Procédures modérées

144 souris, des souriceaux et leurs mères allaitantes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les souriceaux sont exposés avec leur mère pendant cinq jours à une forte concentration en oxygène pour provoquer des anomalies des vaisseaux de la rétine, puis reçoivent sous anesthésie une injection dans chaque œil d'une protéine étudiée contre les complications oculaires du diabète. L'injection peut provoquer douleur, saignement ou infection, et plus rarement une cataracte ou un décollement de la rétine. Présentée comme une étude pilote qui doit décider de la poursuite du programme, elle se termine par la mise à mort des souriceaux à 14 ou 17 jours pour prélever leurs yeux, puis par celle des mères à la fin du protocole.

Objectifs

Le diabète de type 1 peut entraîner, à long terme, des complications au niveau des yeux, notamment en endommageant les petits vaisseaux de la rétine. Notre équipe étudie une protéine qui a déjà montré des effets intéressants chez la souris diabétique. Ce projet vise à déterminer si cette protéine pourrait également réduire les anomalies des vaisseaux de la rétine. Une première étude réalisée chez un petit nombre de souris a donné des résultats encourageants, mais elle ne permet pas encore de conclure sur l’efficacité du traitement. Cette nouvelle étude permettra donc d’évaluer plusieurs doses de la protéine et de vérifier sa tolérance au niveau de l’œil. Pour reproduire certaines anomalies observées dans les maladies de la rétine, de jeunes souris seront temporairement exposées à une forte concentration en oxygène, puis replacées dans l’air ambiant. La protéine sera ensuite administrée une seule fois dans les deux yeux. Les effets du traitement seront étudiés à deux moments différents afin d’évaluer sa tolérance et son action sur les vaisseaux de la rétine. Un maximum de 144 souris, comprenant les jeunes souris et leurs mères allaitantes, pourra être utilisé. Le nombre d’animaux sera limité autant que possible et des mesures seront mises en place pour réduire la douleur, le stress et les complications éventuelles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet concerne principalement la santé humaine. À court terme, dès l’issue du projet, les résultats permettront de déterminer si la protéine étudiée présente un effet favorable sur les anomalies des vaisseaux de la rétine, d’identifier les doses les plus pertinentes et d’obtenir de premières informations sur sa tolérance oculaire. Ces résultats seront dans un premier temps applicables à l’échelle préclinique et permettront de décider de la poursuite ou non du programme. À moyen terme, si les résultats sont encourageants, ils permettront de mieux dimensionner une étude confirmatoire et ainsi d’éviter d’engager inutilement un nombre plus important d’animaux. À plus long terme, et sous réserve de résultats favorables lors des étapes précliniques et cliniques complémentaires nécessaires, cette approche pourrait contribuer à l’évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour certaines maladies de la rétine associées à des anomalies de la vascularisation, notamment les complications oculaires du diabète. Aucun bénéfice direct pour la santé animale ou l’environnement n’est attendu dans le cadre de ce projet pilote.

Procédures

Les jeunes souris resteront avec leur mère et seront exposées pendant 5 jours à une atmosphère contenant une forte concentration en oxygène afin de provoquer des anomalies des vaisseaux de la rétine. Le lendemain de cette exposition, chaque jeune souris sera anesthésiée. Une fois endormie, elle recevra une injection dans chacun des deux yeux au cours de la même séance. La préparation et les injections dureront environ 10 à 15 minutes par animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu’à leur réveil complet avant d’être replacées auprès de leur mère.

Impact sur les animaux

L’exposition à une forte concentration en oxygène peut entraîner chez les jeunes souris un ralentissement de la prise de poids, une déshydratation ou une baisse de l’activité. Chez les mères allaitantes, elle peut provoquer une diminution de l’activité, de la prise alimentaire ou de la production de lait. Les manipulations et les séparations temporaires de la mère peuvent également provoquer un stress passager chez les jeunes souris. L’injection dans l’œil peut entraîner une douleur temporaire, une irritation, un petit saignement, une inflammation ou une infection. Plus rarement, des complications plus importantes peuvent survenir, comme une atteinte du cristallin, une cataracte, une hémorragie dans l’œil ou un décollement de la rétine. Enfin, l’anesthésie générale peut entraîner une baisse de la température corporelle, des difficultés respiratoires ou un réveil plus lent.

Devenir

À l’âge de 14 ou 17 jours selon leur groupe, les jeunes souris seront mises à mort afin de prélever les yeux. Les mères allaitantes, exposées avec leur portée à une forte concentration en oxygène, seront mises à mort à la fin du protocole.

Remplacement

Le phénomène étudié dépend de plusieurs mécanismes qui se produisent simultanément dans la rétine : le développement des vaisseaux sanguins, les variations d'apport en oxygène et la réponse des différents types de cellules de la rétine. Il est également nécessaire d'étudier la manière dont le traitement agit directement dans l'œil après son administration. Des méthodes alternatives, comme les cultures de cellules, les tissus rétiniens maintenus en laboratoire ou de petites structures de rétine reconstituées en laboratoire à partir de cellules, permettent d'étudier certains de ces mécanismes séparément. Cependant, elles ne reproduisent pas l'ensemble des modifications vasculaires qui apparaissent successivement dans la rétine après une exposition à une forte concentration en oxygène puis un retour à l'air ambiant. L'utilisation d'un modèle animal reste donc nécessaire pour évaluer l'effet du traitement dans un organisme vivant et dans des conditions proches de celles du phénomène étudié.

