Procédures modérées
Formation aux gestes techniques spécifiques
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Aucune connaissance ne sort de ce projet : 600 souris sont utilisées pour entraîner du personnel aux gestes d'injection, de prélèvement sanguin et d'administration par voie orale, nasale ou trachéale. 450 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger et 150 un niveau modéré, chacune tuée dès le geste appris. Les prélèvements peuvent provoquer des hématomes, les injections une douleur locale que l'animal signale en se léchant ou en se mordant, et le porteur précise que les actes se font sous anesthésie générale sans analgésie prévue. Il affirme que les rongeurs en plastique existants ne suffisent pas, puisqu'il faut un animal vivant pour un prélèvement rétro-orbital et une souris qui respire pour qu'une instillation intra-nasale soit efficace.
Objectifs
L’objectif du projet est de former les personnes aux gestes techniques des différents types d’injections, de prélèvements et d’administration de substances par différentes voies afin d’assurer le bon déroulement des protocoles expérimentaux en termes scientifique et de bien-être animal. Il s’agit d’un renouvellement de projet. La formation sera dispensée par des personnels 'tuteurs' de l’unité bien formés à ces gestes et sensibilisés au bien-être animal.
Bénéfices attendus
La maîtrise des gestes est un prérequis pour le succès des futures procédures d’expérimentation animale du laboratoire, destinées à faire progresser les connaissances pour identifier des pistes thérapeutiques en santé humaine à moyen terme. La formation permettra aussi de faire en sorte que la manipulation des animaux soit effectuée selon les bonnes pratiques en termes de bien-être animal. Il s’agit du renouvellement d’un projet. Les bénéfices obtenus du précédent projet comprennent la formation de 3 nouveaux personnels sur contrat, 1 doctorant et de 2 personnels permanents.
Procédures
Il est prévu un prélèvement de sang (maximum 5 minutes/souris) ou une administration (maximum 5 minutes/souris) sur animaux anesthésiés ou vigiles selon le cas et les bonnes pratiques vétérinaires.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent principalement les prélèvements sanguins pouvant générer des hématomes. Les injections peuvent occasionner une douleur localisée au point d’injection qui pourra être détectée si l'animal a tendance à se lécher ou se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les administrations, intra-nasale ou intratrachéales, réalisées sous anesthésie, et le gavage ne devraient causer qu’une gêne passagère. Si l’animal est en souffrance au cours de la procédure, il sera mis à mort. Il s’agit d’un projet renouvelé, sans nuisances relevées lors du précédent projet, la majorité des actes étant réalisés sous anesthésie et de gravité légère.
Devenir
Dans cette DAP ‘Formation aux gestes techniques spécifiques’ nous limitons le nombre de geste par animal, l’animal est donc mis à mort une fois la formation au geste réalisée.
Remplacement
Ce projet est à visée de formation du personnel aux bons gestes techniques expérimentaux sur la souris afin de réaliser les protocoles de recherche avec compétence. Même si des rongeurs en plastique ont été développés pour permettre certains aspects de la formation à l’expérimentation animale, leur utilisation est limitée pour apprendre la maîtrise des gestes techniques de prélèvements sanguins, d’injections ou d’administration par voie orale, intra-nasale ou intra-trachéale. En effet, l’utilisation de rongeurs en plastique n’est pas possible puisqu’il est nécessaire d’avoir un animal vivant pour réaliser un prélèvement sanguin rétro-orbital ou sub-mandibulaire, il faut que la souris respire pour que l’instillation intra-nasale soit efficace, et il faut ouvrir la bouche de la souris pour effectuer l’administration par gavage ou intra-trachéale. De plus il n’est pas possible de vérifier que le volume injecté est allé directement dans les poumons par coloration avec le bleu Evans sur un rongeur en plastique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour acquérir la maîtrise du geste. Ainsi il est estimé qu’une répétition, soit 2 fois 5 animaux par groupe, sera nécessaire. Les animaux utilisés seront issus de l’élevage ne pouvant pas être utilisés pour les projets de recherche.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être et suivis avant et pendant l’expérimentation afin d’éviter au maximum la douleur et le stress au moment de l’expérimentation. Les dommages attendus pour l’animal sont limités, les gestes se faisant sous anesthésie générale, sans analgésie prévue, et les animaux étant mis à mort juste après le geste technique ou dès l’atteinte des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
La souris permettra l’apprentissage des gestes techniques - Les souris (consanguines ou génétiquement modifiées) âgées de 2 à 10 mois seront utilisées dans ces études. - L’établissement utilisateur où se situe notre laboratoire, utilise principalement des souris, ce qui nous donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, selon les références bibliographiques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 2 mois et 10 mois) qui correspond à l’âge des animaux étudiés dans les protocoles de recherche.
Étude du rôle d’une protéine impliquée dans l’agressivité tumorale dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
À six à dix jours de vie, les souriceaux sont séparés de leur mère pour un prélèvement de tissu de queue sur animal vigile. Ceux dont le génotype ne sert à rien sont tués aussitôt, les autres reçoivent pendant cinq jours une molécule qui inactive les gènes visés et déclenche des tumeurs de la prostate, puis une partie est castrée chirurgicalement en quinze minutes sous anesthésie. 3 656 souris vont être utilisées au total, 2 148 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 508 d'un niveau modéré. Elles sont tuées au plus tard un mois après la castration, avant le délai au-delà duquel le porteur reconnaît qu'une tumeur grossissante peut gêner la miction, et leur prostate est collectée.
Objectifs
Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez l’homme dans le monde et la seconde cause de mortalité par cancer. Il s’agit d’un cancer dépendant des androgènes, une hormone, qui, en se fixant à son récepteur favorisent la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques. Ainsi, les cancers de la prostate localement avancés et métastatiques sont traités par déprivation androgénique afin de bloquer toute activation de la voie de signalisation des androgènes. Cependant, bien que ce traitement soit efficace durant les premiers mois, la majorité des patients rechutent et progressent vers un cancer résistant à la castration. A l’heure actuelle, l’efficacité des thérapies disponibles pour ces patients reste limitée. C’est pourquoi, il est urgent de rechercher de nouveaux mécanismes impliqués dans la carcingénèse prostatique et la résistance à la castration. Dans ce projet, nous proposons d’étudier le rôle d’un nouveau candidat dans un modèle murin de cancer de la prostate et dont le potentiel thérapeutique a déjà été démontré dans le cancer du sein et le glioblastome. Cette étude nous permettra de déterminer si ce candidat pourrait être une cible thérapeutique pour les patients ayant un cancer de la prostate.
Bénéfices attendus
Les thérapies actuellement disponibles pour les patients atteints d’un cancer de la prostate ont un bénéfice clinique limité. Parmi ces traitements, les inhibiteurs de protéines impliqués dans la réparation des cassures de l’ADN ont démontré une efficacité limitée en raison de la faible proportion de patients éligibles à ces thérapies et l’apparition de résistances. Mieux comprendre le mode d’action de ces protéines permettrait d’optimiser les thérapies actuelles. Dans cette étude nous souhaitons donc évaluer la contribution de l’une de ces protéines dans le cancer de la prostate.
Procédures
Procédure Expérimentale 1 : Prélèvement de tissu pour génotypage sur animal vigile de 6 à 10 jours d'une durée de 10 minutes environ, réalisé une seule fois par animal. Procédure Expérimentale 2 : Les souris adultes seront injectées avec une molécule permettant d’inactiver les gènes d’intérêt pendant 5 jours (3 minutes par souris). Si besoin, ces souris seront nourries avec de la nourriture contenant cette molécule. L’utilisation de cette molécule a pour but d’induire le développement de tumeurs prostatiques. Les souris seront mises à mort à différent temps, et la prostate sera prélévée pour des analyses au laboratoire. Procédure Expérimentale 3 : Les souris seront injectées avec une molécule permettant d’inactiver les gènes d’intérêt pendant 5 jours (3 minutes par souris). Si besoin, ces souris seront nourries avec de la nourriture contenant cette molécule, puis castrées chirurgicalement à un temps précoce ou tardif de la maladie. La chirurgie sera faite sous anesthésie et analgésie. Cette intervention dure environ 15 minutes pour chaque souris. Les souris seront mises à mort au plus tard 1 mois après castration.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue des souriceaux induit une douleur légère de courte durée au point de biopsie et peut induire un stress lié à la séparation des souriceaux de leur mère pendant les quelques minutes de manipulation. Les souris peuvent être sujettes à un stress physique lors de la contention. Le grossissement de la tumeur peut dans de rares cas générer un inconfort (notamment une gêne urinaire) à des temps tardifs (au-delà de 12 mois). Des nuisances liées à l’anesthésie à l’isoflurane pour la castration peuvent être attendues tels qu’un stress passager, l’hypothermie ou troubles de la récupération. Des effets indésirables peuvent également être observés lors des différentes manipulations : les injections peuvent entraîner une infection et la castration peut induire une infection post-opératoire. De plus, la molécule utilisée pour induire un cancer de la prostate peut conduire à un relâchement du canal inguinal, une vérification du scrotum (présence d’œdème, asymétrie, tension) sera donc réalisée pour détecter ces éventuels effets indésirables.
Devenir
A l’issue du génotypage, les animaux de génotype désiré seront dédiés au maintien des lignées, ou serviront à des expériences. Les animaux de génotype inutile seront mis à mort immédiatement après le génotypage en fin de procédure. Après induction d'un cancer de la prostate, les souris seront mises à mort selon une cinétique définie d'après notre expertise et l’étude pilote réalisée dans ce projet. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en oeuvre du projet de recherche.
