Procédures modérées

2 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant enchaîner sept prises de sang sur animal éveillé, des injections dans l'orbite de l'œil et soixante-douze heures seule dans une cage métabolique de 500 cm2. Elles reçoivent des régimes hypercaloriques ou privés de méthionine et de choline, et sont mises à jeun huit à seize heures avant les tests de tolérance. Le porteur qualifie les perturbations du métabolisme hépatique ainsi provoquées de "non dommageable pour la souris", alors que le projet vise justement à installer une maladie hépatique métabolique. Une partie des souris est tuée trente minutes après une injection, le sang étant chassé de leurs vaisseaux par une perfusion dans le cœur, pour mesurer la perméabilité de ces vaisseaux.

Objectifs

Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).

Impact sur les animaux

La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).

Devenir

La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.

Remplacement

Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).

5 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de trois vecteurs qui déclenche un cancer des voies biliaires, puis jusqu'à seize échographies sous anesthésie et trente-deux passages en résonance magnétique sur animal éveillé, auxquels s'ajoutent des vaccins viraux et jusqu'à six traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie. Le porteur annonce une cachexie, une fièvre passagère et un risque de péritonite lié aux injections répétées, et précise qu'aucun médicament de confort ne sera donné pendant les expériences pour ne pas brouiller les résultats immunitaires. Il conclut à l'impossibilité de mener cette étude autrement qu'in vivo, faute d'autre modèle permettant d'évaluer une vaccination et ses mécanismes immunitaires.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins viraux comme nouvelle approche à la fois prophylactique et thérapeutique du cholangiocarcinome, un cancer agressif et encore mal pris en charge qui affecte les voies biliaires. L’objectif est de stimuler le système immunitaire afin, non seulement, de prévenir l’apparition de la tumeur, mais aussi de limiter sa progression et d’améliorer la réponse aux traitements existants.

Bénéfices attendus

Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5 sur 100.000 habitants en Occident. Il présente l’un des pronostics les plus sombres, avec moins d’un patient sur cinq encore en vie après cinq ans, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cholangiocarcinome.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection de 3 vecteurs pour l’induction tumorale (1 minute par souris vigile, 1 fois). Toutes les souris seront soumises à des examens par: échographie sous anesthésie (10 minutes par animal, 1 fois par semaine, 16 fois maximum) et résonance magnétique nucléaire sur animal vigile (2 minutes par animal, 2 fois par semaine, 32 fois maximum). Toutes les souris seront soumises à des injections pour la vaccination virale (pour un maximum de 2 au total, une minute par souris par jour, la moitié sous anesthésie). Une partie des souris sera soumise à des traitements de chimiothérapie et/ou immunothérapie (pour un maximum de 6 au total, moins d’une minute par souris vigile).

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie) et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. L’administration de virus pourrait induire une fièvre transitoire. Les traitements de chimiothérapie et immunothérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité prophylactique et/ou thérapeutique de vaccins viraux dans un modèle de cholangiocarcinome orthotopique. Ces vaccins viraux ont été développés, in vitro, par clonage de 13 antigènes identifiés (ex vivo) par des analyses immunopeptidomiques et immunologiques complémentaires. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de la vaccination virale et ses mécanismes, notamment immuno-dépendants, vu sa complexité.é.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 5296 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 16 souris (8 femelles et 8 mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Le nombre d’animaux pourra être réduit à la baisse si les hypothèses sont validées au cours des premières expériences. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, ...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - Notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.

Produire du cartilage articulaire dans le corps d'un animal avant de le réimplanter sur une articulation abîmée : 10 lapins adultes vont être utilisés pour cette preuve de concept, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une anesthésie par injection dans le muscle, la pose d'un cathéter dans l'oreille et une chirurgie d'une heure trente pour prélever un greffon de périoste et l'associer à un implant placé sous la peau. Pendant les vingt-huit jours suivants, ils sont contenus plusieurs fois par jour pour que l'on mobilise les platines de l'implant, source de stress que le porteur reconnaît, et une grille d'observation fixe les seuils au-delà desquels ils seront mis à mort. Récupérer l'implant demande de rouvrir la cicatrice et les muscles : les lapins seront tués, ce que le porteur présente comme un moyen de leur éviter les séquelles de cette seconde intervention.

Objectifs

L'arthrose est une maladie courante qui affecte les articulations en provoquant une détérioration du cartilage. Cela peut entraîner des douleurs et une réduction de la mobilité, en particulier chez les personnes âgées. La recherche se concentre actuellement sur la régénération du cartilage articulaire en utilisant des greffons de périoste, une membrane fibreuse qui peut être prélevée plus facilement que le cartilage lui-même. Le projet a pour objectif de développer un processus chirurgical de régénération du cartilage chez le lapin, en utilisant un implant chirurgical en biomatériaux associé à un greffon de périoste. L'objectif est de réimplanter le cartilage régénéré sur une perte de substance cartilagineuse articulaire et d'évaluer sa durabilité.

