Procédures modérées

Pour savoir si un élément issu d'anciens virus intégrés au génome freine la croissance des tumeurs, 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une implantation de cellules tumorales, puis, pendant six semaines au plus, deux mesures de la tumeur et deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine, avec épilation de la zone. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une tension de la peau, une baisse de mobilité et une dissémination à d'autres tissus. Les souris sont mises à mort plus tôt en cas de tumeur trop volumineuse, d'ulcération, de perte de poids ou de douleur.

Objectifs

Certains éléments présents dans notre génome proviennent d’anciens virus intégrés au cours de l’évolution. Ces éléments sont généralement inactifs, mais certains peuvent encore produire des molécules capables d’influencer le comportement des cellules. Nos travaux suggèrent que l’un de ces éléments pourrait jouer un rôle protecteur en limitant certaines propriétés des cellules tumorales. L’objectif de ce projet est de déterminer si la restauration de cet élément dans des cellules tumorales modifie leur capacité à former une tumeur et à progresser dans un organisme vivant. Pour cela, des cellules tumorales de souris seront modifiées en laboratoire, puis implantées chez des souris. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps par des mesures externes et par une méthode d’imagerie permettant de suivre les mêmes animaux de manière répétée. Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent influencer la progression tumorale et les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre certains mécanismes biologiques qui influencent la croissance et la progression des tumeurs. En particulier, il vise à déterminer si certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent contribuer à limiter le développement tumoral. Les résultats attendus pourraient apporter de nouvelles connaissances sur les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans l’organisme. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de recherche pour mieux comprendre les mécanismes qui freinent ou favorisent la progression des cancers.

Procédures

Tous les animaux recevront une seule implantation de cellules tumorales, réalisée sous anesthésie brève. Cet acte durera environ 5 à 10 minutes par animal, incluant l’anesthésie, l’implantation des cellules et la surveillance immédiate du réveil. La croissance des tumeurs sera ensuite suivie deux fois par semaine pendant 6 semaines maximum. Ce suivi comprendra une mesure externe de la tumeur, d’une durée d’environ 1 à 2 minutes par animal. Les animaux seront également suivis par imagerie deux fois par semaine. Pour cette imagerie, ils recevront un agent permettant de visualiser les cellules tumorales, puis seront placés sous anesthésie brève pendant l’acquisition des images. La durée totale d’une session d’imagerie sera d’environ 30 minutes par animal, incluant l’administration de l’agent d’imagerie, l’anesthésie, l’acquisition des images et la surveillance du réveil. Une épilation locale pourra être réalisée afin d’améliorer la qualité de l’imagerie. Elle sera limitée à la zone nécessaire et ne sera renouvelée qu’en cas de repousse gênant l’acquisition du signal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des cellules tumorales, aux manipulations répétées nécessaires au suivi, aux anesthésies brèves réalisées pour l’imagerie, ainsi qu’au développement de la tumeur. Les animaux pourront présenter une gêne transitoire au moment de l’implantation des cellules ou lors des manipulations. Le suivi par imagerie pourra entraîner un stress modéré lié à la contention, à l’anesthésie et aux manipulations répétées. Une irritation locale de la peau pourra également survenir après l’épilation limitée à la zone à imager. La croissance de la tumeur pourra provoquer une gêne locale, une tension de la peau, une masse palpable, une diminution de la mobilité selon la taille et la localisation de la tumeur, ou plus rarement une altération de l’état général. En cas de progression tumorale importante, une dissémination à d’autres tissus pourrait également contribuer à une dégradation de l’état général. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation. Cette mise à mort est nécessaire car le projet repose soit sur le suivi complet de la croissance tumorale, soit sur le prélèvement des tumeurs et de certains tissus pour réaliser des analyses biologiques. Ces prélèvements permettront d’étudier les caractéristiques des tumeurs, leur organisation, leur activité moléculaire et leurs interactions avec leur environnement dans l’organisme. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés dans un autre projet. Les animaux seront mis à mort au plus tard 6 semaines après l’implantation des cellules tumorales, ou plus tôt pour les groupes destinés à des prélèvements à des temps définis. Ils seront également mis à mort avant la fin prévue de l’étude si des critères d’arrêt sont atteints, notamment en cas de tumeur trop volumineuse, d’ulcération, de perte de poids, de douleur, de gêne locomotrice ou d’altération importante de l’état général.

Remplacement

Avant d’envisager cette étude chez l’animal, les cellules tumorales sont étudiées en laboratoire afin de caractériser leurs propriétés et de sélectionner les conditions les plus pertinentes. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas d’étudier correctement la croissance d’une tumeur dans un tissu, ses échanges avec les cellules environnantes, son accès aux nutriments, ni ses interactions avec le système immunitaire. Ces éléments sont pourtant essentiels pour comprendre comment une tumeur se développe et progresse dans l’organisme. Il n’existe donc pas, pour cette question, de méthode alternative permettant de remplacer complètement l’utilisation d’animaux. Le recours à la souris est nécessaire pour valider les observations obtenues en laboratoire dans un contexte biologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables, tout en évitant l’utilisation d’effectifs excessifs. Les groupes ont été dimensionnés afin de comparer plusieurs types de cellules tumorales et de tenir compte de la variabilité naturelle de la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sera suivie plusieurs fois chez les mêmes animaux, grâce à des mesures externes et à une méthode d’imagerie répétée au cours du temps. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux, car elle évite de constituer de nouveaux groupes uniquement pour suivre l’évolution des tumeurs à chaque étape. Une première série d’animaux permettra de définir les moments les plus pertinents pour les prélèvements biologiques. Cette stratégie évite de multiplier inutilement les temps d’analyse dans la seconde série et limite ainsi le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début de l’expérience afin de réduire leur stress. Les actes susceptibles d’être inconfortables seront réalisés sous anesthésie brève, avec protection systématique des yeux pendant l’anesthésie. Après chaque anesthésie, les animaux seront surveillés jusqu’à récupération d’un comportement normal, puis replacés dans leur cage d’origine. La croissance tumorale sera suivie régulièrement pendant 6 semaines maximum, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt. L’état général des animaux, leur poids, leur mobilité, leur alimentation, l’aspect de leur pelage et l’aspect de la tumeur seront contrôlés tout au long de l’étude. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas de perte de poids modérée ou de diminution de l’alimentation, une aide alimentaire sera mise en place. Si l’état de l’animal se dégrade ou si un critère d’arrêt est atteint, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle permet d’étudier le développement d’une tumeur dans un organisme vivant complet. Ce modèle permet de prendre en compte des éléments qui ne peuvent pas être correctement reproduits en culture cellulaire, comme l’organisation des tissus, les interactions entre la tumeur et les cellules environnantes, l’accès aux nutriments et les interactions avec le système immunitaire. Les cellules utilisées dans ce projet sont des cellules de souris. Les implanter chez des souris permet donc d’étudier leur comportement dans un environnement biologique adapté, sans introduire de différence d’espèce qui pourrait fausser l’interprétation des résultats. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune, à partir de 6 semaines. À cet âge, les souris sont sevrées, suffisamment développées pour permettre des manipulations reproductibles et disposent d’un système immunitaire fonctionnel. L’utilisation d’animaux plus jeunes serait moins adaptée en raison de leur développement encore en cours, de leur plus petite taille et de la difficulté accrue des manipulations répétées. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines maximum après l’implantation des cellules tumorales, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt.

Un microbiote administré par la bouche au premier jour de vie, puis le parasite Eimeria tenella vers deux semaines d'âge : 128 poussins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à J14 ou J21 pour prélever leurs cæcums. Le projet compare trois microbiotes face à la coccidiose, et le bénéfice attendu pour les poussins supplémentés se mesure en "meilleures performances zootechniques", pour une filière qui chiffre ses pertes à plus de 1,5 milliard d'euros par an. Le résumé mentionne aussi une pose de puces sous anesthésie, sans dire où ni pourquoi. Le porteur justifie le choix du poulet par le parasite, qui n'infecte que cette espèce.

