Procédures modérées

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est infecté par le virus de l'immunodéficience simienne, puis subit une quinzaine d'anesthésies générales, une quinzaine de prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse et environ sept ablations chirurgicales de ganglions lymphatiques, avec un hébergement individuel une fois infecté. Le porteur attend de l'infection une perte de poids, des diarrhées, une chute des lymphocytes, des nodules palpables et des lésions cutanées, et prévoit de compléter l'alimentation si les anesthésies répétées coupent l'appétit. Il affirme que le macaque est le seul modèle animal reproduisant la maladie humaine et qu'il n'existe "pas d'autre modèle animal" pour le sida, l'objectif restant de comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires échouent à contrôler le virus.

Objectifs

Malgré des décennies de recherche, il n'existe toujours pas de vaccin ni de traitement curatif contre le VIH/SIDA. Pour mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans le contrôle de l'infection, nous utilisons deux modèles animaux primates non humains (il s’agit d’animaux d’élevage) infectés par le virus d’immunodéficience simienne (VIS) : • Le singe vert d’Afrique, naturellement infecté par le VIS sans développer la maladie, • Et le macaque cynomolgus, chez qui l’infection par le VIS est pathogène, comme chez l’humain. Un intérêt particulier est porté à un type de cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles (NK, natural killers), qui jouent un rôle crucial dans la réponse antivirale, notamment au sein des tissus lymphoïdes secondaires . Ces tissus, comme les ganglions ou la rate, sont les lieux stratégiques où les cellules immunitaires se rencontrent et s’activent pour organiser la défense de l’organisme. Parmi ces cellules, on retrouve les cellules T, des globules blancs spécialisés qui reconnaissent spécifiquement un agent infectieux et coordonnent la réponse immunitaire. Tout comme elles,ces cellules NK peuvent acquérir des caractéristiques de mémoire et s'adapter fonctionnellement. Il a été d’ores et déjà montré chez le singe vert d’Afrique que les cellules NK adaptatives fortement différenciées se développent dans les tissus lymphoïdes secondaires et contribuent à un contrôle efficace du virus. Il n’y a pas de contrôle chez le macaque cynomolgus. Pour comprendre l'absence de contrôle du virus chez ce dernier, cette étude sera menée sur six macaques infectés par le VIS. Cette étude se concentre sur l’analyse de la charge virale ainsi que l’évaluation de l’ensemble des caractéristiques phénotypiques, tel que leur apparence ou les molécules présentes à leur surface et fonctions des cellules NK dans divers tissus. L’objectif global est de comprendre les conditions qui favorisent ou empêchent la génération de cellules NK efficaces, et d’identifier des éléments précis du système immunitaire sur lesquels on peut agir afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques contre le VIH.

Bénéfices attendus

Cette étude sur le modèle macaque vise à mieux comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires, appelées cellules NK adaptatives, sont dysfonctionnelles et incapables de contrôler l'infection par le virus VIS, un équivalent du VIH chez ces animaux. En combinant des expériences en laboratoire et des observations directes sur ce modèle, nous cherchons à découvrir comment ces cellules se développent et comment elles sont régulées. Pour cela, nous utilisons des techniques de pointe, comme la cytométrie de flux et le séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule, afin d'analyser en détail les cellules NK durant l'infection. Ces méthodes nous fourniront des informations précieuses sur la diversité et le rôle de ces cellules dans l’infection. L'objectif à long terme est d'identifier les facteurs qui pourraient rendre ces cellules NK particulièrement efficaces pour éliminer les cellules infectées. Nos résultats pourraient aider à développer de nouvelles stratégies de traitement pour le VIH chez l'humain, en ciblant les réservoirs du virus dans le corps et en contribuant à une rémission durable de l'infection.

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (15 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus VIS (une fois, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (15 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait chirurgical de ganglions lymphatiques périphériques (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection: Perte de poids, diarrhée, baisse importante des lymphocytes, observation de nodules à la palpation, lésions cutanées Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entraîner un stress. Nuisances possibles suite à l’ablation de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin d’avoir accès à tous les organes lymphoïdes primaires et secondaires où sont activées les cellules NK.

Remplacement

Les expériences uniquement in vitro ne peuvent pas refléter le comportement de la cellule dans son contexte physiologique, ni mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier. C’est pourquoi les études in vivo sont nécessaires. Le modèle primateest, pour toutes ses similarités avec l’humain, le plus adapté aux études physiopathologiques. Par ailleurs, pour le SIDA, il n’existe pas d’autre modèle animal que celui-ci. Par opposition aux études menées chez l’humain infecté par le VIH, l’utilisation des modèles primates où l’infection est pathogène, comme chez l’humain, nous permet d'analyser et de comparer, en absence de traitement, les réponses cellulaires dans différents tissus en plus du sang, notamment la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, l’intestin, le foie et la rate qui jouent un rôle dans la pathogenèse. Le modèle du macaque cynomolgus permet donc d’analyser les interactions hôte/virus dans des contextes contrôlés (virus, timing) facilitant ainsi l’identification des caractéristiques propres à l’organisme qui influencent sa réponse face au virus. Par ailleurs, seul le modèle animal permet d’analyser les interactions virus/hôte dès les premiers jours post-infection (période qui généralement est impossible à étudier chez l’humain infecté par le VIH), or il est connu que les temps précoces suites à l’infection sont fortement impliqués dans la régulation des réponses immunes et l’établissement des réservoirs viraux. Il est donc très important d’étudier cette période précoce pour mieux comprendre les facteurs responsables de l’induction d’un contrôle viral efficace.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude sont réalisées en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale avec un soutien thermique pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (patés pour singe, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. En cas d’apparition de réaction locale, un traitement symptomatique pourra être instauré. Les animaux sains seront hébergés en groupe. Les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Le macaque est le seul modèle animal, qui, lorsqu’il est infecté par le SIV présente une physiopathologie comparable à celle observée chez l’humain infecté par le VIH. C’est le modèle animal le plus pertinent pour étudier et comprendre les mécanismes de transmission du virus et de développement du SIDA chez l’Humain. Cela fait d'eux un modèle précieux pour étudier pourquoi le système immunitaire est dysfonctionnel pour lutter contre le SIDA. Les recherches se concentrent sur les singes adultes, car leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de protection. En étudiant ces animaux, les scientifiques espèrent découvrir des pistes pour renforcer la réponse immunitaire contre le VIH chez l'humain.