Bénéfices attendus

L'arthrose est une maladie articulaire caractérisée par la détérioration progressive du cartilage qui recouvre les extrémités osseuses dans les articulations. Cette détérioration entraîne des douleurs et une diminution de la mobilité chez les personnes touchées, en particulier dans les populations vieillissantes où la fréquence de la maladie est en augmentation. En conséquence, l'arthrose est considérée comme un problème de santé publique en raison de son impact négatif sur la qualité de vie des individus affectés et des coûts associés aux soins de santé pour traiter cette maladie. L’approche chirurgicale décrite dans ce projet pourrait être utilisée pour traiter l'arthrose en permettant la réimplantation d'un nouveau cartilage sur une zone où il est détérioré, de façon similaire à ce qui est pratiqué en chirurgie humaine lors d'interventions appelées "mosaïcplasties". Il s’agit d’interventions chirurgicales où de petits morceaux de cartilage sain sont prélevés dans une zone de l'articulation non porteuse de poids et réimplantés dans les zones endommagées du cartilage, mais sur des surfaces limitées (1 à 4 cm2), en particulier du fait d’un nombre réduit de sites donneurs. Cette nouvelle technique offrirait l'avantage de pouvoir traiter des zones plus importantes de perte de cartilage, avec un bénéfice non négligeable sur la qualité des patients.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux participeront à une seule procédure expérimentale, comprenant une anesthésie générale par injection intramusculaire (15 min), la pose d'un cathéter intraveineux au niveau de l'oreille (2 min), une intervention chirurgicale (environ 1h30) au cours de laquelle la douleur sera contrôlée par injection médicamenteuse. Au cours du suivi post-opératoire pendant 28 jours, ils seront manipulés quotidiennement pour recueillir des données mais sans geste invasif (pesée, vérification de l'implant...).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, trois types de nuisances ont été identifiées. Le premier est lié à l’intervention chirurgicale, nécessaire pour le prélèvement du greffon de périoste pour laquelle l'anesthésie nécessitera des injections par voie intra-musculaire, puis la pose d'un cathéter intraveineux au niveau de l'oreille. La présence d'une plaie chirurgicale pourra générer de la douleur après le réveil. Le deuxième type de nuisances est lié à l’implant lui-même, situé sous la peau, ce qui pourrait entraîner une gêne. Enfin, les manipulations quotidiennes pour la mobilisation des platines nécessiteront une contention légère des animaux mais répétée plusieurs fois par jour sur toute la durée de l’étude, cela pouvant induire un stress.

Devenir

L'implant devant être récupéré pour réaliser des analyses tissulaires, il sera nécessaire de rouvrir la cicatrice et les muscles. Les animaux seront euthanasiés pour leur éviter toute séquelle liée à ces gestes.

Remplacement

Dans le cadre de la croissance et de la régénération des os et du cartilage, l’ensemble des processus biologiques impliqués est complexe. Plusieurs équipes ont notamment démontré qu’il existe une interaction très active entre le muscle strié et l’os au cours de la réparation osseuse. Cet aspect d’interaction positive entre le muscle et l’os est aussi retrouvée au plan clinique orthopédique où l’importance d’un environnement musculaire de qualité pour la réparation osseuse est constatée quotidiennement. C’est pourquoi l’utilisation d’un environnement tissulaire de type muscle strié squelettique autour du greffon de périoste est nécessaire pour ce projet de développement d’un dispositif innovant. En l’état des connaissances actuelles, Il n’existe pas de système alternatif “in vitro” susceptible de reproduire un environnement aussi riche en faveur d’un processus de construction tissulaire ostéocartilagineuse, d’où la nécessité de passer par un modèle animal.

Réduction

Une étude préalable sur cadavre sera réalisée pour vérifier la faisabilité de l’implantation. S’il s’avérait que des difficultés apparaissent, alors la procédure serait revue avant de débuter les essais sur animaux vivants. De plus il s’agit d’une étude très préliminaire pour « preuve de concept ». L’identification histologique de la production d’un cartilage de qualité spécifiquement articulaire sera l’élément essentiel de validation de la procédure mais ne donnera pas lieu à une étude statistique particulière. Un nombre limité de 10 animaux est donc envisagé dans cette première étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par deux. Après l’intervention, l’animal est transféré dans une cage dédiée, où lui seront proposés de l’eau et de la nourriture dès son réveil afin de permettre une reprise alimentaire rapide. Le fond de cage sera matelassé pour réduire les risques d’hypothermie et éviter que le lapin ne se blesse en faisant un faux mouvement pendant son réveil. Une alèse chirurgicale permettra d’absorber les urines. Les animaux resteront sous surveillance en isolement, mais avec un contact visuel avec leur congénère, pendant les 24 premières heures. Si leur état clinique le permet, ils seront remis en espace libre dès le lendemain de l’intervention. Au cours des étapes suivantes, l’état clinique des animaux sera vérifié quotidiennement et évalué le cas échéant à l'aide d'une grille d'observation permettant d'établir des points limites et les actions à mener (surveillance accrue, administration d'antidouleurs, mise à mort) en fonction du score obtenu.