Remplacement
Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle d'un nouveau candidat dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration. Une alternative pourrait être l’utilisation de modèles de culture 3D. Cependant, il est clairement défini que les communications entre le microenvironnement tumoral (cellules immunitaires diverses, fibroblastes associés au cancer…) et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans la progression tumorale et la résistance au traitement. Cette complexité ne peut pas être atteinte même à l’aide de culture 3D puisque l’ensemble des paramètres ne pourront pas tous être réunis. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs en fonction des expériences à réaliser. Deux études pilotes seront réalisées afin d’éviter d’utiliser un protocole d’induction du cancer de la prostate non adapté et de déterminer au mieux la cinétique d’évolution des tumeurs. Une étude pilote « cinétique » nous permettra de déterminer les temps les plus intéressants à utiliser pour les analyses plus approfondies, et ainsi réduire le nombre d’animaux étudiés par lignée. Certains modèles de souris proposés dans cette étude servent de contrôles, le nombre de ces souris contrôles pourrait être revu à la baisse après plusieurs étapes de validation.
Raffinement
Durant toute la vie des animaux, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute souffrance inutile. Une habituation des animaux sera mise en place quelques jours avant les différentes procédures expérimentales afin de limiter leur stress. Dans un souci de raffinement et dans la mesure du possible, des procédures alternatives moins invasives pourront être mises au point lors de nos expérimentations.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est justifié par le fait que les questions scientifiques posées ne peuvent pas être étudiées dans des organismes invertébrés et que nous pouvons utiliser chez la souris des animaux génétiquement modifiés pour répondre aux objectifs scientifiques. La souris présente également une composition prostatique, un système immunitaire et des gènes similaires à l’homme. Selon les procédures, les animaux sont des nouveaux nés âgés entre 6 et 10 jours ou seront des adultes. Ils seront mis à mort selon une cinétique définie selon notre expertise. Pour la procédure de génotypage, les animaux sont des nouveaux nés agés entre 6 et 10 jours. Pour le reste, les animaux utilisés seront adultes et seront mis à mort selon une cinétique définie selon notre expertise.
Apport de la thérapie génique pour soigner le syndrome d’Usher de type 2A
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Des souriceaux âgés d'un jour reçoivent une injection dans l'oreille interne, d'autres une injection sous la rétine à trente jours, puis passent sous anesthésie des tests auditifs répétés à un, deux et trois mois, des tests d'équilibre dont un dure trente et une minutes, et seize heures d'obscurité avant l'enregistrement de leurs réponses à des flashes lumineux. 2 310 souris vont être utilisées, 60 opérées sans réveil, 210 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 2 040 d'un niveau modéré. Le porteur écrit qu'aucune dégradation de leur état n'est attendue hormis un risque limité de cataracte, alors qu'il annonce pour les deux lignées créées une surdité et des troubles visuels modérés. Toutes sont tuées entre six jours et onze mois après l'injection, pour des prélèvements post-mortem.
Objectifs
Le syndrome d’Usher est l’une des principales causes de surdicécité héréditaire chez l’enfant. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour prévenir et/ou corriger les déficits sensoriels responsables de ces atteintes auditives et visuelles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins du syndrome d’Usher de type 2 (USH2). Nous testerons trois stratégies de thérapie génique dans des souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables des pertes visuelles et auditives décrites dans le syndrome d’Usher de type 2A et de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder la maladie. A court terme : - L’utilisation d’une souris porteuse de la mutation humaine nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la maladie dans les cellules sensorielles de la rétine et de l’oreille interne. - Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de ces stratégies pour corriger les troubles sensoriels chez nos souris déficientes. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques afin de prévenir ou retarder la cécité et la surdité chez les patients atteints du syndrome d’Usher de type 2A. Ceci inclut : - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques.
Procédures
Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes à 30 minutes en fonction du type d’injections. Tests auditifs : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifiée par 2 tests (l’un durant 31 minutes, l’autre 2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à deux autre tests (10 à 60 secondes chacun). Un test de nage sera finalement réalisé (10 secondes) avant le retour en cage d’hébergement. Tests Visuels : Les souris injectées au niveau de la rétine seront soumises à des tests entre 2 et 11 mois post-injection. Elles seront placées à l’obscurité 16 heures avant leur anesthésie, puis exposées à de brefs flashes lumineux d’intensité croissante. Les réponses électriques générées seront enregistrées à l’aide d’électrodes placées sous les paupières. Des mesures seront également réalisées entre 0 et 60 minutes après désensibilisation à la lumière (exposition lumineuse intense de 3 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en la protéine étudiée fonctionnelle présentent des déficits visuels et auditifs modérés. Les deux nouvelles lignées de souris que nous souhaitons créer pourraient présenter des phénotypes similaires. Aucune aggravation de phénotype n’est attendue pour ces lignées. Les injections dans l’oreille interne et dans la rétine seront réalisées sous anesthésie et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en pré- et post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue, hormis un risque limité de cataracte. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté contribuera à rétablir les fonctions sensorielles des souris injectées. En découle la liste ci-dessous des interventions après raffinement, et de leurs éventuels effets indésirables supérieurs ou égal à une piqûre d’aiguille : 1) Pour la création de deux lignées de souris transgéniques déficientes en la molécule étudiée, élevées dans un milieu fortement enrichi -> surdité et troubles visuels modérés 2) Pour les injections dans l’oreille ou sous-rétiniennes sous anesthésie et analgésie, avec soins pré- et post-opératoires -> pas de nuisance attendue du fait des injections réalisées sous contrôle stricte pré et post-opératoire.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements post-mortem à des fins d’analyses.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de la rétine ou de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus visuel ou mécanique par certains récepteurs ou cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à la rétine ou à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous aurons recours à la souris dans notre projet pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la cécité ou la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons retraité les données issues de souris normales et mutantes avec un outil statistique. Nous avons déterminé qu’il nous faudrait un minimum de 5 individus par groupe. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons.
Raffinement
A) Grille d’évaluation d’un phénotype dommageable : Notre projet prévoit la création de deux nouvelles lignées de souris transgéniques. Dans la mesure où toute création d’une nouvelle lignée de souris implique de surveiller la survenue d’un phénotype dommageable, nous suivrons la « fiche d'évaluation de phénotype suite à une création de lignée » proposée par notre SBEA. Ainsi, sur un minimum de 14 mâles et de 14 femelles (issues de 4 portées distinctes), pour chacune de nos deux lignées, nous examinerons un panel de critères physiques et comportementaux à trois stades : 1) à la naissance : taille des portées, soins apportés par les mères, présence d’une poche de lait stomacale, poids, apparence, réactivité, 2) au sevrage : âge du sevrage, nombre de souris sevrées, proportion mâles/femelles, poids, apparence, réactivité, 3) à 2 ou 3 mois : poids, apparence, déplacement, posture. La survenue d’un signe clinique grave (souriceaux cyanosés, cachexie, poil hirsute, prostration, lésion cutanée ou malformation) et persistant (plus de 24h) entrainera la mise à mort de l’individu concerné. B) Enrichissement de l’environnement Chez la souris, les troubles sensoriels peuvent s’accompagner d’hyperactivité, de désorientation, de stress et de bagarres (chez les mâles). D’expérience, nous avons remarqué que pour limiter ces effets, il suffisait d’ajouter deux igloos par cage, des copeaux en carton (et non pas en coton propice aux garrots), des bâtonnets en bois à grignoter (1 par souris), et d’équilibrer le nombre d’animaux normaux et d’animaux déficients dans une même cage. Les cages doivent de plus être manipulées avec une très grande délicatesse et le moins souvent possible (moins d’une fois par jour). Les personnes amenées à intervenir sur nos cages de souris déficientes sont alertées sur les consignes à appliquer. C) Monitoring des souris en amont et en aval d’une anesthésie avec ou sans chirurgie L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par notre SBEA.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’œil et de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Afin de nous rapprocher de la pathologie humaine, nous souhaitons nous focaliser sur une région du génome pour lequel un variant pathologique a été décrit. Il n’existe pas à ce jour de modèles murins impliquant précisément cette région, raison pour laquelle nous souhaitons créer deux nouveaux modèles de souris mutées pour cette région. Ces deux modèles vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections sous la rétine se feront sur des animaux âgés de 30 jours, soit à un stade où l’espace sous la rétine est bien formé. Les injections dans l’oreille se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 6 jours et 11 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.
Gestion de la production d’animaux expérimentaux de lignée NOD SCID
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Maintenir en animalerie la production d'une lignée de souris immunodéficientes, disponible pour d'autres projets : 545 souris NOD SCID vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun acte expérimental ne leur est infligé, la souffrance vient du phénotype lui-même. Leur système immunitaire génétiquement affaibli les rend vulnérables aux infections, elles peuvent développer un lymphome spontané qui limite leur vie à huit mois environ, un diabète chez certaines femelles, une perte progressive d'audition dès trois mois et des difficultés de cicatrisation. Une partie sera tuée dès qu'un point limite est atteint, les autres gardées vivantes pour la reproduction de la lignée ou versées à un projet déjà autorisé.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de maintenir la production d'une lignée immunodéficiente en animalerie avec un statut sanitaire stricte
Bénéfices attendus
Les animaux utilisés dans ce projet possèdent une particularité importante : ils ne réagissent pas contre certaines cellules étrangères qu’on leur greffe. Cela permet d’introduire des cellules provenant d’un autre animal, ou même de l’humain, sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour pouvoir étudier dans de bonnes conditions le devenir de ces cellules dans le corps. Les animaux seront gardés en vie pendant une période limitée, jusqu’à un maximum de 5 mois, car au-delà, ils peuvent développer une maladie naturelle à leur état fragile. Cette précaution est prise pour garantir leur bien-être, aussi bien pour les souris utilisées à des fins de reproduction que pour celles destinées à d’autres projets expérimentaux. Ce projet permettra de maintenir cette lignée fragile dans notre animalerie, afin qu’elle soit disponible pour des recherches futures, dans un autre cadre déjà autorisé.
