Procédures modérées

2 120 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune pouvant recevoir le traitement jusqu'à sept fois par semaine et passer deux séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau ou dans la prostate, des mesures répétées de la tumeur au pied à coulisse, un prélèvement de sang par semaine à la veine mandibulaire, puis une chirurgie de retrait de la tumeur. Toutes sont tuées pour que les tumeurs et les organes voisins soient prélevés. Le porteur indique que ses molécules ont déjà montré leur efficacité et leur spécificité sur des cellules, et renvoie au conditionnel la stratégie thérapeutique qui serait un jour proposée aux patients, alors que les greffes et les gestes répétés sont, eux, programmés.

Objectifs

Le traitement du cancer par chimiothérapie cible avant tout les cellules à renouvellement rapide dont les cellules cancéreuses mais pas que. Cette absence de sélectivité engendre des effets secondaires importants avec une une toxicité adjacente pour les tissus sains. Les autres traitements tels que les rayons peuvent également toucher les tissus sains autour de la tumeur et l'immunothérapie est un traitement lourd avec des effets secondaires qui altère l'état général car il y a nécessité de stimuler le système immunitaire. Au sein de notre laboratoire, nous avons développé des molécules thérapeutiques anti-cancéreuses dont l’efficacité et la spécificité ont été démontrées. L’innocuité du traitement chez la souris a été vérifié. Nous planifions d’utiliser des modèles tumoraux tels que 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d’oncologie pré-clinique) 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopiques (c’est-à-dire l’organe duquel les cellules tumorales sont issues) comme la prostate. Ces modèles permettront d'évaluer l’efficacité de molécules présentant des propriétés anticancéreuses. 

Bénéfices attendus

Ces molécules thérapeutiques ont déjà montré leur efficacité et leur spécificité sur des cellules Pour valider ces résultats, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans un environnement en 3 dimensions complexe et multicellulaire, idéalement dans leur organe d’origine. C’est pour cela que nous allons réaliser des greffes de cellules cancéreuses humaines qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d’origine. En validant ces résultats chez la souris, nous pourrons à terme proposer une stratégie thérapeutique anti-cancéreuse aux patients qui ciblera spécifiquement la tumeur et aboliera la formation de métastases.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés pour les procédures suivantes : - une implantation de cellules tumorales sous-cutanée (

Impact sur les animaux

La répététion des gestes techniques peuvent creer des nuisances chez les animaux . Pour limiter ces effets nous regroupons au maximum ces gestes pendant les séances d'imagerie où les animaux sont sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à l’injection des cellule tumorales sous cutanée avec une aiguille de très faible diamètre. Cette injection dure très peu de temps et n’aura lieu qu’une fois et sur des animaux endormis évitant leur douleur et stress. Par la suite, les gestes techniques : acquisition d’image , mesure du volume de la tumeur avec un pied à coulisse , retrait de la tumeur, prélevement d’un petit volume de sang à la joue auront également lieu sur animaux endormi pour éviter du stress supplémentaire. Une injection de d'une molécule permettant de visualiser la bioluminescence sera réalisée par voie intra péritonéale avec une aiguille de très faible diamètre d’un petit volume adapté qui nécessite quelques secondes de contention indolore. Des nuisances plus importantes peuvent être attendues dans la procédure de la greffe prostatique telles que des difficultés pour les animaux à se redresser completement sur les pattes arrières ou une gène liée à la chirurgie les heures suivantes. Pour limiter et éviter toute douleur et stress liée à la chirugie ou le retrait de la tumeur, les animaux seront sous anti douleur et l’accès à l’eau et la nourriture sera facilitée les heures suivant l'opération. Les animaux peuvent se défaire un point de suture ou la plaie peut ne pas bien cicatriser auquel cas l’expérimentateur refera immédiatement le point et desinfectera la plaie sous anesthésie. Par la suite, le développement de la tumeur peut générer une gène ainsi qu'une baisse de l'état général qui sera au maximum anticipé par l'expérimentateur. L’évolution de la taille de la tumeur sera donc surveillée 2 fois par semaine, sur animaux endormis, par le système d’imagerie in vivo (IVIS) non invasif qui detecte la luminescence de la tumeur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs seront prélevés juste après l'euthanasie.

Remplacement

Les molécules thérapeutiques ont été caractérisées in vitro avec la même lignée cellulaire utilisée chez la souris. Cependant le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi cellulaire d’une tumeur avec son micro environnement multicellulaire complet. Les études réalisées in cellulo ne permettent pas de conserver et reconstituer le microenvironnement exhaustif des tumeurs et reproduire sa constitution globale, son évolution spatio-temporelle tels qu’ils ont lieu in vivo dans un organisme entier. En effet nous ne pouvons pas in vitro (ni dans les organoïdes, ni dans une flasque de culture) reconstituer tout le micro environnement sécrétoire, le stroma, le système immunitaire et l’endothélium autour des celles tumorales en 3 dimensions qui reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation, nous avons réalisé une étude approfondie de la littérature actuelle concernant les modèles de greffe qu’on utilise pour ne pas reproduire des résultats d’expérience déjà réalisés. Grâce au système d’imagerie in vivo, il est possible de suivre longitudinalement et de manière non invasive les tumeurs bioluminescentes qui se développent au sein des animaux sans nécessiter d’euthanasie. Nous construisons également nos manips pour extraire un maximum d’informations par animal pour éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Un projet pilote est également inclus pour calibrer le protocole et réduire le nombre des animaux nécessaire pour qualifier l’efficacité de la nouvelle molécule.

Raffinement

Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations de la directive 2010/63 EU. Du papier absorbant, du sizzle (lanières de papier kraft), des tunnels seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. Les animaux étant immunodéficients, le statut sanitaire sera strictement contrôlé, l’expérimentateur portera systématiques les EPI adaptés et les animaux seront manipulés sous un poste à sécurité microbiologique. Notre équipe à une expérience solide (>20 ans) dans l’expérimentation animale avec une formation continue des expérimentateurs pour être en cohérence avec les pratiques éthiques les plus récentes et approprié à nos modèles. Cela permet un suivi, une évaluation et une anticipationau plus juste de la souffrance animale. Les expérimentations ont été réfléchie de sorte que la majorité des gestes techniques qui peuvent générer du stress soient réalisées sur animaux endormis. La préhension se fera de cette façon : l’animal sera dirigé doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de le poser sur une grille et d’effectuer la contention de l’animal. Les personnes qui réaliseront la chirurgie possède le diplôme de chirurgie et microchirurgie. Les chirurgies se feront en début de semaine afin de garantir le meilleur suivi des animaux les jours suivant l’opération. Les animaux sont posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie et nous recouvrirons leurs yeux par du gel oculaire afin d’éviter le dessèchement. Les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée par l’expérimentateur. De l’analgésique sera administré aux souris avant et après l’opération pour éviter toute douleur. En complément du tapis chauffant, les animaux seront délicatement déposés entre deux chaufferettes préalablement réglées à 37°C. Les animaux sont remis dans leur cage sur du coton afin d’améliorer leur confort. Des granulés alimentaires déposés dans la cage afin d’éviter le redressement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques. Des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont un excellent modèle d’étude selon plusieurs critères : -La littérature scientifique définit le modèle murin comme pertinent pour étudier le développement tumoral en particulier pour une greffe avec cette lignée cellulaire. -La souche utilisée est immunodeficiente pour limiter le rejet de la greffe. -Leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet . En effet nous nous intéressons à la pathologie du cancer de la prostate chez l’adulte humain. Les souris utilisées dans nos expériences devront avoir atteint un âge considéré comme adulte (après la maturité sexuelle à 6 semaines).