Objectifs

Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques (>1,5 milliards d’euros/an dans le monde). Ces maladies sont provoquées par des parasites, Eimeria. La prophylaxie repose sur l’utilisation d’anticoccidiens et sur la vaccination. Le coût élevé des vaccins, l’apparition de résistances aux anticoccidiens et la demande des consommateurs pour limiter l’utilisation des anticoccidiens et des antibiotiques nécessitent le développement de nouveaux moyens de lutte plus naturels. Dans cet objectif, notre ambition est d'utiliser la modulation du microbiote pour atténuer la sévérité de la pathologie liée à l'infection par Eimeria. Comme nous l’avons décrit précédemment, nos résultats mettent en évidence un rôle du microbiote et/ou ses métabolites sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella incluant le développement du parasite E. tenella et sur la réponse inflammatoire associée à l’infection. La nature des bactéries et/ou leur métabolites impliqués dans cet effet restent encore à déterminer.Dans ce projet, nous comparerons différents microbiotes (témoin, adulte, commercial) sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella. Nous évaluerons l'effet de ces différentes compositions microbiennes caecales sur le développement des parasites, la formation de lésions et la réponse inflammatoire. La composition du microbiote et du métabolome seront déterminés avant l’infection expérimentale. Ensuite, les corrélations entre la composition du microbiote, ses fonctions et des paramètres d'infection seront déterminées pour détecter quel(s) microorganisme(s) sont impliqués dans le cas de pathologies plus ou moins sévères. Ce projet fournira des indications pour le développement d'un microbiote limitant les conséquences négatives de l'infection.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que les animaux supplémentés résistent mieux à l’infection (effet anticoccidien) et présentent par conséquent de meilleures performances zootechniques, moins de lésions, moins d’inflammation, moins développement parasitaire. Si l’administration d’un microbiote ne présente pas d’effet, les animaux présenteront des charges parasitaires et des paramètres lésionnels similaires à ceux du groupe témoin.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux administrations orales : une de microbiote et une du parasite Eimeria. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux. Chaque intervention dure environ 30 secondes à 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. Une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite, ni des signes cliniques sévères. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux.

Devenir

A J14 et J21, l'euthanasie des animaux est prévue pour des prélèvements des caeca et mesures de différents paramètres (parasitaire, inflammatoire, microbiote, métabolites).

Remplacement

L’agent pathogène Eimeria tenella responsable de la coccidiose a un spectre d’hôte restreint : il infecte exclusivement le poulet Gallus gallus. L’étude de l’influence du microbiote sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella nécessitent des expérimentations in vivo pour lesquelles des analyses des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, et du microbiote intestinal seront réalisées.

Réduction

Le nombre de 128 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Les effectifs sont basés sur les études de la littérature portant sur les analyses de microbiote lors de supplémentations pour avoir une différence significative.

Raffinement

Aucune étude in vitro n’a été réalisée en amont de ce projet, la pathologie étudiée et le cycle parasitaire ne pouvant être reproduits de manière pertinente qu’in vivo. Les poulets seront hébergés dans des conditions environnementales contrôlées et disposeront d’un enrichissement social et comportemental (dans des petites salles séparées au sol : petites rondelles en inox suspendues ou du bolduc suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans, des perchoirs qui apporte un enrichissement qui fait partie du comportement naturel et de la litière favorisant le grattage (litière de miscanthus pour éviter les poussières). Ils seront hébergés en groupe de 32 poussins, au sol, dont la température est régulée (ajout le lampe chauffante) avec aliment et eau ad libitum ainsi qu’un éclairage 12h/24h. Pour la pose de puces, l'anesthésie gazeuse flash dure quelques minutes et récupération très rapide des animaux, qui sont remis en lot dans la foulée. Pas de gène visible, ni de modification d’interactions entre les poussins. Limitation des nuisances sur le bien-être animal : Évaluation de l’état de santé des animaux deux fois par jour par le personnel de la plateforme expérimentale. Si atteinte du point limite : euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Les poussins à statut sanitaire protégé et contrôlé seront utilisés et seront l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. L'éclosion constituant une fenêtre unique pour l'implantation de bactéries et l'amélioration précoce des fonctions intestinales, l'implantation de bactéries pour améliorer précocement les fonctionnalités de l'intestin sera réalisée juste après l’éclosion (1er jour d’âge). Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à environ 2 semaines d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire.

Tous tués à l'issue, 1 500 rongeurs, 1 200 souris et 300 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des anticancéreux sur des tumeurs greffées dans le pancréas. Une partie subit une irradiation totale du corps avant la chirurgie qui implante la tumeur, puis jusqu'à quatre administrations par jour et des prises de sang répétées à la jugulaire, à la saphène ou à la queue. La tumeur peut provoquer une occlusion intestinale, un envahissement de l'abdomen et de l'ascite, et le gavage, rarement, une détresse respiratoire jusqu'à la mort. Le porteur juge le statut immunodéprimé de ces rongeurs "indispensable" à la greffe de cellules tumorales humaines, et ne donne aucune raison à leur mise à mort, annoncée en une phrase de quatre mots.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. Le cancer du pancréas, bien que ne représentant que 2.6% des diagnostics chaque année, est le sixième plus mortel et présente un très fort taux de mortalité (plus de 490 786 décès en 2024 pour environ 531 318 nouveaux cas) selon l’organisation mondiale de la santé (WHO). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer pancréatiques, les plus prédictifs possible, en condition orthotopique (présentant l’avantage d’inclure le microenvironnement tumoral aux études) afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs pancréatiques chez l’humain. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme afin d’arriver, avant les essais cliniques chez l’humain, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’Homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Le cancer du pancréas est le onzième cancer le plus diagnostiqué mais il est le sixième en termes de mortalité. Cette maladie très meurtrière nécessite donc un développement important de nouvelles stratégies pour la prise en charge des patients. Cela nécessite l’établissement de nouveaux modèles précliniques plus prédictifs afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme. Environ 90% des tumeurs pancréatiques présente une mutation dans le gène KRAS. L’essor récent des inhibiteurs de KRAS en clinique ouvre de nouveaux espoirs dans la prise en charge de cette maladie. Cependant, des mécanismes de résistance se développent et nécessitent d’être compris afin d’adopter des stratégies pour surpasser ces phénomènes de résistance. Dans ce contexte, le développement de nouveaux modèles précliniques, tout particulièrement orthotopiques, est incontournable pour le développement de futures molécules en préclinique puis en clinique chez les patients. L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Les études précliniques sur l’animal permettront d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique et de développer de nouvelles stratégies pour contourner ces phénomènes de résistance. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie dans le but de stimuler le système immunitaire contre le cancer. Cela pourrait permettre d’évaluer des immunothérapies dans le cancer du pancréas ce qui n’est pour le moment pas une pratique clinique approuvée.

Procédures

Différents types d’interventions sont prévus: • Irradiation totale avant induction tumorale: nécessite le transport des animaux et leur déplacement temporaire (1 à 2 fois par étude ; inférieur à 4h) • Induction tumorale : sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). • Imagerie non invasive (sous anesthésie pour une durée maximale d’1 heure. • Traitements par différentes voies d’administration (limité à 4 administrations par jour) : o Orale sur animaux vigiles (moins d’1 min) o Sous-cutanée sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intramusculaire sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intrapéritonéale sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intraveineuse sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) • Prélèvements sanguins effectués par voies : o Jugulaire (3 prélèvements par jugulaire/jours) (moins d’1 min) o Saphène (3 prélèvements par coté sur 24h) (moins d’3 min) o Caudale (2 prélèvements / 24h), (moins d’1 min) • Volume tumoral évalué par palpation des tumeurs nécessitant la contention des animaux (inférieur à 30 secondes) • Prélèvements d’urine réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention.

