Procédures modérées

Un point limite doit permettre de retirer de l'étude tout animal présentant un effet secondaire sévère. 161 rats, 120 lapins et 50 porcs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour prélever les sites d'injection, dix porcs étant gardés vivants en fin d'étude pour être réutilisés. Les dispositifs médicaux injectables leur sont implantés sous la peau ou dans le derme sous anesthésie générale, suivis de prises de sang hebdomadaires puis mensuelles et, chez les porcs, de vingt biopsies cutanées au maximum par animal. Le porteur écrit que le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement européen 2017/745 et la norme ISO 10993 pour obtenir le marquage CE, et cette modification du projet augmente le nombre de lapins parce que plus de formulations qu'annoncé seront mises au point.

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables résorbables (DM classe III) et de répondre aux exigences quant à la constitution des dossiers réglementaires en vue de leur mise sur le marché. Les exigences relatives à la caractérisation de ces DM sont de plus en plus élevées, afin de garantir la sécurité des patients à court et long terme. La réalisation d'études de tolérance locale sur des modèles animaux appropriés, permettant de détecter au mieux l'apparition d'effets secondaires, est essentielle dans étapes de développement des dispositifs médicaux injectables. Toutes les études réalisées, même très en amont dans le processus de développement, sont susceptibles d'être utilisées dans les dossiers réglementaires, pour la partie "conception". Les études de tolérance sont généralement couplées à des observations d'efficacité des produits évalués (versus des produits de référence), et à la caractérisation de leur comportement dans l'organisme (modification des propriétés physiques du produit, dégradation, intégration dans les tissus...): ainsi une seule étude permet l'obtention de nombreuses informations pertinentes. MODIFICATION : Augmentation du nombre total de Lapin prévu dans la demande d'autorisation de projet, dans la même période d'autorisation. Sur la période d'autorisation, nous développerons plus de dispositifs médicaux biocompatibles innovants qu'il était prévu initialement, dont il est nécessaire d'évaluer la tolérance pour chaque nouvelle formulation. Leur tolérance est mesurée conformément à des protocoles expérimentaux standard et récurrent néccessitant un nombre d'observation minimum par formulation. Ajout également d'un nouveau fournisseur d'animaux.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatibles en solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme en vigeur. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.

Isolées en cage individuelle jusqu'à 37 jours et privées de 40 % de leur ration pendant 21 jours, 102 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent en plus cinq injections dans le ventre, quatre sous la peau et deux à trois prises de sang. Le projet vise à mettre au point un modèle de chimiothérapie chez la souris, puis à tester si un probiotique limite les effets de cette chimiothérapie sur l'absorption intestinale. Le porteur écrit que ce projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées, tout en listant la faim liée à la restriction calorique, le stress de l'isolement prolongé et celui de la chimiothérapie.

Objectifs

La dénutrition associée à une altération de l'absorption intestinale est un phenomène couramment observé après une chirurgies de l'intestin ou une chimiotherapie. Nous souhaitons développer un protocole expérimental chez la souris permettant de tester l'hypothèse selon laquelle un probiotique ou ses derivés peuvent améliorer l'absorption intestinale chez le sujet adulte dont la fonction intestinale est dégradée. Un probiotique se définit comme un micro-organisme vivant qui, lorsqu'il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels. Nous espérons ainsi, dans ce modèle murin, améliorer la fonction intestinale par cet apport de probiotique. Dans un premier temps nous mettrons en place et caractériserons un modèle de chimiothérapie chez la souris. Dans un second temps, nous étudierons comment un traitement par un probiotique ou ses dérivés peut limiter les effets de cette chimiothérapie. Cette étude permettera de mieux comprendre l'influence du microbiote sur les phénomènes de dénutrition chez l'adulte. Nous espèrons également pouvoir ainsi, par l'apport de probiotiques ou de leurs dérivés, améliorer l’absorption intestinale et ainsi limiter les effets secondaires d'une chimiothérapie. A terme, l'utilisation de ses probiotiques pourrait permettre d'améliorer l'efficacité d'une renutrition des patients adultes après une chirurgie intestinale ou lors d'une chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de la dénutrition et l'implication du microbiote dans ce phénomène. De plus, nous espérons à l’aide d’un probiotique ou de ses dérivés pouvoir, en ameliorant l’absorption intestinale, limiter les effets secondaires d'une chimiothérapie et améliorer l’effet d’une renutrition. Cela pourrait à terme, par exemple, permettre d’envisager un traitement probiotique des patients traités par chimiothérapie afin de limiter les éffets secondaires associés, mais aussi des patients ayant subit une intervention chirurgicale de l'intestin qui souffrent également d’une altération de la fonction intestinale.