Choix des espèces

Le lapin est un des modèle animaux très couramment utilisé pour la recherche sur le cartilage articulaire. Des adultes de 3 à 3,5 kg ont été choisis car leur taille est suffisante pour implanter le dispositif médical. De plus, l’équipe initiatrice du projet a déjà une expérience sur cette espèce, dont les travaux précédents avaient montré qu’il serait possible de produire du cartilage articulaire à partir de greffons de périoste, ce qui a donné lieu à ce nouveau projet.

Soumis à une ligature d'artère coronaire de vingt-cinq minutes qui leur provoque une insuffisance cardiaque, 404 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois mois plus tard, une fois la défaillance installée, ils passent quelques jours exposés à une chaleur de type canicule, avec cinq échocardiographies et quatre épreuves d'effort, et 40 % d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour l'implantation d'un capteur de télémétrie. Le calcul des effectifs intègre la mortalité attendue dans ce modèle. Le porteur décrit pourtant des "examens non douloureux" et un "environnement sécurisé et surveillé", et présente le projet comme un moyen de mieux protéger les personnes fragiles pendant les fortes chaleurs.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment les fortes chaleurs, comme celles rencontrées lors des canicules, peuvent aggraver certaines maladies cardiaques. Les animaux seront exposés à une température élevée pendant quelques jours, dans un environnement sécurisé et surveillé. Leur état de santé sera suivi à l’aide d’examens non douloureux, comme l’échographie, ou de petits capteurs mesurant la température ou la pression artérielle. Les résultats aideront à mieux protéger les personnes fragiles lors d’épisodes de chaleur extrême.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment la chaleur intense, comme lors d'une canicule, peut aggraver une maladie cardiaque déjà présente. Grâce à ce modèle animal, il sera possible d’observer les effets de la chaleur sur le cœur et la circulation, et d’identifier des signes d’alerte utiles pour prévenir les complications. L’étude évaluera aussi des outils permettant de surveiller les animaux de manière plus précise et moins stressante. Ces travaux pourraient, à terme, aider à mieux protéger les patients cardiaques pendant les périodes de fortes chaleurs, en améliorant les recommandations médicales.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront différentes interventions, principalement dans un but d’observation ou de mesure. Certaines procédures sont non invasives, comme les échocardiographies (5 fois, 15min max, espacées d'au moins 48h) ou l’évaluation à l’effort (4 fois, 30min max, espacées d'au moins 72h). D’autres sont plus invasives, comme la pose de puces sous-cutanées pour suivre la température ou la pression artérielle (1 seule injection, 2 min max), ou une chirurgie d’implantation de capteur de télémétrie pour effectuer les mêmes mesures (1 seule intervention de 35min concernant 40% des animaux maximum). La mise en place du modèle d’insuffisance cardiaque est obtenue par chirurgie de ligature coronaire sous anesthésie générale avec gestion de la douleur péri et post-opératoire (1 seule intervention de 25min concernant tous les animaux). Tous les gestes sont réalisés sous anesthésie et selon les normes éthiques en vigueur, avec un suivi rigoureux du bien-être animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront exposés à certaines contraintes liées à leur état de santé, à la chaleur ambiante ou aux examens nécessaires. Les principales nuisances prévues sont : une tolérance réduite au stress, un risque modéré lié à la chaleur (perte d’appétit, fatigue, aggravation cardiaque), une à deux chirurgies espacées d'au moins 3 mois (avec antidouleurs adaptés), et des examens répétés mais non douloureux (échographies, suivi de la température).

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront mis à mort conformément aux normes éthiques en vigueur afin de permettre les prélèvements nécessaires aux analyses post-mortem (histologie, biologie moléculaire, etc.). Ces analyses sont indispensables pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour comprendre les mécanismes tissulaires associés à la décompensation cardiaque.

Remplacement

Le projet porte sur les effets d’un stress thermique sur l’évolution de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection réduite. Les mécanismes étudiés impliquent une réponse cardiovasculaire intégrée, thermorégulatrice et inflammatoire, impossible à reproduire in vitro ou in silico avec pertinence. Les méthodes alternatives ont été considérées pour l’optimisation des phases exploratoires (modélisation informatique, revue bibliographique, données historiques), mais les objectifs scientifiques nécessitent ici l’utilisation d’un organisme entier. Aucun modèle alternatif ex vivo ou cellulaire ne permet à ce jour de simuler la complexité des interactions physiopathologiques impliquées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été optimisé grâce à plusieurs stratégies complémentaires : tout d'abord, l'utilisation d'outils statistiques pour déterminer les effectifs minimum permettant l'obtention de données robustes, la mutualisation de certains groupes entre procédures pour éviter les redondances ; la constitution de sous-groupes expérimentaux permettant de répartir les manipulations et de limiter le stress tout en assurant la robustesse statistique des résultats ; l’exploitation de données historiques internes, notamment pour les groupes témoins lorsque cela est justifié ; l’utilisation de dispositifs de suivi longitudinal (thermopuces ou télémétrie) autorisant des mesures répétées sur un même individu ; et enfin, une estimation rigoureuse du nombre nécessaire d’animaux par calcul de puissance, prenant en compte la mortalité attendue dans ce modèle.