Réduction

Une seule souche de souris sera utilisée afin d’éviter de multiplier les groupes expérimentaux. L’étude sera réalisée en plusieurs étapes : une première analyse permettra d’évaluer l’effet principal du traitement, et une analyse plus précoce ne sera réalisée que si elle apporte des informations complémentaires utiles. Cette organisation permet de ne pas engager inutilement des animaux supplémentaires. Chez chaque souris, les deux yeux recevront le même traitement et seront utilisés pour réaliser des analyses complémentaires. Cela permet d’obtenir plusieurs types d’informations à partir d’un même animal et de limiter le nombre total de souris nécessaires. Comme il s’agit d’une étude pilote, les effectifs ont été définis pour obtenir une première estimation de l’effet du traitement et de la variabilité des résultats, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Les résultats permettront également de mieux déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour une éventuelle étude ultérieure.

Raffinement

L'exposition à une forte concentration en oxygène sera limitée à la durée strictement nécessaire au modèle. Les jeunes souris et leurs mères seront surveillées régulièrement. Afin de limiter les effets de cette exposition sur les mères et la production de lait, un relais des femelles allaitantes pourra être mis en place et de l'aliment humidifié leur sera proposé. Les jeunes souris seront identifiées par un marquage temporaire non invasif. L'injection dans les yeux sera réalisée sous anesthésie générale par un opérateur formé. Des mesures seront prises pour limiter la douleur et protéger la surface de l'œil, notamment par l'utilisation d'un collyre anesthésique local contre la douleur, d'un gel lubrifiant et d'une antisepsie adaptée. Le volume injecté sera réduit au minimum nécessaire. Un traitement contre la douleur sera administré selon le même protocole dans les groupes concernés et poursuivi pendant 24 à 48 heures après la procédure. Les animaux seront maintenus au chaud pendant l'anesthésie et surveillés jusqu'à leur réveil complet. Leur état général et leurs yeux seront ensuite contrôlés au moins deux fois par jour pendant les 48 premières heures. En cas d'anomalie, des mesures correctives seront mises en place rapidement et, si nécessaire, l'animal sera retiré de l'étude.

Choix des espèces

La souris est utilisée car le développement des vaisseaux de la rétine se poursuit après la naissance, ce qui permet de reproduire de manière fiable les anomalies vasculaires étudiées dans ce projet. La souche choisie est couramment utilisée pour ce type de modèle et a également été utilisée lors de l’étude préliminaire. Les jeunes souris seront étudiées avant le sevrage, pendant la période où les vaisseaux de la rétine sont encore en développement. Les mères allaitantes resteront avec les portées pendant toute la période nécessaire au modèle.

Certaines des 1 296 souris utilisées sont génétiquement modifiées pour que Listeria monocytogenes franchisse leur intestin, ce qu'elle ne fait pas chez les souris non modifiées, et d'autres ont plus de vingt mois. Toutes sont infectées une fois, par injection intraveineuse ou par gavage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées à l'issue pour l'étude de leurs organes. L'infection peut gagner le cerveau et provoque faiblesse, perte de poids et troubles digestifs, des effets que le porteur estime durer un à trois jours. Une souris qui perd plus de 20 % de son poids ou présente une paralysie partielle est mise à mort.

Objectifs

La listériose est une infection grave d'origine alimentaire causée par la bactérie Listeria monocytogenes. Cette maladie peut atteindre le cerveau et provoquer des méningites et encéphalites particulièrement mortelles chez les personnes âgées de plus de 65 ans, avec un taux de mortalité d'environ 30 % même après traitement antibiotique. Ce projet vise à comprendre pourquoi la susceptibilité à la listériose augmente avec l’âge, et ce plus particulièrement pour les hommes. Les connaissances acquises contribueront au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives contre la listériose, essentielles pour protéger les populations vulnérables, tout en apportant des éléments fondamentaux sur les mécanismes immunitaires altérés au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à réduire l'impact d'une maladie infectieuse responsable de plusieurs centaines de décès chaque année en France, touchant particulièrement les personnes âgées de plus de 65 ans. En comprenant comment la bactérie responsable traverse les barrières naturelles de protection pour atteindre le cerveau et d'autres organes essentiels, ainsi que les raisons de la vulnérabilité accrue des personnes âgées, cette recherche fournit les bases scientifiques indispensables au développement de nouvelles stratégies de lutte contre l'infection. Les bénéfices attendus concernent donc la santé publique mais également l’industrie agro-alimentaire en raison de l’origine alimentaire de l’infection. Sur le plan scientifique, cette étude apporte une compréhension approfondie des mécanismes complexes régissant les interactions entre agents infectieux capables de survivre à l'intérieur des cellules et le système de défense de l'organisme. Ces connaissances constituent un modèle précieux pour l'étude d'autres infections graves présentant des mécanismes de propagation similaires. Les approches méthodologiques et les découvertes réalisées seront transposables à l'étude d'autres pathogènes, multipliant l'impact de cette recherche.