Injectées dans l'abdomen avec du tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant quatre semaines et demie, 48 souris dont le gène IRE1 a été désactivé dans le foie développent une fibrose hépatique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection dure dix secondes et se répète neuf fois, sous contention, sur animal éveillé. Le porteur qualifie la fibrose obtenue d'asymptomatique et sans douleur chez la souris, ce qui laisse le niveau modéré déclaré pour les 48 animaux reposer sur les seules piqûres. Toutes sont tuées à la fin du protocole, pour que leur foie soit prélevé et la surface de fibrose mesurée.

Objectifs

La fibrose hépatique correspond à une accumulation anormale de tissu cicatriciel dans le foie, qui apparaît lors de nombreuses maladies chroniques du foie. Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou de faire régresser cette fibrose, ce qui explique la nécessité de mieux comprendre comment elle se développe. Dans ce projet, nous nous intéressons à une protéine appelée IRE1, présente dans les hépatocytes (les principales cellules du foie). Des études ont montré que cette protéine est fortement activée lorsque le foie est agressé et que son fonctionnement pourrait jouer un rôle important dans l’apparition de la fibrose. L’objectif de notre étude est de déterminer si l’absence d’IRE1 dans les hépatocytes peut protéger le foie contre la fibrose, en utilisant un modèle bien établi chez la souris, basé sur l'administration répétée d’une substance appelée CCl₄. En comprenant mieux le rôle d’IRE1 dans ce processus, nous espérons contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour lutter contre la fibrose hépatique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer si IRE1 constitue une cible thérapeutique potentielle dans la fibrose hépatique, une pathologie pour laquelle aucun traitement spécifique n’est actuellement disponible. Il permettra également de préciser la contribution de la réponse UPR à la physiopathologie de la fibrose, et ainsi de mieux caractériser le rôle d’IRE1α en vue de son ciblage thérapeutique.

Procédures

Les souris auront une administration par voie intrapéritonéale de CCl4 d'une durée de 10 secondes par souris, 2 fois par semaine pendant 4,5 semaines.

Impact sur les animaux

Les souris recevront une injection de CCl₄ ou de son véhicule (huile d’olive) deux fois par semaine pendant 4 semaines (douleur légère de courte durée au moment de l’injection). Ce traitement induira le développement d’une fibrose hépatique, qui reste asymptomatique chez la souris (comme chez l’homme) (sans douleur).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie.

Remplacement

Des approches non animales existent dans le domaine de l'étude des mécanismes de fibrose hépatique, notamment les cultures d’hépatocytes ou de cellules stellaires, les cocultures, les modèles tridimensionnels (organoïdes) ou encore certaines simulations in silico. Ces méthodes sont utiles pour étudier des mécanismes moléculaires spécifiques, mais elles ne permettent pas de reproduire la complexité physiopathologique de la fibrose hépatique, qui implique l'interaction coordonnée entre hépatocytes, cellules stellaires, cellules immunitaires, inflammation, remodelage tissulaire et modifications du microenvironnement hépatique. Elles ne permettent donc pas de répondre aux objectifs du projet. Nous avons déjà utilisé des approches in vitro pour caractériser le rôle d’IRE1 dans les hépatocytes, mais la suite du projet nécessite impérativement un modèle intégrant un foie complet, perfusé, soumis à une agression chronique, ce qu’aucune alternative non animale ne permet aujourd’hui. Des alternatives animales partielles (tranches de foie, foies perfusés, modèles ex vivo) ont également été envisagées, mais elles ne reproduisent pas la fibrose qui résulte d’une maladie chronique, avec une dynamique d’activation des cellules stellaires sur plusieurs semaines. Elles ne permettent pas non plus d’évaluer l’effet d’une délétion génétique hépatocytaire spécifique dans un environnement physiologique complet. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable pour étudier le rôle d’IRE1 dans la fibrose hépatique et aucune alternative, animale ou non animale, ne permet d’atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % du paramètre étudié (aire de fibrose hépatique). Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose. L'injection de CCl4 sera réalisée par une personne expérimentée qui maîtrise donc parfaitement le geste ce qui réduit le temps nécessaire pour le réaliser et donc le temps de contention de la souris.