Raffinement

Dans ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place pour garantir le bien-être des animaux et limiter toute souffrance. Des critères cliniques stricts sont utilisés pour évaluer l'état de santé des animaux, permettant d'interrompre toute procédure en cas de signes de souffrance et d'opter pour une euthanasie anticipée si nécessaire. Les interventions stressantes sont réparties de manière à éviter les cumuls sur un même animal, et l'hébergement des animaux en condition de "canicule" est limité dans le temps, avec un suivi clinique renforcé et des aménagements pour améliorer leur confort. De plus, l'utilisation de thermopuces pour la surveillance thermique réduit le besoin d'interventions chirurgicales, et les éventuelles chirurgies, telles que l'implantation de dispositifs de télémétrie, sont réalisées sous anesthésie appropriée, avec des soins analgésiques avant et après l'intervention. Enfin, un suivi clinique rigoureux est effectué pour assurer la santé des animaux tout au long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le choix des rongeurs, et spécifiquement des rats Wistar, est motivé par plusieurs facteurs. Les rats Wistar sont largement utilisés dans des études similaires au sein du laboratoire, ce qui permet de comparer et d’enrichir les résultats avec les données historiques accumulées. Leur taille, qui facilite les manipulations pratiques, ainsi que leur place intéressante dans la phylogénie, sont également des éléments importants. Au début du projet, les animaux seront âgés de 8 semaines. Ce modèle récupère bien d’une chirurgie réalisée au cours de leur 10ème semaine de vie, présentent une insuffisance cardiaque 3 mois après cette chirurgie, stade idéal pour étudier l’évolution de cette pathologie.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, choisies pour leur incapacité à rejeter des cellules humaines. 1 120 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules souches du sang humaines modifiées par thérapie génique, après un conditionnement qui leur fait perdre du poids, et un prélèvement sanguin qui peut leur léser un œil. La mise à mort sert à récupérer leur moelle osseuse et à mesurer si les cellules injectées s'y sont installées, l'enjeu déclaré étant d'évaluer la toxicité à long terme de ces modifications avant leur passage chez des patients.

Objectifs

Parmi les méthodes thérapeutiques modernes, on retrouve la greffe de cellules souches sanguines (CSH). Le but est de permettre l’installation de ces cellules dans la moelle osseuse des patients au sein de « niches », où elles pourront produire de nouvelles cellules fonctionnelles et saines nécessaires à la personne traitée. Ces cellules peuvent être modifiées par thérapie génique dans le but d’améliorer et de corriger leur activité. Il est cependant nécessaire d’évaluer l’impact et l’efficacité de ces modifications, d’autant qu’elles peuvent induire une toxicité non souhaitée pour les CSH. Cette étude vise à déterminer si les modifications sont toxiques à long terme.

Bénéfices attendus

Cette étude portant sur les greffons sanguins permettra de caractériser les modifications apportées aux CSH modifiées par thérapie génique ainsi que leurs capacités de greffe (survie, auto-renouvellement, différenciation). Ces connaissances seront appliquées afin de (i) optimiser les greffons de thérapie génique avant leur infusion aux patients, (ii) optimiser les protocoles d'expansion des greffons hématopoïétiques modifiés par thérapie génique, et (iii) d'évaluer le risque à long terme de la toxicité de la thérapie génique.

Procédures

Les souris utilisées dans ce projet seront anesthésiées avant d’être soumises à une greffe de cellules. Il s'agit d’injections réalisées en quelques secondes (minimum 5 secondes - maximum 90 secondes). Les injections se feront sur animaux vigiles (2 à 24h d’intervalle). Le suivi de la prise de greffe se fait par un unique prélèvement sanguin sous anesthésie (30 secondes).

Impact sur les animaux

Le conditionnement des souris induit une légère perte de poids (

Devenir

A l'issue de la procédure, il est nécessaire de récupérer les moelles osseuses des souris afin d'évaluer la prise greffe par les cellules injectées initialement. L'ensemble des souris est donc euthanasié afin de procéder à ces analyses et à l'obtention des résultats expérimentaux.

Remplacement

L’absence d’alternative à l’expérimentation animale pour l’ensemble de ces études est justifiée par le fait que la greffe des cellules souches du sang (« nichage » et développement chez l’hôte) fait intervenir des microenvironnements cellulaires et moléculaires extrêmement complexes et impossibles à reproduire en culture in vitro. Néanmoins, dans le cadre de ce projet, toutes les expérimentations in vitro (notamment analyses phénotypiques ciblant des populations cellulaires enrichies en CSH, analyse de la génotoxicité) seront réalisées chaque fois que possible en vue de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Réduction