Procédures
Les animaux ne subiront aucune intervention directe autre que celle liée à leur phénotype particulier. En effet, cette lignée est porteuse d’un phénotype dommageable, ce qui signifie qu’elle peut développer, avec l’âge, des troubles graves comme un lymphome thymique spontané. Pour éviter cela, les animaux sont utilisés sur une période 6 mois, avant l’apparition de ces signes, et suivis cliniquement chaque jour.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans ce projet sont très fragiles. Leur système de défense est génétiquement affaibli, ce qui les rend très vulnérables aux infections. Ils peuvent aussi développer spontanément une forme de cancer du système lymphatique (lymphome) à partir d’un certain âge, ce qui limite leur durée de vie à environ 8 mois. Chez certaines femelles, du diabète peut aussi survenir, ce qui peut réduire leur capacité à se reproduire. Certaines souris peuvent développer un faible niveau de cellules immunitaires fonctionnelles, ce qui peut affecter les résultats des études si cela n’est pas surveillé. Enfin, une perte progressive de l’audition dès l’âge de 3 mois, ainsi que des difficultés de cicatrisation en cas de blessure peuvent survenir. Toutes ces fragilités sont bien identifiées et seront surveillées de près.
Devenir
Certains animaux seront mis à mort lorsqu’un point limite est attaint, afin d’éviter toute dégradation de leur état de santé. D’autres animaux seront gardés en vie, soit pour être utilisés dans un projet expérimental déjà autorisé ainsi que pour assurer la reproduction et le maintien de la lignée dans l’animalerie. Ces décisions seront prises en fonction de l’état des animaux, de leur âge, et des objectifs de suivi dans les projets associés.
Remplacement
La lignée immunodéficiente est indispensable dans ce projet car aucun autre modèle murin ni aucune méthode in vitro ne permet de reproduire ses propriétés immunologiques. Ces souris sont dépourvues de lymphocytes T et B fonctionnels, ce qui rend possible la greffe stable de cellules allogéniques ou xénogéniques (notamment humaines) sans rejet. Cette tolérance est une nous permettant l’étude des effets neurofonctionnels à moyen terme de cellules greffées dans notre région cérébrale d’intérêt. Le recours à un système in vitro ou à un autre modèle murin immunocompétent exigerait une immunosuppression pharmacologique, ce qui pourrait interférer avec les résultats que nous obtiendrons en affectant les fonctions neuronales, gliales et vasculaires. De plus, aucun modèle computationnel ou organoïde ne permettrait d’évaluer de manière fiable l’impact des cellules greffées sur l’organisme in vivo. Ainsi, la lignée immunodéficiente ne peut être remplacée dans ce projet, car elle est la seule à permettre une analyse intégrée, physiologiquement pertinente et immunologiquement stable des greffes cellulaires dans le cerveau vivant.
Réduction
La production est strictement adaptée aux besoins expérimentaux et à la fragilité de la lignée. Seuls les animaux nécessaires sont élevés, avec une planification par petites cohortes. Le nombre de reproducteurs est limité, et renouvelé régulièrement en raison de la courte durée de vie reproductive des femelles. Cette organisation permet d’éviter toute surproduction tout en assurant une disponibilité continue des animaux pour les projets autorisés.
Raffinement
Bien que le phénotype dommageable associé à cette lignée ne s’exprime pas durant la période expérimentale prévue, des mesures spécifiques de raffinement sont mises en œuvre pour anticiper toute expression subclinique et garantir le bien-être des animaux. Les souris sont hébergées en conditions barrière, dans des portoirs individuellement ventilés, sous un tatut sanitaire strict, afin de minimiser l’exposition à tout agent pathogène. Leur environnement est enrichi avec des matériaux de nidification, des cachettes et des objets à ronger, afin de réduire le stress chronique, facteur aggravant dans les lignées immunodéficientes. La densité d’animaux par cage est limitée : pour la reproduction, un maximum de deux femelles avec leur portée est autorisé. Ces conditions strictes sont indispensables pour garantir la survie, le bien-être et la validité scientifique des données obtenues chez ces animaux vulnérables. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, intégrant des grilles d’observation standardisées portant sur l’état du pelage, la respiration, le comportement spontané et le poids corporel. Des points limites sont définis a priori. Une euthanasie immédiate sans attendre de dégradation supplémentaire sera envisagée une fois un point limite atteint.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, à développement rapide, modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation d'un modèle murin est la seule approche permettant d’observer directement une corrélation entre les cellules qui nous intéresse et sa fonctionnalité. La souris est également est un modèle animal qui permet de disposer de lignées immunodéprimées, indispensables pour les séries d’expérimentation qui vont être effectuées. Celles-ci sont décrites dans une autre DAP Les souris seront mises en expérimentation après le sevrage, entre P21 et P25. La reproduction se fera entre 6 et 8 semaines d’âge, en restant attentif à l’éventuelle apparition de diabète chez les femelles, généralement observée entre 10 et 14 semaines.
Impact de la manipulation pharmacogénétique d’un circuit cérébral sur la consommation d’aliments palatables et la rechute dans des modèles d’obésité et d’hyperphagie boulimique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trépanés pour une chirurgie intracérébrale sous anesthésie générale, 520 rats reçoivent ensuite jusqu'à cinq injections d'un médicament activant les cellules ciblées, puis passent des enregistrements d'activité de vingt-quatre heures et un test d'anxiété en labyrinthe surélevé. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et durent de six à douze semaines après l'opération, tous les rats étant tués pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Il s'agit de savoir si perturber un circuit cérébral de la récompense augmente la consommation d'aliments gras et sucrés après un sevrage forcé, ce qui reproduit une rechute. Le porteur décrit une douleur de trépanation "généralement transitoire mais parfois prolongée" tout en la présentant comme "efficacement minorée", et héberge les rats seuls tout en qualifiant ce stress d'atténué par les contacts entre cages voisines.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle d’un circuit cérébral impliqué dans le contrôle de la récompense et de la motivation, dans la régulation des comportements alimentaires compulsifs et dans la rechute après un sevrage d’aliments très appétissants (riches en graisses et en sucres) chez le rat. Ces comportements reflètent des situations observées dans l’hyperphagie boulimique et l’obésité, deux troubles alimentaires fréquents où le système de récompense du cerveau est perturbé et où le risque de rechute est élevé. Dans des travaux préliminaires, nous avons montré que perturber sélectivement ce circuit entraîne une augmentation marquée de la consommation de graisses, aussi bien lors d’un accès continu à un régime gras et sucré qu’après une période de sevrage, ce qui reproduit un phénomène de rechute. Ces résultats suggèrent que ce circuit joue un rôle essentiel dans le contrôle des comportements alimentaires compulsifs et leur réapparition après une abstinence forcée, ce qui en fait une cible d’intérêt pour mieux comprendre et prévenir ces troubles chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les circuits cérébraux impliqués dans la surconsommation d’aliments très appétissants et la rechute après une période de sevrage. L’étude ciblée de ce circuit, grâce à une approche pharmacogénétique (c’est-à-dire une méthode permettant d’activer ou d’inhiber temporairement certaines cellules cérébrales grâce à un médicament spécifique), permettra de préciser son rôle dans la modulation des comportements alimentaires compulsifs et dans les réponses émotionnelles et motrices associées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie intracérébrale, réalisée sous anesthésie générale avec analgésie multimodale. Ils recevront ensuite plusieurs injections d’une solution neutre ou d’un médicament permettant d’activer temporairement les cellules ciblées, d’une durée de quelques secondes chacune, réalisées au maximum cinq fois pendant la période expérimentale. Les animaux participeront également à des tests comportementaux : enregistrements d’activité locomotrice de 24 h (réalisés à plusieurs reprises selon la procédure) et un test d’anxiété dans le labyrinthe en croix surélevé (5 min). La durée totale de la procédure varie selon les groupes expérimentaux, entre environ douze semaines post-chirurgie pour les groupes comprenant un régime prolongé et environ six semaines post-chirurgie pour ceux comprenant une période expérimentale plus courte.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue est liée à la chirurgie intracérébrale, pouvant entraîner une douleur principalement due à la trépanation osseuse, généralement transitoire mais parfois prolongée, et dont l’intensité est efficacement minorée par l’administration d’antalgiques. Un inconfort peut également survenir lors du réveil post-anesthésie. Des effets secondaires mineurs peuvent apparaître à la suite des injections répétées, tels qu’un stress léger ou un inconfort transitoire. Un stress modéré lié à la période d’hébergement individuel est également possible, bien qu’atténué par les contacts visuels, olfactifs et auditifs entre congénères.