Procédures

Au cours de ce projet, en fonction des procédures, les animaux pourront être soumis aux interventions listées ci- dessous, classée par catégories. Les procédures concernées par ces gestes sont indiquées. Infection bactérienne -Infection intraveineuse / 1 seule fois, pour environ 2min / procédures 1, 2 et 3 -Infection orale (gavage) / 1 seule fois, pour environ 2min / procédures 1 et 2 Injections -Injection intraveineuse / 2 fois, pour environ 2min par injection/ procédure 3

Impact sur les animaux

Les procédures induiront une maladie d'une gravité modérée chez les animaux. Ils développeront une infection se traduisant par une faiblesse générale, une perte de poids et des troubles digestifs. L'infection pourra se propager à différents organes internes, y compris le cerveau, provoquant des souffrances. Les injections réalisées pour administrer l'agent infectieux ou d'autres substances généreront des douleurs et des gênes ponctuelles. Les manipulations par les expérimentateurs, les injections et l’infection pourront être une source de stress. Compte tenu de la durée des expériences, ces effets indésirables sont susceptibles de durer entre 1 et 3 jours.

Devenir

Les procédures mises en œuvre dans ce projet nécessitent toutes une mise à mort des animaux à la fin des expériences, afin d’étudier les organes par diverses techniques. Il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin du projet. De plus, le caractère infectieux du projet ne permettra pas la réutilisation, le replacement ou l’adoption des animaux.

Remplacement

Le remplacement total de ces procédures par des méthodes ne faisant pas appel à des animaux n'est pas réalisable actuellement. L'étude de la pathophysiologie de cette infection nécessite de comprendre comment la bactérie interagit avec l'ensemble d'un organisme vivant : son système de défense naturel et ses différents organes cibles. Ces phénomènes, notamment la dissémination de la bactérie d'un organe à un autre et la réaction globale de l'organisme, en particulier dans le cadre d’un organisme âgé, ne peuvent être reproduits fidèlement in-vitro. Toutefois, afin de limiter le recours à l'expérimentation animale, des alternatives sont employées dès que possible. Des cultures cellulaires permettant d'explorer des questions spécifiques ou d'étudier des mécanismes cellulaires précis seront mis en place quand cela est possible.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé par des calculs statistiques, afin de garantir la détection de différences biologiques significatives entre les groupes étudiés, tout en limitant l'effectif au minimum. Cette estimation repose sur des analyses préalables permettant d'anticiper les variations attendues. Pour réduire davantage ce nombre, lorsque cela est possible, un même animal sera infecté avec deux souches différentes de la bactérie (chacune identifiable par une marque distinctive) afin de les comparer directement. Cette méthode divise par conséquent le nombre global d'animaux requis. Concernant la réutilisation, elle s'avère impossible dans le cadre de cette recherche. En effet, la compréhension des mécanismes exige l'examen des organes internes après la phase d'infection, afin d'analyser la propagation de la bactérie et les tissus affectés. Cette analyse post-mortem rend toute réutilisation ultérieure exclue.

Raffinement

Les mesures de raffinement mises en œuvre visent à minimiser la souffrance et à garantir les meilleures conditions de vie possible aux animaux tout au long de l’étude. D’un point de vue hébergement, les animaux vivent en groupe dans des cages équipées d’une litière adaptée, de matériaux permettant la nidification, d’un abri de type igloo, et d’un morceau de bois pour rongeage. Pour éviter l’isolement, si un seul individu mâle d’une portée présente les caractéristiques génétiques étudiées, un second mâle est conservé à ses côtés. Une surveillance étroite sera mise en œuvre, pour détecter les premiers signes de déshydratation, notamment une perte de poids supérieure à 10% ou l’aspect ridé de la peau. Dans ce cas, les animaux reçoivent des injections de sérum physiologique sous la peau et bénéficient d’une eau présentée sous forme gélifiée, plus facile à consommer pour favoriser la récupération. Des chaufferettes seront utilisées pour réchauffer la cage si besoin. Des points limites précis sont définis pour agir au plus vite et limiter le mal-être. Dès qu’un animal présente de signes visibles de souffrance, une maigreur correspondant à une perte de poids supérieure à 20%, ou des troubles moteurs comme une paralysie partielle révélant une atteinte du système nerveux, il est immédiatement mis à mort pour mettre fin à toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin est choisi pour sa proximité physiologique avec l'organisme humain et la possibilité de le modifier génétiquement. Toutefois, les souris sauvages résistent à l'infection car la bactérie ne parvient pas à traverser leur barrière intestinale comme chez l'homme, en raison d’une spécificité d’espèce. Pour étudier l'infection après ingestion, des souris génétiquement modifiées seront utilisées, permettant à la bactérie de traverser l'intestin de façon comparable à ce qui se passe chez les humains. Pour étudier la dissémination dans l'organisme indépendamment de la barrière intestinale, des souris non modifiées suffisent. Diverses lignées aux caractéristiques génétiques variées permettent d'analyser précisément les réponses de l'organisme face à l'infection. L'utilisation de ces différentes souris permet de modéliser fidèlement les différentes étapes de la maladie humaine tout en respectant les spécificités biologiques de l'espèce. Les animaux seront utilisés à deux stades différents de leur vie. 1) Des adultes, âgés de 3 à 5 mois, présentant un système de défense naturel complètement mature permettant d'étudier la réponse normale de l'organisme face à l'infection. 2) Des animaux âgés de plus de vingt mois, présentant une sensibilité accrue à l'infection, ce qui reflète la vulnérabilité particulière des personnes âgées et permet ainsi d'étudier les mécanismes liés au vieillissement qui favorisent la maladie.