Procédures

- Individualisation des animaux : 98 souris au maximum pendant une durée maximum de 37 jours. - Restriction alimentaire : 98 souris maximum pendant 21 jours - Prélèvement de sang sur l'animal anesthésié : 2 à 3 fois maximum pour 102 souris maximum,cela prend moins d'une minute. - 5 Injections dans le ventre sur l'animal vigile : 102 souris maximum, le geste prend moins d'une minute. 4 injections sous la peau sur animal vigile : 102 souris maximum, le geste prend moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet ne devrait entrainer que des nuisances modérées chez les animaux : - Le stress lié au traitement par chimiothérapie est limité à 4 jours ce qui ne devrait pas induire d'effet secondaire - La sensation de faim associée à une restriction calorique de 40% de leur prise alimentaire moyenne pendant un temps limité de 21 jours - Le stress associé à l'individualisation des animaux pendant la durée de l'expérience en cas de restriction calorique. Cette individualisation sera prolongée à la phase de renutrition à satiété. En effet, après individualisation la remise en groupe des animaux pendant la période de renutrition risquerait de provoquer des combats pouvant induire des blessures graves voire la mort des animaux. Pour éviter un biais expérimental sur les conditions d'hébergement, nous devrons également individualiser les animaux contrôles non soumis à une restriction calorique. - Le stress associé à la pesée des animaux qui ne prend que quelques secondes et ne necessite pas de contention de l’animal - Le stress associé aux prélèvements sanguins qui seront espacés d’au moins 7 jours. Ces prélèvements se feront sous anesthésie - Le traitement par un probiotique ou ses dérivés qui se fera par voie orale à la pipette en déposant délicatement dans le coin de la joue une petite quantité de solution qui sera alors volontairement déglutis par l'animal. Ce traitement qui se fera après avoir contentionné la souris dure moins d'une minute. le stress induit par une injection dans le ventre et la contention associée de moins d'une minute. le stress associé à une injection sous la peau et la contention associée de moins d'une minute.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter différents organes en vue d'analyses ultérieures

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme et de son microbiote à une chimiothérapie éventuellement associée à une restriction calorique ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier et des interactions avec sa flore dans ce contexte de restriction. C'est pourquoi cette étude nécessite d’expérimenter sur l’animal. Des études précédentes, laissent supposer un effet potentiel des probiotiques utilisés dans le contexte étudié.

Réduction

Nous avons prévu des expériences pilotes afin d'utiliser un minimum d'animaux pour mettre en place le modèle. De plus, le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus. Nous avons prévu de réaliser ce projet de manière séquentielle et de ne réaliser les procédures que si les résultats précédents le justifie. Dans une optique de réduction, nous allons également prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, foie, tissu adipeux, par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas forcemment prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, nous n'utiliserons que des animaux de plus de 20g au debut du projet. Les animaux seront pesés à minima toute les semaines afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie suivis d’un point de compression jusqu’à l’arrêt complet du saignement. En cas de restriction calorique, les animaux seront individualisés dans des cages transparentes pour maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils auront un environnement enrichi afin de pouvoir exprimer au mieux leur répertoire comportemental (abri, morceau de bois, matériel de nidification en quantité importante). Le traitement probiotique ou par ses dérivés se fera en déposant délicatement une petite quantité de solution dans le creux de la joue. Pour chaque procédure, des points limites adaptés ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix pour étudier la flore dans une étude nutritionnelle. Afin de pouvoir modéliser les effets d'une chimiothérapie chez l'adulte, il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes. Nous utiliserons donc des souris mâles de 13 semaines au début de l'expérience (10 semaines à l'arrivée dans l'établissement).

526 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. 414 d'entre elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à six injections de peptides dans l'abdomen sur animal vigile, trois injections d'agent de contraste dans la veine de la queue et trois passages de dix minutes au micro-tomographe à rayons X. Les tumeurs sont implantées au flanc, alors que le projet porte sur le glioblastome, un cancer du cerveau. Sur le remplacement, le porteur affirme n'avoir pas d'autre choix que l'animal, la culture cellulaire ne représentant pas les mécanismes d'un "organisme entier".