Devenir
À la fin des procédures, les animaux seront mis à mort pour permettre l’analyse post-mortem des cerveaux.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené à bien par l’utilisation de modèles in vitro, d’organoïdes, ou par simulation informatique et intelligence artificielle. Les comportements d’hyperphagie boulimique, le développement d’une obésité, et la rechute alimentaire sur des aliments hautement palatables reposent sur des interactions dynamiques entre circuits cérébraux et processus métaboliques, dont l’organisation et la contribution exacte restent à ce jour insuffisamment élucidées.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préliminaires, de la littérature et d’analyses statistiques de puissance, afin d’assurer la robustesse scientifique tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux par groupe est fixé de manière à garantir la validité des analyses comportementales et histologiques, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Dans un cadre de formation, les effectifs sont volontairement restreints au minimum requis pour assurer l’apprentissage des gestes expérimentaux. Une progression expérimentale stricte sera appliquée : les étapes ultérieures ne seront pas conduites si les résultats obtenus permettent de conclure, ce qui contribuera à réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront de soins appropriés pour optimiser leur bien-être, indispensable à la validité scientifique de l’étude. Les chirurgies cérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse, associée à une analgésie complète incluant des traitements locaux et généraux pour prévenir la douleur et l’inflammation. Les pertes hydriques seront compensées par une réhydratation adaptée. Un suivi post-opératoire rapproché est mis en place : examen clinique et pesée quotidiens pendant la première semaine, puis trois fois par semaine en l’absence de complications. Les critères de suivi sont consignés dans une grille spécifique, avec application stricte de points limites prédéfinis. Une habituation progressive est réalisée durant la deuxième semaine d’acclimatation et avant les tests : manipulation quotidienne par du personnel expérimenté afin de réduire la réactivité et de faciliter les gestes expérimentaux. Les rats sont hébergés individuellement pour permettre des mesures précises, mais les cages sont disposées côte à côte pour maintenir les contacts visuels, sonores et olfactifs, et enrichies avec des éléments non nutritifs. Lors des mesures prolongées, ces conditions sont conservées. Des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute souffrance inutile
Choix des espèces
Le choix du rat se justifie par la continuité avec nos travaux antérieurs portant sur le rôle d’un circuit cérébral impliqué dans la régulation de la motivation et de la récompense dans l'obésité, déjà étudié dans cette espèce. Le rat constitue un modèle particulièrement pertinent pour l’analyse des comportements alimentaires pathologiques, tels que l’hyperphagie boulimique, la rechute alimentaire et l’obésité. Il possède un répertoire comportemental riche, permettant de reproduire des altérations comparables à celles observées chez l’humain. De plus, les structures cérébrales impliquées dans la régulation motivationnelle et émotionnelle présentent une forte homologie avec celles de l’homme. Ces circuits étant absents ou très simplifiés chez des organismes plus simples, le rat représente un modèle préclinique indispensable pour l’étude des mécanismes neurobiologiques des troubles alimentaires et pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Les rats Wistar mâles seront utilisés au stade de jeune adulte. Ils arrivent à 8 semaines et bénéficient de 2 semaines d’acclimatation, de sorte que les interventions chirurgicales sont réalisées à environ 10 semaines. Dans la procédure 1, les animaux sont suivis de 10 à environ 22 semaines, incluant les phases de récupération post-chirurgicale, d’exposition au régime palatable, de sevrage et de rechute. Dans la procédure 2, ils sont suivis de 10 à environ 15 semaines, incluant la récupération, les tests comportementaux et deux semaines de régime intermittent. Le choix de ce stade, utilisé également dans nos travaux antérieurs sur les comportements alimentaires et la modulation des circuits de la récompense, assure la comparabilité et la reproductibilité scientifique.
Effets thérapeutiques d’une nouvelle formulation de la mémantine dans un modele murin de la maladie d’Alzheimer MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant dix mois, de trois à douze mois d'âge, une eau contenant la mémantine associée à une seconde molécule, et passent trois fois deux tests de mémoire de dix minutes ainsi que trois fois un test de navigation spatiale étalé sur cinq jours. Le porteur indique isoler les souris, un stress qu'il justifie par le risque de blessures répétées voire de mort en cas d'agressivité après plusieurs mois d'hébergement en groupe. Il présente l'étude comme une preuve de concept "capitale" pour la mise sur le marché, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'évaluer un effet sur la cognition, qui repose selon lui sur l'observation du comportement de l'animal vivant.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus fréquente après 65 ans, et représente un enjeu majeur en santé publique en raison du vieillissement de la population, de son impact sur les patients et leurs proches, ainsi que de son coût économique considérable. Malgré des avancées thérapeutiques, les traitements actuels restent peu efficaces, rendant nécessaire le développement de nouvelles approches plus performantes. Un nouveau traitement a été conçu en associant deux substances aux propriétés complémentaires : l’une, déjà utilisée en clinique, aide à ralentir la progression de la maladie, tandis que l’autre possède des effets protecteurs sur le système nerveux. Leur combinaison a montré un effet renforcé en laboratoire, en particulier sur la mort neuronale, et l’innovation repose sur un dosage optimisé pour en maximiser les bénéfices. Pour confirmer son efficacité, des études précliniques seront menées sur un modèle animal reproduisant les caractéristiques de la maladie, afin d’évaluer son impact sur la protection des cellules nerveuses et les capacités cognitives.
Bénéfices attendus
Cette étude constituera une première validation de l’efficacité pré-clinique de ce nouveau traitement dans un modèle animal de maladie d'Alzheimer. L’étude permettra en outre d’évaluer l’étendue de l’effet observé et la présence d’un effet dose potentiel, ainsi que des effets potentiels à contrecarrer la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer. Il s’agira d’une étude preuve de concept, capitale pour envisager le développement clinique de la molécule et aboutir in fine à la mise sur le marché de ce traitement pour l’amélioration du pronostic de la maladie.
Procédures
Tous les animaux seront exposés à deux tests de mémoire d’une durée de 10 minutes par test, trois fois pour chaque test sur toute la durée du projet. Un autre test (navigation et mémoire spatiale) nécessite plusieurs sessions de 5 minutes d’apprentissage par jour, pendant 5 jours. Ce test sera également répété 3 fois. Les traitements pharmacologiques seront administrés dans l'eau de boisson, quand les souris sont agées de 3 à 12 mois, soit pendant 10 mois. L'isolement des souris est un stress pour l'animal, mais permet d'eviter les blessures repetees voire la mort en cas d'aggressivite des souris entre elles, ce qui est tres previsible au bout de plusieurs mois d'hebergement en groupe.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux peuvent engendrer du stress lié à la manipulation des animaux et leur isolement ponctuel durant ces tests. Le traitement ne devrait pas entraîner d'effets secondaires notables, d'après les données existantes. À partir du 8e mois de vie, les souris transgéniques utilisées développent des caractéristiques pathologiques associées à la maladie d'Alzheimer. Cela inclut principalement la formation de plaques amyloïdes dans le cerveau, qui peuvent entraîner des troubles cognitifs et comportementaux. Ces troubles peuvent se manifester par des déficits de mémoire et des difficultés d'apprentissage.
Devenir
Afin d'etudier l'effet du traitement sur les marqueurs histopathologiques de la maladie d'Alzheimer,tous les animaux seront mis a mort a la suite de l'unique procedure du projet.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée, a savoir l’efficacite d’un traitement sur la cognition qui repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.
Réduction
Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Le calcul de la taille d’échantillon indique qu’un total de 60 animaux est nécessaire, soit environ 12 animaux par groupe. Afin d’assurer la représentativité biologique et d’examiner d’éventuelles différences liées au sexe, les expériences seront faites sur une cohorte de souris males, et une cohorte de souris femelles, ainsi l’effectif sera doublé avec un total de 120 animaux soit environ 24 animaux par groupe.
Raffinement
Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes, et/ou tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences pour l’acclimatation. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Un suivi du poids des souris et d’hydratation sera effectué de façon hebdomadaire, et une vigilance sera accrue sur la prise de boisson (pesee des biberons) pour s’assurer que le traitement ne perturbe pas la prise alimentaire et hydrique. Dans le cas peu probable ou la prise de boisson est pertubee par le traitement, un additif sucré sera ajouté à la preparation. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
L'étude utilisera l’un des modèles de souris transgeniques les plus utilisés dans la littérature pour l’évaluation de l’efficacité de traitements pour la maladie d'Alzheimer. Il est bien connue que le phénotype associé, ainsi que les lésions cérébrales typique de celle-ci, se manifestent aux alentours de 8 mois de vie et sont encore davantage prononcés à 12 mois de vie. Les animaux adultes seront testés selon une chronologie bien decrite dans la literature pour ce modele transgénique.
Évaluation d’un nouveau traitement pour protéger le foie des atteintes provoquées par des médicaments
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
624 souris mâles vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trois injections intrapéritonéales, dont 600 microlitres de paracétamol pour une souris de 30 grammes. 96 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, 528 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour le prélèvement du foie. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles synthétisant le glutathion plus vite et supportant mieux le surdosage. Les bénéfices annoncés, de nouvelles pistes contre la première cause d'insuffisance hépatique d'origine médicamenteuse, sont renvoyés au long terme, alors que l'intoxication provoquée est immédiate et que le porteur qualifie le modèle animal d'"incontournable" après des essais in vitro qu'il dit déjà concluants sur hépatocytes.
Objectifs
Le paracétamol (appelé aussi acétaminophène, connu sous le nom de Doliprane) est l’un des médicaments les plus utilisés pour faire baisser la fièvre et soulager la douleur. Il est sûr lorsqu’il est pris aux doses recommandées, mais une prise trop importante peut provoquer de graves lésions du foie. Cette toxicité est liée à la formation, dans le foie, d’une substance nocive qui épuise les défenses naturelles de la cellule. Le seul traitement actuellement disponible est la N-acétylcystéine (NAC), efficace uniquement lorsqu’elle est administrée très rapidement après l’intoxication. Malgré ce traitement, le surdosage en paracétamol reste aujourd’hui la principale cause d’insuffisance hépatique aiguë. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc nécessaires, notamment pour agir à des stades plus avancés de la maladie. Des travaux récents ont montré que certains dérèglements des mitochondries (les «centrales énergétiques » des cellules) jouent un rôle clé dans les lésions du foie provoquées par le paracétamol. Notre équipe a développé une nouvelle molécule capable de bloquer ces dérèglements et de protéger les cellules du foie. Ce projet vise à évaluer, chez la souris, l’efficacité de ce composé comme traitement potentiel contre les atteintes hépatiques dues à un surdosage en paracétamol.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines (C105SR) dans l’intoxication au paracétamol, qui constitue la principale cause de défaillance hépatique d’origine médicamenteuse. Les résultats attendus permettront de : - déterminer l’efficacité du C105SR en termes de protection hépatique et mitochondriale, seul ou en association avec le traitement de référence (N-acétylcystéine) ; - mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la toxicité induite par le paracétamol et dans l’action protectrice du C105SR ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de l’intoxication au paracétamol. À plus long terme, les connaissances générées pourraient également ouvrir la voie à l’exploration de stratégies innovantes de protection mitochondriale dans d’autres maladies hépatiques ou non hépatiques où le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle central.