Comprendre comment des zones profondes du cerveau commandent le mouvement et la décision : six macaques rhésus sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur cinq ans. Chacun subit jusqu'à six chirurgies de six heures pour poser des implants crâniens, jusqu'à dix séances d'IRM de quatre heures sous anesthésie, et des sessions quotidiennes allant jusqu'à cinq heures pendant lesquelles de fines électrodes sont insérées dans son cerveau. Le porteur maintient les animaux sous contrôle alimentaire pour "maximiser" leur motivation, et décrit cet accès restreint à la nourriture comme un "levier motivationnel". Deux macaques seront tués pour analyse du cerveau, les quatre autres passant à un projet suivant ou, si leur état le permet, placés en sanctuaire.

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment certaines zones profondes de notre cerveau nous permettent de contrôler nos mouvements et de prendre des décisions. Pour comprendre leur rôle exact, nous réaliserons des enregistrements et des stimulations au niveau du cerveau chez le singe macaque, dont le cerveau est très proche du nôtre. L’objectif sera de corréler ces enregistrements et stimulations avec le comportement de l'animal afin de comprendre le lien de cause à effet entre l'activité des neurones des zones étudiées et les actions. Mieux comprendre le fonctionnement normal de ces circuits est une étape essentielle avant de pouvoir comprendre ce qui ne va pas dans certaines maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera surtout des connaissances nouvelles et fondamentales sur le fonctionnement normal de notre cerveau. À court terme il pourrait permettre d’avoir une image beaucoup plus précise du rôle exact joué par une zone spécifique du cerveau dans le contrôle de nos actions et décisions. Il pourrait ainsi être possible de dire comment ces zones spécifiques contribuent à préparer, choisir, démarrer ou exécuter un mouvement. Obtenir ces informations détaillées chez le singe est très important car son cerveau ressemble beaucoup au nôtre et pourrait donc fournir des données cruciales pour l’identification des dysfonctionnements observés dans certaines pathologiques neurologiques. En effet, à plus long terme ce projet contribuera à obtenir une meilleure compréhension de la manière dont ces circuits fonctionnent normalement, ceci constituera la première étape indispensable pour ensuite comprendre pourquoi ils dysfonctionnent dans certaines maladies du cerveau qui affectent les mouvements ou les décisions (comme la maladie de Parkinson, les troubles obsessionnels compulsifs, les addictions...). Ces connaissances fondamentales pourraient, un jour, aider à développer de nouvelles pistes pour des traitements ou à améliorer les thérapies existantes comme la stimulation cérébrale profonde.

Procédures

Les singes seront d'abord entraînés à réaliser des exercices d’interactions avec l’écran. Ces apprentissages peuvent prendre plusieurs mois et seront réalisés à raison de 1 à 5h par session, 5 sessions par semaine sur toute la durée du projet. L’animal est en contrôle alimentaire pendant la durée de ces sessions pour maximiser sa motivation et le nombre d’essai réalisé Une fois entrainés les animaux auront 2 chirurgies sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour mettre en place deux implants sur leur tête (6 heures maximum) avec 3 semaines de récupération minimum entre chaque chirurgie. Ces interventions pourront être renouvelées en cas de perte des implants et avec l’accord du vétérinaire (6 chirurgies au total maximum). Avant et après les chirurgies, ils auront une imagerie par résonance magnétique sous anesthésie générale, ces imageries seront répétées après les premiers enregistrements neurophysiologiques et chaque année pour vérifier l’intégrité des tissus et implants (4heures maximum par imagerie, 10 imageries maximum). Après la première chirurgie, pendant plusieurs mois, lors de sessions quotidiennes de quelques heures (5 jours par semaine maximum, 5h maximum par session), de fines électrodes seront insérées temporairement au niveau du cerveau pour mesurer l'activité des neurones pendant que l'animal vigile réalise les exercices. L’animal sera aussi sous contrôle alimentaire pour augmenter sa motivation. Son dispositif d’enregistrement sera nettoyé avant et après chaque séance (animal vigile, acte indolore, 15 minutes environ). Une dernière intervention sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera faite pour injecter un composé au niveau du cerveau nous permettant de modifier génétiquement certaines cellules nerveuses spécifiques (durée 6h maximum). Après cette chirurgie et un temps d'attente entre un et deux mois, des sessions similaires à l’enregistrement de l’activité des neurones auront lieu, mais cette fois une fibre optique sera insérée pour envoyer de la lumière dans le cerveau et activer ou inhiber les cellules nerveuses modifiées. Une partie des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem d’intérêt. Les autres animaux seront gardés en vie pour une utilisation continue ou pour être replacés dans un centre d’accueil.

Impact sur les animaux

L'entraînement aux tâches comportementales et le maintien de la tête au cours de ces tâches génèrera un stress et un inconfort pour l’animal pendant une durée propre à chaque animal (généralement inférieur à une semaine). L'accès contrôlé à la nourriture pourra créer une légère faim, un risque de perte ou de prise de poids et un stress pour l’animal. Les opérations chirurgicales comportent un risque de douleurs et d’inconfort post-opératoire. Les implants crâniens génèreront un inconfort, seront associés à un risque d’infection et un risque de perte suite à un rejet du matériel. L'injection dans le cerveau peut causer une petite inflammation locale. Les anesthésies générales nécessaires pour les chirurgies et les imageries génèreront un stress pour l’animal à l’induction et seront associées à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiorespiratoires. La stimulation par la fibre optique peut causer un échauffement local extrêmement léger et modifier temporairement le comportement de l'animal (c'est le but de l'étude), ces effets sont temporaires et limités à la durée de la stimulation, mais pourraient éventuellement être associés à un stress ou léger inconfort pour l’animal.

Devenir

Sur les 6 macaques, 2 seront euthanasiés à la fin du projet pour pouvoir analyser précisément leur cerveau afin de répondre à nos objectifs scientifiques. Pour les 4 autres animaux, soit nous les mettrons en utilisation continue dans un futur projet, soit nous chercherons activement à les replacer dans des structures d'accueil spécialisées (sanctuaires ou centres agréés) pour leur retraite, à condition que leur état de santé et leur comportement le permettent (après évaluation vétérinaire). Notre objectif étant de ne pas euthanasier les animaux quand ce n'est pas indispensable pour les vérifications scientifiques finales.

Remplacement

Pour comprendre comment des circuits précis du cerveau contrôlent nos actions et décisions, et pour tester si l'activité de ces circuits est bien la cause des comportements observés, il faut étudier le cerveau en fonctionnement dans un organisme entier. Les méthodes alternatives (cellules en culture, ordinateurs) ne peuvent pas reproduire cette complexité. L'enregistrement direct de l'activité des neurones (électrophysiologie) et leur manipulation ciblée (optogénétique) pendant que l'animal réalise une tâche nécessitent un animal vivant. Le singe est choisi car son cerveau est le plus similaire à celui de l'homme parmi les animaux de laboratoire, rendant les résultats plus pertinents. Les techniques d'imagerie chez l'homme ne sont pas assez précises pour répondre à nos questions. L'utilisation de singes est donc indispensable ici.

Réduction

Nous utiliserons un maximum de 6 singes sur 5 ans. Ce nombre est le minimum nécessaire pour étudier les deux zones cérébrales d’intérêt avec 3 animaux pour chaque zone, ce qui permet des analyses statistiques fiables. Chaque animal participera à toutes les étapes, ce qui maximise les informations obtenues par animal et réduit le nombre total nécessaire. Seuls 2 animaux sur 6 seront euthanasiés pour des analyses post-mortem nécessaires pour répondre à nos objectifs scientifiques, les 4 autres étant destinés à l’utilisation continue ou au replacement. Nous partagerons les tissus des animaux euthanasiés afin de participer à réduire de manière plus globale le nombre de macaques utilisés à des fins scientifique. Si nous obtenons des résultats clairs plus tôt, nous arrêterons le projet avec moins d'animaux.