Objectifs

Le glioblastome multiforme (GBM) est le cancer du cerveau le plus courant et le plus létal chez l’adulte avec une incidence de 2 à 5 cas par 100 000 personnes par an en Europe et aux Etats-Unis. Le pronostic des patients est très faible, avec une survie médiane à 15 mois malgré le suivi d'une thérapie composée d’une chirurgie puis d’une combinaison de radio- et chimiothérapie. C’est pourquoi il est primordial de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques qui permettront de limiter l’expansion et l’invasion tumorales. Dans ce contexte, nous nous intéressons à deux protéines de la matrice extracellulaire, fortement présentes dans le cancer du cerveau et connues pour favoriser la croissance tumorale. Au laboratoire, ont été développés deux peptides ciblant spécifiquement ces deux protéines. Individuellement et par des approches de culture cellulaire et de modèles murins, ces deux peptides ont montré des effets antitumoraux notamment en rétablissant l’immunité antitumorale et en diminuant la vascularisation de la tumeur. Ce projet comporte plusieurs objectifs. (1) Nous voulons analyser les effets du premier peptide de manière individuelle sur le développement de ce cancer, étude jamais réalisée jusqu’à présent. (2) Nous voulons évaluer si l’injection des deux peptides en concomitance peut entraîner un effet synergique sur l’inhibition du développement tumoral. La procédure 1 va permettre de répondre à ces différentes questions biologiques. Les procédures 2 et 3 ne seront réalisées que si et seulement si la procédure 1 présente des résultats convaincants et permettront d’évaluer (3) la toxicité aiguë et (4) à doses répétées de ces deux molécules. Enfin, la dernière procédure nous donnera (5) des indications sur la répartition de ces molécules seules ou co-administrées dans le corps des animaux et nous permettra de confirmer qu’elles sont bien recrutées au niveau de la tumeur.

Bénéfices attendus

Le cancer du cerveau résiste à tous les traitements actuellement disponibles, d’où la nécessité de trouver de nouvelles approches. Dans cette étude, nous allons tester l’efficacité de deux molécules capables de bloquer certaines fonctions favorisant la croissance des tumeurs. Chacune de ces molécules a déjà montré des effets antitumoraux, à la fois en laboratoire (sur cellules) et chez la souris dans différents cancers, mais jamais encore dans le cancer du cerveau. Le premier intérêt est donc de vérifier si elles sont efficaces aussi dans ce contexte. Le second est d’évaluer leur action lorsqu’elles sont administrées ensemble, ce qui n’a jamais été étudié. Si elles agissent en synergie, elles pourraient modifier l’environnement de la tumeur pour le rendre moins favorable à son développement et permettre au système immunitaire de mieux la combattre.

Procédures

- Injection de cellules tumorales de cancer du cerveau (1x) sous anesthésie gazeuse. Toutes les souris des procédures 1 et 4 sont concernées soit 414 souris (

Impact sur les animaux

Le développement d’une tumeur au niveau du flanc peut entraîner une gêne ou une diminution du bien-être de l’animal (nuisance modérée). Les injections répétées de peptides et les anesthésies peuvent induire un stress transitoire, une baisse de température corporelle ou une altération de l’état général (nuisance modérée). Si une perte de poids importante (>20%) est constatée ou si la tumeur atteint la taille limite autorisée, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude afin d’éviter toute souffrance. Des analyses sanguines hebdomadaires permettront également de vérifier l’état de santé global. Ces prélèvements sanguins peuvent occasionner une gêne passagère et nécessitent une anesthésie pour assurer le confort de l’animal (nuisance modérée). Une dépilation unique sera réalisée pour certaines procédures, pouvant causer un inconfort local mais sans conséquence durable (nuisance légère). L’injection d’un agent de contraste dans la veine de la queue est un geste court, susceptible de provoquer une gêne temporaire, avec un risque limité d’hématome (nuisance légère). Enfin, les souris immunodéficientes, en raison de leur système immunitaire affaibli, présentent une plus grande sensibilité aux infections et au stress (nuisance inhérente au phénotype).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, l’ensemble des animaux sera mis à mort pour analyse approfondie des tissus et de la tumeur.

Remplacement

Une étude sur des cellules seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes biologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, l’environnement tumoral très complexe. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique des candidats médicaments.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés, le projet est conçu selon un schéma expérimental séquentiel. La première phase (procédure 1) vise à identifier la dose maximale efficace (d1) parmi deux doses testées. La poursuite du protocole vers la procédure 2 sera conditionnée par l’observation d’un effet antitumoral significatif et l’absence de signes de toxicité majeurs. La procédure 3 ne sera mise en œuvre qu’avec les doses jugées non toxiques à l’issue de la procédure 2. Enfin, la procédure 4 sera exclusivement réalisée avec la dose présentant le meilleur index thérapeutique, déterminé à partir des résultats précédents. Ce déroulé progressif permet d’éviter l’exposition inutile d’animaux à des conditions expérimentales non pertinentes. Par ailleurs, dans la première procédure, le nombre d’animaux par groupe a été déterminé de manière à minimiser leur utilisation tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour l’interprétation des résultats. Pour les autres procédures, le nombre de souris par condition a été déterminé à minima afin d’obtenir des données qualitatives qui n’ont pas besoin d’être quantitatives.