820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris rendues "dépressives" par de la corticostérone dans leur eau de boisson reçoivent des agonistes du récepteur 5-HT2A, hallucinogènes ou non, puis passent quatre tests en onze à seize jours, parmi la nage forcée de six minutes, l'alimentation inhibée par la nouveauté, la préférence pour l'eau sucrée, le splash test et l'open field. 195 d'entre elles subissent une trépanation sous anesthésie pour l'implantation de deux sondes de microdialyse dans le cortex préfrontal, et le porteur juge la douleur modérée parce que le cerveau serait "dépourvu de fibres nociceptives". Les bénéfices annoncés se résument à une "avancée supplémentaire" vers des antidépresseurs à action rapide. Il indique que les cages resteront sans enrichissement, sans dire pourquoi.

Objectifs

Depuis peu les psychédéliques ont démontré un effet antidépressif rapide. Notre projet vise donc à étudier les effets antidépresseurs rapides de ces molécules qui ciblent des récepteurs particuliers de la sérotonine : le récepteur 5-HT2A. Ces effets seront aussi étudiés au travers des neurotransmissions (libérations de neurotransmetteurs par les neurones) dans une région cérébrale impliquée dans l'effet antidépresseur des molécules déjà commercialisées ; le cortex médian préfrontal. Il est donc important de comprendre comment ces molécules affectent le fonctionnement des différents types de neurones du cortex. La meilleur compréhension des mécanismes d'action de ces molécules est une étape clé dans le développement de nouvelles prises en charge de la dépression notamment chez des patients résistants ou suicidaires.

Bénéfices attendus

La mise en évidence des mécanismes sous-jacents aux effets antidépresseurs des agonistes des 5-HT2AR hallucinogènes et non hallucinogènes seront une avancée supplémentaire dans le développement d'antidépresseurs non monoaminergiques à action rapide.

Procédures

En comportement : administration d'agonistes ou d'antagoniste 5-HT2AR ou de saline pour chaque souris. Chaque souris sera testée en comportement pour évaluer l'effet anxiolytique et antidépresseur des agonistes 5-HT2AR. En neurochimie: anesthésie de la souris, chirurgie stéréotaxique pour implanter deux sondes de microdialyse, administration d'agonistes ou d'antagonistes 5-HT2AR ou de saline pour chaque souris: 24h après, collecte des dialysats du cortex médian préfrontal toutes les 30 minutes pendant 3 heures, soit 6 dialysats/souris. Expérience 1 : nombre n=300, toutes les souris seront soumis à une batterie de tests comportementaux ; 4 tests en 16 jours : novelty suppressed feeding test dure 5 minute - SPT : les animaux sont soumis à un choix dans leur cage d'hébergement : soit un biberon d'eau, soit un biberon d'eau sucrée. La consommation de chaque boisson est ensuite enregistrée. - FST : dure 6 minutes - Open field : dure 10 minutes. Expérience 2 : nombre n=325, toutes les souris seront soumis à une batterie de tests comportementaux ; 4 test en 11 jours : Open field qui dure 10 minutes - novelty suppressed feeding test dure 5 minute - Splash test dure 5 minutes - FST : dure 6 minutes. Expérience 3 : implantation stéréotaxique de 2 sondes de microdialyse : une intervention par souris, durée 24h/souris ; nombre n=195

Impact sur les animaux

Les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour l'implantation intracérébrale de sonde qui inclue le positionnement sur le cadre stéréotaxique, la trépanation osseuse et l’incision du scalp, l'animal est sous anesthésie. Le cerveau étant dépourvu de fibres nociceptives, le niveau de douleur pour ces implantations intracérébrales est modéré.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour analyse post-mortem

Remplacement

Les expériences in vitro et in vivo sont complémentaires et ne s'excluent pas l'une l'autre. À ce jour, il n'est possible ni de modéliser les troubles de l'humeur, ni de modéliser les effets de molécules sur de tels troubles in vitro ou in silico — les mécanismes sous-jacents sont trop complexes pour cela. Il est donc nécessaire de recourir à l'expérimentation animale dans une telle situation.

Réduction

Le calcul de puissance effectué pour les expériences de comportement a été réalisé avec un logiciel statistique. Ceci indique 22 animaux par groupe ; nombre qui est augmenté à 25 pour pallier les aléas expérimentaux. Pour les expériences de microdialyse, un calcul de puissance a aussi été effectué grâce à un logiciel statistique. Ceci indique 14 animaux par groupe ; nombre qui est augmenté à 15 pour pallier les aléas expérimentaux.

Raffinement

Un anesthésique est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux. Cependant, pour prévenir des douleurs induites par la chirurgie crânienne, un traitement anti-inflammatoire sera entrepris le jour de la chirurgie. Un suivi quotidien sera assuré et l'état de prostration des animaux sera évalué. Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Les points limites définis dans les différentes procédures expérimentales seront strictement appliqués. L’enrichissement dans les cages ne peut être utilisé mais la durée des procédures est limitée.