Procédures
Les souris auront une administration par voie intrapéritonéale de paracétamol (ou son diluant), de C105SR (ou son diluant), et de NAC (ou son diluant), chacune d'une durée de 10 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris recevront : 1) une injection intrapéritonéale de paracétamol (APAP) ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (600 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection). Le modèle d’intoxication au paracétamol utilisé dans ce projet repose sur l’administration d’une dose unique de paracétamol à des souris mâles adultes qui provoque une atteinte hépatique aiguë, caractérisée par une élévation des enzymes hépatiques plasmatiques reproduisant de manière fiable les lésions observées chez l’humain après un surdosage. La majorité des souris ne présentent que des signes transitoires et modérés (diminution d’activité, diminution de la prise alimentaire), mais une petite proportion peut montrer des signes plus marqués, comme une posture anormale ou une perte de poids. Une surveillance quotidienne sera assurée après l’administration du paracétamol par les zootechniciens et les expérimentateurs (voir grille de score) ; 2) une injection intrapéritonéale de NAC ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (360 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection) ; 3) une injection intrapéritonéale de C105SR ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (210 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie.
Remplacement
Nos travaux préliminaires ont permis de valider in vitro la capacité de l'inhibiteur de cyclophilines à protéger les hépatocytes en culture de la toxicité du paracétamol. Nous arrivons ainsi à un stade du projet où le recours à un modèle animal est devenu incontournable pour confirmer ces observations dans un organisme entier et dans un environnement physiologique complexe. En effet, à ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes impliqués dans l’intoxication par le paracétamol, lesquels résultent d’interactions entre plusieurs types cellulaires (notamment hépatocytes et cellules immunitaires). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % du paramètre étudié (aire de nécrose). Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.
Raffinement
Le bien-être animal sera garanti par des conditions d’élevage appropriées, incluant le contrôle de la température et de l’hygrométrie. Les souris seront hébergées dans des locaux adaptés, avec un enrichissement systématique (papier kraft, carrés de coton pour la construction de nids, dômes en cellulose). Elles seront maintenues en groupes de 5 individus par cage, favorisant leur comportement social. Toutes les manipulations, y compris la mise à mort, seront réalisées par du personnel formé, dans le strict respect des règles éthiques et réglementaires. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les zootechniciens. Ce suivi permettra de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de stress (prostration, négligence de la toilette, blessure). Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée.
Choix des espèces
Le modèle murin d'hépatotoxicité du paracétamol reflète étroitement la physiopathologie humaine et est pertinent pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles. De plus, les sites actifs de CypA et CypD présentent une homologie de 100 % entre la souris et l'humain. Des souris mâles adultes (âgées de 8 à 12 semaines) seront utilisées, car les femelles sont moins sensibles au surdosage de paracétamol en raison d'un taux de synthèse du glutathion plus rapide, ce qui se traduit par une toxicité moindre de paracétamol par rapport aux mâles pour une dose donnée de paracétamol. Dans ce projet, l’objectif est d’évaluer les effets hépatoprotecteurs d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines dans le contexte de l’intoxication par le paracétamol chez l’adulte. Pour cette raison, seules des souris adultes seront utilisées. L’âge choisi (8–12 semaines) correspond à une phase de maturité physiologique où le métabolisme hépatique est pleinement fonctionnel, ce qui permet de reproduire de manière pertinente la situation clinique observée chez l’adulte humain.
Travaux Pratiques de physiologie sur le contrôle du métabolisme par les glandes surrénales chez le rat.
- Enseignement supérieur
Gavés trois jours de suite, mis à jeun vingt-quatre heures pour certains, 140 rats ont ensuite la paroi abdominale ouverte sous anesthésie pour un prélèvement de sang artériel terminal, puis un prélèvement de foie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous les rats sont tués, pour des dosages sanguins et des analyses de tissus. Elles servent des travaux pratiques où des étudiants vérifient si leurs résultats concordent avec ce qu'ils ont appris du métabolisme du glucose. Le porteur écrit mettre la glande surrénale "au repos par voie chimique", sans nommer la substance administrée ni sa dose.
Objectifs
Ce projet à vocation pédagogique s'inscrit dans le cadre de travaux pratiques. Il s'agit de mettre en évidence le rôle joué par les glandes surrénales (qui sécrètent notamment plusieurs hormones nécessaires au bon fonctionnement de l'organisme) dansl’équilibre hydrominéral, c'est-à-dire l’état d’hydratation de l’organisme et la teneur en sels minéraux (sodium et potassium), et également dans le contrôle du métabolisme du glucose à l’état nourri et à l’état à jeun. En effet le jeûne est un stress métabolique qui entraîne une adaptation de plusieurs organes afin de converger vers le maintien du taux de glucose sanguin, le glucose étant crucial pour le fonctionnement des neurones, et toute baisse de la glycémie au délà de la moitié de la valeur normale pouvant conduire à la perte de conscience, au coma puis à la mort.
Bénéfices attendus
Les étudiants pourront donc apprécier l’effet métabolique du jeûne, de la mise au repos de la glande surrénale par voie chimique, et de l’association de ces deux paramètres, et analyser si leurs résultats sont cohérents avec leurs connaissances sur le métabolisme glucidique et les hormones sécrétées par les glandes surrénales (aldostérone, corticostérone, catécholamines…).
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 gavages (1 par jour) pour une durée d'environ 1 minute. Certains seront mis à jeun pendant 24h. Le jour du TP, sous anesthésie gazeuse et analgésie, ils subiront un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( 5 secondes) puis ils auront leur paroi abdominale ouverte de façon à permettre un prélèvement de sang artériel (procédure terminale) qui dure environ 1 à 2 minutes, puis un prélèvement de foie en peri-mortem (20 secondes).
Impact sur les animaux
Les gavages répétés pendant trois jours (un gavage par jour) pourraient occasionner un stress et une irritatation de l'oesophage. La mise à jeûn pour une durée de 24h occasionnera un stress métabolique léger et une sensation de faim. La mise au repos de la glande surrénale pourrait dans certains cas provoquer un risque de déshydration, par précaution les animaux auront une supplémentation en NaCl dans leur eau de boisson (0.9%).
Devenir
les animaux seront mis à mort pour dosages sanguins et analyses de tissus.
Remplacement
l’objectif du TP est d'étudier une grande fonction physiologique de l'organisme : l'adaptation à un jeûne de 24H, et de confronter les étudiants à la manipulation d’animal vigile, puis anesthésié. On ne peut par conséquent pas le remplacer par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour chaque binôme il y aura 1 rat expérimental + 1 rat temoin partagé pour deux binômes, afin de réduire le nombre d'animaux (étant donné que l'on ne s'attend pas à avoir une grande variabilité chez les contrôles). Les résultats obtenus dans les 2 salles seront mis en commun pour permettre de faire l'analyse sur un "n" plus grand.
Raffinement
Peu de manipulation seront réalisées sur les animaux. Seuls les gavages peuvent induire du stress lors de la contention. Il est donc nécessaire que ce geste soit réalisé par un manipulateur expérimenté. Le jour du TP, les animaux seront anesthésies par voie gazeuse et recevront une analgésie, ce qui permettra aux étudiants de réaliser les gestes techniques sans risque de reveil ou de mouvements des animaux. Des points limites adaptés sont mis en place dès le début de la procédure et poursuivis le jour du TP.
Choix des espèces
Le rat a été choisi car il est un bon modèle de la représentation de la physiologie en ce qui concerne le métabolisme glucidique dont les résultats obtenus sont très proche de l'homme. Nous utilisons des rats wistar de 200g adulte de 6-8 semaines. Les animaux au stade "jeune adulte" sont plus facile à manipuler que des anaimux plus jeunes donc plus petits, et inversement des animaux plus âgés présenteraient des variations trop importantes de leur équilibre glycémique.
Effet de l’hypoxie intermittente sur la biologie du muscle squelettique et des cellules souches musculaires en homéostasie et lors de la régénération musculaire.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses histologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent 28 ou 56 jours en hypoxie intermittente, des baisses répétées d'oxygène reproduisant l'apnée du sommeil, dans le bruit de la machine et avec la fatigue d'un sommeil dégradé, puis reçoivent une lésion musculaire provoquée sous anesthésie. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, mieux comprendre comment ce manque d'oxygène perturbe le muscle chez des souris jeunes ou âgées, mâles ou femelles. Le porteur mène en parallèle des cultures de cellules souches musculaires, tout en écartant le remplacement total au motif que le in vitro ne rend pas compte des interactions dans un tissu entier, et fixe des groupes de huit à dix animaux sans dire combien de groupes composent les 3 360.
Objectifs
Le Syndrôme d’Apnées Obstructives du Sommeil (SAOS) est le trouble respiratoire du sommeil le plus courant, qui touche plus d’un milliard de personnes dans le monde. Cette maladie chronique se caractérise par des épisodes répétés de l'affaissement complet ou partiel des voies aériennes supérieures entraînant une diminution transitoire de la saturation en oxygène appelée hypoxie intermittente. Cette succession de phases hypoxiques et de réoxygénations crée un déséquilibre d’approvisionnement des organes en oxygène, responsable de nombreux effets délétères pour notre organisme tels que de l’inflammation, des anomalies vasculaires et de la mortalité cellulaire. Certains patients atteints de SAOS présentent des changements structurels et bioénergétiques dans les muscles squelettiques impliqués dans la respiration mais l’impact de l’hypoxie intermittente sur la biologie des muscles squelettiques périphériques et des cellules souches musculaires reste méconnu. Chez l’adulte, le muscle squelettique a une croissance prodigieuse et possède de grandes capacités régénératrices qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, les cellules satellites nommées ainsi du fait de leur localisation en périphérie des fibres musculaires. Elles sont présentes dans toutes les masses musculaires squelettiques, où elles résident dans un état de repos jusqu’à ce que des stimuli notamment environnementaux viennent les solliciter afin de participer à l’homéostasie et à la régénération musculaire. Notre hypothèse est que l’hypoxie intermittente joue un rôle délétère sur la fonction des cellules satellites en homéostasie ou au cours de la régénération musculaire. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’impact de l’hypoxie intermittente sur l’homéostasie du muscle squelettique et au cours de la régénération chez la souris saine, jeune ou âgée, mâle ou femelle.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels l’hypoxie intermittente liée au SAOS perturbe l’homéostasie du muscle sain ou en régénération, chez des sujets jeunes ou âgés, mâles ou femelles.