Pour chaque greffon utilisé et pour chacune des conditions d’optimisation testées, le nombre d’animaux injectés a été fixé à 7, qui est le nombre minimum d’animaux pour avoir une significativité suffisante lors de la réalisation des tests statistiques. Afin d'éviter toute utilisation inutile d'animaux, les greffons sont testés pour leur contenu en cellules immatures (contenant potentiellement les cellules souches) sur des critères phénotypiques et/ou métaboliques afin d’estimer la qualité du greffon et d’éviter des injections inutiles en cas de greffons dont la qualité est jugée insuffisante.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les souris recevront notamment de la nourriture enrichie dès le départ de l'expérimentation. Les souris seront hébergées en animalerie adaptée aux souris immunodéprimés, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques. Elles seront hébergées en conformité avec la réglementation en présence de leur congénères (à raison de 5 souris par cage) afin de maintenir leurs relations sociales. Les conditions d’hébergement sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu adapté pour entretenir le bien-être des animaux. L’ensemble des animaux recevront un traitement analgésique et/ou anesthésique prévu pour parer à toute souffrance ou stress, réfléchit pour chaque acte pratiqué. Les points limites ont été définis et appliqués pour le suivi de ces animaux. Notamment, la souffrance et la gêne des animaux seront évaluées à travers une grille de points limites adaptée permettant d’anticiper au plus tôt la souffrance des animaux et de mettre en place les procédures conservatoires adéquates.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons des souris immunodéficientes. Cette souche de souris est très largement utilisée dans la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques en raison de sa capacité à permettre la génération d'une hématopoïèse humaine à partir des cellules souches injectées Cette capacité est obtenue grâce à la forte immunodépression. Cette souche de souris représente donc un modèle pertinent et efficace pour l'étude et la mise en évidence de cellules souches humaines ; ce modèle permet d'extrapoler la greffe chez l'humain. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

Un régime riche en graisses pendant huit ou seize semaines, appliqué pour installer une inflammation puis une fibrose du foie : 60 souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer une protéine dans cet organe vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ne décrit comme atteintes que le stress de deux pesées par semaine et une perte de poids d'environ 5 % la première semaine, alors que la maladie qu'il provoque évolue chez l'humain vers la cirrhose et le cancer du foie. Il revendique un "besoin urgent" d'optimiser le traitement de cette maladie et écrit qu'il serait "intéressant d'affirmer" que sa protéine y joue un rôle. Toutes sont tuées après un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour qu'on collecte leurs tissus.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la Maladie Hépatique Associée au Syndrome Métabolique (MASH). La MASH est caractérisée par une inflammation et une dégradation des cellules hépatiques dues à une accumulation de graisse dans le foie. Au stade précoce, la MASH est souvent asymptomatique et généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, évoluant vers un cancer du foie dans les cas les plus graves. Le Resmetirom, 1er médicament approuvé par la FDA (mars 2024) pour la MASH, permet seulement de retarder l’échéance en réduisant la fibrose chez 24% des patients. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser le traitement de la MASH. Au sein de notre laboratoire nous étudions une protéine localisée sur la membrane cellulaire, qui joue un rôle dans le développement de différents cancers, notamment celui du foie. Il serait maintenant intéressant d’affirmer que cette dernière joue un rôle important dans le développement de la MASH. Pour cela, un nouveau modèle de souris a été développé avec une suppression ciblée de cette cible au niveau du foie uniquement. Cela nous permettra d’affirmer l’implication de cette dernière sur le développement de la MASH. Afin d’induire un modèle pertinent de MASH avec fibrose hépatique in vivo, un régime spécifique riche en graisses sera appliqué.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre en profondeur le rôle de notre cible thérapeutique dans le développement de la MASH. Par exemple l’étude de son rôle fonctionnelle dans le foie et le métabolisme (réponse au stress oxydatif, inflammation, impact sur la signalisation immunitaire et métabolique) dans le cas de la MASH. Ce modèle avec une suppression ciblées de notre cible permettra de comprendre comment notre protéine d’intérêt participe à l’évolution de la maladie et d’identifier de nouveau biomarqueur ainsi que des signatures moléculaires spécifique.

Procédures

Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation (pendant 8 semaine dans un groupe et 16 semaines dans un autre). Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Un modèle à base d’un régime alimentaire spécial, permettra de récapituler le développement de la maladie chez la souris permettant le développement d’une maladie hépatique liée au syndrome métabolique (MASH). Un stress de la souris peut être observé dû à la pesé des animaux 2 fois par semaine. Une légère perte de poids la première semaine du régime est observée (environ -5%).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier pour une meilleure compréhension du mécanisme et avant une transposition chez l’Homme.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie. Les animaux sont observés quotidiennement. A l’arrivé des souris dans l’animalerie, une période d’acclimatations de 7 jours sera appliquée avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une MASH. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).

Deux heures d'anesthésie d'affilée, dont un quart d'heure avec une aiguille-capteur enfoncée au centre de la tumeur : 110 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales du sein ou du pancréas leur sont injectées dans le flanc, la tumeur pousse deux à trois semaines, puis vient l'examen complet, une heure quinze d'IRM, trente minutes d'échographie et la mesure directe de la pression interne. Toutes sont tuées ensuite pour que la tumeur soit découpée et comparée aux images. Le porteur retient la souris parce que les appareils d'imagerie ont été conçus pour elle et qu'il est plus aisé de trouver des points de comparaison dans la littérature.