Choix des espèces

L'animal, dans son entité, est la seule alternative à l'étude des troubles de l'humeur et de leurs mécanismes de part l'implication de nombreuses populations neuronales différentes interconnectées entre elles. Le modèle de rongeur rendues dépressives par l'application chronique de corticostérone dans l'eau de boisson (modèle CORT) a été développé et validé au sein du laboratoire chez la souris. Les animaux seront adultes et âgés de 8 à 10 semaines au moment de débuter le CDM. Les animaux seront adultes et âgés de 8 à 10 semaines au moment de débuter le traitement à la corticosterone. Ainsi la chirurgie sera menées sur les animaux agés de 16 à 18 semaines.

280 souris femelles immunodéficientes et sans poils vont être utilisées, chacune subissant une greffe de cellules tumorales sous la peau, environ huit injections de traitement, cinq à six prises de sang et une quinzaine de mesures de sa tumeur en cinq semaines. Dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la croissance de la tumeur peut causer gêne, perte de poids et fatigue, et toutes les souris sont tuées vers la cinquième semaine, ou plus tôt si la tumeur devient trop grosse, après une dernière prise de sang sous anesthésie profonde. Les anticorps testés visent CD146, une molécule d'adhésion, dans des cancers du cerveau, du pancréas et du sein, avec des retombées que le porteur renvoie au "plus long terme". Il justifie le choix de ces souris par un taux de réussite des greffes supérieur à 90 %, et retient uniquement des femelles, au motif qu'elles reproduisent mieux la croissance tumorale observée chez les patientes.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester de nouveaux traitements qui pourraient freiner la croissance de certains cancers très agressifs, en particulier un cancer du cerveau, un cancer du pancréas et un cancer du sein qui évoluent rapidement et dont le pronostic reste très mauvais. L'étude permettra aussi de vérifier si ces traitements atteignent bien la tumeur, notamment lorsqu'elle est située dans le cerveau, et d'évaluer s'ils agissent réellement sur la maladie. Les résultats obtenus aideront à mieux comprendre comment ces traitements se comportent dans l'organisme et à identifier des signes biologiques pouvant indiquer s'ils sont efficaces ou non.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d'identifier de nouveaux traitements plus efficaces contre des cancers graves, en particulier le cancer du cerveau, le cancer du pancréas et le cancer du sein, pour lesquels les options actuelles restent limitées. À court terme, il apportera de nouvelles connaissances sur l'efficacité de ces traitements et sur leur capacité à atteindre la tumeur. À plus long terme, ces résultats pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées et mieux adaptées aux patients, avec l'objectif d'améliorer la prise en charge de maladies aujourd'hui de très mauvais pronostic.

Procédures

Les animaux subiront un ensemble d'interventions précisément définies, réalisées par du personnel formé, afin de limiter au maximum l'inconfort et la douleur : ● Une injection unique de cellules tumorales sous la peau, réalisée sous anesthésie, en moins de 10 secondes. ● Des prises de sang répétées : une avant l'injection des cellules tumorales (référence), puis une par semaine pendant environ 4 à 5 semaines (soit 5 à 6 prélèvements au total par animal), chacune durant moins d'une minute, réalisées sous brève contention. ● Des injections du traitement à tester : deux fois par semaine pendant environ 4 semaines (soit environ 8 injections par animal), chacune durant moins de 30 secondes ● Des mesures de la taille de la tumeur, sans anesthésie : deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude (soit une quinzaine de mesures par animal), chacune durant quelques secondes. ● Éventuellement, un à deux examens d'imagerie non invasive sous anesthésie, d'une durée de 5 à 10 minutes chacun. ● Un dernier prélèvement de sang, réalisé sous anesthésie profonde, juste avant la mise à mort de l'animal en fin d'étude (au bout d'environ 5 semaines, ou plus tôt si un critère de bien-être l'impose).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement liées à l'injection des cellules tumorales sous la peau, à la croissance progressive de la tumeur, aux injections répétées de traitement, et aux prises de sang. L'injection des cellules tumorales, réalisée sous anesthésie, peut entraîner un stress modéré lié à une brève contention (moins de 5 minutes) et une douleur locale faible, comparable à une piqûre, ainsi qu'un gonflement local qui se résorbe en 2 à 3 jours. La croissance progressive de la tumeur (sur 3 à 6 semaines) peut s'accompagner d'une gêne locale liée à la pression exercée par la tumeur, d'une perte de poids progressive, et de signes de fatigue ou de diminution d'activité chez l'animal. Les injections répétées de traitement entraînent un stress léger lié à une contention brève (30 secondes) et une douleur locale très faible, qui disparaît en moins de 24 heures. Les prises de sang entraînent un stress bref et une douleur très faible. Un suivi quotidien de l'état de chaque animal (poids, comportement, aspect général) est réalisé tout au long de l'étude, avec des critères d'arrêt précoces stricts permettant d'interrompre l'étude dès l'apparition de signes de souffrance.

Devenir

À la fin de l'étude prévue (au bout d'environ 5 semaines), les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire, réalisée sous anesthésie profonde de façon à exclure toute douleur. Cette euthanasie est nécessaire pour prélever les tumeurs et les tissus, afin d'analyser si les traitements testés ont été efficaces. Les souris ne sont pas réutilisées ni remises en liberté, car elles font l'objet d'un prélèvement de tissus au moment de leur euthanasie.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé des tests en laboratoire sur des cellules et des modèles simplifiés qui nous ont permis de choisir les meilleurs traitements à tester. Ces essais nous ont montré que les traitements peuvent ralentir la croissance des cellules cancéreuses et réduire la formation de nouveaux vaisseaux sanguins qui alimentent la tumeur. Cependant, ces modèles artificiels ne reproduisent pas la complexité d'un vrai organisme avec ses vaisseaux sanguins, son système immunitaire et ses multiples interactions. Seule l'utilisation d'animaux permet de vérifier si les traitements atteignent bien la tumeur dans le corps entier, s'ils sont bien tolérés et s'ils fonctionnent réellement contre le cancer.