Raffinement

À leur arrivée, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine avant le début des procédures. Le nombre de souris par cage sera limité à 3 pour les immunodéprimées et 5 pour les immunocompétentes. La litière des souris immunodéficientes sera en cellulose pour éviter tout risque de blessure, et chaque cage sera enrichie avec dômes et tubes en carton. Les animaux seront habitués à la manipulation pour réduire le stress. Toutes les interventions pouvant provoquer douleur ou gêne (implantation de tumeur, imagerie) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. À leur réveil, les souris seront placées en cage de récupération avec lampe chauffante. Pendant toute l’expérimentation, elles seront surveillées quotidiennement et pesées trois fois par semaine, avec remplissage d’une grille de suivi au moins trois fois par semaine pour détecter les premiers signes de mal-être. Après les injections répétées de peptides, une surveillance accrue sera mise en place. La douleur éventuelle sera prévenue ou traitée par anesthésiques et analgésiques. En cas d’atteinte d’un point limite, l’animal sera euthanasié sous anesthésie profonde par une méthode rapide et validée. Seules des souris femelles seront utilisées, permettant l’hébergement de plusieurs animaux par cage. Afin de raffiner le recours à l’utilisation d’animaux, à chaque fin de procédure, des prélèvements (tumeurs et organes d’intérêts) seront réalisés après euthanasie pour analyses complémentaires approfondies.

Choix des espèces

Le recherche de nouvelles molécules antitumorales est primordial dans le contexte du cancer du cerveau au vu de la résistance des cellules tumorales aux traitements actuels et à la très faible survie des patients. Nous avons développé de nouveaux peptides qui, en culture cellulaire, montrent de réels effets antitumoraux. Il est donc primordial de tester ces nouveaux peptides dans un contexte largement plus complexe que la culture cellulaire et la souris est une espèce qui permet de récapituler assez fidèlement l’environnement tumoral (vascularisation, immunité) retrouvé chez l’humain. Les souris utilisées auront 10 semaines au début des procédures afin d’éviter toute influence du développement sur les résultats.

Une partie des souris utilisées est génétiquement modifiée pour que leurs adipocytes bruns soient détruits. 7 018 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles passent de sept à vingt jours à des températures dérogatoires et reçoivent jusqu'à quatre injections, l'inflammation provoquée par les adjuvants étant reconnue comme une source de douleur, alors que le porteur écrit que ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Leurs ganglions lymphatiques et leur tissu adipeux brun sont prélevés après la mise à mort.

Objectifs

Chez les mammifères, comme chez l’humain et la souris, la température du corps est très bien régulée. Quand il fait froid, le corps met en place différents mécanismes pour rester à une température stable, par exemple en resserrant les vaisseaux sanguins ou en produisant de la chaleur dans de la graisse spéciale qu’on appelle le tissu adipeux brun. Mais cette température peut aussi changer en cas de maladie ou après une vaccination. On peut avoir de la fièvre (hausse générale de la température) ou une chaleur localisée à l’endroit de l’inflammation. Cette élévation de la température n’est pas anodine et elle peut jouer un rôle important dans le bon fonctionnement du système immunitaire. Les ganglions lymphatiques, sortes de petits centres de contrôle du système immunitaire, sont entourés de graisse. Cette graisse pourrait, elle aussi, produire de la chaleur en cas d’inflammation, aidant à réguler la température locale autour des ganglions. Des signaux envoyés par le système immunitaire (comme des cellules ou des molécules solubles) pourraient contrôler cette fonction "chauffante", comme cela a déjà été observé en cas d’exposition au froid. Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre ces mécanismes, à travers trois grands objectifs : 1) voir comment la température ambiante influence la réponse immunitaire chez la souris, 2) tester si certains adjuvants (substances ajoutées à un vaccin pour renforcer la réponse du système immunitaire) peuvent activer cette graisse "chauffante" autour des ganglions, et 3) déterminer si cette production de chaleur locale par la graisse joue un rôle dans la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre comment la température, la production de chaleur par le corps et le système immunitaire interagissent pourrait aider à trouver de nouvelles façons d'agir sur nos défenses. Par exemple, cela pourrait permettre de renforcer la réponse du corps lors d'une vaccination pour qu'elle soit plus efficace, ou au contraire de la calmer dans certaines maladies où le système immunitaire s'emballe, comme les maladies auto-immunes.

Procédures

Les interventions réalisées seront les suivantes : 7 jours d’exposition à des températures expérimentales (64 animaux), 7 jours d’exposition à des températures expérimentales + 1 injection (30 secondes) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (800 animaux), 8 à 10 jours d’exposition à des températures expérimentales + 2 injections sous anesthésie (10 minutes) (954 animaux), 9 à 15 jours d’exposition à des températures expérimentales + 2 injections (30 secondes par injection) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (400 animaux), 12 à 20 jours d’exposition à des températures expérimentales + 4 injections (30 secondes par injection) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (4800 animaux).

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère. L'inflammation induite par les adjuvants est également une source de douleur potentielle. Les animaux sont hébergés dans des conditions de température dérogatoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les ganglions lymphatiques et le tissu adipeux brun dans le but de les analyser.

