Procédures modérées

Injectés sous la peau dans leurs premiers jours de vie pour déclencher une modification génétique, 476 souriceaux sont ensuite tués entre deux et vingt et un jours après la naissance pour que leurs tissus soient découpés et analysés. Les procédures sont classées en niveau de souffrance modéré. Le projet cherche le rôle d'une molécule dans la formation du réseau lymphatique de l'utérus, un travail que le porteur qualifie d'exclusivement fondamental, avec une suite déjà annoncée sur le cancer de l'endomètre. Pour tirer plus de données de chaque animal, les cornes utérines sont coupées en deux et les expérimentateurs prélèvent en plus le diaphragme et l'oreille des mâles.

Objectifs

Le système lymphatique est constitué d'un réseau ouvert, unidirectionnel et à faible pression de vaisseaux lymphatiques. Il maintient le volume et la composition du liquide situé entre les cellules de l’organisme, participe à l'absorption intestinale des graisses et des vitamines alimentaires et contribue au bon fonctionnement du système immunitaire. Ces vaisseaux sont tapissés par des cellules qui délimitent l’intérieur du vaisseau et le tissu. La formation du réseau lymphatique à partir de la vascularisation préexistante est un processus hautement contrôlé appelé lymphangiogenèse. Ce mécanisme fait intervenir de nombreuses molécules, dont des molécules connues pour contrôler le développement du système nerveux. Ce projet vise à comprendre le rôle d'une de ces molécules et de son récepteur au cours de la mise en place de ce réseau lymphatique dans l’utérus. Ce projet sera réalisé à l’aide de plusieurs modèles génétiques murins permettant de moduler l’expression de gènes d’intérêt dans un tissu spécifique et à un moment donné. Ce contrôle spatio-temporel permet d’éviter les événements délétères sur les animaux. Ce projet pourrait donc permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et l’organisation des vaisseaux lymphatiques au cours du développement mais également d’ouvrir de nouvelles perspectives d’études dans des conditions pathologiques comme le cancer. En effet, le système lymphatique est impliqué dans la progression métastatique où il est une voie de dissémination pour les cellules cancéreuses, notamment dans les cas de cancer de l’endomètre.

Bénéfices attendus

Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle d’une molécule de guidage axonal et son récepteur dans la mise en place du réseau lymphatique de l’utérus. Si ce projet aboutit à l’identification d’une fonction pour ce couple ligand/récepteur. Nous déposerons une nouvelle demande de projet pour tester ce rôle dans un contexte tumoral (cancer de l’endomètre). En effet, le système lymphatique est connu pour être une voie de dissémination métastatique dans les cancers de l’endomètre.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons uniquement des interventions sur des nouveau-nés. Nous réaliserons une injection sous-cutanée (15 secondes). Enfin, nous prélèverons les tissus post-mortem pour des analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les nouveau-nés recevront une injection sous-cutanée d’un analogue d’une hormone sexuelle afin de déclencher l’évènement génétique permettant d’étudier la fonction de nos gènes d’intérêt. Nous n’attendons pas d’effet délétère fort, mais plutôt un retard de croissance du système lymphatique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure, car nous réaliserons des analyses sur tous les animaux(histologiques, transcriptomiques).

Remplacement

La compréhension du développement du système vasculaire lymphatique ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du réseau vasculaire lymphatique est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions tissulaires. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur des caractères histologiques qui seront quantifiés. Nous avons pu ainsi déterminer à l’aide d’outils statistiques le nombre d’individus nécessaires permettant d’obtenir des résultats robustes. Par ailleurs, les cornes utérines seront scindées en deux ce qui permet de diviser par 2 le nombre d’individus. Dans un souci de réduction, nous collecterons également chez les individus mâles le diaphragme et l’oreilles qui sont des modèles d’étude de la mise en place du réseau lymphatique. De la sorte, nous pourrons généraliser nos observations dans l’utérus à l’intégralité de l’organisme.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections sous-cutanées seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Le contrôle spatial et temporel de l’évènement génétique permet de restreindre les défauts au système vasculaire lymphatique par rapport aux animaux constitutivement invalidés pour les gènes étudiés.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Dans ce projet, le système lymphatique sera analysé grâce à des souris génétiquement modifiées dont l’expression des molécules candidates est perturbée. Les analyses seront réalisées à différents âges qui ont été choisis suite à une étude préliminaire qui a montré que le système lymphatique de la corne utérine se développe entre 2 jours post-natals et 21 jours post-natal (le réseau a atteint sa maturité).