Réduction

Nous avons calculé précisément le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables en utilisant des méthodes statistiques adaptées. Des tests préliminaires nous ont permis de choisir les meilleures doses et les meilleurs traitements à tester. Nous utilisons uniquement des femelles car elles reproduisent mieux la croissance des tumeurs observée chez les patientes humaines, évitant ainsi les différences naturelles entre mâles et femelles. Un suivi très régulier sans intervention lourde (mesures de poids et taille de tumeur) et des critères d’arrêt très stricts dès les premiers signes d’inconfort permettent d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats scientifiques solides.

Raffinement

Toutes les manipulations sont réalisées sous anesthésie gazeuse, avec des calmants (analgésiques) donnés de façon préventive avant les gestes pouvant être douloureux. Les animaux sont surveillés chaque jour (poids, comportement, aspect de la tumeur) par du personnel spécialement formé, à l'aide d'une grille d'évaluation clinique. Dès qu'un animal montre des signes d'inconfort (perte de poids, diminution d'activité, posture anormale), il reçoit un calmant supplémentaire et fait l'objet d'une surveillance renforcée ; si ces signes persistent ou s'aggravent, ou si la tumeur devient trop grosse, l'animal est euthanasié de façon anticipée, avant la fin prévue de l'étude, pour lui éviter toute souffrance inutile. Leur cage est aménagée avec des jouets, des nids et des cachettes pour qu'ils se sentent bien.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris immunodéficientes sans poils, un modèle largement utilisé pour étudier des tumeurs humaines, y compris des cancers du cerveau, du pancréas et du sein, car il accepte très bien les greffes de cellules cancéreuses, avec un taux de réussite supérieur à 90 %. Contrairement à d'autres modèles (rat ou poisson-zèbre), il reproduit fidèlement le comportement des tumeurs humaines, y compris les vaisseaux sanguins qui les alimentent et certaines cellules immunitaires, ce qui permet de tester nos anticorps dans des conditions proches de la réalité clinique. Nous choisissons des femelles âgées de 6 à 8 semaines (22 à 26 g), un âge jeune adulte qui donne une croissance tumorale rapide et homogène, permettant de comparer plus fiablement les différents traitements testés tout en limitant le nombre d'animaux nécessaires.

Le projet trie 16 souches de micro-organismes inactivés en vue de futurs compléments alimentaires, après que deux premières souches ont été écartées faute de pouvoir être "valorisées industriellement". 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever intestin, pancréas, foie et muscle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime riche en graisses pour induire un prédiabète, elles subissent un gavage quotidien pendant dix semaines, soit environ 70 contentions chacune, trois tests de tolérance au glucose, trois injections d'insuline, six prises de sang et deux jeûnes de quatre à six heures. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable", faute de modèle cellulaire reproduisant les échanges entre organes qui règlent la glycémie.

Objectifs

CL’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de 16 souches microbiennes inactivées par traitement thermique pour améliorer la régulation de la glycémie dans un contexte de prédiabète. Des résultats préliminaires obtenus ont montré que deux souches de bactéries inoffensives inactivées par la chaleur permettaient de réduire le taux de sucre dans le sang dans un modèle de prédiabète chez la souris. Néanmoins, celles-ci ne peuvent être valorisées industriellement ni être utilisées pour des études cliniques futures par leur manque de traçabilité. Le prédiabète sera induit par un régime riche en graisses et est défini par une intolérance au glucose lors d’un test oral de tolérance au glucose. Le projet vise à analyser, parmi 16 nouvelles souches microbiennes naturellement présentes chez l’être humain, celles qui présentent le meilleur potentiel pour améliorer la régulation de la glycémie. Leur efficacité sera évaluée à partir de mesures de la glycémie (taux de sucre dans le sang à jeun) et du dosage de molécules impliquées dans sa régulation, notamment l’insuline. Des analyses seront également réalisées sur l’intestin, le foie, le pancréas et le muscle afin de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces souches. Enfin, des prélèvements de fèces permettront d’étudier leur impact sur la composition du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