Objectifs

Les tumeurs solides sont principalement composées de cellules et d'autres éléments comme les fibres de collagène, qui affectent leurs caractéristiques physiques. Certaines caractéristiques sont connues pour rendre la tumeur plus sévère et plus résistante aux traitements médicaux. Parmi ces propriétés, seule la dureté de la tumeur peut actuellement être mesurée de manière précise et non invasive en imagerie. Il est alors intéressant de développer des techniques pouvant mesurer les autres caractéristiques tumorales, pour évaluer la sévérité tumorale de manière plus précise. La technique envisagée dans ce projet est l’élastographie par imagerie par résonance magnétique (IRM) sous compression. L’élastographie est la mesure des propriétés mécaniques du tissu comme l’élasticité, la dureté, etc… On utilise un dispositif vibrant pour générer des ondes à travers le tissu d’intérêt. Pour acquérir l’image de ces ondes qui se déplacent, on peut utiliser l’IRM (dont les images sont créées grâce à des champs magnétiques) ou l’échographie (dont les images sont créées grâce à des ultrasons). On peut également mesurer des propriétés plus complexes en réalisant un examen d’élastographie sous compression, c’est-à-dire en appuyant de manière continue sur le tissu pendant l’examen d’imagerie. Des études utilisant l’élastographie échographique sous compression ont été menées sur le foie en dehors du corps et ont montré que ces propriétés étaient liées à la manière dont sont organisées les fibres à l’intérieur du cancer, ce qui affecte sa sévérité. Le but de ce projet est de transposer cette méthode développée avec les ultrasons vers l’IRM. Ce type d’imagerie informe sur un volume entier, ce que ne fait pas l’échographie. Il y aura ainsi une information complémentaire et une meilleure précision dans les mesures. Cette nouvelle technique sera appliquée sur des tumeurs implantées chez la souris, avec deux modèles différents : des tumeurs du sein et des tumeurs du pancréas. Les valeurs obtenues seront ensuite comparées à des données provenant de la microscopie pour valider l’utilisation de cette méthode pour déterminer l’organisation des tissus et la sévérité de la tumeur. La validation de la méthode sera d’autant plus assurée que ces deux modèles possèdent des compositions et des propriétés physiques différentes. Cela permettra d’offrir une méthode sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d’un cancer et adapter ensuite le traitement donné au patient. MODIF: Prolongation.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’approfondir les connaissances fondamentales relatives aux propriétés mécaniques du cancer. En particulier, l’objectif est d’obtenir des marqueurs non-invasifs d’imagerie pouvant indiquer la sévérité tumorale qui est liée à la fois à la composition de la tumeur et à sa pression. Cette étude pourra notamment permettre de définir de nouvelles méthodes d’imagerie afin d’aider le clinicien dans le diagnostic du cancer et, également, adapter le traitement aux caractéristiques de la tumeur.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront anesthésiés pour une injection unique des cellules tumorales en sous-cutané dans le flanc. Cet acte aura une durée totale de 10 min par animal. Les animaux seront observés de manière bihebdomadaire pendant la croissance tumorale. Une fois que la tumeur aura atteint une taille suffisante (environ 2 à 3 semaines après l’injection des cellules), un examen complet sera effectué. Il comprendra un examen d’imagerie IRM, un examen d’imagerie échographie et une mesure de la pression tumorale, tous réalisés au sein d’une même anesthésie gazeuse. Pour la mesure de la pression tumorale, un capteur de pression ressemblant à une aiguille sera introduit au centre de la tumeur pour obtenir des mesures de pression qui seront comparées avec les mesures d’imagerie. Cette comparaison permettra de valider l’intérêt de l’imagerie IRM et échographie comme méthode de mesure de pression non-invasive. Au total, cette intervention aura une durée de 2h pour chaque animal, avec environ 1h15 d’acquisition d’images IRM, 30 min d’acquisition échographique et 15 min de mesures de pression.

Impact sur les animaux

Des cellules tumorales seront injectées dans le flanc droit de l’animal, ce qui peut occasionner un stress ou une légère douleur au point d’injection. La croissance tumorale peut engendrer une gêne, voire une perte de poids pour l’animal. Cette perte de poids sera en revanche limitée, car surveillée deux fois par semaine. De plus, la taille de la tumeur ne devrait pas excéder les 1000 mm3, ce qui limite de potentiels effets indésirables sur la mobilité de l’animal. Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et passer à l’intérieur d’un tunnel d’IRM avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l’animal. Cependant, les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l’examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que l’hypothermie (refroidissement de l'animal) et la diminution du rythme respiratoire.

Devenir

A la suite de l’examen complet (imageries et mesure de pression), les animaux seront euthanasiés et la lésion tumorale sera disséquée. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène) qui composent la tumeur. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.

Remplacement

A notre connaissance, il n’y a pas d’alternatives en dehors d'un système vivant (construction de cellules ou morceaux de tumeurs) ou de modélisation numérique qui ont été validées et qui peuvent être utilisées comme solution de remplacement. Afin de valider l’imagerie comme solution non-invasive de mesure de la pression tumorale, les mesures doivent être effectuées sur des modèles animaux afin de reproduire l’environnement hétérogène et les propriétés tumorales qui pourront être retrouvés en clinique chez les patients atteints de lésions tumorales.

Réduction

Les dispositifs d’imagerie utilisés dans ce projet ont déjà été validés en amont, ce qui évite d’avoir une phase de test et de validation sur petit animal. Le nombre d’animaux par groupe a été défini selon des données obtenues précédemment et les données de la littérature.

