leurs organes et fluides soient analysés.

Objectifs

La dermatite atopique est une allergie, touchant 15 % des enfants en Europe. Elle est associée à une barrière et un microbiote cutané altéré et à un dysfonctionnement du système immunitaire. 70 % des enfants guérissent naturellement et 30 % souffrent de symptômes persistants avec un risque accru d’autres allergies (asthme, rhinite ou allergies alimentaires : marche atopique). Il n’existe pas de stratégies préventives efficaces . Plusieurs essais cliniques ont appliqué des émollients sur la peau des bébés pour renforcer la barrière cutanée Ils ont observé que les émollients trilipidiques ne prévenaient pas la dermatite atopique mais amélioraient l'intégrité de la barrière cutanée en réduisant la perte d'eau à travers la peau. Même si les émollients renforcent la barrière cutanée, cette approche seule semble insuffisante pour prévenir la dermatite atopique. Les stratégies thérapeutiques qui ciblent la barrière cutanée, mais aussi le microbiote et le système immunitaire pourraient offrir des approches plus efficaces pour prévenir la dermatite atopique. Certains sucres du lait maternel (oligosaccharides), peuvent moduler le microbiote intestinal en favorisant l'émergence de bactéries bénéfiques et en réduisant l'abondance des bactéries nocives. Ils peuvent renforcer la barrière intestinale et induire un environnement immunitaire tolérogène. Nous avons démontré chez la souris gestante l’efficacité d’une supplémentation anténatale avec un sucre du lait maternel sur la disparition complète des symptômes de l'allergie alimentaire chez les petits. Notre hypothèse est que l'ajout de sucres du lait maternel aux émollients pourrait constituer une stratégie efficace pour cibler le microbiote cutané, le système immunitaire et la barrière cutanée et, par conséquent, pour prévenir l'apparition de la dermatite atopique . Enfin nous étudierons la survenue de la dermatite atopique et de l’allergie alimentaire sur un modèle de souris avec un déficit immunitaire (déficit en DOCK8). En effet ce déficit immunitaire induit la survenue encore plus fréquente et plus sévère de manifestations allergiques et est un modèle de choix pour l’étude de la marche atopique.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier un modèle de dermatite atpique induit par une combinaison d’altération de la barrière cutanée (mécanique par tape stripping ou inflammatoire par le calcipotriol) et de modification du microbiome par ajour de staphylocoque doré ou epidermidis, d’étudier l’efficacité d’un traitement préventif par l’application d’un émollient enrichi avec un oligosaccharides du lait maternel, et enfin d’étudier l’impact d’un déficit immunitaire sur la survenue de la dermatite atpique dans ce modèle.

Procédures

- pour la validation de nos modèles de dermatite atopique, tous les gestes seront réalisés sous anesthésie : rasage ( 2 minutes) , tape stripping (3 minutes), application du calcipotriol et patch staphylocoque ( 5 minutes). Cela sera réalisé tous les 2 jours pendant 12 jours, soit 6 fois par souris. La mesure de la perte en eau transcutanée sera réalisée au début et à la fin du protocole (1 minute), soit 2 fois par souris. - Pour l’étude de la prévention de la dermatite atopique : prise de poids tous les 4 jours pour les femelles gestantes (30 secondes par souris,5 fois par souris), pour les souriceaux : anesthésie puis rasage et application journalière d’un traitement topique dorsale (30 secondes) pendant 14 jours, soit 14 fois par souriceaux. Le protocole d’induction de la dermatite atopique sera ensuite réalisé comme décrit ci-dessus.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la gêne liée à la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages les symptômes liées à la mise en place de la dermatite atopique (démangeaisons, rougeurs, lésions de grattage, œdème), inflammation liée au staphylocoque les anesthésies gazeuses peuvent induire une baisse de temperature, une baisse de tension, une baisse de la fréquence respiratoire, ou une baisse de la concentration en oxygene. Les souris atteintes du déficit immunitaire sont susceptibles d’avoir plus de manifestations allergiques, et sont plus à risques d’infections notamment induites par les virus et les champignons.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczema atopique ou de l’allergie alimentaire et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique , il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales (peau, intestin, poumon).