L’objectif final de ce projet est de confirmer à l'aide d’études précliniques, le potentiel de nouvelles souches microbiennes améliorant la régulation de la glycémie dans un contexte de prédiabète. A terme, ce travail vise à identifier des candidats susceptibles de prévenir ou retarder l’apparition du diabète de type 2 et de contribuer au développement de futurs compléments alimentaires destinés à l’Humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à des contentions brèves répétées pour les gavages quotidiens durant quelques secondes pendant les 10 semaines d’expérimentation, soit environ 70 contentions par animal. Ils seront également soumis à 3 tests de tolérance au glucose (OGTT) par voie orale et 3 tests de tolérance à l’insuline (ITT) par voie intrapéritonéale, espacés de 3 semaines. Chaque ITT nécessitera une injection intrapéritonéale d’insuline par animal. Ces tests comprendront au total 6 prélèvements sanguins par animal, réalisés sur animal vigile, d’une durée de quelques secondes chacun (10 à 15 secondes). Des prélèvements de fèces seront réalisés une fois par semaine pendant les 10 semaines, soit 10 collectes par animal, sans manipulation invasive. Ces manipulations, ainsi que les prélèvements sanguins et les injections, sont susceptibles d’occasionner un stress et une douleur ou gêne transitoire. Les prélèvements de fèces, réalisés sans manipulation invasive, ne sont pas considérés comme douloureux. Ces contraintes seront limitées par les mesures de raffinement décrites dans le protocole.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress de courte durée lors des manipulations nécessaires aux gavages, aux prélèvements et aux injections, les contentions ne dépassant pas 20 secondes. Les prélèvements et les injections pourront provoquer une douleur légère et de courte durée. Les souris seront soumises à deux périodes de jeûne de courte durée (4 ou 6 heures) nécessaires à la réalisation des tests. Ces périodes entraînent une diminution modérée de la glycémie. La prise de poids liée au régime riche en graisses ainsi que ces périodes de jeûne pourront entraîner un stress faible à modéré. Les résultats préliminaires obtenus au laboratoire montrent que les traitements administrés par gavage n’entraînent pas de perte de poids corporel ni d’effet indésirable sur l’état général des animaux. Les prélèvements de fèces selon une méthode non invasive et ne sont pas susceptibles d’entraîner de douleur. Ils peuvent néanmoins occasionner un stress transitoire lié, le cas échéant, au transfert de l’animal dans un contenant individuel et à la récupération des fèces. Cette contrainte sera minimisée par une manipulation rapide, douce et adaptée de l’animal.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, l’ensemble des animaux sera euthanasié afin de permettre le prélèvement des organes et tissus nécessaires (intestin, pancréas, foie et muscle) et la réalisation des analyses prévues dans le cadre du projet de recherche.

Remplacement

A ce jour, il existe aucun modèle cellulaire in vitro et ex vivo permettant de reproduire de manière intégrée les interactions complexes entre les différents organes impliqués dans le maintien du taux de sucre dans le sang. Les mécanismes étudiés reposent sur des interactions dynamiques entre l’intestin, le pancréas, le foie et le muscle, ainsi que sur des régulations hormonales et physiologiques qui ne peuvent être reproduites de manière fiable en dehors d’un organisme entier. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour évaluer l’efficacité des traitements étudiés dans des conditions proches de la réalité biologique. Il permettra de mesurer différents paramètres, tels que le poids corporel, la consommation alimentaire, la glycémie, la sécrétion d'insuline, ainsi que les effets des traitements sur les tissus intestinaux et les organes impliqués dans la régulation de la glycémie, notamment le pancréas, le foie et les muscles. L'utilisation d'animaux est ainsi nécessaire pour évaluer la réponse globale de l'organisme et déterminer si les traitements testés sont capables d'améliorer les troubles métaboliques associés au prédiabète.

Réduction

Chaque groupe expérimental comprendra 12 souris (réparties de manière équilibrée entre les deux sexes), afin de prendre en compte une éventuelle influence du sexe sur les résultats. Cet effectif a été déterminé à parti des études précédentes et de la variabilité observée pour les paramètres étudiés. Les analyses statistiques montrent que 12 souris par groupe sont nécessaires pour mettre en évidence une différence entre les groupes avec une probabilité suffisante. Cet effectif correspond ainsi au nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et répondre aux objectifs scientifiques. Il permet de respecter le principe de réduction (3R), en limitant le nombre d'animaux utilisés sans compromettre la robustesse des résultats.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu de vie avec des bouts de tissus, papier kraft à déchiqueter pour construire leur nid et des bûchettes de bois à grignoter. Afin de limiter leur stress, ils seront habitués à la salle d’expérimentation avant le début des manipulations et resteront dans leur cage d’élevage avec leurs congénères. Leur état général sera surveillé visuellement et leur poids sera mesuré une fois par semaine. Des points limites seront définis et appliqués afin de détecter rapidement toute dégradation de leur état général et d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour étudier les troubles métaboliques liés à une alimentation riche en graisse, car sa physiologie est bien connue et les modifications métaboliques observées sont reproductibles. Ce modèle est particulièrement adapté pour évaluer l’efficacité des traitements visant à améliorer les perturbations de la régulation de la glycémie associées au prédiabète, qui constitue un facteur de risque de développer un diabète de type 2. Ce projet s’inscrit dans la continuité des travaux menés avec ce modèle, permettant de comparer les résultats obtenus aux données déjà disponibles. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes âgés de 8 à 12 semaines, dont le métabolisme est mature et peu influencé par les effets du vieillissement. Cet âge est adapté aux modèles de prédiabète induits par un régime riche en graisses et permet d’utiliser des animaux présentant un microbiote intestinal stabilisé.

Des souris anesthésiées subissent une chirurgie de vingt minutes qui crée un défaut dans un os, puis l'implantation d'un biomatériau, avec un risque d'infection, de retard de cicatrisation ou d'ouverture de la plaie. 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever et analyser l'os, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet évalue de nouveaux implants destinés à réduire, à long terme, le recours aux greffes osseuses chez l'humain. Le porteur ne précise ni l'os opéré, ni la taille du défaut, ni le délai avant la mise à mort, et justifie en une phrase l'absence de méthode de remplacement par la "complexité de l'environnement osseux".