Gavées, mises à jeun jusqu'à douze heures et soumises à dix prélèvements sanguins sur animal vigile, 1 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes. L'objet déclaré est de comprendre comment les cellules immunitaires du foie participent à l'athérosclérose, avec l'espoir lointain de nouvelles cibles thérapeutiques. Sur la façon dont ces 1 600 animaux ont été comptés, le résumé tient en une ligne, les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la principale cause de décès dans les pays développés. Parmi elles, l’athérosclérose, une maladie caractérisée par le dépôt de graisses dans les artères, est particulièrement redoutée pour ses conséquences, comme la crise cardiaque. L'inflammation joue un rôle central dans l'évolution de l'athérosclérose, ce qui fait de sa compréhension et de sa modulation une priorité de santé publique. Les cellules immunitaires du foie jouent un rôle dans la régulation de l’inflammation au sein de cet organe, et pourraient également contribuer, à plus large échelle, à l’inflammation chronique des artères et des organes immunitaires, associée aux maladies cardiovasculaires. L’objectif de ce projet est d’étudier la contribution des cellules immunitaires du foie dans le développement de l’inflammation et des maladies cardiovasculaires. Nous allons utiliser un modèle d’athérosclérose chez la souris pour explorer les mécanismes immunitaires et inflammatoires impliqués dans le développement de ces maladies. Les objectifs de ce projet sont de 1) caractériser les cellules immunitaires du foie ainsi que leur devenir dans les maladies cardiovasculaires et 2) étudier leur contribution dans l’athérosclérose et l’inflammation.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes liant le foie à l’athérosclérose, et pourraient conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires du foie, chez les patients souffrant d’athérosclérose.

Procédures

Les animaux auront jusqu'à 4 injections sur toute la durée de la procédure (durée inférieure à 30 secondes par injection). Les animaux vigiles auront un gavage (durée inférieure à 30 secondes) au cours de la procédure. Des prélèvements auront lieu sur animaux anesthésiés (une seule fois avec une durée inférieure à 30 secondes) ou vigiles (jusqu'à 10 prélèvements de moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : - la préhension et contention des animaux génèrent un inconfort léger et de courte durée - la mise à jeun avant les tests de tolérance à l'insuline (5h) et au glucose (12h) génère un inconfort - l'individualisation des animaux génère un stress léger durant la durée des tests - le gavage génère un stress et un inconfort légers de courte durée - les prélèvements de sang génèrent une douleur légère de courte durée - l'injection génère une légère douleur de courte durée au point d’injection - le prélèvement sanguin génère un stress et une douleur modérée de courte durée - l'anesthésie gazeuse génère un stress et une hypothermie légère de courte durée

Devenir

A l'issue des différents gestes techniques, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure dans le but de prélever les différents organes ou tissus d'intérêt.

Remplacement

Actuellement il n'existe pas de modèle plus pertinent que la souris pour l’étude de l’athérosclérose et de l’obésité. L’expérimentation animale est également le seul moyen permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans ce contexte.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel technique qualifié de l’animalerie et hebdomadaire par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. La mise en place de points limites adaptés permettront d'identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie locale adaptées.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude de l’athérosclérose et l'obésité avec notamment le développement de plaques d’athérosclérose et du syndrome métabolique dans un laps de temps raisonnable. De plus, c’est le seul modèle animal dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Grâce à ces modèles, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet. Les souris seront utilisées au stade adulte, à partir de 8 semaines. Le développement de l’athérosclérose est corrélé à l’âge, c’est pour cela qu’on utilisera des souris adultes.

Jusqu'à huit chocs à la tête et vingt séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures étalées sur quatre-vingt-dix jours : 1 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles reçoivent aussi un radiotraceur et passent trois tests comportementaux répétés à cinq dates, coordination motrice, mémoire spatiale et anxiété, pour suivre l'état de la barrière hémato-encéphalique après une commotion cérébrale. Le porteur décrit des signes passagers de désorientation et de baisse d'activité après le traumatisme, et compte sur ces travaux pour mieux diagnostiquer les séquelles chez les sportifs et les militaires. Il retient la souris parce que son cerveau ressemblerait au nôtre sur ces points, et choisit des animaux de quatre à huit semaines, jeunes adultes encore capables de récupérer d'un stress.

Objectifs

Le traumatisme crânien léger, aussi appelé commotion cérébrale, est une blessure du cerveau souvent considérée comme bénigne, mais qui peut avoir des effets à long terme, notamment sur la mémoire, l’humeur ou le comportement. Certaines études montrent qu’il pourrait être lié à des maladies neurodégénératives comme Alzheimer. Ce projet vise à mieux comprendre les effets du traumatisme crânien léger sur une structure protectrice du cerveau appelée la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cette barrière empêche les substances indésirables de pénétrer dans le cerveau. Après un choc, elle pourrait devenir plus perméable, favorisant des réactions inflammatoires durables. Grâce à des techniques d’imagerie avancées (notamment la tomographie par émission de positons, TEP) et à un modèle expérimental chez la souris, nous allons observer comment la BHE est modifiée après un choc à la tête, et pendant plusieurs semaines. Ces recherches permettront de mieux évaluer les risques, améliorer le diagnostic et, à terme, aider à mieux prendre en charge les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet a avant tout pour but d’améliorer la compréhension des effets à court et long terme d’une commotion cérébrale (ou traumatisme crânien léger) sur le cerveau et sur sa barrière naturelle, la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui pourrait être fragilisée après un choc. Les résultats pourront servir à identifier de nouveaux outils pour diagnostiquer plus tôt les complications liées aux traumatismes crâniens, mieux évaluer les risques à long terme, et adapter la prise en charge des personnes exposées de manière répétée, comme les sportifs ou les militaires. Ce projet pourrait donc contribuer à mieux prévenir les séquelles neurologiques liées aux commotions cérébrales.