Impact sur les animaux

En cas d’irradiation, le transport peut engendrer un stress modéré pendant quelques heures (moins de 4h). La greffe tumorale peut engendrer une douleur et un stress modérés sur 1-2j. Lors de l’induction tumorale, un risque de phase septique à la réalisation des sutures est possible pouvant entrainer des douleurs abdominales et un stress pendant 3-4 jours. L’évolution de la tumeur peut entraîner une douleur généralement modérée (d’intensité variable selon chaque individu), une gêne, une occlusion intestinale, un envahissement de la cavité abdominale, de l’ascite et une perte de poids. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral peuvent entraîner un faible stress qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela peut engendrer un stress de 1-2j. Des effets locaux liés aux voies d’administration des traitements par piqûre peuvent survenir. Selon la voie utilisée, ce peut être : irritation / inflammation / œdème / rougeur / sensibilité / douleur transitoire / hématome ou plus rarement nécrose / une ulcération. Lors d’un gavage oral, une irritation de la cavité buccale, de l’œsophage ou de l’estomac, peut être observée. L’intensité de ces effets dépend de la dose administrée, du composé et de la fréquence. Les administrations répétées peuvent entraîner un stress cumulatif, généralement limité à la durée de la phase expérimentale. Le gavage oral peut provoquer un stress aigu temporaire et, rarement, une détresse respiratoire voir le décès de l’animal. Les administrations répétées peuvent majorer ce stress sur plusieurs jours à plusieurs semaines. Les prélèvements sanguins, peuvent induire une gêne ou une douleur légère de courte durée au point de prélèvement. Des prélèvements répétés peuvent entraîner un stress cumulatif et un impact physiologique limité. Les prélèvements d’urine et de fèces sont considérés comme peu invasifs et associés à un stress modéré lié à l’isolement temporaire. Les prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie comportent un risque anesthésique ponctuel limité à la durée de l’intervention. Les procédures seront réalisées dans des conditions contrôlées, avec une surveillance adaptée, l’application de points limites précoces et des mesures visant à réduire la douleur, la détresse et toute souffrance inutile.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais ne sont pas suffisantes.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. Il est estimé que 40 études seront réalisées sur 5 ans. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 10 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés minimum 2 fois par semaine. Le volume tumoral sera estimé, minimum 2 fois par semaine par palpation ou 1 fois par semaine par imagerie. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids sera supérieure à 10%. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages. La greffe de tumeur sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse avec administration préalable d’un analgésique opiacé. L’implantation de la greffe nécessitera l’incision de la peau, la chirurgie sera réalisée de façon aseptique et les animaux recevront une injection d’anti inflammatoire non stéroïdien en préopératoire ainsi que le lendemain, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Toutes les procédures invasives et la plupart des procédures peu invasives, seront réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés dont les compétences ont été validées. Les administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire et intradermique) seront réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal sera mis en observation et un traitement sera mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, (souris et rats) ont été choisis en raison de leurs caractéristiques physiologiques bien documentées et de leur utilisation largement reconnue en recherche préclinique. De plus ce sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Également, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique chez l’humain. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront des animaux adultes ou ayant atteint un stade de développement compatible avec les procédures expérimentales, avec une première manipulation réalisée à partir de 7 semaines d’âge. Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets de la chirurgie, les effets secondaires des composés à tester et les effets du développement tumoral.

196 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes celles opérées sont tuées pour prélever leur cerveau. Avant quatre jours de vie, les souriceaux reçoivent une injection de virus dans le cerveau, séparés de leur mère jusqu'à deux heures, puis une seconde injection cérébrale de trente à quarante-cinq minutes entre 24 et 28 jours. Le projet vise à démontrer chez un mammifère un mode de transport des vésicules dans les neurones, surnommé "Sushi-go-round", et ses retombées sur les maladies du système nerveux restent au conditionnel. Le porteur désigne le "cannibalisme maternel" comme le "plus gros problème" de ses procédures, et le résumé ne dit pas ce que deviennent les mères.

Objectifs

Comment les cellules du cerveau (les neurones) peuvent-elles réagir si rapidement aux signaux, alors qu'il faut parfois des minutes, voire des heures, pour que les molécules voyagent d’une cellule à l’autre? Grâce à l’utilisation de techniques in vitro et à la modélisation mathématique, nous avons découvert un nouveau mode de transport cellulaire expliquant comment le signal se transmet de façon rapide et efficace le long des connections cérébrales. Ces résultats, obtenus in vitro sur culture cellulaire de neurones, nécessitent maintenant d’être validés in vivo afin de démontrer la pertinence physiologique de ce nouveau mécanisme dans le cerveau de mammifère. Pour cela, nous proposons d’exprimer une molécule fluorescente dans le cerveau de souris adultes qui sera transportée le long des connections cérébrales. Nous bloquerons ensuite le mécanisme de transport en injectant un inhibiteur que nous avons identifié. Nous analyserons ensuite la localisation de la molécule fluorescente après fixation des tranches de cerveau. Si le nouveau mode de transport que nous avons découvert existe in vivo, nous devrions observer une accumulation de la molécule fluorescente au niveau des points de contact avec les neurones cibles. Ces travaux permettront ainsi de démontrer comment les neurones gèrent leur communication pour la transmission rapide et efficace du signal à travers le cerveau.

Bénéfices attendus

Le transport des vésicules dans les neurones est un processus essentiel qui permet de déplacer des protéines importantes du corps cellulaire vers les zones de communication entre les neurones, appelées synapses. Dans une étude précédente, nous avons découvert un nouveau mode de transport que nous avons surnommé "Sushi-go-round", qui joue un rôle dans la régulation de ces communications. Ce projet va nous permettre de prouver l'exitence de ce mode de transport chez les mammifères, ce qui nous aidera à mieux comprendre comment les neurones communiquent et s'adaptent. Ces découvertes pourraient avoir des implications majeures en neurosciences, en nous aidant à mieux saisir le fonctionnement du cerveau et en ouvrant de nouvelles voies pour comprendre les maladies qui affectent le système nerveux.

Procédures

Dans cette étude, des souris, qui n'ont même pas encore quatre jours de vie, vont recevoir une injection de virus dans une zone du cerveau. Cette opération dure entre 10 et 20 minutes. Pendant ce temps, les souriceaux seront séparés de leur mère pour un maximum de deux heures. Ensuite, quand ils seront âgés entre 24 et 28 jours (après sevrage), ils subiront une autre injection dans une autre partie précise de leur cerveau. Cette deuxième opération prendra un peu plus de temps, entre 30 et 45 minutes. Après un temps défini dans l’étape 0 du projet, les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux pour analyse.

Impact sur les animaux

- stress : Les souris nouveau-nés (P0-P4) et leurs mères seront séparés momentanément (120min maximum) donc cela engendrera du stress. -anesthésie : risque de déshydratation, dépression cardio-vasculaire et respiratoire, hypothermie. Après l’injection des nouveaux nés, un suivi de l’animal sera mis en place tous les jours pendant une semaine pour vérifier l’apparition de signes de souffrance (peau de couleur bleutée, vocalisation, changement de la respiration abdominale). Concernant les animaux sous chirurgie, un suivi postopératoire sera également mis en place pendant les 4h de traitement (Agité ou très immobile, vocalisation ou automutilation, Augmentation de la fréquence et de la respiration abdominale), jusqu’à leur mise à mort. Un traitement analgésique en sous cutané sera utilisé en présence de signes de souffrance.

Devenir

Tous les animaux ayant subis une chirurgie seront mis à mort pour les prélèvements.