Choix des espèces

Le modèle "souris" présente l’avantage de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables du développement de la fibrose hépatique. Dans ce projet, nous utiliserons les souris KO IRE1 dans les hépatocytes pour lesquelles la protéine IRE1 est spécifiquement invalidée dans les hépatocytes. La fibrose hépatique sont des processus qui surviennent chez l’adulte, nous utiliserons donc des animaux âgés de plus de 8 semaines dans notre étude.

Un prélèvement de sang dans la joue tous les quinze jours sur animal éveillé, plus une ponction dans le fémur qui laisse l'animal boiter : 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les organes cibles. Elles reçoivent aussi un ou deux gavages pour déclencher, au moment voulu, l'extinction du gène étudié. Le projet cherche à comprendre le rôle d'une protéine de régulation de l'ARN dans le maintien et la différenciation des cellules souches du sang, sans annoncer d'application autre que la connaissance de ces mécanismes. Le porteur retient la souris pour ses similarités génétiques avec l'être humain et la facilité avec laquelle son génome se manipule, et indique que la transgénèse chez les mammifères a commencé chez elle.

Objectifs

Le système sanguin, composé des plaquettes, globules rouges, et globules blancs, a une capacité remarquable de régénération, et ce processus s’appelle l’hématopoïèse. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH), grâce à leur capacité d’autorenouvellement et de différenciation, ont un rôle majeur dans le maintien de l’hématopoïèse au cours de la vie. Ce projet de recherche vise à étudier le rôle d’une protéine qui permet la régulation de l’expression des gènes dans le maintien, la survie, la prolifération et la différenciation des CSH.

Bénéfices attendus

Comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la régénération du système hématopoïétique est un enjeu majeur. La régénération du système hématopoïétique et la maintenance des CSH sont des processus physiologiques essentiels qui sont perturbés dans différentes pathologies mais aussi lors du vieillissement (anémie, leucémies, immunodéficience)

Procédures

Tous les animaux subissent les mêmes interventions : Gavage : 1 à 2 fois sur animal vigile et dure moins d’une minute. Prélèvement intrafémoral : réalisé sous anesthésie et dure moins de 5 minutes. Prélèvements sanguins en submandibulaire réalisés tous les 15jours sur animaux vigiles – durée moins d’1minute

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux, 2/ une gêne transitoire lors du gavage 3/ un boitement transitoire lors des prélèvements intrafémoraux. 4/ une gêne transitoire lors des prélèvements submandibulaires.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de prélever les organes cibles et ainsi réaliser les analyses phénotypiques, moléculaires et histologiques nécessaires à la conclusion de l'étude. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Des expériences in vitro ont permis de démontrer que la délétion de notre protéine d’intérêt avait un effet sur la prolifération et la différenciation des CSH. Cependant, la régulation du système hématopoïétique fait intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro de façon efficace. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. Les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules délétées pour notre gène d’intérêt et ainsi permettre de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Des études pilotes seront réalisées avec de petits groupes d’animaux pour définir les doses et durées de traitement efficaces. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour chaque expérience en utilisant un test de puissance et des tests statistiques seront utilisés post expérimentation pour évaluer la significativité de nos résultats.

Raffinement

Les lignées transgéniques utilisées comportent des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules modifiées et ainsi permettre de détecter l’apparition de changements dans le système hématopoïétique très précocement ce qui permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide. Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou postopératoire. Les animaux recevront des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. C’est la raison pour laquelle l’ensemble des techniques de la transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines lorsqu’elles ont atteint leur maturité sexuelle pour étudier l'impact sur l'hématopoïèse à l'âge adulte.

Pour tester des outils de thérapie génique contre la myopathie de Duchenne, 2 640 souris porteuses de mutations du gène de la dystrophine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Les mâles reçoivent une injection intracérébrale au lendemain de leur naissance, sous anesthésie générale, d'autres une micropompe et un transpondeur posés le même jour. Suivent des tests comportementaux que le porteur nomme, exploration spontanée, conditionnement sur trois jours, apprentissage en groupe de stratégies de recherche de boisson pendant vingt-huit jours en continu. Sur l'effectif, il écrit lui-même que le nombre d'animaux prévu est "largement surestimé", plusieurs cohortes devant être abandonnées si les tests ne détectent pas de déficit ou si les traitements sont inefficaces.

Objectifs

La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique récessive liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 naissances, causée par des mutations dans le gène qui produit des protéines nommées dystrophines. En plus d’une dégradation progressive des muscles squelettiques, des troubles cognitifs, comportementaux et neuropsychiatriques touchent une grande partie des patients DMD. Les avancées récentes dans notre compréhension des mécanismes dépendants des dystrophines et responsables de la myopathie de Duchenne (DMD) ont conduit au développement d’outils innovants en thérapie moléculaire et en thérapie génique. Cependant, leur capacité à corriger toutes les altérations cognitives associées à cette maladie reste actuellement partielle. Il convient de tester de nouvelles molécules et de nouvelles voies d’administration, afin d’évaluer la possibilité de compenser ces troubles du neurodéveloppement tout comme les troubles musculaires. Le projet a pour but de tester de nouveaux outils de thérapie génique et de les administrer le plus tôt possible, avant qu’une partie des altérations cérébrales se développent dans la période postnatale. Ceci déterminera quels déficits peuvent être compensés, et quels sont ceux qui sont irréversibles du fait d’anomalies déjà induites pendant la vie fœtale. Les déficits cérébraux étant de nature différente en fonction de la position de la mutation, plusieurs souris modèles porteuses de différentes mutations seront testées. Ce projet est donc crucial pour le développement de nouvelles offres thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le cerveau chez les enfants atteints de DMD.