Procédures

Les interventions prévues sont listées ci-dessous : • Réalisation sous anesthésie gazeuse d’un traumatisme crânien léger (ou commotion cérébrale) (durée 1 seconde répétable 8 fois au maximum, 1078 animaux) • Réalisation au maximum de 20 sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, espacé sur 90 jours, 1232 animaux) • Injection d’un radiotraceur, sous anesthésie générale (durée 1 min ; 1232 animaux) • Des tests comportementaux seront réalisés chez 1232 souris. Chaque animal réalisera trois types de tests évaluant la coordination motrice (10 min), la mémoire spatiale (15 min) et l’anxiété (10 min). Ces tests seront conduits à J3, J15, J30, J60 et J90 selon un calendrier alterné pour limiter la fatigue. La durée cumulée n’excédera 30 minutes par session et par animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans la cage de l’animal. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important. • Après le traumatisme crânien les souris peuvent montrer des signes passagers de désorientation, de baisse d'activité ou de modifications légères de leur comportement..

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique.

Remplacement

Ce projet utilise un modèle animal (la souris) car il n'existe pas, à ce jour, de méthode alternative permettant d'étudier de manière fiable et complète les effets d’un traumatisme crânien léger (comme une commotion) sur le cerveau vivant. En particulier, il s’agit ici d’observer la barrière hémato-encéphalique (BHE), une structure essentielle qui protège le cerveau, et de suivre dans le temps ses éventuelles altérations à l’aide d’imagerie cérébrale et de tests comportementaux. Aucun modèle informatique ou sur cellules ne permet aujourd’hui de reproduire toutes les réactions complexes du cerveau après un choc : inflammation, circulation sanguine, comportements, etc. Les souris sont donc utilisées pour observer ces effets dans un organisme entier, en conditions réelles. Cependant, afin de réduire le recours aux animaux, les étapes de préparation du projet (comme les tests sur les doses ou les images de référence) sont réalisées autant que possible à partir de données déjà existantes ou sur cellules.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétiques au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 2 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utilisons des souris car elles sont l’un des modèles les plus couramment employés en recherche biomédicale. Elles présentent des similitudes importantes avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne la barrière hémato-encéphalique (BHE), les processus inflammatoires et les réactions au traumatisme crânien. Leur petite taille, leur génétique bien connue et la possibilité de suivre leur comportement en détail en font un modèle adapté pour ce type d’étude. Les souris utilisées ont entre 4 et 8 semaines au début des expériences. Cet âge correspond à un stade jeune adulte, c’est-à-dire à un moment où le cerveau est complètement formé, mais où l’animal est encore en bonne santé et capable de récupérer d’un stress. Ce choix permet de mieux modéliser les effets du traumatisme crânien léger (TCL) chez l’humain adulte, tout en garantissant que les résultats soient pertinents et reproductibles.

Pour savoir si des œstrogènes ou des molécules apparentées protègent encore les artères après la ménopause, 1 320 souris subissent l'ablation des deux ovaires, la souris n'ayant pas de ménopause naturelle. Toutes vont être tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit ensuite une injection unique du composé à tester, l'autre moitié une capsule à libération prolongée posée sous la peau, avant prélèvement des tissus. Le porteur ramène les effets indésirables à une douleur, une perte de poids et un stress, et renvoie à une grille d'évaluation de la douleur appliquée après chaque chirurgie, sans dire quel seuil déclenche la mise à mort.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité chez les femmes, mais leur lien avec la ménopause reste encore mal compris. Après cette période, la chute des œstrogènes augmente le risque de développer des problèmes cardiaques. Ce projet vise à déterminer si certains traitements à base d’œstrogènes ou de molécules similaires peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, un modèle de souris dont les ovaires sont retirés est utilisé afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes, puisque la souris ne présente pas de ménopause naturelle. L’effet des traitements sera évalué en étudiant comment les gènes des vaisseaux réagissent. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé en culture cellulaire, car les cellules perdent rapidement leur capacité à détecter et répondre aux œstrogènes une fois isolées et cultivées en laboratoire. L’expérimentation animale est donc indispensable pour reproduire les conditions hormonales et physiologiques d’un organisme vivant. L’objectif est d’identifier les types d’œstrogènes ou les molécules capables de bien activer leur récepteur, afin de préserver la santé des vaisseaux sanguins après la ménopause. Ces résultats pourraient contribuer au développement de traitements mieux adaptés pour prévenir les maladies cardiovasculaires chez les femmes.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier les traitements hormonaux les plus efficaces pour protéger les artères après la ménopause, une période où le risque cardiovasculaire augmente fortement chez les femmes. En comparant différents types d’œstrogènes et de molécules ciblant leur récepteur, il deviendra possible de mieux comprendre quels composés sont réellement bénéfiques pour le système cardiovasculaire. À terme, ces connaissances pourraient aider à améliorer les traitements existants ou en développer de nouveaux, plus sûrs et plus adaptés aux besoins des femmes ménopausées. Cela contribuerait à réduire la mortalité cardiovasculaire chez les femmes, en tenant mieux compte de leurs spécificités biologiques souvent négligées dans la recherche médicale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 1320 animaux 2-Injection aigu de composé (1min) 660 animaux 3-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 660 animaux

Impact sur les animaux

Les chirurgies sur la souris telles que l’ovariectomie, l'injection en aigu de composé ou la pose de pellet peuvent engendrer une douleur, une perte de poids et un stress.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.