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation de 2 semaines avant d’entrer en procédure. Ils auront ensuite un entrainement progressif adapté au rythme de chaque animal et réalisé par renforcement positif. Ainsi, l’animal recevra une récompense (nourriture) à chaque comportement attendu durant l’entrainement, pour renforcer la fréquence de ce comportement. Un écran tactile sera fourni en cage pour débuter l’entrainement de manière volontaire avant qu’ils ne soient amenés dans le box de travail. Afin d’obtenir un levier motivationnel pour les tâches plus complexes nous mettrons en place un contrôle de la distribution des aliments, nous suivrons de manière rigoureuse et quotidienne l’équivalent énergétique fourni à l’animal pour nous assurer de couvrir ses besoins journaliers. L’animal sera également pesé chaque jour d’entrainement pour suivre sa courbe de poids et détecter toute variation liée au contrôle. Une diversification de l’apport alimentaire sera mise en place pour fournir des aliments pauvres en calories permettant d’augmenter le temps de disponibilité de nourriture sans influer significativement sur l’apport énergétique fourni à l’animal. Les chirurgies seront optimisées (neuro-navigation, équipe experte et matériel de qualité) et réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée et un suivi post-opératoire de plusieurs jours. Un suivi quotidien rigoureux (comportement et état général) sera assuré tout au long du projet par du personnel qualifié et le vétérinaire. En cas d’anomalie observée un avis vétérinaire sera demandé pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites précis et précoces sont définis et seront appliqués pour éviter toute souffrance. En amont de l'implantation du matériel sur le crâne de l’animal, nous réaliserons une IRM pour localiser précisément les sites d’implantation et d’injection, nous permettant d’optimiser l’implantation et les enregistrements ou stimulations qui seront ensuite réalisés. Les enregistrements de l’activité du cerveau et les stimulations lumineuses seront réalisés via l’implant mis en place et ne nécessiteront donc pas de chirurgie supplémentaire pour l’animal et pourront être réalisés en état vigile (actes non douloureux) grâce à l’entrainement des animaux. Pour la stimulation lumineuse nous utiliserons des paramètres rigoureusement contrôlés pour minimiser l'échauffement tissulaire et surveillerons attentivement les effets comportementaux induits.

Choix des espèces

Nous utilisons des singes macaques rhésus (ou éventuellement cynomolgus en l’absence de rhésus disponible) car leur cerveau, notamment les zones cérébrales qui contrôlent les mouvements et les décisions, est très similaire à celui de l'homme. Cette ressemblance est cruciale pour que nos découvertes sur le fonctionnement de ces circuits soient utiles pour comprendre le cerveau humain. Ces singes peuvent apprendre les tâches complexes nécessaires et les techniques d'enregistrement et de stimulation cérébrales nécessaires dans ce projet sont bien maîtrisées chez eux. Nous utilisons des animaux adultes (3 à 16 ans). À cet âge, ils apprennent bien les tâches, s'adaptent bien à la vie en groupe (important pour leur bien-être), et cela permet d'étudier leur cerveau avant les effets du vieillissement. Cela facilite aussi leur replacement éventuel en fin de projet.

530 souris juvéniles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont environ 280 qui subissent trente prélèvements de sang, un toutes les six minutes pendant trois heures, après une incision d'un millimètre à la queue. Nourries pendant cinq semaines d'un régime pauvre en protéines qui reproduit la malnutrition infantile, elles sont mesurées chaque semaine sous anesthésie, contentionnées chaque jour pour détecter la puberté, soumises à des frottis vaginaux quotidiens et à un jeûne de six heures. 48 femelles sont opérées des ovaires et d'autres reçoivent un régime qui provoque une hypothyroïdie, avec ralentissement de la croissance et baisse du tonus musculaire. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, y compris les mères, tuées au sevrage de leurs petits parce que leur exposition au régime interdit de les réutiliser.

Objectifs

La malnutrition infantile constitue un problème de santé publique majeur à l’échelle mondiale. Elle entraîne des altérations durables de la croissance, du métabolisme et de la maturation sexuelle. Des études récentes suggèrent que cette réponse à la malnutrition est modulée par le sexe, les garçons étant globalement plus affectés que les filles. De précédentes études ont confirmé ces observations dans un modèle murin : un régime déficitaire en protéines perturbe davantage la croissance et le métabolisme des mâles juvéniles, tandis qu’il retarde significativement la puberté chez les femelles. Ces observations suggèrent l’existence de compromis physiologiques différents entre les mâles et les femelles, coordonnés par des facteurs endocriniens. Plusieurs hormones candidates sont impliquées : les hormones sexuelles, les hormones thyroïdiennes, ainsi qu'un signal provenant du foie, induit en réponse à la restriction protéique. Ce dernier module trois processus clés pendant la période juvénile : la croissance, le métabolisme et la reproduction en fonction du statut nutritionnel. L’objectif général de ce projet est d’explorer comment l’ensemble de ces signaux module la réponse à la malnutrition juvénile, et dans quelle mesure ils participent à la différence de réponse entre les mâles et les femelles. Chaque signal indépendant permettant d’expliquer une partie de cette réponse, l’analyse de tous ces signaux donnera un point de vue global sur le contrôle de l’adaptation à la malnutrition protéique en fonction du sexe. À travers une série de sept procédures combinant approches génétiques, pharmacologiques et chirurgicales, nous chercherons à identifier le rôle causal de ces signaux dans trois processus physiologiques majeurs : croissance, reproduction et métabolisme. Ce projet contribuera à mieux comprendre l'origine de pathologies métaboliques et reproductives, en tenant compte du sexe et de la nutrition.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment différents signaux coordonnent les réponses physiologiques à la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Ces connaissances contribueront à améliorer notre compréhension de la physiologie juvénile en contexte de malnutrition et pourraient, à terme, éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine. Notamment, ce projet participe à comprendre les bases de la réponse différente entre le sexe à un même régime alimentaire, et pourrait donc permettre l'adaptation de la prise en charge de la malnutrition au sexe des enfants et individus concernés.

Procédures

530 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). Pour étudier les hormones circulant dans le sang, environ 280 souris subiront une unique incision à la queue (1 seconde) puis 30 prélèvements d’une petite goutte de sang toutes les 6 minutes pendant 3 heures (≈ 5 secondes par prélèvement) sur animal vigile dans sa cage. Afin d’étudier l’effet d’une hormone, celle-ci sera injectée en sous-cutanée (10 sec), puis suivie de 3 prélèvements d’une petite goutte de sang à 0, 10 et 30 min. À 56 jours, un prélèvement final de 200 μL de sang sera effectué sous anesthésie générale (3 minutes). Dans les procédures chirurgicales, 48 femelles subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (20 minutes d’intervention), précédée d’une injection d’analgésiques et d’une anesthésie locale (10 sec). La couverture analgésique (par injections) sera maintenue le jour de l’intervention et le lendemain. Environ 320 souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes). 52 souris de 0 à 21 jours et 10 souris adultes en lactation seront nourries avec un régime pauvre en iode et contenant un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne, induisant un manque d’hormone thyroïdienne.