Remplacement

Pour comprendre comment la température, la production de chaleur par le corps et le système immunitaire interagissent, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre un ganglion lymphatique et la graisse qui l’entoure et entre les différents types de cellules à l’intérieur du ganglion.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, les souris « sauvages » seront commandées chez un fournisseur agréé afin de ne pas générer d’animaux surnuméraires. Pour les élevages, nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles dans certaines procédures. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins trois fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’humain nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’humain. De plus, nous étudions le tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant la déplétion spécifique des adipocytes bruns. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 8 semaines).

337 rats vont être utilisés, chacun sous restriction alimentaire pendant quatre-vingts jours au maximum et soumis jusqu'à soixante-dix sessions d'apprentissage sur dix semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 241 d'entre eux passent deux heures de chirurgie sous anesthésie pour l'implantation d'un dispositif d'enregistrement neuronal, et 87 restent seuls en cage jusqu'à la fin du projet. Trois jours de suite, tous reçoivent une injection de chlorure de lithium qui provoque des crampes intestinales pendant une dizaine de secondes, pour les détourner d'un choix appris. Le projet est présenté comme une piste pour aider à terme les personnes addictes à reprendre le contrôle de leurs actions, quand la restriction alimentaire, la chirurgie et l'isolement sont immédiats et que tous les rats finissent tués pour analyse du cerveau.

Objectifs

Dans notre vie quotidienne, nous adoptons deux grands types de comportements : ceux que nous faisons de manière volontaire pour atteindre un but, et ceux que nous faisons automatiquement, par habitude. Les comportements orientés vers un but sont conscients et flexibles : on réfléchit à ce qu’on veut faire et pourquoi. Mais ils demandent du temps et de l’énergie. À l’inverse, les comportements habituels sont des actions que l’on répète jusqu’à ce qu’elles deviennent automatiques, comme se brosser les dents ou attacher sa ceinture. Ils ne demandent plus d’effort mental et nous permettent d’économiser nos ressources. Ces deux formes de comportement doivent être équilibrées pour s’adapter au mieux à notre environnement. Pourtant, cet équilibre est parfois altéré dans certaines maladies mentales, où la personne agit de manière trop automatique, même si cela devient inadapté ou nuisible. Les chercheurs ont déjà bien étudié comment un comportement devient une habitude dans le cerveau, notamment en identifiant certaines régions cérébrales impliquées dans ce processus. Mais on sait encore peu de choses sur la manière dont on peut interrompre une habitude pour revenir à un comportement plus réfléchi, surtout lorsque les circonstances changent. Une autre limite des recherches actuelles est que les études chez l’animal sont souvent menées dans des environnements très simples, où l’animal n’a qu’un seul choix possible. Cela ne reflète pas la complexité du monde réel. Pour mieux comprendre le fonctionnement de l’équilibre entre action réfléchie et habitude, il faut donc étudier les comportements dans des situations plus variées et plus proches de la vie naturelle. C’est l’objectif de ce projet : explorer comment le cerveau équilibre ces deux types de comportements, et comment il s’adapte lorsque les habitudes ne sont plus efficaces. Pour cela, nous répondrons à 3 sous-objectifs : 1. Comprendre comment les comportements orientés vers un but et les habitudes se mettent en place et s’influencent mutuellement. 2. Observer l’activité cérébrale lorsqu’un individu passe d’un comportement automatique à un comportement plus réfléchi, à l’aide d’une technique pour enregistrer un groupe de neurones. 3. Approfondir cette observation avec une autre technique qui permet d’enregistrer l’activité de neurones individuels.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment le cerveau équilibre comportements automatiques et actions réfléchies, un mécanisme essentiel dans notre vie quotidienne, mais qui peut devenir problématique dans certaines maladies comme l’addiction. En identifiant les bases cérébrales qui permettent de rompre avec des habitudes devenues inadaptées, ce travail ouvrira la voie à de nouvelles stratégies pour aider les personnes à reprendre le contrôle sur leurs actions. À terme, ces recherches pourraient améliorer la prévention et le traitement des troubles liés à une perte de flexibilité comportementale, comme les addictions.

Procédures

Tous les rats seront sous alimentation restreinte pendant 80 jours maximum et seront pesés 5 fois par semaine. Tous auront accès à des récompenses plaisantes après avoir exécutés et appris des tâches simples (appui sur des leviers) dans des cages de comportement. Les sessions d'apprentissage et de détection des habitudes s'étaleront sur 10 semaines (70 session maximum). Les animaux seront soumis à 3 séances de 10 minutes en présence de la récompense suivi d'un stimulus aversif (injection d'une solution provoquant des crampes intestinales pendant quelques dizaines de secondes) à raison d'une séance par jour pendant 3 jours consécutifs. Les injections ne durent que quelques secondes. 241 rats suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée 2 heures) afin d’implanter un dispositif pour mesurer ou modifier l’activité neuronale. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, 87 rats seront hébergés seuls dans leur cage. Pour mesurer l'activité neuronale, 241 rats vigiles seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. Les rats auront 20 sessions de mesure de l'activité neuronale. Tous les rats recevront 3 injections d’un agent aversif pour les détourner de leur choix.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : - Restriction alimentaire : peut induire un léger stress. - l’injection intra-péritonéale peut engendrer une douleur au niveau du site d’injection. - Le chlorure de lithium induit des contractions abdominales transitoires pendant une dizaine de secondes. - Léger stress transitoire due à la contention de l’animal lors des injections - Chirurgies : inconfort transitoire au réveil et douleur post-opératoire minorée par des antalgiques - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience - Isolement nécessaire dès lors que l’animal est équipé avec le dispositif de mesure de l’activité cérébrale (électrodes d’enregistrement, procédure 3): stress