Remplacement

Le processus vasculaire implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire les variations hormonales, d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentes dans le vaisseau perdent leur capacité à réagir aux œstrogènes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 10 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle de mise à mort, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du récepteur aux oestrogènes ou de ces sous fonctions. Ces souris sont issues d’une lignée génétique bien connue, souvent utilisée pour mieux comprendre les maladies du cœur et des vaisseaux. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, après la puberté, à partir de 7 semaines d’âge dans le cadre de l'étude de la ménopause.

Issues du cheptel de l'établissement, 40 brebis sont saillies pour en retenir 25 gestantes, dont les agneaux entreront eux aussi dans le protocole. 160 moutons au total vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, 141 tués et 19 renvoyés à l'élevage. Les brebis gestantes reçoivent huit injections intramusculaires sur dix-huit semaines pour reproduire un syndrome des ovaires polykystiques, leurs descendants subissent quatorze prises de sang de la naissance à vingt-quatre semaines, et les femelles pubères jusqu'à 36 prélèvements par cathéter jugulaire, immobilisées douze heures en cage individuelle sans pouvoir se retourner. Le porteur écrit en majuscules que le nombre de brebis a été doublé "suite à un problème sanitaire, résolu depuis", sans dire combien d'animaux la première version prévoyait.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la cause la plus fréquente d'infertilité féminine (8 à 13 % des femmes en âge de procréer dans le monde). Les critères du diagnostic du SOPK sont basés sur au moins deux des trois caractéristiques suivantes : 1/ irrégularité ou absence des règles, 2/ un taux élevé d’hormones masculines dans le sang, et 3/ ovaires renfermant de nombreux kystes folliculaires de 2 à 6 mm. La plupart des patientes atteintes de SOPK présentent également des taux d'hormone AMH (anti-müllérienne) et LH (hormone lutéinisante) élevés. De plus, ce trouble est généralement associé à une résistance à l'insuline, de l’obésité, des taux de cholestérol élevés et une hypertension artérielle. Il est important de noter que la plupart des caractéristiques du SOPK sont transmises aux filles des femmes atteintes de ce syndrome, puisque 60 à 70 % de leurs filles développent ce syndrome. Malgré le nombre de femmes touchées par ce trouble, les causes du SOPK restent incomprises. Parmi les facteurs impliqués dans le SOPK, les androgènes, et l'AMH ont été reconnus comme jouant un rôle central. L'hypothèse actuelle est que l’excès d'androgènes ou d'hormones sexuelles masculines durant la grossesse pourrait entraîner des modifications au niveau de l’activité ovarienne et la sécrétion de certaines, ce qui entraînerait le développement du SOPK à l'âge adulte. Notre projet qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) a pour objectif de tester si un anticorps dirigé contre l’AMH peut supprimer les défauts d'ovulation observés dans un modèle de brebis ayant reçu un excès d'androgènes mimant le SOPK chez la femme. En effet, la brebis est une espèce proche de la femme en terme de développement ovarien. Nous étudierons également chez la mère et chez ses descendants mâles les conséquences d’un taux élevé d’hormones masculines au niveau des tissus périphériques et reproducteurs.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de constituer un corpus de données visant à évaluer si un anticorps anti-AMH est un bon candidat pour des essais ultérieurs chez l'humain, en l'occurence chez la femme développant un syndrome des ovaires polykystiques. Elle permettra aussi de mieux comprendre les effets moléculaires de la testostérone chez la femme et les conséquences chez la descendance mâle.

Procédures

Pour les 40 brebis adultes : 1 prise de sang (PS) intra-veineuse (IV) (jugulaire) sera réalisé à 18 jours après la saillie. Pour les 25 brebis gestantes sélectionnées : 8 Injections intra musculaire (IM) sur 18 semaines. 4 PS IV (jugulaire) pendant la gestation. Pour tous les descendants mâles (n=20) : 14 Prises de sang par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Pour tous les descendants femelles (n=20) : 14 PS par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Autour de la puberté, 6 PS par IV (jugulaire) sur 3 semaines. 1 anesthésie générale pour 1 passage à l’IRM à la puberté. Pose de cathéter à la puberté sous anesthésie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Pour les femelles pubères issues des mères androgénisées (n=16) : 18 Prises de sang sur 9 semaines. 4 injections intra veineuse (jugulaire). 1 anesthesie genérale pour un passage à l’IRM après l’injection de l’anticorps. 1 pose de cathéter après le passage à l’IRM sous anesthesie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Dans l'EU1 seront effectuées toutes les expérimentations sauf l'anesthésie générale et le passage à l'IRM qui seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les differentes injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose des cathéters jugulaires peut entraîner des douleurs au point d'injection. Pour les animaux traités, il existe un risque d’apparition de kystes et d’anomalies de la vessie (observés par IRM). Il peut arriver mais trés rarement des signes extérieurs associés à une douleur comme une dérivation urinaire entre les cuisses qui peut entrainer des brûlures. Les nuisances en lien avec l’anesthésie de l’IRM sont une irritation des voies respiratoires lors de l’intubation et l’extubation, un possible hématome lors l’intraveineuse et un potentiel stress lors des manipulations.