Remplacement

Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une recherche précédente qui a été réalisée dans notre laboratoire, où nous avons découvert un nouveau moyen par lequel les cellules nerveuses peuvent communiquer rapidement entre elles. . Ces résultats proviennent d’analyse à partir de culture de cellules de souris. Maintenant, nous devons vérifier si ce même processus se produit dans un organisme vivant, la souris. C'est pourquoi nous ne pouvons pas nous passer de ce modèle animal pour nos prochaines étapes de recherche.

Réduction

Pour réaliser nos expériences, nous devons déterminer combien de souris nous avons besoin. Cette décision est basée sur des études précédentes, ce qui nous aide à garantir que nos résultats seront fiables et reproductibles. Nous avons prévu d'utiliser 15 souris par groupe pour certaines analyses, en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour une autre partie de notre étude, qui concerne l'activité électrique des neurones, nous utiliserons 10 souris par groupe. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires tout en assurant que nos résultats soient cohérents, nous allons d'abord tester les paramètres d'injection des virus. Cela nous permettra d'optimiser nos méthodes avant de commencer les expériences principales.

Raffinement

Lors de la chirurgie, les souriceaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. La croissance pondérale est le principal marqueur de bonne santé chez les nouveau-nés puisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir et que la mère s'occupe bien de lui. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).

Choix des espèces

Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle du transport axonal. Nous utiliserons des souris C57/BL6J. Les injections seront réalisées à deux stades de développements : 1/ Cerveau immature : injection de virus avant les 4 jours de vie du souriceaux 2/ Cerveau mature : injection après 21 à 24 jours de latence (après expression du virus) d'un inhibiteur du transport, pour visualiser l'accumulation de vésicules ( petites sacs) au niveau des prolongements des cellules nerveuses qui se trouve dans la zone du cerveau qui relie les deux hémisphères.

Après deux injections, dont celle de cellules de lymphome qui envahissent la rate et les ganglions, des souris sont pesées trois fois par semaine et prélevées de sang chaque semaine pendant cent jours au plus, certaines recevant en plus une injection quotidienne pendant quatorze jours. Au total, 6 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la maladie peut réduire leur activité et leur mobilité pendant une à deux semaines. Le projet cherche à savoir si la façon dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influe sur la réponse aux cellules CAR-T, avec des retombées pour les patients au conditionnel. Les lots décrits totalisent 5 580 souris, et le résumé ne dit rien des 1 080 autres.

Objectifs

Le lymphome est un cancer du sang agressif et fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très hétérogène, ce qui explique qu’environ 40 % des patients ne répondent pas durablement au traitement de référence. Pour certains de ces patients, une thérapie innovante peut être proposée : la thérapie par cellules CAR-T. Cette thérapie est un traitement révolutionnaire contre le cancer qui consiste à modifier génétiquement les propres cellules immunitaires du patient pour les transformer en « super-soldats » capables de repérer et de détruire les cellules cancéreuses. Malgré l’efficacité remarquable de cette thérapie chez certains patients atteints de lymphome, environ la moitié d’entre eux ne répondent pas ou rechutent rapidement, notamment au cours de la première année. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui déterminent l’efficacité de cette thérapie afin d’identifier de nouvelles stratégies permettant d’améliorer la réponse au traitement. Les cellules de lymphome peuvent utiliser différentes sources d’énergie pour se multiplier. L’objectif de ce projet est de déterminer si la manière dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influence leur sensibilité au traitement.

Bénéfices attendus

À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux identifier les patients susceptibles de répondre aux traitements et à développer de nouvelles stratégies permettant d’améliorer l’efficacité de cette thérapie chez les patients résistants.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur des animaux vigiles : Lots 1 à 3 : 2 340 souris : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 4 : 360 souris : mise à disposition ad libitum d’un régime alimentaire pendant une durée maximale de 100 jours, associée à deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 5 : 2 880 souris : : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Une injection par jour pendant 14 jours et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson à volonté pendant 5 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : 1/ un stress transitoire et un inconfort léger liés aux contentions, auxquels peuvent s’ajouter, selon les procédures, les manipulations nécessaires à l’administration des traitements ; 2/ les effets liés au développement de la tumeur : après leur injection, les cellules tumorales se multiplient principalement dans la rate et les ganglions lymphatiques, qui jouent un rôle important dans le fonctionnement du système immunitaire. La progression tumorale va entraîner une gêne légère à modérée et, à un stade plus avancé de la maladie, une diminution de l’activité ainsi qu’une mobilité réduite. Ces effets sont attendus environ 3 à 4 semaines après l’injection des cellules tumorales et peuvent persister pendant 1 à 2 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les organes et de réaliser les analyses in vitro nécessaires à l’obtention des résultats scientifiques.

Remplacement

Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement. Des études in vitro ont été menées en amont afin d’identifier et de sélectionner les mécanismes métaboliques les plus pertinents à étudier. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict minimum, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables. Nous avons utilisé un outil informatique, basé sur nos premières données, pour calculer le nombre d’animaux réellement nécessaires. Après la fin des expériences, nous recueillerons également plusieurs organes et tissus afin de réaliser un maximum d’analyses complémentaires avec les mêmes animaux. Enfin, le projet est organisé par étapes. En fonction des résultats obtenus au laboratoire et chez l’animal, certaines expériences pourront ne pas être réalisées si elles ne sont plus nécessaires.

Raffinement

Nous avons établi des critères d’arrêt précis, précoces et adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de limiter toute souffrance animale, tout en conservant une exploitation optimale des résultats scientifiques. Nous serons particulièrement attentifs à toute modification du comportement et de l’aspect physique des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. En absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.

Opérés sous anesthésie pendant trente à quarante-cinq minutes pour retirer la thyroïde et les parathyroïdes, puis pour certains réopérés afin d'implanter une minipompe, des rats reçoivent chaque jour, pendant quinze jours au plus, un candidat-médicament ou un placebo, avec des prises de sang à l'éveil. 345 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'hypocalcémie provoquée pouvant entraîner des tremblements, une baisse d'activité et une perte de poids. Le porteur prévoit cinq rats par groupe pour en inclure trois dans l'étude, sans dire ce qu'il advient des deux autres. Tous sont tués à la fin pour prélever leurs organes, ou plus tôt si l'hypocalcémie produit des "effets marqués".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de candidat-médicaments sur la régulation du calcium chez le rat ayant subi une thyroïdectomie préalable. L'hypoparathyroïdie est un déficit en hormone parathyroïdienne. Chez l'homme, elle est souvent causée par une maladie auto-immune ou des suites d'une chirurgie au niveau des glandes thyroïdes ou parathyroïdes. L'hormone parathyroidienne, ou parathormone, est principalement impliquée dans le métabolisme du calcium de l'organisme et dans la régulation de la calcémie. Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont liés à une hypocalcémie et comprennent des fourmillements dans les mains ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Le traitement comprend en première intention une supplémentation en calcium et en vitamine D. Ce traitement ne répond pas correctement sur tous les patients et ne permet pas une régulation très fine de la calcémie au cours de la journée (pics d'hypercalcémie suivis de phases d'hypocalcémie). Il ne permet pas de diminuer le risque de complications à long terme de l'hypoparathyroïdie (p. ex., hypercalciurie, diminution de la densité minérale osseuse). Dans ce cas des traitements à base de parathormone recombinée sont nécessaires. Aucun traitement de ce type n'est approuvé à ce jour.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer les effets bénéfiques de nouveaux médicaments pour traiter l'hypoparathyroïdie, une pathologie humaine touchant 40 personnes pour 100000 et pouvant avoir une application également en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

Ce projet nécessite différents types d'interventions. Dans un premier temps, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée sur certains animaux afin de réaliser une ablation de la thyroïde et des parathyroïdes (durée: 30-45min). Certains animaux pourront subir une seconde chirurgie afin d'implanter un dispositif (minipompe) permettant la délivrance d'un produit en perfusion continue (durée: 15-20 min). Les animaux opérés seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la/les chirurgies, les candidat médicament ou le placebo seront administrés tous les jours aux animaux par voie sous-cutanée (bolus ou perfusion) (durée 1-2minutes) pendant un maximum de 15 jours. Des prélèvements sanguins seront effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile (durée des prélèvements: moins de 3min).