Impact sur les animaux

Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort de courte durée. La caractérisation de la puberté nécessite de manipuler les animaux, ce qui peut occasionner un stress de courte durée. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. Le gavage est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation oesophagienne. Les injections sous-cutanées peuvent causer une douleur brève au point d’injection. Les chirurgies ovariennes induisent une douleur modérée de moyenne durée au réveil, limitée grâce à la prise en charge. Les hypothyroïdies induites, bien que transitoires, peuvent entraîner un ralentissement de la croissance, une altération du tonus musculaire, de la température corporelle ou du rythme cardiaque. Ces effets sont surveillés et réversibles après sevrage.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères qui auront eu accès à un régime hypothyroïdien pendant la lactation seront mises à mort au sevrage de leurs petits, à cause de leur exposition temporaire au régime qui affecte leur physiologie et ne permet donc pas leur réutilisation.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. De plus, ce projet vise notamment à comprendre des mécanismes systémiques et moléculaires (en utilisant des traitements et modèles génétiques), et ne peut donc pas être réalisée en clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en préservant la robustesse statistique des résultats. Ayant déjà des données solides et reproductibles sur l’effet de la malnutrition protéique chez les juvéniles, la procédure pilote ne comporte qu’un seul groupe, qui sera comparé aux données précédemment acquises. Pour les procédures complètes, le nombre de 14 mâles et 12 femelles a été déterminé à partir d’un calcul statistique. Nos études précédentes nous permettent de déterminer le nombre minimal d'animaux à utiliser pour détecter un changement, notamment sur nos critères d'évaluation de la puberté. Sur le plan statistique, la prise en compte simultanée de plusieurs facteurs (régime alimentaire, sexe, etc.) permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour pouvoir conclure sur le mécanisme biologique impliqué. Afin de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de futures expériences, tous les organes d’intérêt potentiels (muscle, tissu adipeux, etc.) seront prélevés à la fin des procédures et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

La procédure expérimentale ne sera initiée que chez des animaux avec un poids suffisant au moment du sevrage. La croissance sera mesurée individuellement chaque semaine. Pour les jeunes récemment sevrés, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu'ils puissent manger facilement. La prise alimentaire sera également suivie pour s’assurer que les animaux mangent. Le régime faible en protéine et le test métabolique sont déjà utilisés au laboratoire et n’induisent pas de souffrance manifeste. L’utilisation d’anesthésie gazeuse permet une induction rapide, un bon contrôle de la profondeur d’anesthésie pendant la chirurgie, et un réveil plus rapide. La température corporelle sera contrôlée pendant et après l’anesthésie. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage propre et chauffée. Une grille d’évaluation de leur bien-être permettra d’adapter les doses d'analgésiques individuellement pendant 48 h. Toutes les mesures visent à limiter le stress et la douleur tout en assurant la robustesse scientifique des données. Des points limites précis et prédictifs ont été définis spécifiquement pour ce projet.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet des régulations endocrines dans une étude nutritionnelle. Les animaux utilisés seront suivis pendant les 5 semaines après le sevrage (procédure commencée à 3 semaines), jusqu’à 8 semaines. L'objectif du projet est d'étudier les effets de différentes hormones sur le métabolisme et la croissance pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour les 3 paramètres d'intérêt : la croissance, la puberté, le métabolisme.

Toutes tuées à l'issue, parce qu'elles auront reçu un vaccin en développement et subi des infections, 12 jeunes vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Arrivées gestantes après cinq heures de transport, elles mettent bas et restent en lactation, avec deux traites par jour, pour recevoir deux immunisations, des stimulations de la mamelle, jusqu'à trois infections bactériennes de la mamelle, des antibiotiques et 32 prises de sang, une partie de ces actes pouvant être refaite sur les mêmes vaches si le premier vaccin n'est pas concluant. Le sort des veaux nés pendant le projet n'est pas indiqué. Il s'agit d'une preuve de concept destinée à amorcer des partenariats avec le secteur pharmaceutique vétérinaire. Le porteur écrit que deux groupes de 6 vaches offrent une puissance "limitée", où "seules des différences marquées peuvent être détectées", et exclut un effectif plus grand pour des "contraintes financières" et la capacité de l'unité.

Objectifs

Les infections intramammaires causées par des bactéries (mammites) sont la maladie la plus fréquente chez les vaches laitières. En plus de leur impact important sur le bien-être animal et la rentabilité des exploitations, ces infections sont la première cause d'utilisation d'antibiotiques dans l'élevage laitier. Face à cette problématique, le projet vise à optimiser une plateforme vaccinale basée sur une levure, dans le but de proposer à la filière laitière une alternative plus efficace aux vaccins actuellement disponibles pour la lutte contre les mammites. Pour répondre aux enjeux soulevés par les parties prenantes de la santé animale et de l’élevage laitier, nous proposons une stratégie axée sur l’amélioration de notre plateforme pour la conception de vaccins polyvalents sûrs, peu onéreux et faciles à produire. Pour cela, nous mettrons en place une évaluation in vivo de l’efficacité de notre formulation candidate (en tant que vaccin préventif et thérapeutique) afin de fournir une preuve de concept sur l’espèce et la catégorie cible qui pourra amorcer de futurs partenariats avec le secteur pharmaceutique vétérinaire. En effet, suite à des échanges avec des partenaires potentiels de l’industrie pharmaceutique vétérinaire, ce projet a pour but d’apporter des améliorations à un vaccin contre les mammites, utilisant une levure comme plateforme vaccinale. Le programme scientifique est reparti sur les tâches suivantes : I) Augmenter la capacité de la levure à produire des antigènes vaccinaux ; II) Tester des méthodes chimiques d’inactivation de la levure ; III) Produire des vaccins polyvalents candidats contre les mammites bovines ; IV) Estimer l’immunogénicité des formulations vaccinales candidates par un test in vitro ; V) Evaluer l’efficacité in vivo préventive et thérapeutique d’un vaccin prototype contre les mammites chez des vaches en lactation. La demande d’autorisation de projet formulée ici concerne donc le point V. Nous estimons que les résultats de ce projet contribueront à l'amélioration de l'efficacité de la production laitière, ainsi qu’à la stratégie globale de lutte contre les maladies infectieuses au sein des élevages visant à protéger la santé de animaux, de l’être humain, des écosystèmes et renforcer la stratégie de diminution de l'utilisation des antibiotiques en élevage.

Bénéfices attendus

Une étude récente estime à 224 € par vache le coût du traitement des mammites en France. De plus, ces infections compromettent la qualité du lait, entrainant des conséquences importantes sur sa commercialisation et sa transformation. Compte tenu d’un cheptel de 20 millions de vaches laitières en Europe, dont 3,2 millions en France, ainsi que d’une prévalence de mammites cliniques estimée à environ 30% en France et dans d’autres pays européens, le contrôle des mammites représente un enjeu de taille pour l’industrie du médicament vétérinaire et pour la filière laitière. Les résultats de ce projet pourront ainsi bénéficier directement à l'industrie laitière, tant en France qu'à l'international. Ce projet pourra également contribuer à la protection de la santé publique en facilitant la mise en place de nouvelles stratégies de prévention des mammites au niveau des troupeaux et, par conséquent, la réduction de l'utilisation des antibiotiques dans l'élevage laitier. Pour cela, nous avons l’ambition de proposer aux parties prenantes de l’industrie du médicament vétérinaire un vaccin prototype répondant à un besoin largement souligné par la filière laitière : un vaccin polyvalent contre les mammites qui soit sûr, bon marché et facile à utiliser. En Europe, un vaccin polyvalent contre les mammites causées par S. aureus et Escherichia coli est commercialisé. Ce vaccin, visant l’induction des anticorps protecteurs et présentant une efficacité faible sur le terrain, laisse une large marge d'amélioration car la stimulation de la réponse cellulaire dans la mamelle n’a pas été ciblée lors de sa conception. Pourtant, la littérature scientifique montre que la réponse cellulaire représente la principale barrière contre les infections intramammaires par les bactéries. Pour palier cette problématique, les vaccins basés sur la levure représentent une alternative prometteuse pour la prévention et le traitement des mammites, compte tenu de leur capacité à induire une immunité cellulaire robuste au niveau de la glande mammaire, comme démontré lors de nos protocoles précédents (résultats en cours de valorisation).