Réduction

En effectuant un test de puissance sur un logiciel en ligne de statistiques, nous avons besoin de 12 animaux par groupes afin d’obtenir un score de sévérité de l'eczema atopique (three item severity score (TIS) statistique et avoir assez de matériel biologique pour effectuer des coupes histologiques et des mesures des biomarqueurs immuns de la dermatite atopique dans la peau et dans le serum. De plus, ce nombre d'animaux permettra d'obtenir des résultats exploitables pour la réalisation d'analyses statistiques

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur en détectant rapidement les signe de souffrance et les points limites afin de mettre en place les mesures adaptées. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hebergées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la dermatite atpique, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Nous souhaitons valider ce modèle murin de dermatite atopique sur deux lignées différentes (une lignée de souris noires C57BL/6 et une lignée de souris blanches Balb/C ) car ces deux lignées ont des propriétés différentes notamment concernant les réponses inflammatoires de type 2. De plus les souris avec un deficit en DOCK8 sont issues de la lignée C57BL/6 Les souris seront âgées de 4 semaines pour les procédures 1 et 3 comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la dermatite atpique chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie. Pour la procédure 2, Les souris blanches femelles reproductrices seront âgées de 6 semaines et les mâles reproducteurs seront âgés de 10 semaines car c’est à ces âges là que nous avons observé la meilleure efficacité de reproduction. L’application topique des émollients se fera chez le souriceau de 2 semaines pour reproduire les applications topiques d’émollients chez les bébés dès le plus jeune âge. La dermatite atpique sera induite chez les souriceaux âgés de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature

3 porcs femelles de 60 à 70 kg sont mis à jeun douze heures, puis anesthésiés une heure pour qu'une capsule soit placée par endoscopie dans leur tube digestif, avant 72 heures seuls en loge. Nouveau jeûne, puis jusqu'à dix heures d'anesthésie continue : cathéter dans la veine de l'oreille, sonde urinaire posée à travers le pubis, seconde capsule, sonde de manométrie et scanners. Ces procédures, d'un niveau de souffrance modéré, préparent un capteur de transit digestif destiné à l'humain, présenté comme complémentaire d'une solution commerciale existante. Les trois porcs sont tués sous anesthésie à l'issue, sans reprise de conscience.

Objectifs

Ce projet constitue une étape dans le développement d’un dispositif autonome visant à mesurer en temps réel la vitesse du transit digestif chez le patient humain, en utilisant le porc comme modèle translationnel. Ce système est complémentaire d'une solution commerciale déjà existante, qui permet une visualisation digestive mais nécessite une interaction humaine pour définir des points de référence. L’objectif spécifique de l’étude proposée est DE DETERMINER SI LE SIGNAL ENREGISTRE PAR LA CAPSULE VARIE EN FONCTION DE SA POSITION DANS LE SYSTEME DIGESTIF (ESTOMAC, INTESTIN, COLON…). ELLE VISE EGALEMENT A DETERMINER SI CES VARIATIONS SONT LIEES AUX MOUVEMENTS NATURELS ET CYCLIQUE DU SYSTEME DIGESTIF..

Bénéfices attendus

DANS LE CADRE DE CETTE ETUDE PRELIMINAIRE, LES BENEFICES ATTENDUS EN TERMES DE CONNAISSANCES SONT DE MIEUX EVALUER LE FONCTIONNEMENT DU DISPOSITIF IN VIVO, NOTAMMENT EN DETERMINANT SI LE SIGNAL ENREGISTRE PAR LA CAPSULE VARIE EN FONCTION DE SA POSITION DANS LE SYSTEME DIGESTIF ET S’IL PEUT ETRE MIS EN RELATION AVEC LES SIGNAUX ELECTRIQUES LIES AU PERISTALTISME DIGESTIF A PLUS LONG TERME, CE DISPOSITIF, BASE SUR L’INGESTION DE CAPTEURS MINIATURES, POURRAIT PERMETTRE DE MESURER EN TEMPS REEL LE TRANSIT DIGESTIF CHEZ L’HUMAIN ET DE DETECTER DE MANIERE NON INVASIVE DES ANOMALIES DU TRANSIT SUSCEPTIBLES D’INDIQUER DES PATHOLOGIES DIGESTIVES. CE SYSTEME EST COMPLEMENTAIRE D’UNE SOLUTION COMMERCIALE DEJA EXISTANTE, QUI PERMET UNE VISUALISATION DIGESTIVE MAIS NECESSITE UNE INTERACTION HUMAINE POUR DEFINIR DES POINTS DE REFERENCE. UNE FOIS VALIDEE, CETTE TECHNOLOGIE POURRAIT EGALEMENT ETRE UTILISEE CHEZ LE PORC DANS UN CONTEXTE EXPERIMENTAL, NOTAMMENT POUR DES ETUDES DE NUTRITION, OU CLINIQUE. SON UTILISATION POURRAIT A TERME CONTRIBUER AU RAFFINEMENT DES METHODES DE MESURE DU TRANSIT DIGESTIF, EN PERMETTANT DE S’AFFRANCHIR DE L’UTILISATION D’ANIMAUX OPERES ET/OU DE MARQUEURS INDIGESTIBLES.