Impact sur les animaux

Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont connus et clairement identifiés chez l'homme, et consistent en des fourmillements dans les extrémités ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Ces effets sont liés à une hypocalcémie et seront maitrisés par des apports quotidiens en calcium ou des traitements à base d'analogue de la parathormone endogène, partiellement ou totalement absente dans ce modèle. Les effets potentiellement indésirables du/des produit(s) font l’objet d’échanges avec les inventeurs du nouveau candidat médicament pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiperau mieux de potentiels signes cliniques. Chez le rat, l'hypocalcémie peut entrainer des tremblements, une diminution de l'activité locomotrice et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort en fin de procédure pour la réalisation de prélèvement d'organes ou suite à des effets marqués liés à l'hypocalcémie.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme et la régulation du calcium dans l'organisme sur des sujets atteints d'hypoparathyroïdie ou, si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est de mesurer les taux de calcium circulant dans le sang, et d'évaluer les mécanismes de régulation de ce dernier, ce qu'il n’est pas possible de mesurer sur des cellules ou organes isolés mais qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. 5 animaux par groupe seront utilisés pour en inclure 3 par groupe en étude et ce nombre a été montré suffisant pour répondre aux objectifs de l'étude.

Raffinement

Le raffinement de la procédure expériementale sera obtenu par un protocole anesthésique et analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire et un suivi post opératoire de l'état de santé des animaux (avec grille de scoring) avec des soins adaptés. Les animaux seront manipulés pour diminuer le stress lié aux contentions. Les animaux sont également suivis quotidiennement (suivi pondéral et signes cliniques). Des points limites adpatés sont définis et le recours à une supplémentation orale en calcium + vitamine D en cas d'hypocalcémie associée à des signes cliniques, ou à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets d’un produit sur la calcémie et le métabolisme du calcium dans l'organisme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

78 des 174 macaques à longue queue de ce projet doivent être gardés en vie puis réutilisés dans d'autres études, les 96 autres tués pour analyser leurs tissus infectés. Dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 144 d'entre eux sont colonisés par des bactéries hospitalières, parfois multirésistantes, et tous subissent jusqu'à sept anesthésies générales et neuf prises de sang par semaine, des lavages rectaux, des traitements et l'implantation d'une puce de télémétrie, certains des biopsies rectales et des gavages d'antibiotiques. Après l'inoculation, chaque macaque est logé seul, face à un congénère à deux mètres. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'usage de primates "reste nécessaire", malgré "les efforts pour privilégier ces alternatives", qu'il ne décrit pas.

Objectifs

L’étude des sepsis, c’est-à-dire des réactions anormales et excessives de l’organisme face à une infection, constitue un enjeu majeur de santé publique. Les sepsis engendrent une mortalité élevée, estimée à environ 11 millions de décès par an dans le monde, due à l’absence de traitements réellement efficaces. Les formes les plus sévères de sepsis sont le plus souvent liées à des bactéries retrouvées dans les intestins. Ces bactéries finissent par circuler dans les hôpitaux et représentent aujourd’hui une menace importante pour les systèmes de santé. De plus, la résistance aux antibiotiques développée par ces bactéries constitue un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale. Cette augmentation de la résistance aux antibiotiques rend le traitement des infections graves beaucoup plus difficile et accroît le risque de développer des sepsis sévères. Dans ce contexte, le développement de stratégies visant à prévenir l’infection en réduisant ou en éliminant, au niveau de l’intestin, les bactéries susceptibles de provoquer des infections chez les patients à risque apparaît comme une approche prometteuse contre à la fois le sepsis et la multirésistance aux antibiotiques. L’étude envisagée vise à mettre en place un modèle de colonisation digestive chez des primates non humains par des bactéries pertinentes du contexte hospitalier, multirésistantes ou non, afin d’évaluer, tester et optimiser des stratégies innovantes permettant d’éliminer ces bactéries.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le développement de modèles de colonisation intestinale par différentes bactéries d’intérêt pour tester de nouvelles stratégies de décolonisation intestinale pouvant être utilisées chez des patients à risque avant le développement d’infections sévères.

Procédures

- Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupées pour limiter leur nombre (1 à 7 fois par semaine, 174 animaux, 30-45 minutes). Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 9 fois par semaine, 174 animaux, 5 minutes - Récoltes de fluides rectaux/trachéaux ou nasaux (1 à 5 fois par semaine, 174 animaux 2 minutes). - Biopsies rectales, (2 fois maximum, 30 animaux, 30 minutes). - Lavages rectaux (1 à 2 fois par semaine, 126 animaux, 20 minutes). - Lavages broncho-alvéolaires (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 10 minutes). Interventions - Inoculation bactérienne (1 fois 144 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des molécules thérapeutiques (ou placebo) (jusqu’à 6 fois, 174 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des antibiotiques par gavage (4 fois 144 animaux, 5 minutes) - Imageries in vivo (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 45 minutes).

Impact sur les animaux

Les méthodes expérimentales ont été définies de manière à éviter toute souffrance lors des interventions (limitation des volumes sanguins prélevés, expositions et traitements réalisés sous anesthésie générale). Anesthésies, prélèvements de sang Perte d’appétit avec perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection au site d’injection possible dans les jours qui suivent le prélèvement (rare, quelques jours). Traitements Réaction locale, démangeaisons et/ou douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Perturbation de la flore intestinale, vomissement et/ou diarrhée transitoire. Colonisation L’étape de colonisation ne s’accompagne souvent d’aucun signe clinique particulier. Cependant, en cas de passage des bactéries dans le sang ou d’infections pulmonaires, des signes cliniques de l’infection bactérienne peuvent apparaitre : fièvre, perte d’appétit, difficultés respiratoires pendant quelques jours. Nuisances liées aux traitements antibiotiques L’altération de la flore intestinale peut causer des diarrhées et entérites (quelques jours) Implantation de puces de télémétrie Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Biopsies rectales : Des signes cliniques liés aux biopsies rectales : réaction inflammatoire au site de la biopsie, perte d’appétit, saignements, pendant quelques heures/jours Nuisances liées à l’hébergement individuel : Les animaux seront hébergés en groupe avant exposition et en hébergements individuels proches, permettant des interactions sociales pendant la phase d’expérimentation. Nuisances suite aux écouvillonnages : Saignement pouvant aller de quelques secondes à quelques minutes. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation de la trachée liée à l’intubation. Toux, difficultés respiratoires légères juste après le geste. Nuisance liée à la mise à jeun (

Devenir

Pour l’étude de mise en place de modèle : les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études compatibles après avis vétérinaire. Cependant, si les animaux montrent des signes d’infection, ils seront euthanasiés afin d’étudier l’infection dans les tissus. Dans l’étude d’évaluation de la sécurité des traitements, les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études après avis favorable du vétérinaire. Dans les études d’efficacité des traitements, tous les animaux seront euthanasiés, dans le but de faire des analyses des tissus infectés.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en place des modèles de colonisation intestinale par des bactéries souvent retrouvées chez des patients hospitalisés, afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques de décolonisation. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire, la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries de l’intestin. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Le primate non-humain, étant proche de l’humain au niveau anatomique, immunitaire et physiologique, permet de reproduire la complexité de ces interactions, nécessaires pour permettre une colonisation intestinale par des bactéries retrouvées chez les patients. Cela permet ainsi d’évaluer de façon fiable tout nouveau traitement avant son utilisation chez l’être humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Dans la phase de mise en place du modèle, les conditions optimales d’inoculation de la bactérie seront déterminées selon un procédé étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Cette méthode permet de réduire le nombre d’animaux, en évitant de multiplier les essais. Dans les études de tolérance et de distribution, seules les stratégies de décolonisation ayant déjà démontré une efficacité chez le petit animal (rongeurs) seront testées dans cette étude chez le primate non humain. Ensuite, pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter des différences statistiques entre les groupes.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire leur nombre. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. Les animaux seront hébergés en groupes puis en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales après inoculation bactérienne (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés de 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, et par renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, éviter une contamination croisée, et permettre d’associer le prélèvement d’excréments à l’animal. Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques liés au traitement afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux ainsi que leur alimentation (des points limites sont mis en place). Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, anti-douleurs localement). L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué, qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement anti-douleur sera appliqué avant la chirurgie.