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires sur le cerveau ou pour des vérifications histologiques (expression du virus, localisation de l’implant, …etc).

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier. Les connaissances acquises dans ce projet devraient permettre dans le futur d’apporter des connaissances pour développer des algorithmes permettant de modéliser le comportement. Ces algorithmes pourraient à terme constituer des outils de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 337 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 5 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; tunnel pour se cacher) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux récompenses qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, ainsi que les récompenses sucrées, de façon spontanée. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis des injections quotidiennes pendant quatre semaines et une échocardiographie sous anesthésie toutes les deux semaines, pour tester des molécules censées protéger le cœur de la doxorubicine sans réduire son effet antitumoral. Le porteur signale une nécrose possible au point d'injection, une intolérance à l'effort et une respiration accélérée, et transporte les souris à pied entre deux établissements, en cage placée dans un sac opaque. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever le cœur, la tumeur, le foie et les reins, prélèvements qu'il qualifie d'"indispensables".

Objectifs

La cardio-oncologie connait actuellement un essor grandissant au regard du problème de santé publique. En effet, ceci est dû au vieillissement de la population, l’augmentation de cas de cancer et la mise sur le marché de nouvelles molécules anticancéreuses. La doxorubicine (dox) fait partie des agents de chimiothérapies les plus utilisés dans le traitement des tumeurs solides comme le cancer du sein. Cependant son utilisation clinique est limitée due à sa cardiotoxicité qui peut conduire à l’insuffisance cardiaque (IC). Actuellement il existe une seule molécule cardioprotectrice dont l’utilisation reste limitée pour cause d’effets secondaires importants. L’objectif général scientifique de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires liés à la cardiotoxicité afin de proposer une molécule à la fois cardioprotectrice, n’interférant pas avec le pouvoir antitumoral de la dox et idéalement l’amplifierait. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier de nouvelles molécules permettant de protéger le cœur lors d’une chimiothérapie anti-cancéreuse. L’effet de chaque molécule sera étudié à la fois sur le cœur et sur la tumeur, afin de s’assurer que l’efficacité antitumorale n’est pas altérée. L’ensemble du projet contribuera ainsi à proposer une nouvelle stratégie cardioprotectrice lors de l’utilisation de chimiothérapies couramment utilisées dans le traitement du cancer, améliorant ainsi la prise en charge du patient et ses chances de survie.

Procédures

Les animaux suivront plusieurs types d’interventions : une injection unique de cellules tumorales sous anesthésie (durée environ 1 minute) ; des injections journalières pendant 4 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile). Une échocardiographie sous anesthésie sera réalisée une fois toute les deux semaines (10 minutes chacune). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1. Seule l'isolation des cellules primaires en intervention terminale et la mise à mort réglementaire des animaux se fera dans l'établissement utilisateur 2.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection tumorale (apparition d’une masse localisée), une légère perte de poids ou une baisse d’activité liées aux traitements, ainsi qu’un stress ponctuel lors des manipulations répétées. De rares effets cardiovasculaires (intolérance à l’effort, respiration plus rapide) pourront survenir avec la doxorubicine ainsi qu’une nécrose localisée au niveau du site d’injection. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole car les prélèvements d’organes (cœur, tumeur, foie, reins) sont indispensables à l’évaluation de la toxicité cardiaque et de l’efficacité antitumorale.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre la chimiothérapie et la fonction cardiaque dans un organisme complet. Les modèles in vitro ou sur organoïdes ne permettent pas de reproduire la complexité des réponses métaboliques et circulatoires impliquées dans la cardiotoxicité et la croissance tumorale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Les groupes expérimentaux ont été optimisés afin de partager les animaux pour plusieurs types d’analyses et d’éviter les répétitions inutiles.

Raffinement

Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Les injections de cellules tumorales sont effectuées sous anesthésie, les échocardiographies sous anesthésie légère avec maintien thermique, et les animaux font l’objet d’un suivi clinique quotidien. Les points limites (perte de poids, taille tumorale, détresse respiratoire) ont été clairement définis pour éviter toute souffrance prolongée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude du cancer du sein et de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Sa physiologie cardiovasculaire et ses réponses tumorales sont bien décrites et transposables à l’humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), correspondant à un stade physiologique stable et adapté aux procédures de greffe et de traitement.