Devenir

Sur les 40 brebis saillies, 25 seront utilisées, les 15 brebis non selectionnées retourneront à l'élevage. Les 25 brebis sont nécessaires afin d'obtenir suffisamment de descendants femelles pour tester l'effet de l'injection d'anticorps . Une fois l'agnelage effectué, les 20 brebis androgénisées et les 5 témoins seront euthanisées afin de récupérer les tissus périphériques et reproducteurs pour une analyse moléculaire. Sur les 40 descendants, 4 descendants femelles issues des mères témoin pourront retourner sur l'élevage. Ainsi, seront euthanasiés 12 descendants mâles issus des mères androgénisées et 4 descendants mâles issus des mères témoin mais aussi 16 descendants femelles injectés soit avec l'anticorps (n=8) ou avec une solution témoin (n=8) afin de pouvoir mener une étude moléculaire sur les tissus périphériques et reproducteurs.

Remplacement

Nous ne pouvons tester les anticorps que sur un organisme entier. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. D'autre part, il a été démontré dans la littérature que la brebis androgénisée est un bon modèle syndrome d'ovaires polykystiques chez la femme.

Réduction

Nous allons utiliser 25 brebis gestantes, 20 (16+4) agneaux mâles et 20 (16+4) agneaux femelles jusqu’à la puberté. Ce nombre a été estimé en utilisant un test de comparaison de deux moyennes (nombre de follicules antraux) dans chaque groupe. Avec des lots de 8 descendants femelles issues de mères androgénisées cela donne une puissance tout à fait satisfaisante. Afin d’avoir 16 brebis issues de mères androgènisées, il faut partir d’au moins 20 brebis au départ. Afin de vérifier que le traitement de testostérone fonctionne, nous suivrons également 5 brebis qui seront non traitées, et leurs descendants.

Raffinement

NOUS MAINTIENDRONS LES AGNEAUX SOUS LEUR MÈRE, CONTRAIREMENT À CE QUI ÉTAIT PRÉVU INITIALEMENT. CETTE STRATÉGIE PRÉSENTE UN DOUBLE AVANTAGE : D’UNE PART, LA PROTECTION VACCINALE DES MÈRES SERA TRANSMISE AUX AGNEAUX VIA LE COLOSTRUM, RENFORÇANT AINSI LEUR IMMUNITÉ PASSIVE ; D’AUTRE PART, LA PRÉSENCE MATERNELLE FAVORISERA UNE TRANSITION ALIMENTAIRE PLUS PRÉCOCE VERS LE FOURRAGE, APPORTANT UNE PROTECTION DIGESTIVE SUPPLÉMENTAIRE. Les animaux seront gardés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. LA PÉRIODE D’ACCOUPLEMENT SERA AVANCÉE DE 15 JOURS PAR RAPPORT AU RESTE DU CHEPTEL POUR PERMETTRE UNE SURVEILLANCE RENFORCÉE DES NOUVEAUX NÉS PAR LE PERSONNEL ZOOTECHNIQUE. Pour limiter les stress liés à la manipulation, ils seront visités tous les jours avec contact direct ou non, permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Nous récompenserons les animaux après chaque session de prises de sang en distribuant du concentré à l’auge excepté lorsqu’un suivi métabolique sera prévu sur ces prélèvements. Lors de la pose des cathéters, le comportement et l'apparence des brebis (notamment au niveau de l’implantation du cathéter) seront suivis avec attention. Les animaux seront maintenus en cage individuelle (107 cm de long sur 67 cm de large) le temps des prélèvements (12 heures), ils ne pourront pas se retourner mais auront tout de même un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Avant toute injection intramusculaire ou intraveineuse, une application de gel antalgique (type Vétobiol) sera réalisée. Les deux veines jugulaires seront utilisées en alternance pour limiter le risque d’hématome. Les animaux seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie pour le passage à l’IRM, afin de limiter tout risque de régurgitation. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Le transport des animaux avant l'opération et leur retour sera réalisé par un technicien formé et expérimenté dans une bétaillère agréée pour le transport d'animaux vivants. Le trajet est de moins de 5 minutes et la bétaillère sera abondamment remplie de paille.