Bénéfices attendus

Les troubles cognitifs et comportementaux des patients atteints de myopathie de Duchenne sont variables en fonction de la position des mutations dans le gène responsable de la maladie. Les thérapies géniques sont donc développées à la carte et nécessitent de nombreuses évaluations précliniques chez la souris. Cibler le cerveau est particulièrement difficile, et il est actuellement considéré que des cocktails de molécules thérapeutiques seront nécessaires et que l’âge d’administration est un facteur déterminant. Ce projet permettra de déterminer un traitement optimal pour améliorer les fonctions comportementales affectées par la maladie, et identifiera également l'âge optimal d'administration d'un traitement. Nos comparaisons de plusieurs souris modèles permettront de préciser l’impact de différentes mutations dans l’apparition des déficits cérébraux, et d’identifier les traitements permettant de les compenser. Les découvertes issues de ces études ont un intérêt critique pour l’orientation du traitement d’un nombre important de patients atteints de DMD. L’objectif principal est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques.

Procédures

Une anesthésie gazeuse de courte durée (

Impact sur les animaux

Certaines interventions chirurgicales peuvent occasionner une douleur légère postopératoire, et certains tests comportementaux un stress de courte durée qui se traduira par une réduction de l’activité exploratoire.

Devenir

À la suite des tests comportementaux, les souris tests seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem de leur cerveau.

Remplacement

Nos molécules thérapeutiques font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats, non toxiques, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation sur animaux vivants. Ensuite, les études précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles déficientes en dystrophine chez lesquelles les troubles comportementaux sont préalablement caractérisés, afin de servir de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Notre projet implique donc d’effectuer des tests fonctionnels (comportementaux) qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et pouvant se comporter librement.

Réduction

La sélection préalable des traitements in vitro, identifiant des molécules à fort potentiel thérapeutique et non toxiques, permet de limiter le nombre d’études sur animaux vivants. De plus, seules les molécules montrant des effets bénéfiques après injection dans le cerveau seront testées après injection intraveineuse. Le nombre d’animaux prévu dans ce projet est donc largement surestimé, car si certains tests comportementaux n’ont pas permis de détecter de déficit en période postnatale, ou si certains traitements sont inefficaces, plusieurs cohortes seront abandonnées et certains traitements ne seront pas testés en injections intraveineuses. Après sélection pour nos études de comportement, le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base des publications utilisant des méthodes similaires d’analyse du comportement, la réussite des expériences nécessite 12-15 souris par groupe. Les groupes comprennent des souris recevant un traitement et des groupes contrôles indispensables aux analyses statistiques. Nos études sont en grande partie longitudinales et les souris seront soumises à plusieurs tests, ce qui permet aussi de réduire le nombre total d’animaux. Nous utiliserons préférentiellement des tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, ils auront 5-7 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement à leur arrivée. Les tests comportementaux induisant de l’anxiété sont très courts (

Choix des espèces

D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les troubles émotionnels et sociaux ont uniquement été étudiés chez les souris modèles. Les recherches précliniques pour ces pathologies sont donc généralement menées sur des souris présentant cette maladie, chez lesquelles les déficits comportementaux identifiés servent de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Les traitements seront administrés soit le lendemain de la naissance, soit plus tard à l'âge de 3-4 semaines ou chez des jeunes adultes (6 semaines). Les tests fonctionnels (comportement) seront effectués pendant la période après sevrage (3-6 semaines) et/ou à l’âge adulte (2 à 5 mois), bien avant l'apparition des troubles musculaires (myopathie).

Inoculées dans le bas-ventre avec une souche de toxoplasme puis vaccinées par deux injections intramusculaires dans les pattes arrière, 60 souris femelles sont toutes tuées à l'issue, l'infection par un agent pathogène interdisant tout autre devenir. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré pour la totalité des animaux. Le projet teste une immunothérapie à ARN visant les cellules qui hébergent les kystes du parasite, transposée des vaccins contre le Covid-19 et des traitements anticancéreux. Le porteur écrit pourtant que la souche choisie ne provoque ni symptôme clinique ni souffrance notable et que les seules nuisances attendues tiennent aux deux piqûres, ce qui laisse la souffrance modérée déclarée pour les 60 souris sans description.

Objectifs

Validation in vivo d'une immunothérapie à ARN contre les parasites persistants à l'intérieur des cellules. Ce projet propose une approche innovante pour traiter le parasite appelé toxoplasme en ciblant non pas directement le parasite dormant, mais les cellules qui l’hébergent sous forme de kyste. En s’inspirant des stratégies d’immunothérapie développées contre les rechutes du cancer et la vaccination contre le Covid-19, notre objectif est de stimuler une réponse capable de détruire de façon ciblé les cellules infectées par les kystes, via une thérapie à ARN. Nous testons une immunothérapie à ARN dans un modèle murin infecté par le toxoplasme. En ciblant des protéines capables d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques, nous espérons éliminer les cellules infectées par les kystes. Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité, la sécurité et la réponse immunitaire de cette approche innovante.

Bénéfices attendus

L’approche que nous proposons, est une première étape de validation d’une nouvelle stratégie thérapeutique adapté à l’infection de la souris par le toxoplasme extrapolable à l'ensemble de ses hôtes mammifères . Cette méthodologie pourrait ensuite être étendue à d’autres infections parasitaire à formes dormantes.