Procédures

Le projet prévoit l’utilisation de trois porcs femelles. Chaque animal sera soumis à une procédure unique, ORGANISEE EN DEUX ETAPES SUCCESSIVES ET S’ETALANT SUR UNE DUREE TOTALE D’ENVIRON 4 JOURS. LA PREMIERE ETAPE COMPREND UNE PERIODE DE JEUNE DE 12 HEURES (SOLIDES UNIQUEMENT), SUIVIE D’UNE ANESTHESIE GENERALE DE COURTE DUREE (ENVIRON 1 HEURE) AU COURS DE LAQUELLE UNE PREMIERE CAPSULE EST POSITIONNEE DANS LE TUBE DIGESTIF PAR VOIE ENDOSCOPIQUE. L’ANIMAL EST ENSUITE REVEILLE, REALIMENTE ET HEBERGE INDIVIDUELLEMENT PENDANT 72 HEURES. LA SECONDE ETAPE COMPREND UNE NOUVELLE PERIODE DE JEUNE DE 12 HEURES (SOLIDES UNIQUEMENT), SUIVIE D’UNE ANESTHESIE GENERALE CONTINUE D’UNE DUREE MAXIMALE DE 10 HEURES, SANS REVEIL. AU COURS DE CETTE ETAPE, UN CATHETER VEINEUX AURICULAIRE ET UN CATHETER VESICAL TRANSPUBIEN SONT MIS EN PLACE. UNE SECONDE CAPSULE EST POSITIONNEE DANS LE TUBE DIGESTIF PAR VOIE ENDOSCOPIQUE ET UNE SONDE DE MANOMETRIE EST INSEREE. DES EXAMENS D’IMAGERIE PAR SCANNER X SONT REALISES AU COURS DU SUIVI. L’ANIMAL EST MIS A MORT SOUS ANESTHESIE GENERALE PROFONDE A L’ISSUE DE LA PROCEDURE.

Impact sur les animaux

Le projet sera réalisé en veillant à ce qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. L’ensemble du protocole se déroulera sous anesthésie générale, avec un monitoring complet garantissant l’absence de douleur et l’absence de retour à l’état de conscience. LA PREMIERE ETAPE ETANT REALISEE AVEC REVEIL DE L’ANIMAL, ELLE PEUT ENTRAINER UNE FATIGUE TRANSITOIRE ET UNE DESORIENTATION AU REVEIL. LE MAINTIEN EN LOGE INDIVIDUELLE PENDANT LES 72 HEURES SEPARANT LES DEUX ETAPES EST A L’ORIGINE D’UN STRESS MODERE. Jeûne préalable (solide uniquement) : ce jeûne peut induire une sensation de faim susceptible de générer un inconfort temporaire. Ce risque est toutefois atténué par l’absence de jeûne hydrique. CETTE NUISANCE CONCERNE LES DEUX PERIODES DE JEUNE PREOPERATOIRE. Induction et maintien de l’anesthésie générale : des effets indésirables POTENTIELS LIES A L'ANESTHESIE sont possibles (hypotension, hypothermie, bradycardie, dépression respiratoire). De plus, l’intubation trachéale comporte des risques d’irritation locale et de microtraumatismes des voies respiratoires. Position en décubitus ventral prolongé : malgré l’anesthésie et la surveillance, il existe un risque d’hypoventilation, d’hypoxie ou de compression des organes. Insertion des dispositifs (endoscope, sonde manométrique) : peut provoquer une irritation muqueuse ou une stimulation mécanique locale. Ces effets indésirables sont identifiables et surtout quantifiables avec les méthodes de monitoring proposées. Les solutions pour les combattre sont précisées dans le paragraphe "déroulé du projet".