Choix des espèces

SUITE À UN PROBLÈME SANITAIRE, RÉSOLU DEPUIS, LE NOMBRE DE BREBIS A ÉTÉ DOUBLÉ. Afin de pouvoir mimer le SOPK chez la femme nous souhaitons utiliser des brebis gestantes pour plusieurs raisons : 1. contrairement aux rongeurs, la brebis présente l'avantage d'avoir un développement ovarien similaire à la femme. 2. De plus, ce modèle a déjà été validé dans nos unités. - 40 brebis saillies seront utilisées pour la détection de 25 brebis gestantes qui rentreront dans la procédure. Cet effectif doit permettre d'assurer la production de descendants assez conséquente pour poursuivre nos travaux. - 20 descendants mâles seront étudiés de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 20 descendants femelles seront étudiées de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 16 femelles pubertes sur les 20 entreront dans la 2ème phase de l’expérimentation (de J168 jusqu’à J235).

96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer de la prostate vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. À six mois au moins, avec un carcinome installé, elles subissent une ouverture de l'abdomen de dix minutes et l'exposition de leur prostate antérieure à une torche à plasma froid, ou à un jet d'hélium pour les témoins, puis sont gardées sept jours avant d'être tuées. L'enjeu déclaré est le traitement des marges chirurgicales lors des prostatectomies robotisées chez l'humain, un domaine que le porteur présente comme une aire de développement technologique de premier plan. Il écrit que les organoïdes et tumoroïdes permettent "de ne pas recourir à l'expérimentation animale", et conclut dans la même rubrique que la souris reste "indispensable".

Objectifs

Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).

Procédures

Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.

Remplacement

La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.

Réduction

Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.

Raffinement

Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.

Choix des espèces

Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).

Injection dans l'utérus de femelles gestantes après ouverture de l'abdomen, injection déclenchant une naissance prématurée, transfert des nouveau-nés prématurés à une mère adoptive, anesthésie de souriceaux sur la glace, chirurgie stéréotaxique de deux heures sur adultes : 4 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur prévoit des saignements vaginaux, des mises bas prématurées difficiles et le rejet possible des petits par la mère adoptive. Le projet cherche comment une inflammation pendant la gestation ou une naissance prématurée perturbent la construction du cerveau, croisées avec des risques génétiques de troubles neuropsychiatriques. Il annonce des procédures "établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress", après avoir décrit un protocole qui provoque délibérément des naissances prématurées et sépare des nouveau-nés de leur mère.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de mieux comprendre la mise en place d’un organe complexe tel que le cerveau des mammifères. En effet, il a été montré que des défauts de son développement, contribuent à l’étiologie de plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques (troubles du spectres autistique, schizophrénie ou troubles bipolaires). Il apparaît donc essentiel mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement du cerveau. En particulier nous voulons comprendre comment des changements environnementaux au cours du développement (inflammation pendant la gestation et chez le juvénil, naissance prématurée ou absence de cellules immunitaires embryonnaire) perturbent l’élaboration du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques associés aux troubles neuropsychiatriques. Notre projet vise à déterminer le lien entre environnement et prédisposition génétique sur la mise en place du cerveau chez la souris. En combinant la génétique de la souris avec un ensemble d’outil d’analyses biologiques disponible nous souhaitons comprendre comment la naissance prématurée ou les fonctions immunitaires au cours de la gestation provoquent des perturbations pouvant causer de défauts de développement du cerveau associés à des pathologies.

Bénéfices attendus

Les maladies neuropsychiatriques trouvent souvent leur origine dans des perturbations du développement du cerveau, notamment au cours de périodes critiques allant de la vie prénatale à l'adolescence. Cette complexité provient d'une combinaison de facteurs génétiques et d'influences environnementales incluant des perturbations immunitaires (inflammations) lors des étapes cruciales du développement ou une naissance prématurée. Des études ont montré qu’une grande prématurité et des perturbations immunitaires modifient non seulement directement le développement, mais ont également un impact sur les cellules immunitaires du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques qui ont été identifiés dans divers troubles neuropsychiatriques chez l’homme. Ainsi, comprendre comment des perturbations gène/environnement impact sur les processus développementaux entourant la naissance et sur la formation du cerveau représente un intérêt majeur de santé publique.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques : 1) Chirurgie sur femelle gestante analgésiées et anesthésiées pour procéder à une injection in utero de molécules dans des embyrons (20 minutes). 2) Injection unique sur femelle gestante ou animal juvenil vigiles d’une solution induisant une inflammation (quelques secondes). 3) Injection unique sur femelle gestante vigile d’une solution permettant d’induire une naissance prématurée par voie basse (quelques secondes). 4) Adoption de nouveaux nés prématurés par une mère adoptive issué d’un autre croisement. 5) Injection répétée quotidiennement d’une substance permettant de moduler les niveaux de sérotonine dans des nouveaux nés (quelques secondes). 6) Anesthésie sur glace et injections de marqueurs neuronaux sur souriceaux (environ 10 min). 7) Chirurgie sur animaux adultes analégésiés et anesthésiés pour injections stéréotaxiques de traceurs axonaux (max 2h).