Procédures

Les interventions qui peuvent causer des nuisances sont (1) l'inoculation dans le bas ventre de 100 µL d'une souche avirulente pour la souris (la durée de cette intervention est estimée à 15 secondes) et (2) l'inoculation de l’immunothérapie de 50 µL en intramusculaire dans chacune des 2 pattes postérieures soit 100 µL au total (la durée de cette intervention est estimée au maximum à 30 secondes par injections soit 2 x 30 s), qui peuvent entrainer une gêne sur un laps de temps très court. Ces interventions seront réalisées une seule fois pour chaque souris.

Impact sur les animaux

La souche de toxoplasme inoculée est sélectionnée pour sa non virulence pour la souris. Elles ne provoquent pas de symptômes cliniques ni de souffrance notable chez les animaux, ce qui garantit une charge parasitaire suffisante pour l’étude tout en préservant leur bien-être. Le protocole inclura un suivi rigoureux des animaux qui seront surveillés quotidiennement afin de détecter tout signe de détresse ou d'effet indésirable en lien avec le traitement. Les seules nuisances ou effets indésirables potentiellement attendus sont liés à l'injection vaccinale : 2 injections intramusculaires de 50 µL chacune, même si les traitements à ARNm (vaccins COVID-19 ou immunothérapies anticancéreuses) ont démontré une innocuité préclinique solide chez la souris.

Devenir

Les animaux ayant été infectés par un agent pathogène, les souris seront systématiquement mises à mort après avoir été au préalable endormis en fin de procédure.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible à ce stade du projet. L’objectif est de valider in vivo un traitement à base d’ARN visant à éliminer les formes dormantes de parasites intracellulaires. Les mécanismes immunitaires complexes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro. Le modèle murin infecté par le toxoplasme est actuellement le seul disponible pour reproduire une infection chronique à formes dormantes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été strictement limité. L’expérience sera conduite en duplicat sur trois groupes de 10 souris seulement, soit un total de 60 animaux, ce qui représente un compromis entre puissance statistique et minimisation du nombre de sujets. Ce design expérimental a été optimisé pour maximiser l’information obtenue par animal.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Du fait du faible nombre de souris inclues dans l’étude les souris inoculées seront hébergées dans des cages pouvant contenir plus de souris d’après les normes en vigueur. Les souris font l’objet d’un enrichissement dès leur mise en cage et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les souris recevront un traitement antalgique en cas de symptôme afin d'éliminer toute douleur potentielle liée à la procédure. L’infection sera induite par une souche adaptée à l’établissement d’une infection chronique sans signes cliniques pour la souris, ce qui permet d’éviter toute souffrance chez ces dernières. Les animaux seront anesthésiés et sous antalgique pour minimiser tous risque de stress et souffrance au cours de l'injection du traitement en intramusculaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter précocement tout signe de détresse ou de dégradation de l’état général et la fréquence d’observation est accentuée (deux à trois fois par jour au lieu d’une seule) en cas de symtômes. Des critères d’arrêt (score clinique) seront mis en place pour garantir leur prise en charge immédiate si nécessaire.

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont l’animal de choix pour l'entretien du parasite. Mis à part le chat domestique, la souris représente l'espèce animale de laboratoire la plus adaptée pour l'isolement et l'entretien de souches de toxoplasmes (le modèle rat par exemple ne permet pas le maintien des souches). Elle est utilisée par l'ensemble des équipes de recherche internationale qui travaille sur la culture in vivo du toxoplasme. Des souris femelles (âgées de 4 à 8 semaines) seront utilisées pour la mise en place d'une infection chronique par le toxoplasme et tester la réponse au traitement ARN. L’âge des animaux utilisés dans nos procédures correspond à une taille et un poids de l’animal minimum pour lequel l’injection des volumes d’inoculum et de traitement envisagés sont bien tolérés.

60 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à douze injections d'une protéine musculaire accompagnée d'un adjuvant, en quatre points du corps et à trois reprises espacées de quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer une nécrose ou un durcissement de la peau, et que les souris développent pendant douze semaines une faiblesse musculaire et une mobilité réduite. Un électromyogramme sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal closent l'étude, avant la mise à mort de tous les animaux pour collecte des organes. Le projet construit le modèle de myasthénie MuSK qui servira ensuite à sélectionner des médicaments, et le porteur présente comme un bénéfice pour les souris le fait d'améliorer les conditions de l'expérience qu'il leur impose.