Procédures
Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de trois : 1. Modèle de régénération musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 2. Mesure de la force musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 30min) 3. Prélèvement sanguin sur animal anesthésié (1 fois, durée : 2 min). Les procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Exposition à une hypoxie intermittente (28 ou 56 jours) 2. Mesure de la perfusion sanguine sur animal anesthésié (2 fois / souris, durée : 15 min) 3. Test d’agrippement sur animal vigile (2 fois, durée : 5 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement). Les effets indésirables sont principalement ceux liés à l’exposition à l’hypoxie intermittente : à l'hypoxie au début de l'expérimentation et au bruit généré par la machine ainsi qu'une fatigue chez les souris due à une faible qualité de sommeil. Dans notre expérience, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une lésion musculaire passées les 24 premières heures post-lésionnelles suggérant que la période critique sera principalement celle de l’exposition des animaux à l’hypoxie intermittente.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des trois procédures afin de permettre les analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour répondre à nos questions biologiques.
Remplacement
Afin de tester l’impact direct de l’hypoxie intermittente sur la biologie des cellules satellites, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux, présentant des similitudes au niveau des systèmes de réparation du muscle squelettique humain, reste essentielle afin d’étudier les effets délétères de l'hypoxie intermittente sur le muscle squelettique. Par ailleurs, les souris âgées peuvent fournir des notions importantes sur l’impact de l’hypoxie intermittente sur le muscle squelettique dans les populations vulnérables, avec une grande pertinence pour la santé humaine.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (test d’agrippement) permettant de répéter les analyses sur le même animal mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés (*) et au fait d’utilisation de la patte controlatérale comme contrôle sans lésion. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=8-10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans notre modèle de régénération musculaire et de la mortalité potentielle des animaux exposés à l’hypoxie intermittente. (*)Un test de Student (également appelé test T) sera utilisé pour comparer deux groupes (effet de l’exposition à l’hypoxie intermittente versus contrôle). Pour les comparaisons multiples (effet de l’exposition à l’hypoxie intermittente en fonction du sexe et/ou de l’âge), nous utiliserons des tests ANOVA à un ou deux facteurs. Une valeur p < 0,05 sera considérée comme statistiquement significative.
Raffinement
Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour le modèle de lésion musculaire, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon quotidienne pendant les 2-3 premiers jours suivant le début de l’exposition à l’hypoxie intermittente et l’induction de la lésion musculaire afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées. Les souris Tg :Pax7-GFP et Tg :Pax7CT2mTmG permettent l’expression ciblée de protéines fluorescentes dans les cellules satellites afin de faciliter leur analyse spatiale en histologie et/ou leur tri en cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure de leur potentiel myogénique en culture ou de leur expression génique différentielle. Le modèle de lésion musculaire utilisé n'entraine aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous utiliserons des outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes de 4 mois. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules satellites résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous utiliserons également des souris âgées de 16 mois pour évaluer l’influence de l’âge un facteur de vulnérabilité majeure dans l’impact de l’hypoxie intermittente.
Rôle de la protéine X dans le développement tumoral pancréatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
78 souris sur 5 079 subiront la chirurgie qui fait l'objet du projet, une incision de l'abdomen sous anesthésie pour injecter des cellules cancéreuses dans le pancréas. Les 5 001 autres sont élevées et biopsiées à l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et toutes sont tuées, les reproductrices à neuf mois, les opérées trente-cinq jours après l'implantation. Après l'opération, les souris sont palpées deux fois par semaine pour sentir la tumeur pousser sous la peau et portent des agrafes pendant sept jours, avec une douleur modérée sur un à deux jours puis une douleur légère liée à la croissance tumorale. Les souris utilisées sont dépourvues de la protéine étudiée, hyperlaxes, en difficulté pour s'agripper, ce que le porteur qualifie de léger tout en prévoyant une surveillance renforcée toute leur vie.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer peu fréquent (12ème cancer le plus fréquent), mais pour lequel le pronostic vital est extrêmement sombre. En effet, l'espérance de vie des patients, 5 ans après le diagnostic, est inférieure à 10%. La protéine d'intérêt de ce projet est présente dans le pancréas sain, est surproduite autour des lésions précancéreuses puis disparait totalement dans les stades avancés de la maladie. Des premiers résultats suggèrent que cette protéine est produite par les cellules saines du pancréas dans les stades précoces du cancer pour empêcher la multiplication des cellules tumorales et par la suite, les cellules tumorales éduquent les cellules environnantes pour empêcher la production de cette protéine d'intérêt et ainsi favoriser le développement de la tumeur. Notre projet vise donc à vérifier cette hypothèse. Pour cela, nous disposons de souris génétiquement modifiées dans lesquelles la protéine X est absente. Ces souris ont une espérance de vie similaire aux souris sauvages, se reproduisent normalement, mais présentent des difficultés lors de tests d'agrippements aux supports, ce qui implique une surveillance accrue de celles-ci tout au long de leur vie. Nous injecterons dans le pancréas de ces souris des cellules tumorales pancréatiques. Si notre hypothèse est vérifiée, les souris dépourvues de la protéine X devraient développer une tumeur plus rapidement que les souris sauvages.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer que la protéine X empêche la prolifération des cellules tumorales dans les premiers stades de développement du cancer du pancréas et donc d'envisager cette molécule comme une cible thérapeutique dont la production devra être réactivée pour permettre de contrer ce cancer hautement mortel.
Procédures
Un prélèvement d'un bout d'oreille (
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement modifiées pourraient développer des difficultés très légères au déplacement et à l'agrippement. Le prélèvement d'un bout d'oreille peut engendrer un stress léger lors de la contention et une douleur légère 1 à 2 minutes après cet acte réalisé sur animaux vigiles. Les souris d'intérêt subiront une chirurgie sous anesthésie pouvant engendrer une douleur modérée sur 1 à 2 jours. Cette opération pourrait conduire à une baisse de la température corporelle des souris sur quelques heures. La douleur post-chirurgie peut conduire à des difficultés de déplacement sur les premières heures post-chirurgie. Une sécheresse occulaire peut être induite au cours de la chirurgie. La présence d'agrafes sur la zone de chirurgie peut causer une gêne légère jusqu'à leur retrait (7 jours). La croissance tumorale peut conduire à une douleur légère. Les palpations et pesées sur animaux vigiles n'excéderont pas 1 minutes par souris au total 2 fois par semaine et pourront induire un stress léger.
Devenir
Tous les animaux d'élevage seront mis à mort à 9 mois. Une reproduction au-delà de ce point de cinétique pourrait impacter le bien-être des animaux et pourrait conduire à une baisse de la fertilité. Pour l'analyse du rôle anti-tumoral de la protéine X : les animaux seront mis à mort à 8 semaines + 35 jours post-implantation de cellules tumorales pancréatiques maximum. A la fin de cette étude, le pancréas doit être collecté pour analyses ainsi que les organes potentiels de métastase (foie + poumons).
Remplacement
Au préalable de ce projet, différents travaux ont été réalisés sur des biopsies de patients atteints de cancer du pancréas et sur des cellules pancréatiques en culture. Cependant, le développement d'une cellule tumorale, la formation d'une tumeur et des métastases impliquent la participation de nombreux tissus environnants (vaisseaux sanguins, système immunitaire). Cette complexité tissulaire ne peut pas être reproduite dans des modèles cellulaires. Ainsi, le recours aux modèles murins génétiquement modifiés est nécessaire pour comprendre le rôle de la protéine X dans la carcinogenèse pancréatique.
Réduction
Pour l'élevage des souris génétiquement modifiées, le nombre de souris généré a été réduit au maximum pour pouvoir obtenir le nombre d'animaux suffisant à nos projets. La chirurgie (injection de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris sauvages ou mutées) est très bien documentée dans la littérature. 12 souris par lot au maximum seront utilisées, ce qui correspond au nombre d'animaux minimal et suffisant pour conduire à l'obtention de résultats statistiquement interprétables. Ce projet a été établi de manière à réduire au minimum les gestes invasifs réalisés sur les animaux. En effet, les souris seront identifiées par simple marquage de la queue avec un stylo indélébile de couleur et le génotype des souris sera vérifié après la mise à mort en fin d'expérience.
Raffinement
Les souris déficientes en protéine X ne présentent pas de défauts de reproduction ou de vieillissement, ni de sensibilité à des pathogènes communs. Elles sont cependant hyperlaxes et présentent des difficultés légères mais significatives à l'agrippement, même si leur locomotion n'est pas altérée. Pour s'assurer du bien-être de ces souris, elles seront surveillées de leur naissance à leur mort 1 fois par semaine. Elles seront mises en reproduction de 6 semaines à 9 mois, âge max à leur mise à mort. Pour l'étude du rôle anti-tumoral de la protéine X au cours de la carcinogenèse pancréatique, la chirurgie sera réalisée sur des souris de 8 semaines, sous anesthésie générale supplémentée en analgésiques locaux et généraux. Les conditions de stérilité seront assurées par l'utilisation de matériel stérile (instruments, champs opératoire et gants stériles) et par l'utilisation de bétadine vétériniare pour éliminer les pathogènes sur la zone opérée. La chirurgie sera réalisée en plaçant la souris sur un tapis chauffant de manière à éviter la baisse de température corporelle. De même, les souris seront placées dans des cages placées dans des armoires chauffantes jusqu'au lendemain de la chirurgie. Du gel occulaire ophtalmique sera utilisé pour éviter le désèchement des yeux lors de la chirurgie. De la nourriture humide et de l'eau gélifiée seront déposées dans des coupelles au fond de la cage après la chirurgie pour favoriser la prise alimentaire et hydrique. Une surveillance étroite des souris sera réalisée post-chirurgie pour vérifier l'absence de douleur et une potentielle infection de la zone incisée. Cette surveillance s'attachera à observer le comportement de la souris, l'apparence de la plaie et le poids de la souris. Les agrafes seront enlevées à J7 sous anesthésie gazeuse et une pommade anlagésique sera appliquée sur la zone précédemment agrafée. Une surveillance des souris au cours de la croissance tumorale sera également réalisée 2 fois par semaine à partir de 15 jours post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort de l'animal (35 jours post-implantation max) pour détecter tout signe de mal-être potentiellement induits par la croissance de la tumeur. Hormis pendant les 24h après la chirurgie ou un tissu fin servira de litière, les animaux seront hébergés en groupe de 4-6 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, baton).