Choix des espèces

Dans ce projet, le macaque a été sélectionné pour sa proximité génétique, anatomique et physiologique avec l’être humain. Son appareil digestif ressemble beaucoup à celui de l’être humain au niveau anatomique, mais aussi au niveau de l’environnement intestinal incluant le microbiote. Le macaque reproduit la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries naturellement présentes dans l’intestin. Cela en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la colonisation bactérienne par des bactéries retrouvées chez l’être humain et l’étude de la tolérance à de nouveaux traitements. Ces bactéries pouvant être retrouvées dans l’intestin de personnes de tout âge, nous envisageons de réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature et un microbiote intestinal stable.

Deux mois d'hébergement à 30 °C pour douze d'entre elles, afin de dérégler leur graisse brune : 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, leurs organes et leur plasma. Toutes subissent deux prises de sang à la queue et un régime liquide chargé de glucose marqué, et vingt-quatre une échographie de trente minutes sous anesthésie. Le projet met au point une méthode de traçage par l'alimentation qui éviterait la pose chirurgicale d'un cathéter, et le porteur en attend moins de souris tuées "dans de futurs projets". Les plus jeunes entrent dans l'étude à cinq semaines, pour avoir environ trois mois à la sortie de la chaleur, âge où leur graisse brune est assez développée pour, selon le porteur, y "induire un dysfonctionnement".

Objectifs

Avec le fait que les gens vivent de plus en plus longtemps, il devient très important de garder les personnes âgées en bonne santé, autonomes et avec une bonne qualité de vie. En vieillissant, le corps devient moins efficace pour faire face aux stress et pour maintenir un bon équilibre énergétique. Cet équilibre correspond au fait que ce que l’on mange (apports) et ce que le corps dépense restent en balance. Normalement, plusieurs organes travaillent ensemble pour maintenir cet équilibre et s’adapter aux changements. Mais avec l’âge, cette coopération fonctionne moins bien, ce qui peut favoriser des problèmes métaboliques (comme le diabète ou l’obésité). Parmi les organes importants, il y a les tissus adipeux (les graisses du corps) avec la graisse blanche (stockage d’énergie) et la graisse brune et beige (qui brûle l’énergie sous forme de chaleur). Avec le vieillissement, ces tissus (surtout les graisses brunes et beiges) fonctionnent moins bien. Cela peut perturber la manière dont le corps utilise et distribue l’énergie, ce qui impacte le fonctionnement global de l’organisme. Pour étudier comment l’énergie circule dans le corps, les chercheurs utilisent des approches spéciales : ils donnent à des souris des molécules “marquées” (repérables) pour suivre leur transformation dans le corps. Ces approches nécessitent souvent une chirurgie pour réaliser une perfusion intraveineuse via un cathéter. De plus, elles sont très compliquées et ne sont pas toujours adaptées pour étudier certains types de molécules comme les lipides (graisses). Ce projet a donc pour objectif de développer une méthode plus simple et plus efficace (avec l’utilisation d’un régime liquide spécial au lieu d’une chirurgie) pour suivre ces molécules dans le corps et de valider une technique d’analyse qui va permettre d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques auparavant). Une fois ces méthodes validées, elles permettront de mieux comprendre comment le métabolisme change quand certaines graisses (brunes et beiges) ne fonctionnent plus correctement au cours de l’âge. Ce projet sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer d'étudier comment certaines graisses du corps (les tissus adipeux) en particulier brunes et beiges influencent le métabolisme, en particulier la gestion des lipides (les graisses), lorsqu'elles ne fonctionnent plus correctement. Si cette perte d’activité observée au cours de l'âge joue un rôle dans les problèmes du métabolisme, alors ces tissus pourraient devenir des cibles importantes pour maintenir un bon équilibre énergétique, favoriser un vieillissement en meilleure santé et diminuer la dépendance des personnes âgées. Par ailleurs, ce projet permettra grâce à l'utilisation d'un régime liquide de diminuer la souffrance des animaux en évitant une chirurgie. De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Procédures

Pour la totalité des souris, une prise de sang à la queue sera réalisée juste avant le changement de régime puis juste avant la mise à mort. Vingt-quatre animaux subiront une seule échographie, qui durera 30 minutes environ, sous anesthésie gazeuse pour mesurer leur debit sanguin. Douze animaux seront hébergés pendant deux mois à une température de 30°C (température dite de thermoneutralité). Toutes ces interventions seront réalisées dans un service de zootechnie.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - le stress lié à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux prélèvements sanguins en raison de la contention nécessaire à la prise de sang, - le stress possible lié à la température d’hébergement de 30°C (30°C étant la température de thermoneutralité pour la souris c'est à dire température à laquelle la souris ne met pas en jeu le frisson et/ou l'augmentation du métabolisme énergétique pour réguler sa température corporelle)(par expérience cette température de 30°C n'engendre généralement pas de stress particulier), - le stress possible liè au changement de régime (toutefois ce régime liquide à été décrit comme sans stress).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever leurs tissus et organes ainsi que du plasma pour réaliser l'analyse des molécules du corps et étudier le devenir de ces molécules.

Remplacement

Notre projet consiste à mettre au point une méthode d'administration de molécules marqués et d'extraction de ces molécules afin d'étudier la distribution et le devenir de ces molécules dans l'organisme en entier dans un contexte d'inactivation des tissus adipeux. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de molécules entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les approches in vitro ne peuvant pas être envisagées car elles ne permettent pas d'avoir cet aspect intégré d'échanges de molécules. De même les approches in silico ne peuvent pas être utilisées car elles ne sont pas en capacité de modéliser la complexité du métabolisme de chacun des organes d'un idividu et les échanges de molécules qui ont lieu entre ces différents organes. Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les tissus adipeux bruns et beiges, a été bien étudiée.

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle observée concernant le métabolisme, pour chacune des conditions, 8 souris seront utlisées (4 souris supplémentaires seront utilisées comme contrôles non marquées). Ce nombre d'animaux est necessaire pour avoir 90% de chance de voir une différence significative sur la quantité de molécules marquées. Pour déterminer ce nombre de souris le logiciel EDA a été utilisé (outil d'analyse permettant de déterminer le nombre d'animaux en se basant sur le plan expérimental et les statistiques). De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour diminuer la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Pour le transport entre les deux bâtiments, les animaux seront tranportés, à pieds, dans leur cages d'origines (pour diminuer le stress) placées dans un système de transport de type sac isotherme opaque fermé. Dix minutes plus tard à l'arrivée au second bâtiment, les animaux seront directement placés soit sur un portoir ventilé identique au premier bâtiment pour les souris hébergées à 21°C, soit dans une armoire à thermoneutralité similaire au premier bâtiment pour les souris hébérgées à 30°C afin de diminuer le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …). Elles seront également surveillées et pesées (par une personne impliquée dans le projet) tous les 15 jours pendant les deux mois d'hébergement à 30°C, en début et fin d'acclimatation au régime liquide puis toutes les 24h pendant l'exposition au régime liquide supplémenté avec le glucose marqué. La vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté seront contactés pour avis lorsque une souris présentera une perte de poids supérieure à 10% par rapport au poids initial et/ou sera prostrée, aura le poil hirsute, le dos rond, des signes de diarrhée (postérieur sale, souillé). Toute souris sera mis à mort quand elle présentera une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial et/ou après avis de la vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les graisses brunes et beiges, a été bien étudiée. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois et des souris âgées de 5 semaines afin que ces dernières aient environ 3 mois après les deux mois d'hébergement à 30°C. A cet âge les souris sont de jeunes adultes avec une graisse brune bien développée sur lequel nous pouvons induire un dysfonctionnement suite à l'hébergement à thermoneutralité (30°C).