Objectifs

La Myasthénie Gravis (MG) est une maladie auto-immune qui perturbe la communication entre les nerfs et les muscles, qui a pour conséquence une faiblesse musculaire et une fatigabilité impactant fortement la qualité de vie des patients pouvant aller jusqu’à l’isolement social. L’incidence de cette maladie est estimée entre 3 et 28 personnes sur 1 million avec plus de 700000 patients atteints dans le monde. Les traitements actuels sont essentiellement des immunosuppresseurs qui nécessitent des mois de traitements et qui sont souvent associés à des effets secondaires lourds. De plus, 10 à 15% des patients sont résistants à ces traitements. La MG est causée par la production d'auto-anticorps attaquant les molécules de la jonction neuromusculaire, perturbant la transmission des signaux entre nerfs et muscles. La plupart des patients produisent des auto-anticorps contre le récepteur de l’acétylcholine (AChR), mais certains présentent des auto-anticorps ciblant la kinase spécifique du muscle (MuSK), essentielle pour une bonne communication nerveuse et musculaire. Ce projet vise à développer un modèle de MG forme MuSK chez la souris, car aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité biologique de cette pathologie. Le projet consiste à administrer aux souris tout ou une partie de la protéine MuSK pour que leur système immunitaire produise des anticorps contre cette protéine, perturbant ainsi la communication nerf/muscle et reproduisant la pathologie observée chez les patients. Pour induire une réaction immunitaire, un adjuvant est ajouté, optimisant la production de ces auto-anticorps. Les études réalisées dans le cadre de ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes en fin d’étude pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces études seront réalisées sur des souris génétiquement modifiées ou non pour un gène/cible d’intérêt impliqué dans la maladie. Nous prévoyons une étude de mise au point du modèle en comparant le protocole bibliographique à un protocole apportant des améliorations éthiques (adjuvant) (36 souris). Dans un second temps nous souhaiterions adapter ce protocole sur une souris génétiquement modifiée (sans phénotype dommageable) d’intérêt pour un de nos projets et tester l’intérêt d’immuniser avec tout ou partie du domaine extracellulaire de la protéine MuSK (24 souris) soit 60 souris au total pour ce projet.

Bénéfices attendus

Dans le processus de développement d’un nouveau médicament, ce type d’étude se fait après des tests en laboratoire sur des cellules et des simulations informatiques. L'objectif est de mettre au point un modèle murin de MG forme MuSk en apportant des améliorations éthiques au protocole de référence. Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Affiner le modèle de la pathologie MG forme Musk sur les souris, en réduisant au maximum leur souffrance et en améliorant les conditions des expériences. 2. Proposer un modèle permettant de sélectionner les médicaments qui ont un effet positif sur les mécanismes de la MG forme Musk, avant de passer aux essais cliniques, et offrir ainsi une nouvelle option de traitement.

Procédures

- Immunisation par l’agent inducteur (protéine + adjuvant) de la pathologie/du modèle : l’immunisation se fait 4 fois par jour (4 injections à 4 sites différents), 1 jour toutes les 4 semaines, et cela jusqu’à 3 fois, moins de 30 secondes pour chacune des 4 injections - Administration d’un anti-douleur au préalable des immunisations par l’adjuvant le nécessitant (30 secondes par administration) - Prélèvement de sang (faible volume, moins de 30 secondes) avec une fréquence en accord avec les recommandations de la structure de Bien-Etre Animal : jusqu’à 3 prélèvements sur les 13 semaines que dure l’étude - Electromyogramme (étude de la fonction des nerfs et des muscles) sous anesthésie générale avec utilisation d’électrodes musculaires réalisé une seule fois par souris (en fin d’étude) - Prélèvement de sang terminal sous anesthésie générale et analgésie (une seule fois, 30 secondes) - Pour la 2ème phase du projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées élevées et commercialisées par un éleveur : préalablement à leur expédition dans notre établissement utilisateur, elles auront eu un prélèvement de tissus (biopsie de l’extrémité de la queue) pour confirmer leur modification génétique.

Impact sur les animaux

Selon les données de la littérature, les nuisances estimées sont les suivantes : 1. Administration de peptide avec adjuvant (4 sites d’administration, jusqu’à 3 jours d’immunisation espacés de 4 semaines) : moins de 30 secondes par injection, 3 fois. Risque de nécrose ou durcissement de la peau (douleur modérée) dans les jours suivant les administrations et dépendant du type d’adjuvant (risque accru avec l’adjuvant de l’article de référence pondéré par l’administration préventive 5 minutes avant d’un antalgique). 2. Prélèvements de sang : 30 secondes maximum 3 fois. Stress et douleur ponctuels (douleur légère). 3. Développement de myasthénie gravis sur maximum 12 semaines : Faiblesse musculaire et réduction de la mobilité (souffrance modérée), sans atteindre des signes cliniques sévères 4. Electromyogramme : 5 électrodes sous anesthésie gazeuse en fin d’étude : Stress léger (une fois, 10 minutes) 5. Prélèvement de sang terminal sous anesthésie et analgésie : Sans réveil, donc sans douleur post-procédure.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour la collecte des organes et tissus nécessaires pour les analyses in vitro des échantillons (immunohistochimie, etc) nécessaires à la caractérisation complète du modèle.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. Néanmoins, l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est pas possible de modéliser complètement in vitro, c’est pourquoi nous souhaitons établir ce modèle vivo.

Réduction

Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle, et un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour de futures études (sur une nouvelle DAP ultérieurement). La technique de micro-prélèvement décrite en 5.10.3 pour réaliser les prélèvements sanguins permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet.

Raffinement

Des prélèvements de sang répétés sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique de micro-prélèvements de la souris, réalisable plusieurs fois sur un même animal en respectant les bonnes pratiques, les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. L’adjuvant de référence (dont le but est d’activer le système immunitaire et le rendre plus sensible à l’agent qui va induire le modèle) sera associé à l’administration d’un antidouleur 5 minutes avant l’administration de l’adjuvant. Nous évaluerons cependant un second adjuvant, jamais utilisé dans ce modèle, mais connu pour être mieux toléré, dans l’optique de raffiner ce modèle. L’alternative d’immunisation en sous cutanée dans le mollet plutôt que dans la voute plantaire sera mise en place dès la première étude afin de diminuer le risque de douleur. Des points limites spécifiques à ce modèle ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

L’espèce murine est exclusivement utilisée dans la bibliographie pour reproduire ce type de pathologie de par sa transposition à l’homme et la possibilité d’utiliser des souris transgéniques permettant d’évaluer la cible humaine. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, tel que décrit dans la littérature de ce modèle (en comptant les premières étapes de pesées avant le début d’induction de la pathologie à 8 semaines).