En cas de douleur manifeste ou de blessure persistant trois jours, les souris sont tuées par perfusion intracardiaque. 1 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont privées d'abri et de matériel de nidification pendant quatre à sept semaines pour induire un stress, mises à jeun dix-huit heures, aspergées de sucrose sur le dos pour déclencher une heure de toilettage intense, puis placées seules dans une cage inconnue fortement éclairée, avec deux gavages qui exposent à une blessure de l'œsophage et à une fausse route. Il s'agit de savoir si des récepteurs à la sérotonine portés par la microglie conditionnent les effets de la fluoxétine, un antidépresseur inefficace chez un tiers des patients pour des raisons que le porteur dit indéterminées.

Objectifs

La dépression et l’anxiété représentent les troubles psychiatriques les plus répandus à l’échelle mondiale, touchant environ 332 millions de personnes. Les traitements de première intention appartiennent à la famille des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS), mais leur efficacité est très variable, et 1/3 des personnes traitées y sont insensibles pour des raisons encore indéterminées. Les ISRS, tels que la fluoxétine, augmentent les concentrations extracellulaires de sérotonine en bloquant sa recapture. Chez la souris, un traitement chronique de fluoxétine provoque à la fois une diminution de l’anxiété et des processus de plasticité dont une augmentation de la neurogenèse adulte dans l’hippocampe. Il a par ailleurs été montré que cette neurogenèse adulte est diminuée dans les modèles murins de dépression et qu’elle est nécessaire pour permettre les effets anxiolytiques de la fluoxétine. La microglie, c'est-à-dire les cellules immunitaires du cerveau, joue un rôle important dans la régulation de la neuroinflammation. En situation de stress, d’infection ou de lésion, elle adopte un phénotype pro-inflammatoire qui favorise la défense immunitaire. À l’inverse, lorsque la menace est résolue ou pour maintenir l’homéostasie, elle adopte un phénotype anti-inflammatoire qui soutient la réparation tissulaire, et favorise la neurogenèse adulte. Toutefois, une persistance de l’état pro-inflammatoire peut se produire, et un nombre croissant d’études suggère que cet état pourrait contribuer à la pathophysiologie de la dépression. Corrélativement, il a été montré que la fluoxétine peut réduire l’activation pro-inflammatoire de la microglie, suggérant une régulation de ces cellules par la sérotonine. Ce lien entre neuro-inflammation et dépression oriente la recherche vers des traitements ciblant la microglie et l’inflammation cérébrale, en particulier pour les patients résistants aux antidépresseurs classiques. La modulation de la microglie, sans supprimer son activité essentielle, pourrait représenter une stratégie pour améliorer les symptômes ou limiter les dégâts liés à la maladie. Dans ce cadre, nous nous intéresserons à des récepteurs à la sérotonine spécifiquement exprimés par la microglie. Notre projet a pour objectif de déterminer si l’expression de ces récepteurs par la microglie est nécessaire pour permettre les effets de la fluoxétine sur l’anxiété et la neurogenèse adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre le rôle de la microglie, et de sa régulation par la sérotonine, dans les effets des antidépresseurs qui modulent les niveaux de sérotonine dans le cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre comment la sérotonine, un neurotransmetteur clé dans la régulation de l’humeur, influence la microglie, et donc d’apporter de nouvelles connaissances sur les interactions neurones - cellules immunitaires dans le cerveau. Elle pourrait également permettre d’identifier, de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dépression, notamment pour les patients qui présentent des résistances aux traitements pharmacologiques classiques.