Toutes mises à mort après un prélèvement sanguin terminal, pour récupérer leurs organes, 172 souris mâles et femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une injection unique dont le résumé ne précise pas la nature, elles suivent un régime spécifique pendant 24 à 40 semaines pour développer une maladie chronique du foie, et une partie reçoit chaque jour par voie orale, par gavage ou prise volontaire, un antihistaminique ou un traitement de référence pendant 12 à 20 semaines. Ces antihistaminiques sont déjà autorisés chez l'humain contre l'acidité gastrique, et leur profil, leur sécurité d'emploi et leurs effets indésirables sont, selon le porteur, "déjà bien documentés". Il conclut pourtant que l'utilisation des souris "demeure donc nécessaire".

Objectifs

Les maladies chroniques du foie touchent environ 1,5 milliards de personnes dans le monde. Elles évoluent dans la majorité des cas vers la fibrose du foie, qui peut progresser vers une cirrhose puis un cancer du foie. Malgré les progrès réalisés dans leur prise en charge, les options thérapeutiques permettant de ralentir cette progression restent limitées. L'objectif de ce projet est d'évaluer le potentiel d'une stratégie thérapeutique reposant sur le repositionnement de médicaments déjà utilisés chez l'Homme pour d'autres indications. Les travaux permettront d'étudier leur capacité à limiter la progression des maladies chroniques du foie et à prévenir le développement du cancer dans un modèle expérimental pertinent. Ces molécules sont déjà autorisées en clinique pour le traitement des pathologies liées à l'hypersécrétion acide gastrique. Leur repositionnement thérapeutique est particulièrement intéressant, car leur profil pharmacologique, leur sécurité d'emploi et leurs effets indésirables sont déjà bien documentés. Le projet vise également à améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans l'évolution des maladies hépatiques chroniques chez la Femme. Le CHC présente un dimorphisme sexuel marqué : son incidence est plus élevée chez les hommes que chez les femmes, et des différences liées au sexe influencent également la progression de la fibrose, la carcinogenèse et la réponse aux traitements. Afin de prendre en compte ces différences biologiques et d'améliorer la transposabilité des résultats à l'ensemble de la population de patients, cette étude sera réalisée chez des animaux mâles et femelles. Une étude pilote permettra d'abord de caractériser la cinétique de progression de la maladie chez les femelles afin d'adapter le calendrier expérimental à leur évolution plus lente.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies de traitements des maladies hépatiques chroniques et de prévention du cancer du foie. Si l'efficacité des molécules étudiées est confirmée, leur repositionnement thérapeutique pourrait accélérer leur évaluation clinique dans cette indication, grâce aux données déjà disponibles concernant leur sécurité d'emploi, réduisant ainsi les délais de mise à disposition par rapport au développement d'une nouvelle molécule. Les connaissances acquises sur les différences biologiques liées au sexe pourraient également contribuer au développement de stratégies thérapeutiques mieux adaptées aux femmes et aux hommes, favorisant à terme une prise en charge plus personnalisée des maladies hépatiques chroniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure expérimentale visant à reproduire une maladie chronique du foie observée chez l'Homme. Cette procédure comprend une injection unique réalisée en début d'étude, réalisé en moins d’une minute, ainsi que la mise en place d'un régime alimentaire spécifique pendant 24 à 40 semaines, selon le sexe. Une partie des animaux recevra un traitement expérimental ou un traitement de référence administré par voie orale, une fois par jour, pendant une durée de 12 à 20 semaines selon le sexe. Les administrations seront réalisées sur des animaux vigiles et dureront moins d'une minute. Les animaux seront surveillés après chaque administration afin de détecter précocement toute complication liée au gavage ou à l'administration volontaire, selon la modalité retenue. À la fin de l'étude, un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite mis à mort et les organes d'intérêt seront prélevés afin d'évaluer l'évolution de la maladie et les effets des traitements étudiés.

Impact sur les animaux

Les principaux effets attendus sont liés au développement progressif de la maladie hépatique induite expérimentalement. Cette maladie est généralement asymptomatique tout au long de son évolution. Une légère perte de poids transitoire peut être observée au début du régime alimentaire spécifique, avant une compensation progressive. Dans de rares cas, au cours de la progression de la maladie, certains animaux pourront présenter une altération modérée de leur état général, se traduisant notamment par une diminution de l'activité, un pelage moins soigné, une modification de la posture ou une diminution de la prise alimentaire. Les manipulations répétées nécessaires à l'administration quotidienne des traitements peuvent entraîner un stress léger et transitoire. Ils seront surveillés après chaque administration afin de détecter rapidement toute complication éventuelle liée à la procédure. Les traitements évalués pourraient avoir un effet bénéfique en ralentissant la progression de la fibrose hépatique et en limitant le développement des lésions tumorales. Toutefois, ces effets constituent précisément l'objet de cette étude.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les organes et tissues nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Avant la mise en place de cette étude, des travaux ont été réalisés sur des modèles expérimentaux cellulaire. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les maladies chroniques du foie, notamment leur progression et le développement du cancer. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet et évaluer le potentiel de notre stratégie thérapeutique à l’échelle de l’organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé à l'aide d'une analyse statistique réalisée à partir de données préliminaires et de résultats déjà obtenus dans ce modèle expérimental. Cette approche permet d'utiliser le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement fiables et répondre aux objectifs du projet.

Raffinement

Afin de limiter au maximum les nuisances subies par les animaux, les procédures expérimentales ont été optimisées et les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi comprenant du matériel pour nidifier, pour ronger et des abris pour se cacher. Une période d'acclimatation et d’habituation à la méthode de traitement sera respectée avant le début des expérimentations. Lorsque cela sera compatible avec les objectifs scientifiques de l'étude, une administration volontaire sera privilégiée afin de limiter le stress lié aux manipulations. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière de leur état général et de leur poids. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin de mettre fin à la procédure si un animal présente des signes de souffrance ou d'altération importante de son état de santé. Les procédures terminales seront réalisées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour étudier les maladies chroniques du foie. Les mécanismes responsables de l'accumulation de graisse dans le foie, de l'inflammation, de la fibrose et du développement du cancer du foie sont largement similaires entre les deux espèces. Les modèles murins ont ainsi permis de mieux comprendre ces maladies et de développer de nouveaux traitements, dont certains sont aujourd'hui utilisés chez les patients. Les animaux seront inclus dans l'étude à partir de l'âge de 8 semaines, correspondant à un jeune âge adulte chez la souris, afin de reproduire les premières étapes de développement de la maladie hépatique.