Choix des espèces
Notre objectif est de comprendre le rôle de la protéine X dans la carcinogenèse pancréatique. Le modèle murin est le modèle de choix pour les études en cancérologie. En effet, la proximité génétique et physiologique de la souris avec l’homme permet de reproduire de nombreux aspects de la biologie tumorale humaine, tant sur le plan moléculaire que cellulaire. Les souris seront utilisées (injectées) à 8 semaines de développmement. Nous voulons travailler sur des souris adultes, donc matures sexuellement pour standardiser notre modèle (éviter les variations dues à la puberté ou à l'âge) et cette maturité est atteinte chez le mâle et la femelle entre 5 et 7 semaines. Les souris génétiquement modifiées utilisées n'ont pas de problème de reproduction, ni de vieillissement, mais montrent des difficultés légères lors de tests d'agrippements et de suspension. Pour éviter leur mal-être induit par une période de reproduction avancée, elles ne seront mises en reproduction qu'à partir de 6 semaines jusqu'à 9 mois post-naissance.
Etude de l’efficacité de l’Apernavec sur le lymphœdème primaire et le lipœdème EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris femelles reçoivent des lentivecteurs porteurs de mutations humaines pour développer un lymphœdème, cette accumulation de lymphe et de graisse dans un membre. 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, presque toutes des femelles parce que le lipœdème ne touche que les femmes. Elles subissent jusqu'à cinq injections quotidiennes d'affilée, une chirurgie de moins de vingt minutes et une mesure de composition corporelle, et le porteur écrit que la formation de l'œdème, la chirurgie et les injections engendrent des douleurs modérées. Une partie est transférée dans un second établissement pour y recevoir une anesthésie, une lymphographie et la mort, toutes finissant tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Le lymphœdème est une pathologie chronique résultant d’une accumulation massive de lymphe et de tissu adipeux dans un membre. Il existe deux sortes de lymphœdème : primaire et secondaire. Le lymphœdème primaire est d’origine héréditaire, lié à des mutations génétiques. Plus de 30 gènes ont été identifiés comme étant associés au lymphœdème primaire. Le lymphœdème secondaire survient à la suite d’une lésion du système lymphatique, souvent après une chirurgie, une radiothérapie ou une infection. Bien que cette maladie affecte 250 millions de patients, il n’y a à ce jour aucun traitement disponible. Notre équipe a développé une thérapie pour le traitement du lymphœdème secondaire qui passera en clinique en fin d’année. Notre objectif est maintenant d’évaluer son efficacité sur le lymphœdème primaire. Environ 30 mutations génétiques ont été identifiées comme responsables du lymphœdème primaire. Nous nous concentrerons sur les mutations les plus fréquentes. Dans un deuxième temps, nous allons étendre l’application de la thérapie au lipœdème. Le lymphœdème et le lipœdème sont des affections distinctes, mais partagent plusieurs caractéristiques cliniques communes. Tous deux se caractérisent par un gonflement persistant des membres, affectant généralement les membres inférieurs. Il est important de noter que le lipœdème ne touche que les femmes et qu’il n’existe à ce jour aucune thérapie curative. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative pour le lymphœdème primaire et le lipœdème. Cette étude permettra d’évaluer la possibilité d’étendre l’application de l’Apernavec au traitement de ces pathologies. Le lymphœdème primaire étant causé par différentes mutations, évaluer l’efficacité sur plusieurs d'entre elles permettra un champ d’application de la thérapie plus large.
Procédures
Dans l’EU 1/2, les animaux seront soumis à des injections en vigile ou sous anesthésie gazeuse qui auront une durée maximale de 2 minutes chacune. Les injections vigiles pourront être ponctuelles ou sur une semaine à raison de 1 injection par jour (soit 5 jours d’injections au total), chaque injection ne durera pas plus d’une minute. Les injections sous anesthésie seront au maximum de 2 tout au long du projet pour chaque animal. Ils pourront être aussi soumis à une intervention chirurgicale d'une durée inférieure à 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Une analyse de la composition corporelle serait faite par imagerie et aura une durée maximale de 6 minutes. Dans l’EU 2/2, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’anesthésie en vue d’une lymphographie ainsi que la mise à mort.
Impact sur les animaux
La formation d’œdème, la chirurgie, le minispec ainsi que les injections vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, certains animaux seront envoyés dans l’EU 2/2. Tous les animaux de la procédure seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires au projet.
Remplacement
Bien qu’il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant fidèlement la réponse immunitaire et tissulaire à une injection intradermique de l’Apernavec ainsi que des lentivecteurs codant pour les mutations, une phase préliminaire a été conduite sur des cultures cellulaires (kératinocytes et fibroblastes murins) pour évaluer la transduction et la cytotoxicité, limitant ainsi le recours aux animaux. Le choix s’est orienté vers l’espèce animale car il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant les paramètres physiologiques de la pathologie (réponse immunitaire, inflammation, formation d’œdème) nécessaires à la bonne évaluation de l’efficacité de l’Apernavec. Ces données permettront une étude plus fiable.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car ces pathologies touchent essentiellement les femmes. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de souris a été calculé par une analyse statistique rigoureuse afin de garantir la significativité des résultats tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les groupes expérimentaux sont restreints au strict nécessaire. Un lot contrôle (vecteur vide) est inclus afin d’évaluer l’effet de l’administration du vecteur indépendamment du gène muté qu’il contient. Toute mutation n'induisant pas d'effet pas d'effet pathologique ne sera pas retenue pour les tests d'efficacité de la thérapie afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. L’injection est réalisée sous anesthésie afin de réduire la douleur. Toute souffrance anormale entraînera une euthanasie immédiate. Les techniques d’injection et de manipulation sont assurées par du personnel expérimenté afin de limiter le stress. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les précédentes études menées sur l’Apernavec dans le lymphœdème secondaire ont été réalisées sur ces dernières. De plus, des lignées sur le même fond génétique précédemment établies dans l’équipe seront aussi utilisées pour les études sur le lipœdème en raison de leur pertinence scientifique. Le lymphœdème primaire et le lipœdème se caractérisent par une accumulation de tissus adipeux fibrotique dans les membres touchés. Ainsi, le modèle utilisé doit posséder un tissu adipeux suffisamment développé. Le choix s’est alors orienté vers des souris âgées de 10 à 12 semaines pour le lymphœdème primaire et de 5 à 12 semaines pour le lipœdème.
Test de substances pharmacologiques sur rongeur à des fins d’enseignement
- Enseignement supérieur
Des souris reçoivent du xylène sur les oreilles, de la carraghénine ou de la levure de boulanger dans la patte, puis passent sur plaque chauffante pour un test de seuil de douleur. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées d'un travail pratique à l'autre, puis proposées à d'autres projets ou tuées en fin d'année. Chaque animal enchaîne jusqu'à deux sections de l'extrémité de la queue avec sept prélèvements de sang par séance, cinq injections de diazépam ou de flumazénil et vingt tests de comportement, sous la main d'étudiants qui apprennent le geste. Le porteur reconnaît que ce sont ces manipulations par des débutants qui ont fait classer toutes les procédures en gravité modérée, et juge ce "minimum de notions d'expérimentation animale" "tout à fait essentiel" à la formation des pharmaciens, après entraînement préalable sur souris en caoutchouc.
Objectifs
Dans le cadre des études de pharmacie, nous organisons plusieurs séances de travaux pratiques (TP) sur souris permettant la validation pharmacologique de substances d’intérêt médicamenteux. Ces séances ont plusieurs objectifs : 1) Montrer aux étudiants la diversité des approches pharmacologiques possibles, en fonction de l’effet biologique de la molécule à tester. 2) Prévoir et réaliser les expériences en pratique, en tenant compte des contraintes pratiques, organisationnelles et éthiques : prévoir le nombre d’animaux nécessaire et suffisant, les doses de médicaments à tester, les protocoles expérimentaux, et l’analyse statistique des résultats. 3) Acquérir des bases en matière d’expérimentation animale : règles d’hébergement et de manipulation des animaux, règles éthiques. Ces enseignements permettent donc aux étudiants d’appréhender concrètement les tests pharmacologiques réalisables in vivo, tout en leur apportant les bases de l’éthique et de règles de manipulation des animaux. Ce minimum de notions d’expérimentation animale est tout à fait essentiel dans la formation de futurs pharmaciens, qui doivent être sensibilisés aux enjeux des étapes pré-cliniques de la conception des médicaments. L'ensemble de ces compétences permet de les préparer à leur futur métier de pharmacien. L'apprentissage des règles de bonne pratique en expérimentation animale, notamment la manipulation concrète des animaux est un des objectifs du TP, qui ne peut être acquis en travaillant en travaux dirigés (TD) ou en regardant des vidéos.
Bénéfices attendus
Les bénéfices pour les étudiants sont à la fois disciplinaires et transversaux. D'un point de vue disciplinaire, les étudiants mobilisent et concrétisent les notions vues en enseignement théorique sur les effets des médicaments ou la régulation de la glycémie in vivo, ce qui leur permet d'approfondir leurs connaissances. D'un point de vue transversal, ils acquièrent des compétences en gestion de projet scientifique, ils se préparent à maitriser toutes les étapes de la création d'un nouveau médicament, incluant notamment les étapes de recherche préclinique, aujourd'hui indispensables à la validation de médicaments et préalables aux essais cliniques. Ils se familarisent avec la notion de variabilité individuelle, au calcul d'effectif, à l'analyse statistique des résultats, à l'élaboration d'un design expérimental, et acquièrent des bases en matière d’expérimentation animale. Ces compétences sont essentielles pour former les futurs professionnels pharmaciens, en particulier pour tous ceux qui exerceront dans le domaine de l'industrie pharmaceutique ou dans la recherche clinique et préclinique.