Procédures

Dans ce projet, des animaux âgés de 4 à 6 semaines vont recevoir par gavage oral un composé pharmacologique pour bloquer l’expression d’un récepteur dans un type cellulaire spécifique. 2 prises espacées de 48h sont nécessaires. L’acte est réalisé sur animal vigile et dure moins de 30 secondes. Les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental (absence d’abri et de matériel pour faire un nid) afin d’induire un stress basal modéré pour une durée totale de 4 à 7 semaines selon la procédure et seront répartis dans 4 lots différents. Dans le lot 1, ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson pour une durée totale de 5-7 semaines. Au cours du traitement, ils seront soumis à 2 tests comportementaux : un qui mesure l’anhédonie (un marqueur de la dépression) sur une durée d’1 heure, et un qui mesure l’anxiété pendant une durée maximum de 10 minutes, avec 7 jours d’intervalle entre les 2 tests. Dans le lot 2, ils recevront un traitement anxiolytique par une injection unique sur animal vigile (geste durant moins de 20 secondes), et seront soumis à un test mesurant l’anxiété sur une période de 10 minutes maximum. - Dans le test d’anhédonie, les animaux sont aspergés sur le dos avec une solution de sucrose, ce qui déclenche une activité intense de toilettage pendant environ une heure, et la qualité du toilettage du pelage sera mesurée à l’aide d’un score dans l’heure qui suit, ainsi que 24h après. - Dans le test d’anxiété, les animaux préalablement soumis à un jeûne alimentaire la veille (durée du jeûne : 18 heures), sont placés individuellement dans une cage inconnue et fortement illuminée. La latence pour aller manger une croquette située au centre de la cage est mesurée sur une période de 10 min. - Dans les lots 3 et 4, les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental afin d’induire un stress basal pour une durée totale de 4 semaines, pendant laquelle ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson, également pendant 4 semaines. Ils recevront soit une unique injection intrapéritonéale d’un marqueur de division cellulaire (geste durant moins de 20 secondes), soit 2 injections à 2h d’intervalle et réalisées de chaque côté de l’animal pour limiter les douleurs répétées au même site d’injection. Enfin, une chirurgie sans réveil sous anesthésie et analgésie sera réalisée à l’issue des 2 procédures. Ce geste dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’hébergement sans enrichissement environnemental, le jeûne alimentaire de 18h ainsi que le test comportemental associé à ce jeûne (test suppression de la prise alimentaire par la nouveauté) vont provoquer un stress modéré. Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par gavage, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure au niveau de l’œsophage lors de l’insertion de la sonde de gavage, et un risque mineur de “fausse route”. Le traitement pharmacologique dans l’eau de boisson peut entraîner une baisse de la consommation hydrique. L’injection IP peut générer une douleur légère et transitoire au point d’injection, avec un risque de péritonite si l’acte est répété. L'anesthésie peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire voire un arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale et du lien entre microglie et effets des antidépresseurs et anxiolytiques.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales, induites par un traitement antidépresseur, sur la neurogenèse adulte et sur le comportement. De manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, leur remplacement par une approche cellulaire est toujours privilégié, comme des cultures primaires de neurones lorsque la question scientifique posée le permet. Nous pourrions envisager de mettre en place des cultures in vitro composées de microglies (cellules immunitaires du cerveau), de neurones sérotoninergiques et de cellules souches neurales (cellules peuvent donner naissance à des nouveaux neurones), afin d’observer l’effet des antidépresseurs sur ces différents types cellulaires, mais cette méthode ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre cellules et des circuits impliqués dans les effets des antidépresseurs, surtout au stade adulte. Par ailleurs, l’anxiété est un état qui se mesure par le comportement d’un animal éveillé, qui doit pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (odorat, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir, via les hormones de stress, plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, mais on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux effets des antidépresseurs de type ISRS.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des tests statistiques adéquats tels que des ANOVA pour des comparaisons multiples afin de comparer nos différents groupes de génotypes et de traitement, ou des t-test. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 1104 sur 5 ans.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Dans nos expériences, les enrichissements seront retirés à l’âge de 10-12 semaines et ce pendant une durée de 4 à 7 semaines selon la procédure, pour générer un stress permettant d’obtenir un effet antidépresseur ou anxiolytique des composés pharmacologiques qui font l’objet de notre étude. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum la douleur et/ou le stress en termes de durée et d’intensité. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations sont effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Concernant le traitement antidépresseur, nous avons pris l’initiative d’administrer notre traitement dans l’eau de boisson (prise hydrique volontaire de l’animal), au lieu de l’injecter par voie intra-péritonéale, ce qui diminue considérablement la manipulation des animaux et évite les actes douloureux. Concernant la perfusion intracardiaque, les animaux sont injectés avec l'anesthésique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux réglementations, et de manière rapprochée pendant le déroulement de la procédure. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant/après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, injection de solution saline et/ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par perfusion intracardiaque pour être utilisés dans les mises au point.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent pour nos études car en tant que mammifère, son système nerveux présente des homologies importantes avec l’homme. En effet, l’organisation des structures cérébrales et des différentes voies qui les connectent sont similaires entre ces 2 espèces. Les voies sérotoninergiques ainsi que les récepteurs à la sérotonine, sont bien décrites chez la souris, et comparables avec ceux décrits chez l’homme. La souris adulte est le modèle standard pour l’évaluation des effets neurobiologiques des antidépresseurs de type ISRS et les paradigmes comportementaux sont validés. Utiliser la souris est essentiel pour garantir la comparabilité et la reproductibilité avec des études effectuées précédemment. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider des gènes précis spécifiquement dans un type cellulaire donné et à un stade ou âge donné. Dans notre étude, les animaux auront un développement normal, puis nous induirons à l’âge de 4 semaines, l’invalidation d’un gène spécifiquement dans la microglie. Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience. Les animaux seront ensuite traités à partir de 10 semaines avec un antidépresseur, classiquement donné en médecine humaine pour soigner les troubles dépressifs et anxieux.