Jusqu'à trois administrations par jour pendant deux mois, après une ouverture de l'abdomen pour greffer des cellules tumorales directement dans le pancréas : 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang, la tumeur et d'autres organes. Elles portent une tumeur abdominale dont l'évolution provoque une douleur que le porteur qualifie de modérée, avec un risque de métastases. Le projet sert à affiner la présélection de candidats médicaments déjà testés sur des souris greffées sous la peau dans un autre projet. Le porteur décrit ce modèle comme plus invasif que le modèle sous-cutané, et le retient parce que la tumeur se développe dans son organe d'origine.

Objectifs

Le cancer du pancréas est l'un des cancers les plus graves, avec seulement 10-13% de chances de survie à 5 ans. La détection tardive, souvent à un stade avancé avec des métastases, est la principale raison de ce faible taux de survie. Les traitements disponibles incluent la chirurgie, possible pour seulement 10-20% des patients. La plupart reçoivent chimiothérapie et/ou radiothérapie, avec de nombreux effets secondaires et une survie prolongée de quelques mois. En raison de son microenvironnement tumoral très dense, qui agit comme une barrière physique face aux traitements, le cancer du pancréas reste l’un des cancers les plus difficile à traiter. Dans ce contexte, ce projet vise à tester de nouveaux candidats médicaments sur un modèle de cancer du pancréas chez la souris. Les modèles couramment utilisés impliquent l'implantation de cellules de cancer du pancréas sous la peau de la souris. Cependant, ces modèles ne reproduisent pas entièrement le microenvironnement qui entoure les tumeurs présentes chez les patients. Les études liées à ce projet utiliseront le modèle orthotopique, qui consiste à implanter des cellules de cancer du pancréas par voie chirurgicale directement dans le pancréas de la souris (greffe orthotopique). Ce modèle est plus invasif que le modèle sous-cutané mentionné ci-dessus, mais il est plus pertinent car la tumeur se développe dans son organe d'origine et permet de recréer un environnement similaire à celui observé chez l'homme. Les études réalisées dans le cadre de ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques : prélèvements sanguins pour notamment détecter la présence de biomarqueurs et prélèvements d’organes terminaux pour, entre autres, valider l’expression des cibles thérapeutiques. Les composés seront testés seuls ou en combinaison, ajustant doses, voies d'administration, fréquence des administrations, pour espérer une régression partielle ou totale de la tumeur.  L'objectif est de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients atteints de cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Dans le processus de développement d’un nouveau médicament, ce type d’étude se fait après des présélections in vitro sur des cellules et des simulations informatiques. L’objectif est ensuite de pouvoir tester et sélectionner les meilleurs candidats médicaments dans un premier temps dans le modèle de souris greffées par les tumeurs sous la peau, modèle le plus couramment utilisé (autre projet). Puis dans un second temps, la mise en œuvre de ce projet va permettre d’affiner cette pré-sélection sur ce modèle orthotopique qui requiert de la chirurgie. Les bénéfices attendus sont : 1-Poursuivre la sélection d’un ou plusieurs candidats médicaments dans un modèle plus prédictif de la pathologie humaine 2-Prédire l’efficacité de ces candidats médicaments seuls ou en combinaison de composés chez l’homme dans le but d’améliorer la qualité de vie des patients et offrir une nouvelle option de traitement dans le cancer du pancréas

Procédures

- Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera 30 minutes maximum et sera réalisée une seule fois sur l’animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Prélèvements de sang à la veine de la patte : Faible volume, avec une fréquence tout au long de l’étude pour une durée maximale de 3 mois (environ 20 secondes/souris). - Administration d’un composé ou d’une association de composés au maximum 3 administrations par jour (environ 30 secondes par administration), durée de traitement de 2 mois maximum. - Prélèvement terminal de sang réalisé sous anesthésie générale profonde en fin d’étude (une seule fois, environ 30 secondes/souris).

Impact sur les animaux

- Douleur modérée liée à la chirurgie lors de la greffe orthotopique avec une petite ouverture de l’abdomen une seule fois sur l’animal et de douleur modérée. - Douleur modérée liée à la présence de tumeur abdominale et à son évolution (risque faible de métastases) - Douleurs légères liées à l’administration d’un ou d’une association de composés à tester au maximum 3 administrations par jour pendant 2 mois maximum à raison d’une ou plusieurs fois par semaine, avec une durée d’environ 30 secondes /souris/ administration. - Douleurs légères à modérés lié à la (les) molécule(s) administrée(s) pouvant entrainer une nuisance pour l’animal pouvant induire un effet clinique (ex : modifications de la prise de poids, de l’activité locomotrice) - Stress et douleur légers ponctuels lors des prélèvements sanguins d’environ 20 secondes /souris - Douleur légère liée à l’administration d’analgésiques et/ou de l’induction d’anesthésie pour le prélèvement terminal de sang (une seule fois, environ 30 secondes/souris)

Devenir

A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui seront utilisés pour des études complémentaires ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs.