Procédures
Les animaux subiront tous 1 à 2 fois la procédure 1, 5 fois la procédure 2, puis pour la plupart 1 fois une des procédures 3 à 6. Le transport des animaux de la zone d’hébergement aux salles de TP, qui sont dans le même bâtiment, dure moins de 5 minutes. Pour la procédure 1, et par séance de TP, l’animal vigile recevra une injection de substance (ce qui dure quelques minutes), et une goutte de sang sera prélevée à 7 temps successifs après avoir sectionné l’extrémité de la queue (1-2mm) pour le premier prélèvement : ceci afin de mesurer dans le temps l'évolution du taux de sucre dans le sang. Chaque prélèvement de sang dure 1 à 2 minutes. Au maximum il y aura 2 séances de TP par animal, soit 2 injections et 2 sections de la queue sur 1 semaine. Cette procédure concerne 30 animaux. La procédure 2 concerne les 30 animaux de la procédure 1, plus 30 nouveaux animaux, soit 60 animaux. Par séance de TP, il y a 1 injection sur animal vigile (quelques minutes) et 4 tests de comportement (5 minutes chacun). Il y a au maximum 5 séances de TP sur 4 semaines, soit 5 injections et 5x4 tests de comportement. Ensuite, les animaux seront soumis, à l’une des procédures expérimentales 3 à 6. Dans la procédure 3, chaque animal vigile subira 1 injection ou 1 gavage (quelques minutes) et 2 tests de comportement (moins de 2 minutes chacun). Dans la procédure 4, chaque animal recevra une anesthésie gazeuse légère puis 1 injection dans la patte (moins de 10 minutes) + 1 injection ou 1 gavage (quelques minutes). Pour la procédure 5, chaque animal vigile aura une application de xylène sur les oreilles (quelques minutes)+ 1 injection ou 1 gavage (quelques minutes). Pour la procédure 6, chaque animal recevra 2 injections (quelques minutes), et sera anesthésié légèrement pour prendre sa température (moins de 10 minutes, répété 4 fois).
Impact sur les animaux
Les animaux seront tous manipulés par un grand nombre d’étudiants, dans des salles de TP auxquelles ils ne sont pas habitués, ce qui induira un stress pendant la durée des TP (quelques heures avant d’être remis dans la zone d’hébergement). De plus, ils recevront tous au moins trois injections : de glucose et/ou d'insuline (maximum deux injections) dans la procédure 1, de diazépam et/ou de flumazénil (maximum 5 injections) dans la procédure 2, d'ibuprofène ou de paracétamol (maximum 1 injection) dans les procédures 3 à 6. Ces injections induisent un stress lié à la contention et à l'introduction d'une aiguille par les étudiants (ou à défaut par l’enseignant). Dans les procédures 3 à 6, certains animaux pourront être gavés (ibuprofène ou paracétamol), avoir une injection de carraghénine ou de levure de boulangerie, ou être irrités à l’oreille avec du xylène (une fois par animal). Ils seront de plus soumis à des prises de sang à la queue dans la procédure 1 (au maximum deux séances de 7 prélèvements (7x1 goutte de sang par animal), à des tests de comportement non douloureux dans la procédure 2 qui correspondent à un stress léger. Dans les procédures 3 à 6, les animaux seront soumis à des tests d'évaluation de la douleur, type plaque chauffante ou réflexe de retrait de la queue lors d'une augmentation de température. L’effet des molécules dure en général quelques heures, le temps que ces dernières soient éliminées, et les effets des tests eux mêmes sont modérés et ne perdurent pas au delà de quelques heures après la séance de TP. Bien que les gestes effectués sur les animaux soient de gravité légère, en particulier pour les procédures 1 et 2 (injection IP, prise de sang à la queue), le contexte lié à la présence de nombreux étudiants peu habitués à manipuler les animaux, représentant une source de stress pour les animaux, a conduit à classer toutes les procédures en gravité modérée.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, tous les animaux sont utilisés pour la procédure 2. A l'issue de la procédure 2, ils sont tous utilisés pour l'une des procédures 3 à 6. A l'issue de ce projet (mois de mai), tous les animaux sont proposés à la réutilisation dans d’autres projets ou mis à mort.
Remplacement
Des méthodes de remplacement sont prévues et inclues dans les séquences d'enseignement. Tout d’abord, les étudiants peuvent s’entraîner à la contention et aux injections sur modèle inerte (souris en caoutchouc). Puis certaines expériences sont réalisées sur modèles cellulaires (exemple : impact d'un médicament donné sur la sécrétion de molécules inflammatoires), ou ex vivo (exemple : contrôle qualité pour vérifier la présence de contaminants). Nous utilisons également, lorsque c'est possible, un organe isolé tel que de la peau de souris (exemple : vérification de la pénétration dans la peau d'un médicament). Notre demande d'autorisation ne conserve donc que les étapes non remplaçables, à réaliser sur animaux vivants, et ce afin d'intégrer des processus physiologiques (régulation du taux de sucre dans le sang nécessitant l'intégration de plusieurs organes, comportement animal).
Réduction
Les mêmes animaux sont utilisés pour les TP 1, 2 puis pour le TP3 correspondant à une des procédures 3 à 6. Ceux ci sont échelonnés dans le temps de façon à permettre l'utilisation continue des animaux : le TP1 a lieu en février, le TP2 en mars-avril et le TP3 en mai. De plus, pour un seul TP il y a plusieurs séances (les étudiants, au nombre d'une centaine par promotion, sont répartis en 6 à 10 groupes) : là aussi nous utilisons les animaux pour plusieurs séances de TP, tout en veillant à ce qu'ils disposent d'un délai suffisant (de 2 jours minimum) entre deux séances de façon à minimiser le stress et à leur permettre de retrouver pleinement leur état de bien-être, et d'éliminer totalement les substances injectées, dont la demi vie est courte. Ainsi, un seul lot de 60 souris nous permet de réaliser les 3 TPs, concernant près de 240 étudiants au total chaque année. Les doses à injecter sont affinées en amont par une étude bibliographique, de façon à éviter des études de dose-réponse qui ne seraient pas nécessaires et donc à réduire le nombre d’animaux. Enfin, pour certains TP les étudiants travaillent en équipe et chaque équipe ne dispose pas d'un lot complet d'animaux permettant de réaliser une vraie étude statistique, mais les résultats obtenus par chaque équipe sur un petit lot d'animaux (2 à 3 souris) sont mis en commun de façon à ce qu'ils obtiennent collectivement des résultats robustes et qu'ils puissent interpréter statistiquement. Ceci permet de réaliser l'analyse des résultats, tout en réduisant le nombre d'animaux.
Raffinement
Après livraison, les souris auront une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant le début des enseignements. Le personnel responsable du bien-être animal veillera à leurs conditions d’hébergement avec enrichissement, à leur adaptation à leur environnement et à la mise à disposition à volonté en nourriture et eau. Tout comportement anormal ou souffrance sera signalé au vétérinaire responsable des animaux pour mettre en place des soins adaptés. Les animaux seront pesés au début de chaque TP, ce qui permettra de détecter une éventuelle perte de poids. Les procédures 1 et 2 ne nécessitent pas d'analgésie et encore moins d'anesthésie. Les procédures 3 à 6 visent à déterminer l'effet analgésique ou anti-inflammatoire d'un médicament (paracétamol ou ibuprofène), le raffinement est donc intégré au design de l'expérience elle-même. Au cours des TP, nous veillerons à sensibiliser les étudiants aux effets du stress chez les animaux et à imposer l’ambiance de travail la plus calme possible. Nous surveillerons régulièrement les animaux dans les cages afin de détecter d’éventuels signes de stress (perte de poils, perte de poids, bagarres et blessures…). Les animaux seront marqués individuellement, et nous veillerons à perturber le moins possible les groupes qui sont constitués dans les cages, ainsi nous reconstituerons à la fin du TP les groupes d'animaux initiaux dans les cages. Les étudiants pourront d’abord s’entrainer à la contention et à l’injection sur souris en caoutchouc pour réduire leur stress et donc celui des animaux, et le risque de mauvaise manipulation. Les étudiants seront ensuite appelés à manipuler les animaux, et à leur faire réaliser les tests de comportement. Ils pourront également, mais seulement s’ils le souhaitent, réaliser les injections et les gavages. Dans tous les cas, les gestes seront d’abord montrés par les enseignants qui encadrent le TP, puis l’étudiant les réalisera sous supervision étroite d’un enseignant qui contrôlera chaque étape. En cas d’échec, d’hésitation ou de stress trop important de l’étudiant, l’enseignant reprendra l’animal et réalisera lui-même le geste, pour ne pas stresser trop l’animal et/ou de risquer de le blesser. Tous les enseignants ont le niveau concepteur, sont à jour de leur livret de compétences, et sont attachés à respecter la recommandation du CNEA du mai 2019.
Choix des espèces
La validation de substances d’intérêt médicamenteux passe nécessairement par des tests sur au moins une espèce de rongeurs, avant de pouvoir envisager des tests cliniques. L’utilisation de modèles cellulaires ne permet pas d’obtenir des données physiologiques reflétant les effets comportementaux des médicaments. Par ailleurs, la formation de futurs pharmaciens qu’ils soient à l’officine, en industrie ou en recherche académique, ne peut s’abstenir d’une découverte concrète de l’expérimentation animale utilisant l' espèce la plus fréquemment utilisée dans ce domaine d’activité. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (8 semaines) pour le TP1. Puis nous les conservons jusqu'au mois de mai pour le TP3, les souris seront alors âgées d'environ 6 mois soit des souris adultes. Par homogénéité nous commençons dès le TP1 avec des souris adultes.