Procédures

Immunisation (2 minutes par animal, 15 à 20 minutes par lot). - Immunisation (5 minutes par animal, 30 à 45 minutes par lot). Stimulation pour analyse de la réponse locale (10 minutes par animal, 1 h par lot). Infections (5 minutes par animal, 30 à 45 minutes par lot). Deux autres infections avec l’un des agents pathogènes ou les 3 agents pathogènes pourront être réalisées selon le besoin du projet (au cas où l’inoculum ne cause pas de mammite ou si l’évaluation d’une formulation vaccinale améliorée sur les mêmes animaux est nécessaire). Traitement antibiotique (5 minutes par animal, 30 à 45 minutes par lot) Prélèvements sanguins (5 minutes par animal, 30 à 45 minutes par lot), 32 prises de sang sont planifiées. Antibiothérapie en cas de mammite spontanée (5 minutes par animal, 30 à 45 minutes par lot). Ce projet ayant pour but d’évaluer l’efficacité in vivo d’un vaccin prototype, si le 1er candidat vaccin testé venait à ne pas être concluant, un 2ème candidat vaccin pourra être testé sur les mêmes animaux, necessitant de reconduire une partie de la procédure expérimentale, à savoir les deux immunisations, les stimulations et 8 series de prélèvements sanguins associés. Des prélèvements de lait seront réalisés regulièrement afin de suivre le statut sanitaire des mamelles. Au besoin, les quartiers présentant une mammite spontanée seront traités avec une suspension d’antibiotiques prévue pour les vaches laitières.

Impact sur les animaux

Hématome et inflammation locale legère suite aux immunisations IM (

Devenir

Les 12 animaux seront mis à mort étant donné qu’ils seront soumis à un produit en développement (sans autorisation de mise en marché) et à des infections.

Remplacement

Travail in vitro : depuis plus de 20 ans, des études ont été réalisées in vitro et ex vivo pour mieux comprendre les mécanismes de défense de la mammelle des ruminants contre les bactéries. Ces études ont abouti à la production de différents vaccins candidats, dont celui testé dans le cadre de ce projet. Au vu de la complexité des mécanismes de la réponse immunitaire, pas reproductibles en laboratoire, l’évaluation de l’efficacité et de l’immunogénicité d’un vaccin doit idéalement être réalisée chez l’espèce cible (la vache laitière, dans ce cas particulier). Cette preuve de concept chez l’espèce cible représente également une étape indispensable pour la montée du niveau de maturité de notre formulation candidate et pour sa future valorisation dans le cadre d’une collaboration avec une partie prennante de l’industrie de médicaments vétérinaires, si les résultats sont encourageants. Concenant la pertinance des modèles murins pour cette évaluation, des différences majeures entre les cycles de lactation chez les rongeurs et chez les bovins sont amplement décrites dans la littérature. Ces différences limitent l’utilisation de la souris pour aborder des questions précises, comme la réponse innée de la mamelle contre les mammites, mais ne permettent pas de fournir des données solides sur l’efficacité d’un vaccin pour les bovins. Outre les principales différences entre la souris et la vache, il est pertinant de souligner que chez la souris, au retrait des souriceaux, la glande mammaire entre en tarissement/involution. Ainsi, la souris doit continuer d’allaiter afin de maintenir ses glandes mammaires en lactation. Lors des infections expérimentales, la présence de souriceaux genererait leur infection par l’ingestion du lait contaminé et rendrait l’étude inviable. Pour conclure, des données de la littérature indiquent que les souris, souvent élevées dans un environement libre de pathogènes, répondent mieux à la vaccination que les espèces exposées à un environnement plus riches en microrganismes (comme l’homme et les vaches). Etant donné que ce biais pourrait surestimer l’efficacité d’un vaccin candidat, les tests sur vaches en condition du terrain restent l’option la plus pertinente.

Réduction

Nous avons choisi un test statistique adapté aux petits effectifs. Avec deux groupes de 6 animaux (n = 6 vs 6), la puissance reste limitée, ce qui signifie que seules des différences marquées peuvent être détectées. Pour pallier cette limite, nous rapportons également les tailles d’effet, utilisons la version exacte du test, et prévoyons de présenter les données brutes et des graphiques de distribution pour permettre une interprétation qualitative des résultats. Une augmentation du nombre d’animaux n’était pas envisageable en raison de contraintes financières et de la capacité d’accueil limitée de l’unité expérimentale. De plus, un effectif plus important aurait été moins justifiable sur le plan éthique, dans la mesure où nos protocoles précédents, menés avec deux groupes de 5 animaux, avaient déjà permis d’apporter des éléments de réponse : l’effet observé était suffisamment marqué pour montrer une réponse cellulaire plus importante pour les vaches vaccinées avec l’une de nos formulations précédentes, que nous cherchons à améliorer lors de ce projet. Le projet impliquant des animaux en gestation devant mettre bas avant le démarrage du protocole, l’éventualité d’un incident en cours de gestation ou pendant la mise-bas est à prendre en considération dans la quantité d’individus dans chaque groupe. Afin de prévenir l’impact d’un éventuel incident sur le déroulement du projet, dans le cadre de la procédure 1, 2 groupes de 6 animaux seront constitués (6 immunisés et 6 témoins). Pour réduire le nombre d’animaux expérimentaux, les 6 vaches témoins de la procédure 1 seront réutilisées dans le cadre de la procédure 2. Pour produire des résultats statistiquement robustes, nous profiterons du fait que chaque quartier mammaire peut être étudié indépendamment, comme démontré par des travaux précédents de l’équipe. Cela nous permettra de multiplier les échantillons par animal. Ainsi, chaque quartier de chaque vache sera soumis à un traitement différent (figure 2B) : - 6 quartiers infectés puis traités - 6 quartiers infectés non traités - 6 quartiers « contrôles » traités - 6 quartiers « contrôles » non traités

Raffinement

Les prises de sang et les immunisations ne nécessiteront qu’une contention minimale (au cornadis). Dans leur précedent élevage, les animaux seront déjà habitués à l’alimentation au cornadis et il est prévu 2 semaines d’acclimatation entre l’arrivée des animaux et la 1ère prise de sang pour permettre aux animaux de s’habituer à leur nouvel environnement. Pour les interventions sur mamelles, les animaux seront accueuillis en salle de traite, pouvant accueillir jusqu’à 10 vaches. Chacun des groupes pourra être accueilli dans son intégralité pour une période courte, sans mélange des groupes sociaux. Après chaque administration, les animaux seront surveillés pour déceler l'apparition éventuelle de signes systémiques et locaux de réaction adverse. L’état général et la température corporelle des animaux (suivi télémétrique sans contention avec des bolus ruminaux), ainsi que la présence d’hématome et d’inflammation seront évalués pendant une semaine. Nous utiliserons la technologie des bolus ruminaux, couramment utilisée dans les élevages commerciaux. Une fois avalés, ces bolus se localisent au niveau du rumen. Les données de température sont transmises via une base radio vers une base de données informatique où elles pourront être exploitées. Ces données permettront de visualiser d’autre paramètres comme l’abreuvement des animaux, pour un suivi sanitaire précis. Ces données pourront être complétées par des prises de température rectale. Les signes de réactogénicité (inflammation, fièvre) seront traités avec un anti-inflammatoire non stéroïdien. En cas de mammite infectieuse suite aux actes intramammaires, les quartiers affectés seront soumis à un traitement antibiotique à spectre large. Enrichissement du milieu : brosses de grattage et aire paillée pour le couchage. Enrichissement social : hébergement en groupes stables et visite régulière des animaliers, 2 fois par jour au minimum. Une récompense alimentaire sera fournie aux animaux après les interventions. Pour le transport des vaches, nous ferons appel à un transporteur agréé qui devra respecter les obligations règlementaires, durée prévue : 5h de transport dans la journée. Il est prévu d’effectuer un travail de conditionnement et de renforcement positif pour les interventions prévues, La méthode de clicker-training sera mise en place dès l’arrivée des animaux, 15 jours avant la 1ère prise de sang et 2 mois 1/2 avant les immunisations. Plusieurs agents se sont formés à cette méthode.