Remplacement

Des méthodes alternatives comme des tests in silico ou in vitro seront préalablement mises en place en amont des études concernées dans ce projet pour évaluer la pertinence et l’efficacité des composés à tester. Ces méthodes sont essentielles pour présélectionner les composés les plus prometteurs qui seront ensuite testés sur des modèles animaux. Ce projet vise à tester de nouveaux candidats médicaments sur un modèle de greffe de cellules cancéreuses murines du pancréas directement dans le pancréas de la souris (greffe orthotopique). Cette méthode permet à la tumeur de se développer dans un environnement similaire à celui d'un cancer du pancréas chez l'homme. Actuellement, il est difficile de recréer en laboratoire (in vitro) les interactions complexes entre une tumeur et son environnement. Même si de nombreuses initiatives sont en cours d’évaluation afin de proposer des méthodes alternatives, les modèles in-vitro actuels ne rendent pas compte de la complexité de l’interaction entre la tumeur, l’hôte et les traitements. Ils ne se prêtent pas au modèle que nous utilisons qui se veut le plus proche possible de la clinique humaine.

Réduction

Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui seront utilisés pour des études exclusivement in vitro ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir les échantillons nécessaires à ces études complémentaires. La technique de micro-prélèvement pour réaliser les prélèvements sanguins permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet en limitant l’utilisation d’animaux dédiés pour le prélèvement sanguin. De par notre expérience sur le modèle orthotopique lors d’études efficacité, nous évaluons à 10 souris par groupe le nombre de souris suffisant pour évaluer l’effet des composés avec un groupe contrôle et 4 groupes où différents composés et doses seront testé montrant que nous avons la robustesse statistique voulue.

Raffinement

Des prélèvements de sang répétés chez la souris sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt. Ils sont effectués selon la technique de micro-prélèvements, réalisable plusieurs fois sur un même animal en respectant les bonnes pratiques, les volémies et les conditions physiologiques de la souris. La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : - Des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie - Une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie - Un maintien de la température corporelle de l’animal dès l’anesthésie - Une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie. L’analgésie post-opératoire pourra si besoin être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. De plus une grille de scoring post opératoire et un suivi clinique quotidien tout au long de l’étude seront mis en place. L’évolution de la pathologie est surveillée et des points limites prédéfinis permettent d’éviter d’impacter le bien-être animal afin d’euthanasier avant que la tumeur impacte le bien-être animal. - Toutes voies confondues, le nombre d’administration sera réduit au minimum en privilégiant la co-formulation lorsque cela est possible. - Le nombre de contentions sera réduit lui aussi au minimum (ex. privilégier la même contention pour une administration intra-péritonéale et une administration per os).

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique en raison de sa pertinence biologique, sa capacité à fournir des données fiables, et son rôle crucial dans le développement de nouveaux traitements. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie puisque ce modèle récapitule de nombreuses caractéristiques des tumeurs pancréatiques chez l’homme. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines soit environ 18g. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

Nourris pendant soixante semaines au plus avec un aliment riche en graisses et en sucres, 1 000 souris et 1 000 rats subissent jusqu'à 240 prélèvements sanguins pour mesurer leur glycémie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent obésité, diabète, dyslipidémie, insulinorésistance et stéatose hépatique pouvant aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie, et sont tous tués à l'issue sans pouvoir être réutilisés. Le protocole vise à vérifier qu'un aliment gras et sucré stérilisé par irradiation induit toujours le même état pathologique et que le modèle reste valide. Sur le dimensionnement de l'effectif, le porteur indique s'appuyer sur son savoir-faire et ses données historiques, et écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

A l’échelle mondiale, les maladies liées au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimés à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la stéatose hépatique non- alcoolique sont provoquées par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la stéatose hépatique non- alcoolique. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète. Ce protocole a pour objectif de tester un aliment riche en lipides et/ou en glucides stérilisé par irradiation à différentes doses. L’étude permettra d’évaluer si le taux d’irradiation a un impact sur le modèle, en suivant notamment la prise de poids, le maintien du phénotype attendu et l’état général des animaux. Les observations recueillies permettront ainsi de vérifier si le modèle reste valide.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et/ou en sucre et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, pendant 60 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pour mesure de glycémie pourront être faits avec ou sans mise à jeun (mise à jeun de 4 à 6 heures maximum) sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements maximum sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements maximum sur toute la durée du protocole). Une goutte de sang sera prélevée pour mesure de la glycémie sur une bandelette de glucose. La durée de prélèvement sera d’1 minute maximum.

Impact sur les animaux

Au fil de la prise alimentaire riche en gras et/ou sucre et d’un abreuvement standard ou riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire). Le prélèvement sanguin peut induire un léger stress transitoire et une légère douleur.

Devenir

En fin de protocole, les animaux ne pourront pas être réutilisés dans un autre projet et seront donc mis à mort selon les procédures en vigueur.

Remplacement

L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.

Réduction

Nous réalisons ce protocole alimentaire pour proposer un modèle animal pertinent avec un nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre l'objectif scientifique. Notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. En cas d'anomalie clinique observée sur un animal, une grille de scoring général sera utilisée afin de déterminer l'atteinte de points limites et de décider du devenir de l'animal. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). À cet âge, le métabolisme est encore en développement, ce qui permet une meilleure induction de l’obésité par le régime enrichi en graisses et/ou en sucre. De plus, une mise en place précoce du régime permet une meilleure standardisation entre les individus et augmente la robustesse du modèle DIO.