Pour savoir si un cocktail de pesticides aux doses réglementaires, associé à un régime riche en graisses et en sucres, favorise le cancer du pancréas, 230 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes. Gardées jusqu'à sept mois d'âge au plus, elles peuvent développer un diabète modéré et une fibro-stéatose du foie, et subissent trois prises de sang, deux échographies sous anesthésie et deux tests de tolérance au glucose après jeûne. Le gavage, absent de la liste des procédures, n'apparaît que parmi les effets néfastes, sans fréquence ni durée. Une grille d'évaluation fixe le seuil de souffrance "trop importante" qui déclenche la mise à mort d'une souris, sans que ses critères soient donnés.

Objectifs

Le cancer du pancréas PDAC (adénocarcinome canalaire pancréatique) est un cancer très mortel ; il est devenu la troisième cause de décès par cancer. La France fait partie des pays pour lesquels l’augmentation de l’incidence et de la mortalité par cancer du pancréas est la plus élevée, avec une augmentation constante depuis les années 1970. Comprendre les stades initiaux de ce cancer est essentiel pour prévenir l'augmentation de son incidence et de sa mortalité et pour développer des stratégies de prévention pour ce cancer létal. Les facteurs génétiques de ce cancer sont bien identifiés : environ 80 % des patients présentent une mutation sur le gène KRAS, un véritable "accélérateur" biologique qui, lorsqu'il est altéré, pousse les cellules à se multiplier de façon incontrôlée. De plus en plus d’études (épidémiologiques et/ou expérimentales) suggèrent que les facteurs environnementaux contribuent également au développement du cancer du pancréas. Parmi ceux-ci, certaines études montrent qu’un régime riche en graisses peut contribuer à ce cancer et l’obésité est l'un des facteurs décrits pour ce cancer. Certains contaminants alimentaires comme les pesticides sont considérés comme des facteurs de risques potentiels dans l’induction de cette pathologie, mais il n’y a pas à ce jour de données expérimentales pour émettre une conclusion définitive. Notre objectif principal est le suivant : La population humaine Française en général n'étant pas exposée à de fortes doses d'un seul pesticide, nous souhaitons évaluer si l'exposition chronique à un cocktail de pesticides, individuellement présents à des doses réglementaires, trouvés dans l'alimentation de la population française combinée à un régime alimentaire occidental (riche en graisse, riche en sucres) pourrait favoriser l'initiation du cancer du pancréas via des dérégulations du métabolisme. Nous testerons ces changements de régime alimentaire dans un modèle murin génétiquement modifié qui est susceptible de développer un cancer du pancréas en présence de stress.

Bénéfices attendus

La population générale étant exposée quotidiennement à des doses de pesticides ne dépassant pas les LMR (Limites Maximales de Résidus), ce projet vise à évaluer l'impact réel de ces substances sur la santé. Nous étudierons si une exposition prolongée à un mélange représentatif des pesticides retrouvés dans l'alimentation française, ou à un régime alimentaire de type occidental (riche en graisses et en sucres), peut favoriser le déclenchement du cancer du pancréas. Dans ce cadre, nous analyserons également les perturbations hormonales et métaboliques causées par ces régimes, notamment sur la régulation de la glycémie ou sur les signaux chimiques libérés par le foie et le tissu graisseux. Retombées et bénéfices attendus : Ce projet permettra de déterminer pour la première fois si des doses faibles mais répétées de pesticides jouent un rôle clé dans l'apparition du cancer du pancréas. À moyen terme, ces découvertes fourniront des preuves scientifiques solides pour guider les politiques de santé publique, établir de meilleures recommandations nutritionnelles et environnementales, et ainsi mieux prévenir et réduire le risque de développer ce cancer très agressif.

Procédures

Les souris feront l'objet de trois prises de sang, réalisées à plus d'un mois d'intervalle. Pour suivre l'état du pancréas, deux échographies de 15 minutes seront effectuées sur chaque animal, à plus d'un mois d'intervalle. Cet examen d'imagerie non invasif réalisé sous une anesthésie utilise des ultrasons pour visualiser les organes en direct et en profondeur sans douleur. Pour évaluer la fonction pancréatique, deux examens de suivi appelés tests de tolérance au glucose seront réalisés. Cet examen consiste à administrer aux souris une eau très sucrée après une période de jeûne, puis à mesurer l'évolution du taux de sucre dans le sang grâce à de courtes prises de sang régulières, afin de vérifier la capacité du corps à réguler le taux de sucre dans le sang.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec le régime occidental hypercalorique vont progressivement prendre du poids associé à des perturbations métaboliques progressives telles que le développement d’un diabète d’intensité modérée et d’une fibro-stéatose (infiltration de graisse et rigidifié par du tissu cicatriciel) d'intensité légère du foie. Ces altérations s'installent de manière progressive sur plusieurs semaines et correspondent à une nuisance d'intensité modérée, sans altération brutale de l'état général des animaux. Les altérations génétiques n’entraînent pas au stade précancéreux de modifications du fonctionnement normal ni du pancréas ni des souris ; on dit que ces modifications sont asymptomatiques. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une douleur aigüe de faible intensité et de très courte durée (quelques secondes), sans effet persistant. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress de courte durée et d'intensité modérée lié à la contention préalable à l’anesthésie. Le gavage peut également entraîner un stress des animaux lié à la contention, d'intensité modérée et de courte durée (quelques minutes). Lorsqu'il est réalisé par du personnel expérimenté, ces gestes n'entraînent pas de douleur significative ni de complication.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet décrit l’utilisation de souris génétiquement modifiées dans le contexte d’une exposition alimentaire à un cocktail de pesticides. Ces souris seront utilisées pour le prélèvement d’organes. A ce jour, elles ne peuvent être substituées par un autre modèle : - Il n’existe pas d’organoïdes (assemblage de cellules cultivées en 3D qui reproduit en miniature la structure et le fonctionnement du pancréas) établis de lésions pancréatiques précancéreuses ; Les organoïdes ou des lignées de cellules de ne permettent pas d’étudier l’effet sur tous les types cellulaires du microenvironnement. - Nous étudions une exposition par la nutrition, les étapes de digestion et l’effet sur le dialogue entre les organes métaboliques sont nécessaires à la compréhension de notre problématique.

Réduction

Pratiques mises en œuvres pour réduire le nombre d’échantillons : Cette étude est basée sur une étude pilote réutilisant les échantillons de pancréas d’une expérience étudiant le foie. Elle nous a permis de valider le cocktail de pesticides utilisés, les doses, et d’exclure un bras de l’étude pour lequel les pesticides n’ont pas eu d’effet additifs avec le régime alimentaire occidental. Ceci nous évite des expériences de test de doses et a permis de réduire le nombre d’individus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en petits groupes stables dans des cages thermo-régulées et ventilées, dans un environnement sanitaire très strict garanti sans microbes pathogènes. La température, l'humidité et le rythme jour/nuit (12 heures de chaque) sont réglés automatiquement. La nourriture et la litière sont systématiquement stérilisées. Pour leur bien-être et leur confort, les cages sont équipées de matériel d'enrichissement (maisonnettes dômes, de quoi fabriquer un nid). Une surveillance quotidienne est assurée par un personnel qualifié pour détecter tout signe d'inconfort ou de douleur. En cas de souffrance trop importante (définie par une grille d'évaluation), l'animal est immédiatement euthanasié sans douleur par du personnel agréé pour éviter tout mal-être prolongé. Enfin, le suivi de l'état du pancréas est réalisé en direct par imagerie médicale non invasive sous anesthésie gazeuse (isoflurane), permettant à la fois de suivre précisément l'évolution chez chaque individu et de limiter au maximum le stress et l'inconfort de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de la souris (Mus musculus) est le seul qui permette de reproduire fidèlement l'ensemble des étapes de formation du cancer, la diversité des cellules impliquées ainsi que la complexité des mécanismes biologiques clés. Les souris seront étudiées uniquement à l'âge adulte (à partir de 8 semaines), une fois le développement de leur pancréas totalement achevé, et jusqu'à l'âge de 7 mois maximum pour l'analyse de leurs organes.