Devenir

Le projet implique des procédures expérimentales, nécessitant une anesthésie générale continue de longue durée (jusqu'a 10 heures), sans interruption, ni reprise de conscience. Le sort prévu est donc l'euthanasie en fin de procédure, sans réveil

Remplacement

Le recours à l'animal est rendu nécessaire car il s'agit de suivre le déplacement d'une capsule à visée médicale dans le tube digestif. Le déplacement de la capsule est assurée par la mobilité du tube digestif. A ce stade des travaux, cette étude ne peut pas être reproduite in vitro ou in cilico

Réduction

Le nombre d’animaux est limité à trois porcs, défini comme strictement nécessaire pour valider la faisabilité technique du protocole (franchissement pylorique, maintien du transit, imagerie). Le protocole est conçu comme une étude exploratoire, préalable à d’éventuelles études fonctionnelles. Les données issues de cette phase permettront d’optimiser les paramètres techniques et d’éviter l’utilisation ultérieure d’animaux inutiles. Chaque animal fera l’objet d’un suivi complet multiparamétrique (capsule, manométrie, imagerie), maximisant les données récoltées par individu.

Raffinement

Dans une situation où l’un des deux points limites suivants serait atteint - échec du positionnement de la capsule en raison de l’impossibilité de la placer dans LE DUODENUM par voie naturelle, ou déséquilibre anesthésique incontrôlable entraînant des réponses incompatibles avec la stabilité physiologique nécessaire à la poursuite de la procédure-, l’essai serait immédiatement interrompu pour les animaux concernés. UNE PREMIERE ETAPE SOUS ANESTHESIE GENERALE DE COURTE DUREE SERA REALISEE AFIN DE POSITIONNER LA CAPSULE EN AVAL DU PYLOR, SUIVIE DU REVEIL COMPLET DE L’ANIMAL ET D’UNE REPRISE ALIMENTAIRE AVEC ACCES A L’EAU. CETTE ETAPE PERMET DE FAVORISER LA REPRISE DE LA MOTILITE DIGESTIVE AVANT LA SECONDE ETAPE ET DE LIMITER LES PERTURBATIONS DU TRANSIT INDUITES PAR LE JEUNE ET L’ANESTHESIE PROLONGEE.

Choix des espèces

Le porc est connu pour être une espèce modèle pour l'homme. Il reste un animal proche de l’Homme, avec de grandes similitudes anatomiques et physiologiques notamment pour le tube digestif. Nous utiliserons dans cette étude des porcs conventionnels d'un poids 60-70 kg afin que les organes présentent des tailles comprables à l'Homme et qui sont pertinentes pour les recherches humaines. Son régime omnivore fait aussi de lui un modèle idéal pour la recherche en nutrition.

Une prostration, une déshydratation sévère ou une perte de poids importante peuvent conduire à la mise à mort d'un poulet avant la fin de l'essai. 15 poulets âgés de onze semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués une fois leur réponse en anticorps obtenue. Ils sont infectés par voie orale par Salmonella Gallinarum, agent de la typhose aviaire, puis subissent jusqu'à neuf prises de sang d'environ 1 mL à la veine de l'aile, sans médication contre la douleur prévue. Leur sérum sert à fabriquer un témoin positif pour les contrôles sanitaires obligatoires des élevages, en quantité calculée, selon le porteur, "sur la base des données de production et de vente" pour couvrir cinq ans.

Objectifs

La pullorose et la typhose aviaire sont des maladies infectieuses qui peuvent être dues à certaines Salmonella, il s’agit de maladies septicémiques qui affectent principalement les poulets et qui présentent une obligation de déclaration, de surveillance et de certification. Ce projet consistera en un protocole d’infection expérimentale conduit en animalerie protégée sur poulets afin d’obtenir des sérums positifs contre Salmonella.

Bénéfices attendus

Cette procédure doit permettre la production d’un sérum de référence positif vis-à-vis de Salmonella Gallinarum chez le poulet. Ce sérum (qui sera constitué de l’ensemble des différents sérums individuels obtenus par infection expérimentale sur poulets) permettra de valider (témoin positif) les tests sérologiques pour la technique d'agglutination rapide sur lame réalisés dans les contrôles sanitaires des élevages par les laboratoires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention d'une durée inférieure à 5 minutes lors de l’inoculation par voie orale de S. Gallinarum, lors des pesées des animaux ou des prises de sang. Les prises de sang, au maximum neuf, consistent en un prélèvement d’environ 1 mL au niveau de la veine alaire. Les prélèvements seront réalisés en alternance sur les deux ailes afin de limiter les sollicitations répétées d’un même site de prélèvement. Ces actes seront réalisés par des personnels expérimentés, toujours les mêmes, pour limiter au maximum le stress et la douleur chez les animaux.