Impact sur les animaux

Les contentions nécessaires à la réalisation d'une injection peuvent induire un stress chez les animaux, principalement en raison de la manipulation et de la restriction physique temporaire imposées. Ce stress, bien que transitoire, peut perturber le comportement normal des animaux et provoquer des réactions physiologiques liées à l’anxiété. De plus, elles peuvent engendrer une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille ainsi que la possibilité de saignement. L’anesthésie peut quant à elle provoquer des effets secondaires comme : un stress thermique, une hypotension ou une détresse respiratoire. Plus spécifiquement : 1) La chirurgie requise sur femelle gestante analgésiée et anaesthésiée pour l’injection in utero de molécules peut avoir un impact sur i) le déroulement de la gestation des femelles en provoquant des saignements vaginaux ou au site d’incision abdominale ; ii) sur le développement des embryons conduisants à des mises bas prématurées et des difficultés de mise bas. 2) Les injections sur femelle gestantes pour déclencher une naissance prématurée ou sur nouveaux-nés pour moduler la sérotonine peuvent engendrer un stress lié à la contention, provoquer un léger saigenement au site d’injection. 3) Le transfert de nouveaux nés prématurés à une mère adoptive peut engendrer un stress chez les petits ou chez la mère pouvant conduire à une reget de celle-ci. 4) Les injections de molécules inflammatoires sur femelles gestantes ou animal juvenile peuvent engendrer un stress lié à la contention, un léger saigenement ainsi qu’une réaction inflammatoire transitoire au site d’injection. 5) Les chirurgies requisent pour es injections de traceurs axonaux i) chez les nouveaux-nés, peuvent provoquer des saignements au point d’incision et d’injection ; ii) chez l’adulte, nécessite une chirurgie de l’animal analgésié sous anesthesie gazeuse qui peut conduire à des effets secondaires lié à l’anesthesie (stress thermique ou respiratoire) ainsi qu’à des saignements au site d’incision.

Devenir

L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet (4185) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, immunohistochimiques ou transcriptomique.

Remplacement

L’étude des interactions des gènes et de l’environnements dans l’élaboration cerveau en cours de développement nécessite impérativement l’utilisation d’un organisme complet. Ce processus dépend en effet d’une multitude de signaux corporels qui influencent directement le comportement des cellules et leurs interactions avec le tissu. Des signaux hormonaux, immunitaires, de tensions des tissus, de la circulation sanguine, de l’environnement de la mère ou des neurones en développement. Ces processus, hautement coordonnés, ne peuvent être reproduits ni par des systèmes de culture (in vitro), qui présentent des limitations spatiales et temporelles, ni par des organoïdes, qui manquent de la diversité et des interactions cellulaire nécessaires. Les simulations informatiques, quant à elles, se limitent aux molécules bien caractérisées et ne permettent pas d’étudier les mécanismes encore largement inconnus qui régissent les phases précoces de développement du cerveau. De plus, nos travaux s’inscrivent dans la continuité de nos recherches antérieures. L’utilisation d’un modèle mammifère in vivo est indispensable pour observer ces mécanismes dans leur environnement physiologique

Réduction

Un total de 4185 animaux sera nécessaire à la réalisation de ce projet. Notre projet est conçu pour minimiser le nombre de souris utilisées tout en garantissant des résultats scientifiquement robustes. La taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, à cause des variabilités inter-animal et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ainsi, grâce à notre expérience préalable dans des projets similaires, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) constituent la taille optimale par groupe expérimental. Cela équilibre le besoin de robustesse statistique et la réduction du nombre d'animaux. Les procédures expérimentales ont été établies pour éviter l’utilisation inutile de souris. De plus, après le sevrage des souriceaux, les mères non traitées pourront être réutilisées dans de nouveaux accouplements. Enfin, dans nos différentes conditions expérimentales, si un résultat n’est pas concluant lors de la première analyse (immunohistochimie), alors les autres expériences prévues ne seront pas réalisées. Cette stratégie contribue significativement à la réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement qui seront mises en œuvre sont liés aux aspects des procédures et concernent l’établissement de points limites, l’hébergement et l’enrichissement de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort ces souris car les procédures que nous mettons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux et des séances d’habituation à la manipulation des animaux pourront être anticipées afin de limiter le stress de contention lors des injections. Nous examinerons le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure ou dont la mère aura subi un traitement pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez la souris. En cas d’atteinte de points limites et de souffrance grave ne pouvant être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas joignable. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la réglementation en vigueur : hébergement en surpression, portoirs avec des cages ventilées individuellement, stabulation en nombre limité par cage, eau et nourriture à volonté, change litière et biberons hebdomadaires, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu : papier kraft, coton et maison en carton. L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, les animaux seront utilisés à différents stades de développement, adaptés aux objectifs expérimentaux spécifiques allant de l’embryon jusqu’à l’adulte. Ainsi, les cerveaux seront analysés à 2 stades embryonnaires, en fin de gestation, stades critiques pour l‘élaboration du cerveau. Les cerveaux des souriceaux seront étudiés à diiférents stades après la naissance, des périodes critiques pour la maturation du cerveau. Enfin, les souris juvéniles et adultes seront utilisées pour explorer la persistance et les conséquences à long terme Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques.