Choix des espèces

Les infections mammaires chez la vache sont fréquentes en élevage laitier. Elles sont responsables de pertes économiques qui fragilisent les exploitations agricoles et impactent le bien-être des animaux. Des vaccins plus efficaces contre ces infections doivent être mis au point. Le choix de l’espèce cible pour la mise en place de ce protocole se justifie par le constat que les résultats de protection contre l'infection obtenus avec des modèles murins sont peu transposables aux bovins. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont de jeunes vaches, avec un ou deux rangs de lactation maximum, dans le but d’avoir des animaux expérimentaux à statut sanitaire correspondant aux besoins de l’étude.. Les vaches devront arriver avant le dernier tiers de gestation (et en lactation) pour que le protocole d’immunisation et tarissement prévu soit réalisé sur place. Après la mise-bas, les vaches seront maintenues en lactation pendant la durée du projet avec deux traites quotidiennes.

Cinq ans au maximum par animal, avec des sessions d'enregistrement de une à trois heures jusqu'à cinq fois par semaine : douze ouistitis sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit deux chirurgies d'une journée, l'une pour implanter des électrodes chroniques dans le cerveau, l'autre pour transfecter ses neurones à ocytocine afin de pouvoir les activer ou les inhiber à distance. Le projet enregistre ensuite leurs vocalisations et leur activité cérébrale pendant qu'ils interagissent avec leurs congénères, une situation que le porteur qualifie de semi-naturelle alors qu'elle repose sur des animaux implantés et équipés d'une veste à micro. Six d'entre eux seront réutilisés dans un autre protocole et six désimplantés en vue d'un placement en retraite, la décision étant prise au cas par cas.

Objectifs

Pour les primates, humains compris, les signaux acoustiques sont essentiels pour communiquer. Grâce à leurs capacités cognitives, ils sont capables d’ajuster leur production vocale selon le contexte social, mais on ne sait pas encore comment les neurones encodent les vocalisations des congénères et produisent une réponse appropriée. Ce projet permettra d’enregistrer les neurones et d’étudier les vocalisations de singes marmoset dans différents contextes sociaux, dans des conditions semi-naturelles, les animaux se déplaçant librement dans la colonie. En parallèle, les neurones à ocytocine, neurohormone impliquée dans les comportement sociaux et espoir thérapeutique, seront stimulés pour comprendre son influence sur la communication acoustique des primates. Cette approche multidisciplinaire et multisite permettra de mieux cerner le rôle de l'ocytocine et d’en savoir plus sur le fonctionnement du cerveau des primates lors de conversations naturelles dans différents contextes sociaux.

Bénéfices attendus

Le projet produira plusieurs résultats significatifs. Sur le plan scientifique, il révélera comment le cerveau encode la communication accoustique, c'est à dire les échanges vocaux entre individus, ainsig que les liens affiliatifs entre eux. Cela apportera une nouvelle perspective au domaine, où les bases neurales de la perception et de la production vocales sont étudiées ensemble dans le cadre d'une interaction sociale naturelle : les conversations. De plus, il montrera le rôle du neuropeptide ocytocine (OT) dans ce processus. Cela est crucial car ce sera la première preuve causale que l'OT endogène module le comportement social des primates, et, indépendamment, la communication acoustique. Ainsi ce projet avancera nos connaissances sur les bases neurales et chimiques de l'affiliation entre individus.

Procédures

Les animaux seront soumis d'abord habitués à l'environnement et aux expérimentateurs du laboratoire (1 à 3 mois). Ils seront notamment entrainés à coopérer afin que les expériences se déroulent sans stress. Ensuite, des examens de neuroimagerie nous permettrons d'identifier les structures cérébrales d'intérêts (une demi journée par examen). Les animaux seront implantés avec des électrodes chroniques (chirurgie d'une journée), et leurs neurones à ocytocine seront transfectés pour pouvoir les activer ou les inhiber sur commande (chirurgie d'une journée). Enfin, nous enregistreront conjointement l'activité cérébrale et les vocalisations des sujets lors de leur comportements naturels avec leurs partenaires, directement dans la pièce d'hébergement (sessions de 1 à 3h, entre 1 et 5 fois par semaine, pendant la durée du projet). Il s'agit d'une seule procédure modérée, chaque animal participera à ce projet pendant une durée maximale de 5 ans.

Impact sur les animaux

1. Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale, destinée à l'implantation d'électrodes et l'injection de virus AAV. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager (quelques jours), maitrisé par l'administration d'analgésique. Par ailleurs, une légère perte de poids et une réduction de la mobilité sont possibles selon le temps pris par l'individu pour s'adapter à son implant (quelques jours). 2. Pour les tests comportementaux, ceux-ci auront lieu directement dans la cage d'habitat ou la cage d'expérimentation (enregistrement passif de l'animal libre). Cette cage d'expérimentation sera placée soit devant la cage d'habitat ou une autre cage, face à un autre individu. L'impossibilité d'interaction tactile et la nature prosociale des marmosets préviendront l'apparition de stress fort, mais une anxiété légère est possible. De plus, la pose de l'équipement d'enregistrement (neurologger + veste avec micro et ecg) nécessite une manipulation à la main par les expérimentateurs, ce qui peut également être stressant. Ce stress et cette anxiété seront graduellement réduits avec l'habituation des individus à ces situation (quelques semaines). 3. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'IRM, de TEP (Tomographie à émission de positon), pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera un léger stress lors de l'induction ainsi qu'un inconfort (quelques heures) au réveil. 4. La désimplantation ne laisse pas de séquelle (hormis une cicatrice), la peau et l’os se cicatrisent. Comme toutes les procédures chirurgicales, elle peut comporter des risques d’infection, ou plus rarement encore, entraîner des crises d’épilepsie. Dans l’éventualité où une infection ou des crises d’épilepsie se produiraient, une médication appropriée d’antibiotiques ou d’antiépileptiques serait administrée à l’animal, sous l’avis de notre vétérinaire. De même que pour l'implantation, toute douleur post opératoire sera traitée par analgésique (quelques jours).

Devenir

A la fin de la procédure, les singes seront réutilisés dans un autre protocole ou bien désimplanteés et replacés pour une mise en retraite. Cette décision sera prise par la Structure du Bien être Animal au cas par cas et avec l'accord des responsables et du vétérinaire référant.