Impact sur les animaux

La pullorose et la typhose aviaire sont des maladies infectieuses dues à Salmonella enterica enterica serovar Gallinarum (biovar Pullorum ou Gallinarum respectivement). Ces maladies septicémiques affectent principalement les poussins, les jeunes dindonneaux et faisandeaux et sont responsables d’une mortalité en coquille ou après l’éclosion. La maladie est moins grave chez les oiseaux plus âgés, c’est pourquoi il a été choisi des animaux agés de 11 semaines dans cette procédure. Bien que la mortalité puisse être élevée, les signes cliniques peuvent etre d'intensité variable, chez les adultes. Les animaux contaminés peuvent présenter une baisse de l'activité, une diminution de la consommation d'aliment et d'eau, un retard de croissance, un plumage ébouriffé, de la diarrhée et une déshydratation. Cet essai provoquera une phase de stress et de douleur légère qui seront générées par l’inoculation de la souche de Salmonella Gallinarum et les prélèvements réalisés chaque semaine sur les animaux (prises de sang). Cette douleur légère et passagère sera directement liée à l'acte de piqure qui est subie par l'animal : aucun protocole de médication particulière n'est prévu. L’inoculation et les prises de sang seront réalisées par des personnels expérimentés dans la réalisation de ces actes pour limiter au maximum leur stress et la douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort lorsqu'ils auront développé une réponse sérologique spécifique de Salmonella Gallinarum à la fin de l’essai.

Remplacement

La production de sérums de référence est nécessaire pour la validation des contrôles sanitaires obligatoires effectués dans les élevages. Cette production de sérum positif Salmonella Gallinarum ne peut être réalisée que sur espèces cibles (poulets) car il n’existe malheureusement pas, à ce jour, de méthodes alternatives de production de sérums expérimentaux spécifiques.

Réduction

L’expérience acquise a permis de limiter le nombre d’animaux utilisés, ainsi que le nombre d’interventions sur ces animaux. La quantité d’animaux à utiliser a été calculée au plus juste pour produire une quantité de sérum positif suffisante pour 5 ans. Nous espérons récolter entre 8 et 10 ml de sérum par animal. Toutefois, les titres en anticorps sont variables d’un animal à l’autre, et dans certains cas les titres peuvent être trop faibles, voire nuls. Ainsi, sur la base des données de production et de vente, une infection expérimentale de 15 poulets permet de récolter environ 100 ml de sérum positif, quantité utilisée par les laboratoires sur une période de 5 ans. L’objectif de l’étude étant la production et la caractérisation d’un sérum positif de référence, celle-ci ne nécessite pas d’analyse statistique.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Les 15 poulets inclus dans cette procédure expérimentale seront hébergés à l'âge de 7 semaines dans leur nouvel environnement et bénéficieront d’une période d'habituation de 4 semaines afin de favoriser leur adaptation et de limiter le stress lié au changement d'environnement. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). En plus de la litière, qui sera maintenue sèche et friable (renouvellements d’air important), il sera ajouté des cordes suspendues et des plateformes de perchage en grillage. Un suivi des animaux sera mis en place pendant toute la durée de l’essai, les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge. Les paramètres zootechniques (pesées des animaux au démarrage de l’essai, avant l’inoculation et avant chaque série de prélèvement ; suivi de la consommation d’aliment et d’eau) seront pris en compte tout au long de l’essai. Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les pesées, les prises de sang et l’inoculation individuelle des animaux seront réalisées conjointement par deux personnes habilitées dans le but de réduire la durée de la contention et de l’intervention sur l’animal afin d’en diminuer le stress induit. Les points limites sont définis afin de prévenir toute souffrance importante. Une surveillance régulière des animaux permettra de détecter une aggravation de leur état. Les signes attendus d’intensité légère à modérée et transitoire (baisse d’activité, diminution de la consommation, plumage ébouriffé, diarrhée légère, déshydratation légère) seront surveillés. Une altération importante de l’état général, une prostration, une déshydratation sévère, une incapacité à s’alimenter ou à boire, une perte de poids importante ou tout signe de souffrance sévère constitueront des points limites et entraîneront une prise en charge adaptée, pouvant aller jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les poules (Gallus gallus) constituent l'espèce la plus pertinente pour la production de sérums positifs dirigés contre Salmonella Gallinarum, car elles représentent l'hôte naturel et la principale espèce cible de ce pathogène. Les animaux mis en place auront 7 semaines d’age, et la procédure commencera lorsqu’ils seront agés de 11 semaines, afin de permettre une réponse immunitaire des animaux suffisament importante, mais également de réduire les risques de symptomes et d’effets indésirables de la maladie chez ces animaux.