Objectifs

Les pathologies et traumatismes osseux constituent un enjeu majeur de santé publique, notamment en chirurgie orale, parodontale et traumatologique, où les pertes osseuses nécessitent des solutions thérapeutiques efficaces. Les techniques actuelles présentent certaines limites, ce qui a conduit au développement de nouvelles approches en ingénierie tissulaire. Dans ce contexte, l’objectif principal de ce projet est d’optimiser la régénération osseuse par le développement de biomatériaux innovants permettant une régénération osseuse optimale. Plus précisément, ce projet vise à évaluer, dans un modèle préclinique, les performances d’implants en termes de biocompatibilité, de toxicité et d’efficacité sur la régénération osseuse. L’étude in vivo permettra d’analyser la capacité de ces biomatériaux à favoriser la cicatrisation et la néoformation osseuse, ainsi que la cinétique de régénération des tissus osseux. À terme, ce projet a pour finalité de développer de nouveaux implants osseux plus performants, capables d’améliorer la prise en charge des pertes osseuses et de réduire le recours aux greffes osseuses traditionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer et évaluer un biomatériau innovant destiné à améliorer la régénération osseuse. À court et moyen terme, cette étude permettra d’améliorer les connaissances scientifiques sur les mécanismes de cicatrisation osseuse et sur le comportement in vivo de ces biomatériaux. Les résultats permettront notamment d’évaluer la tolérance du biomatériau par les tissus vivants, sa capacité à favoriser la formation de nouvel os, ainsi que sa résorption progressive et son intégration dans l’organisme. Ces données sont indispensables avant toute application chez l’Homme. Ce projet permettra également d’améliorer les méthodes d’évaluation de la régénération osseuse grâce à l’utilisation de techniques d’imagerie tridimensionnelle et d’analyses histologiques, contribuant ainsi à faire progresser la recherche dans le domaine de l’ingénierie tissulaire osseuse. À long terme, les résultats de ce projet pourraient contribuer au développement de nouveaux substituts osseux plus efficaces et plus sûrs pour les patients présentant des pertes osseuses liées à des traumatismes, des maladies parodontales, des tumeurs ou des malformations. À plus long terme, le développement de biomatériaux innovants pourrait permettre de réduire le recours aux greffes osseuses autologues, qui nécessitent des prélèvements chez le patient et peuvent entraîner des complications ou des douleurs supplémentaires. Ce projet pourrait ainsi contribuer à améliorer la prise en charge des patients, à réduire la durée des traitements et à améliorer leur qualité de vie. Enfin, ce projet contribuera au progrès des connaissances en biomatériaux, en médecine régénérative et en chirurgie osseuse, avec des retombées potentielles importantes pour la santé humaine.

Procédures

Une chirurgie de 20 minutes sera réalisée sur des souris anesthésiées.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce protocole sont principalement liées à l’intervention chirurgicale nécessaire à la création du défaut osseux et à l’implantation du biomatériau. L’animal subira une anesthésie générale, ainsi qu’une chirurgie, ce qui peut entraîner une douleur post-opératoire modérée, un inconfort temporaire, ainsi qu’un risque de complications chirurgicales telles qu’une infection, une inflammation locale, un retard de cicatrisation ou une ouverture de la plaie. Une perte de poids transitoire, une diminution de l’activité ou un isolement peuvent également être observés dans les jours suivant la chirurgie. Les anesthésies et les manipulations peuvent également entraîner un stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyse du tissu osseux.

Remplacement

Malgré des études in vitro approfondies ayant validé l’intérêt des implants, le recours à des modèles in vivo demeure nécessaire en raison de la complexité de l’environnement osseux.

Réduction

Limitation du nombre d’animaux grâce à une approche statistique rigoureuse et à l’utilisation de modèles standardisés, ainsi que grâce à une approche en design apparié.

Raffinement

Prise en compte du bien-être animal. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale, complétée par une anesthésie locale et une analgésie pré- et postopératoire afin de limiter la douleur. Une surveillance postopératoire sera assurée par une visite clinique et une pesée quotidiennes. Un tapis chauffant sera utilisé pendant la chirurgie. Une injection de NaCl à 0,9 % sera réalisée en fin de chirurgie afin de réhydrater les animaux. De l’eau et des croquettes seront mises à disposition dans la cage afin de faciliter leur alimentation et leur récupération. En cas de difficulté d’alimentation ou d’hydratation, des mesures compensatoires adaptées seront mises en place. Des points limites ont été définis afin de prévenir toute souffrance excessive et de permettre une intervention rapide si l’état de l’animal le nécessite. Avant le début de l’expérimentation, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de deux semaines. La première semaine permettra aux animaux de s’adapter à leur nouvel environnement sans manipulation. La deuxième semaine sera consacrée à une habituation progressive aux manipulations, afin de limiter le stress lors des procédures expérimentales.

Choix des espèces

L’étude de la régénération en site osseux chez la souris est un modèle validé et utilisé très largement dans notre domaine. Des études similaires nous ont déjà permis de tester et de valider certains biomatériaux d’intérêt thérapeutique pour la régénération osseuse. Nous utiliserons des souris adultes entre 12 et 40 semaines afin de se rapprocher au maximum des conditions cliniques chez un patient adulte non âgé.