Anesthésiées quinze minutes, rasées, la peau du dos abrasée au ruban adhésif, 360 souris reçoivent chaque jour pendant quatorze jours un patch chargé d'ovalbumine, la protéine de l'œuf. Une partie d'entre elles porte l'inactivation du gène DOCK8, qui altère leur système immunitaire et sert ici à modéliser un eczéma d'enfant. S'ajoutent un gavage oral et un isolement de vingt minutes pour la récolte des fèces, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, avec démangeaisons, rougeurs, œdème, lésions de grattage et inflammation possible de l'œsophage. Toutes sont tuées à la fin, organes et fluides prélevés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczéma et de l'allergie alimentaire, et "valider nos modèles".

Objectifs

Les déficits immunitaires monogéniques sont des maladies génétiques induisant une altération du fonctionnement du système immunitaire (susceptibilté aux infections, auto immunité, cancers, allergies) Les déficits immunitaires avec allergie désignent une sous-catégorie de déficits immunitaires primitifs rares associés à des manifestations allergiques (eczéma, allergies alimentaires, asthme). Sur les 500 déficits immunitaires répertoriés, environ 50 gènes liés aux déficits immunitaires avec allergie ont été décrits, les plus fréquents incluent le déficit en STAT3 (syndrome de Job-Buckley), DOCK8, WAS, et IPEX . Outre les allergies, les déficits immunitaires avec allergie se manifestent par des infections potentiellement graves, des maladies auto-immunes, cancers, retards de croissance et anomalies osseuses et du tissu conjonctif. Ces déficits restent souvent sous-diagnostiqués, surtout lorsque les signes se limitent à une manifestation allergique isolée sans infection. Le retard diagnostique peut avoir des conséquences importantes sur le pronostic de ces patients en retardant une prise en charge adaptée (antibioprophylaxie, greffe) et en aggravant éventuellement le risque infectieux. L’eczéma associé aux déficits immunitaires avec allergie semble souvent précoce mais ses caractéristiques cliniques et sa physiopathologie sont mal connus. En particulier, les différences entre l’eczéma associé aux deficits immunitaire et l’eczema classique ne sont pas connues ainsi que les différences concernant la survenue d’autres manifestations allergiques (asthme, allergie alimentaire, marche atopique= survenue successive de manifestations allergiques au cours du temps : eczema, asthme, allergie alimentaires). Une meilleure connaissance de la l'eczema associé aux deficits immunitaires permettrait un diagnostic plus précoce des deficits immunitaires avec allergie (en particulier au sein de la population atteinte d'eczema) et une meilleure compréhension des mécanismes de la marche atopique dans les déficits immunitaires et l'eczema atopique. L’objectif de ce projet est de déterminer si le deficit immunitaire impacte la sévérité et la physiopathologie de l'eczéma et de la survenue d'allergie dans un modèle murin DOCK8 -/-.

Bénéfices attendus

Nous espérons mettre en évidence les caractéristiques cliniques, les mécanismes fondamentaux et les biomarqueurs associés à l’eczéma associé aux déficits immunitaires, ainsi que la sévérité et l'évolution des manifestations allergiques associées (allergie alimentaire, marche atopique). Cela permettra de mieux identifier les enfants atteints de déficit immunitaire, de les dépister plus précisément, et de faciliter une prise en charge plus ciblée (traitements systémiques ciblés, allogreffe de moelle).

Procédures

Anesthésie (15 min), rasage (5 min), tape striping (1 min) application journalière pendant 14 j, d’un patch contenant l'allergène de l'oeuf (ovalbuline) (5 min) isolement pour la récolte des feces (20 min) gavage oral (2 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la gêne liée la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages, les symptômes liés à la mise en place de la DA (démangeaisons, rougeurs, oedème et lésions de grattage), les anesthésies gazeuses peuvent induire une hypothermie, une hypotension, une hypoventilation ou une hypoxémie, les gavages oraux peuvent induire une inflammation de l’œsophage

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation. Leurs organes et fluide biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczéma atopique ou de l'allergie alimentaire et ainsi de valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de l'eczéma atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales (peau, intestin, poumon).

Réduction

En effectuant un test de puissance , nous avons besoin de 12 animaux par groupes afin d’obtenir un score de sévérité de la DA (three item severity score (TIS) statistique et avoir assez de matériel biologique pour effectuer des coupes histologiques et des mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le serum. De plus, ce nombre d'animaux permettra d'obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d'analyses statistiques .

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Les interventions ( rasage, tape stripping et patch) seront réalisées sous anesthésies. L’évaluation des points limites sera réalisée quotidiennement tout au long de l'étude et est basée sur la présence de signes cliniques notables et sévères . En présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, le responsable service du bien être animal et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendront la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à la mise à mort de l'animal

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur l'eczéma atopique en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la peau, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de l'eczema, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris seront âgées de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à l'eczema chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.