Raffinement

En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu deux fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence, de son comportement et de la taille de la tumeur. En cas d’atteinte des points-limites, l’animal sera euthanasié. En cas de score intermédiaire, une injection d’antidouleur sera réalisée et le suivi clinique sera réalisé quotidiennement. Tous les examens seront effectués sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress provoqués par les examens. La durée des examens sera réduite au maximum (temps total prévu de 2 heures au maximum) et tous les examens seront réalisés au cours de la même anesthésie pour éviter plusieurs anesthésies successives. Les animaux seront maintenus dans des cages de cinq maximum afin qu’ils aient suffisamment d’espace et qu’ils maintiennent un comportement social. Du matériau favorisant la nidification leur sera fourni. Les animaux seront hébergés en animalerie avec un statut adapté et manipulés sous hotte.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour cette étude, car elles permettent de greffer en sous-cutané des modèles de tumeurs humaines. Les dispositifs d’imagerie ont été développés pour les souris. De plus, la plupart des études d’imagerie sur tumeurs greffées en sous-cutané ont été réalisées sur des souris et il est donc plus aisé de trouver des informations dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés au stade adulte (au moins 8 semaines) afin de bénéficier d’animaux plus grands et plus à même de supporter les lésions tumorales étudiées. De plus, les cancers du sein et du pancréas sont généralement observés chez des patients adultes.

Capturés en rivière, anesthésiés puis marqués par une injection de colorant sous la peau, 120 gobies à tache noire mâles sont chauffés dans un bac de terrain jusqu'à perdre l'équilibre, en séances de deux heures trente. Suivent un mois en animalerie, jusqu'à trente-six heures de jeûne, des passages isolés en tunnel de nage et en chambre de respirométrie sous oxygène réduit, et un second échauffement mené jusqu'à l'arrêt de la nage. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour prélever leur cœur, leur cerveau et leur muscle et relier ces défaillances à l'état de leurs mitochondries.

Objectifs

Dans un contexte de changement climatique global, les milieux aquatiques continentaux sont de plus en plus soumis à des stress environnementaux (chaleur, hypoxie, etc.) sévères, affectant la physiologie, le comportement et la survie des espèces qui y vivent. Les poissons, ectothermes, sont particulièrement exposés à ces changements. Ainsi, les espèces les plus résilientes pourraient être avantagées et coloniser de nouvelles niches écologiques. Ces espèces invasives entraînent un déséquilibre des réseaux trophiques impactant l’ensemble du milieu. Comprendre les mécanismes qui sous-tendent leur plasticité est donc essentiel pour anticiper les conséquences des contraintes naturelles sur la biodiversité aquatique et orienter les politiques de conservation. Ce projet vise à caractériser les limites de tolérance thermique chez le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus), une espèce benthique invasive en forte expansion dans les rivières européennes, notamment en France. Cette espèce semble capable d’occuper des habitats plus contraignants que ceux d’espèces endémiques, notamment des zones de fond à faible teneur en oxygène. Cette tolérance à l’hypoxie contribuerait à son succès invasif en lui permettant d'exploiter une niche écologique plus large. Le projet repose sur une approche expérimentale comparative combinant plusieurs indices de tolérance thermique basés sur les performances de nage qui seront mesurés dans des dispositifs dédiés à la fois sur le terrain et en laboratoire. La comparaison de ces deux situations n’a jamais été effectuée auparavant et sera complétée par des mesures en condition d’oxygène réduite, caractéristique importante des milieux dégradés. En combinant mesures de performances/tolérances thermiques (CTmax terrain et laboratoire, CTswim) et analyses mitochondriales sur cœur, cerveau et muscle, ce projet vise à fournir une compréhension multi-échelle de la tolérance thermique chez une espèce envahissante, et à identifier les traits qui favoriseraient sa progression dans les milieux aquatiques soumis au changement global. Ce projet implique la capture de gobies sauvages dans la Saône et des expérimentations en conditions de terrain et en animalerie agréée.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à affiner notre compréhension des limites de tolérance thermique chez le gobie à tache noire, une espèce invasive largement répandue dans les grands cours d’eau d’Europe. Il s’agit notamment de comparer différents indicateurs de tolérance thermique : la CTmax, mesurée soit en conditions naturelles, soit en conditions contrôlées, et la CTswim correspondant à une perte fonctionnelle locomotrice sous contrainte thermique. (1) Sur le plan fondamental, cette étude permettra d’identifier les mécanismes écophysiologiques impliqués dans la défaillance thermique, en reliant les seuils critiques comportementaux (perte d’équilibre, arrêt de nage) au fonctionnement des mitochondries de plusieurs organes (cerveau, cœur, muscle). L’approche multi-échelle utilisée (de l’organisme à la cellule) contribuera à clarifier les processus qui limitent les performances thermiques des poissons dans leur environnement. (2) Sur le plan méthodologique, le projet interroge la robustesse d’un indicateur largement utilisé (la CTmax) selon le contexte expérimental (terrain vs laboratoire), et propose une alternative potentiellement plus pertinente d’un point de vue écologique : la CTswim, qui intègre la composante locomotrice, essentielle à la survie (fuite, alimentation, reproduction). (3) Sur le plan appliqué, les résultats aideront à reconsidérer les indicateurs utilisés pour la gestion thermique des milieux aquatiques. Si la CTswim se révèle plus sensible que la CTmax, notamment en conditions hypoxiques, elle pourrait constituer un nouveau seuil critique pertinent à intégrer dans les modèles de niche thermique, la planification de la restauration écologique ou l’évaluation des risques liés aux canicules aquatiques. Enfin, l’étude du gobie comme modèle invasif permettra d’identifier des traits fonctionnels susceptibles de favoriser la résilience thermique et l’occupation de niches écologiquement stressantes, offrant ainsi des clés pour mieux comprendre les dynamiques d’invasion dans un contexte de changement global.