Remplacement

Les modèles in silico du cerveau ne sont pas encore assez évolués pour simuler le comportement spontané de primates. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal. Le choix d'un modèle primate est justifié par les questions spécifiques du projet qui s'intéressent justement à la différence des effets de l'ocytocine chez le rongeur et chez le primate, ainsi qu'aux bases neurales de la communication acoustique du primate. L'OT module-t-elle le comportement social et l'activité cérébrale chez les primates comme elle le fait chez les rongeurs ? Comment les circuits cérébraux spécifiques aux primates (ACC) encodent-ils la communication acoustique ? Comment le contexte social riche et spécifique des primates influence-t-il la production vocale ? Pouvons-nous infecter et manipuler les neurones de primates en utilisant des AAV périphériques ? Nous avons sélectionné le marmoset, pour remplacer le modèle classique qu'est le macaque, en raison de sa plus petite taille, de ses capacités cognitives inférieures ainsi que par sa proximité phylogénétique plus lointaine et surtout du fait de son riche comportement acoustique et pro social.

Réduction

La principale réduction du nombre d'animaux vient des technologies utilisées, les électrodes choisies pour ce projet ont de nombreux contacts et sont implantées de manière chronique et ont une longue durée de vie, ce qui permet d'enregistrer beaucoup de neurones en peu de temps, et d'utiliser un même singe pour toutes les étapes du projet. Ainsi une grande quantité de données sera extraite de chaque session et de chaque singe impliqué, ce qui au final réduit le nombre de session et d'animaux nécessaires. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations (n =12 selon le calcul de puissance).

Raffinement

Plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Durant chaque transport, les animaux seront sédatés à la kétamine. Entrainement des singes via du renforcement positif, ce qui permet de les manipuler sans contention. De plus, l'intégralité des expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques, c’est-à-dire en conditions expérimentales où les animaux sont libres de leurs mouvements et peuvent se déplacer et interagir avec des objets ou des congénères. La différence entre conditions purement éthologiques et semi-éthologiques est que ces dernières n’adviennent pas en milieu naturel. Ces conditions sont rendues possibles grâce à notre laboratoire d’enregistrement sans fil où les animaux pourront se déplacer librement et se comporter d’une manière naturelle. Surtout, ces enregistrements se déroulent directement dans ou à côté de la cage d'hébergement, à l'intérieur de la salle de stabulation, ce qui enlève le stress d'une sortie de cage prolongée. Ces conditions expérimentales dans lesquelles les animaux sont testés constituent un élément de raffinement important. De plus l'hébergement des marmosets se fera dans de grandes cages (1.7 voir 3.4m^3 pour deux animaux) ce qui est supérieur, relativement à leur taille, à ce qu'on les macaques en laboratoire. Tous les actes chirugicaux seront fait sous anésthésie et avec un traitement analgésique. Enfin, un traitement humain des animaux sera assuré par des points limites liés à la douleur éventuelle suite à la chirurgie ou un inconfort lié à un stress chronique.

Choix des espèces

Les aires de la communication acoustique et de l'affiliation ne sont pas équivalentes entre les rongeurs et les primates. Ces derniers ont en effet développé un cortex cingulaire antérieur qui leur est unique, en terme de connectivité et de type de neurones. Par ailleurs, les primates ont une cognition sociale bien plus élaborée et complexe que celle des autres modèles. Dans l'optique de transférer les connaissances acquises par le présent projet à l'humain, et notament à des patients, il est donc crucial de réaliser ces expériences sur un primate non humain. Enfin, un des objectifs du projet est de tester si l'on peut manipuler le comportement social des primates via le système ocytocinergique, comme on a pu le faire chez le rongeur. Il est donc obligatoire d'utiliser un primate non humain pour répondre à cette question. Les animaux utilisés seront adultes. Ce stade permet de documenter les bases neuronales d’un sujet normal adulte et sain, présentant un système de communication et d'affiliation dévelopés.

Toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 616 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur canule les glandes salivaires sous anesthésie pour y injecter un adénovirus qui provoque un syndrome sec, et une partie reçoit en plus un gavage quotidien cinq jours par semaine pendant quatre semaines pour déclencher une fibrose de la peau. D'autres reçoivent une molécule chimique à trois reprises pour induire un lymphome, puis une stimulation immunitaire mensuelle, avec des prises de sang hebdomadaires et des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'autre modèle que la souris pour le syndrome de Gougerot-Sjögren et la sclérodermie, et qualifie ce modèle d'"indispensable" pour suivre l'apparition des auto-anticorps.

Objectifs

Le Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie auto-immune principalement caractérisée par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales responsable d’un syndrome sec. Dans 40% des cas, les patients atteints développent des structures lymphoïdes anormales (ELS) au niveau de leurs glandes salivaires. La présence de ces structures ELS est prédictive d'une expression de la maladie plus aggressive et d'un risque accru de développement de lymphome. Cependant les mécanismes responsables de du dysfonctionnement des glandes salivaires, de la formation des ELS et du développement de l'auto-immunité restent peu connus. Nos collaborateurs ont mis en place un modèle murin de SGS reposant sur la délivrance d'adénovirus non réplicatifs (une fois que le virus a infecté une cellule, aucun autre virus n'est produit) dans la glande salivaire permettant l'induction d'ELS semblables à ceux observés dans le SGS. Tout d'abord, nos objectifs sont donc de mettre en place et caractériser ce modèle murin, ainsi que d'explorer les mécanismes à l'origine du dysfonctionnement des glandes salivaires dans le SGS et les stratégies thérapeutiques potentielles pour y remédier. Ensuite, nous étudierons le SGS dans le contexte d'autres pathologies puisque les patients atteints de SGS ont un risque accru de développement de lymphome et les patients atteints d'une autre maladie auto-immune, la sclérodermie systémique sont à risque de développer un SGS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) et pourra permettre d'identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Egalement, nous espérons faire avancer la compréhension du lien entre le SGS et d'autres maladies auto-immunes ou cancers.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie consistant à une canulation des glandes salivaires (l'acte chirurgical ne durera pas plus de 15 minutes) associée à une anesthésie et une administration d'analgésique. Egalement, pour certains animaux : traitement administré 1 fois par jour pendant 5 jours/semaine pour une durée maximale de 4 semaines (durée : 1 minute / administration) afin d'induire la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune caractérisée par le développement anormal d’une fibrose de la peau. Dans d'autres cas (induction d'un lymphome), administration d'une molécule chimique à 3 reprises (durée : 30 secondes / administration) avec 2 jours d'intervalle pour induire l'expression des altérations génétiques associée à une administration mensuelle (durée : 30 secondes / administration) permettant de stimuler leur système immunitaire. Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum hebdomadaire et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Dans certains cas, de l'imagerie non invasive pourra être réalisée impliquant une administration du substrat d'imagerie et une anesthésie gazeuse, la session durera 20 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

La canulation des glandes salivaires pour le modèle du Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) résultera d'un syndrome sec, une attention particulière sera donc portée sur la consommation d'eau. L'administration par gavage peut générer un stress, un inconfort, voire une fausse route créant une détresse respiratoire, c'est pourquoi elle ne sera réalisée que par des personnes qualifiées pour ce geste et sur animal vigil, diminuant ainsi drastiquement les fausses routes. En cas de fausse route, l’animal sera surveillé le temps de l’évacuation du liquide, l’animal vigil aura le réflexe d’évacuer par lui-même le liquide. Dans nos expériences précédentes, nous n’avons pas observé de stress lié à la répétition de ce geste de gavage. Pour les animaux transgéniques du modèle lymphome, on peut observer un développement tumoral qui reste généralement indolent (non douloureux) comme chez l'Homme ; cependant ces souris seront observées régulièrement afin de détecter l'apparition de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Les autres nuisances attendues proviendront de l'administration de l'inhibiteur. Dans le cas de la sclérodermie systémique, les souris développent une fibrose cutanée au point d'injection (bas du dos) et une fibrose pulmonaire modérée à partir de la 2ème semaine. Celle-ci est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l’ensemble du parenchyme pulmonaire ce qui évite les difficultés ou souffrances respiratoires dans ce modèle murin.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.