Procédures

Les poissons seront soumis à plusieurs interventions expérimentales réparties en séquences, selon les deux procédures décrites dans le projet. - Capture et marquage individuel Après la capture en milieu naturel (temps d’émersion

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés au stress physiologique induit par : - La capture en milieu naturel, - Le changement d’environnement (transition rivière → laboratoire), - Les manipulations expérimentales (chambre de nage, respirométrie, échauffement thermique). Ce stress peut favoriser des troubles immunitaires et l’apparition d’infections opportunistes, notamment chez des individus déjà fragilisés. Ce risque sera réduit par des phases de récupération post-manipulation, une surveillance rigoureuse de l’état des animaux et une stabulation adaptée (eau filtrée, oxygénée, cachettes, densité contrôlée). Les autres effets indésirables incluent : - Le jeûne alimentaire imposé avant les mesures métaboliques (36h max), potentiellement inconfortable mais nécessaire pour éviter les biais liés à la digestion ; - L’isolement temporaire (

Devenir

À la fin de l’expérience, il est prévu de procéder à des échantillonnages pour analyses mitochondriales (cœur, cerveau, muscle squelettique) sur l’ensemble des individus utilisés. Ces analyses nécessitent l’euthanasie de tous les individus restants, conformément au plan expérimental, afin de relier directement les performances thermiques et locomotrices aux mécanismes cellulaires.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques, surtout lorsqu’il s’agit d’animaux sauvages. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle attendue (taille, masse, capture en milieu naturel), le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire tout en garantissant la pertinence scientifique et statistique. Le marquage individuel permet d’appliquer des tests à mesures répétées, prenant l’individu comme facteur aléatoire, ce qui réduit fortement le besoin d’effectifs supplémentaires. Notre plan expérimental inclut : • Deux conditions d’oxygénation (100 % vs 20-50 % de saturation en O₂), • Deux statuts expérimentaux (poissons testés en CTmax terrain vs individus naïfs). Nous travaillons uniquement sur des mâles pour limiter la variabilité liée au sexe et réduire le nombre d’animaux nécessaires. L’effectif final (120 individus) est équilibré entre conditions et prend en compte une faible marge pour compenser la mortalité possible (transport, acclimatation, manipulations), inévitable avec des individus sauvages. Cet effectif se base sur la taille d’échantillons décrite dans les articles publiés sur le sujet.

Raffinement

Lors des protocoles in vivo, un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesures et changement de milieu – tunnel, chambre ou nouvel aquarium) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage avant les protocoles de respirométrie. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les gobies seront maintenus dans des aquariums en densité adaptée à leur espèce, agrémentés de plantes artificielles et de gravier. Des cachettes adaptées des constitués de tubes PVC seront disposées dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement sera particulièrement observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés et précoces pour mettre fin à toute douleur incompatible avec les objectifs du projet. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) a été choisi comme modèle en raison de son fort intérêt de la communauté scientifique quant à son impact écologique. Espèce benthique exotique envahissante, elle colonise rapidement les cours d’eau français (Moselle, Saône, Doubs) et entre potentiellement en compétition avec des espèces autochtones en occupant des habitats hypoxiques peu accessibles à ces dernières. Son comportement locomoteur particulier (nage par bursts, maintien au substrat) et sa tolérance apparente à l’hypoxie en font un modèle idéal pour explorer les limites physiologiques et bioénergétiques de la tolérance thermique. Par ailleurs, le gobie est classé en préoccupation mineure (LC) sur la liste rouge UICN. Sa capture en milieu naturel, dans le cadre d’autorisations préfectorales spécifiques, n’entraînera aucun impact significatif sur les populations locales, d’autant plus qu’il s’agit d’une espèce prolifique, suivie dans plusieurs programmes de gestion piscicole régionaux. Tous les individus utilisés sont des adultes mesurant entre 8 et 14 cm, ce qui correspond aux tailles adultes couramment observées dans les populations naturelles. Le choix de ce stade de développement est justifié pour deux raisons principales : - Il garantit une compatibilité optimale avec les dispositifs expérimentaux utilisés (tunnel de nage de 5 L, chambres métaboliques, système CTmax). - Il assure une représentativité écologique : les individus adultes sont les plus exposés aux contraintes environnementales (température, hypoxie) et jouent un rôle clé dans les dynamiques de population (reproduction, territorialité, compétition interspécifique).