Remplacement

La compréhension des mécanismes responsables du dysfonctionnement des glandes salivaires dans le Syndrome de Gougerot-Sjögren ne peut se faire que partiellement in vitro/ex vivo puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire l'entière complexité de l'environnement des glandes salivaires (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) mais nous travaillons en parallèle à les développer afin d'avoir recours aux animaux uniquement sur les dernières étapes de notre projet. En effet, la première cible thérapeutique que nous allons explorer a été définie grâce à des expérimentations in vitro. Egalement, les autres cibles potentielles seront déterminées grâce à un modèle d'organoïdes mis en place par des collaborateurs.

Réduction

Les expérimentations sont mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations. De manière générale, nous nous sommes basés sur les résultats de nos collaborateurs décrivant que la méthode de canulation de la glande salivaire permettait dans 70% des cas le développement des symptômes, ce qui implique la nécessité d'au moins 8 animaux par groupe afin d'obtenir au moins 5 animaux exploitables. Les doses croissantes d'adénovirus déficient seront testées en séquentiel, ainsi si la première dose testée s'avère suffisante les doses supérieures ne seront pas réalisées. De même si la décroissance observée à J23 est suffisante, les études aux temps plus tardifs ne seront pas réalisées. Lorsque une analyse transcriptomique et une analyse par immunofluorescence devront être réalisées, il sera nécessaire de doubler le nombre d'animaux par groupe car ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur les mêmes échantillons. Dans le cadre de l'étude d'association avec le lymphome, les groupes sont dimensionnés grâce à notre expérience précédente nous permettant d'attendre un taux de développement tumoral de 40% (nécessité d'augmenter les groupes à 11 animaux pour avoir des résultats exploitables).

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin de se construire un «nid». Le stress sera également limité au maximum grâce à une habituation progressive à la manipulation. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (apparence physique, comportement) et un suivi bihebdomadaire des signes cliniques permettront d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés (par exemple du spray anti-démangeaisons ayant des propriétés antiinflammatoires si démangeaisons au point d'injection chez les animaux où la sclérodermie sera induite) si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, et à l’euthanasie dès que nécessaire. Le raffinement sera également obtenu par un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire avec des dispositions adaptées (collyres, maintien à 37°C...) pour permettre une bonne récupération des animaux. La technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique du modèle de Syndrome de Gougerot-Sjögren de façon non douloureuse.

Choix des espèces

Pour les maladies auto-immunes, le Syndrome de Gougerot-Sjögren et la Sclérodermie systémique, il n'existe pas d'autres modèles que le modèle murin. Par ailleurs, ce modèle est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Concernant le modèle murin de lymphome, l'utilisation de souris transgéniques permet de reproduire avec pertinence les mécanismes précoces de la lymphomagenèse ce qui n'est pas possible avec les modèles murins de greffes. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 8 semaines d'âge comme cela a été décrit pour ces modèles qui nécessitent un système immunitaire complètement fonctionnel et mature.

Pour mesurer l'effet de composés candidats sur la mémoire, 300 souris et 300 rats sains reçoivent des électrodes implantées dans l'hippocampe ou le cortex préfrontal au cours d'une chirurgie de deux heures. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, le sang terminal étant prélevé au sinus rétro-orbitaire. Les administrations vont jusqu'à 180 fois par voie orale ou 21 injections intrapéritonéales par animal, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins. Les composés testés ont déjà été évalués in vitro par les clients du porteur, ce projet constituant l'étape suivante d'une prestation commerciale.

Objectifs

La mémoire est une fonction essentielle du cerveau, souvent perturbée dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychiatriques. C’est pourquoi elle représente une cible importante pour développer de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier, chez des rongeurs sains (souris ou rats, selon les besoins), l’effet de nouveaux composés sur le fonctionnement du cerveau lié à la mémoire, et plus particulièrement sur la façon dont les connexions entre les neurones peuvent se renforcer ou s’affaiblir. La mémoire repose en grande partie sur ces modifications durables des connexions, appelées plasticité synaptique, comme la potentialisation à long terme (LTP) — un renforcement durable de la transmission entre deux neurones après leur activation répétée — ou la dépression à long terme (LTD) — une diminution prolongée de cette transmission synaptique. Ces mécanismes permettent au cerveau d’apprendre et de stocker des informations. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons une méthode appelée électrophysiologie in vivo, qui consiste à enregistrer l’activité électrique du cerveau chez des animaux éveillés. Concrètement, nous implantons de petites électrodes, avec une grande précision, dans des régions clés impliquées dans la mémoire, comme l’hippocampe ou le cortex préfrontal. Cela nous permet de mesurer l’activité des neurones et de voir comment les signaux entre eux changent après l’administration des composés testés. Les composés seront donnés par voie orale ou injectés, selon ce qui est le plus adapté, et nous mesurerons leurs effets à différents moments. En observant comment ces substances influencent l’activité des réseaux de neurones, nous espérons mieux comprendre leur impact potentiel sur la mémoire. Les résultats obtenus serviront de base pour des recherches futures dans des modèles animaux reproduisant des troubles de la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment de nouveaux composés agissent sur les mécanismes qui permettent au cerveau de renforcer ou d’ajuster les connexions entre neurones, un processus essentiel à la mémoire. En étudiant leur effet sur l’activité des réseaux de neurones dans un cerveau vivant, nous pourrons mieux cerner l’impact de ces candidats médicaments sur la plasticité cérébrale. Les données obtenues, issues d’un modèle préclinique dans des conditions proches du fonctionnement normal du cerveau, représenteront une étape clé avant de tester ces composés dans des modèles de maladies. Elles poseront ainsi les bases pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les dysfonctionnements des circuits neuronaux impliqués dans les troubles cognitifs liés à différentes maladies neurologiques ou psychiatriques.

Procédures

Sous analgésie anésthésie une seule étape de chirurgie (2 heures). Administrations : sous cutanée 1 à 14 fois max 5 sec ou Intrapéritonéale 1 à 21 fois max 5 sec ou 1 à 14 fois max 1 minute ou voie orale 1 à 180 fois max 5 sec. Prélèvements sanguins maximum 8 fois sur animal vigile ou anesthésiés (5 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les administrations uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. Les produits administrés peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire transitoire. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré au lieu d'injection. Une injection provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo réalisés sur animal vigile, dans leur cage habituelle, limitent considérablement le stress et les perturbations comportementales. L’implantation d’électrodes lors de la procédure chirurgicale peut provoquer une douleur au site d'incision ou des saignements. En post chirurgie, un risque inflammatoire ou infectieux est présent.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée chez l’animal vigile à l’aide de techniques d’électrophysiologie in vivo. Ces approches permettent d’enregistrer l’activité neuronale dans un environnement physiologique préservé, en tenant compte des interactions complexes entre différentes structures cérébrales et des influences de l’état de vigilance ou du comportement spontané. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, ce qui a permis d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’intégration de ces effets dans un réseau cérébral fonctionnel et intact. C’est pourquoi l’expérimentation in vivo s’avère nécessaire dans ce contexte, afin de caractériser l’impact des composés sur l’activité neuronale dans des conditions physiologiques réalistes.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies avec des éléments favorisant leur bien-être, comme des bûchettes de bois à ronger, de la frisure de papier et des carrés de coton. Des tunnels en carton faciliteront les transferts entre cages tout en limitant le stress. Des interactions régulières avec le personnel, ainsi qu’une transition progressive de la lumière, contribueront à améliorer leur acclimatation. Une période d’adaptation d’au moins 10 jours est prévue afin de permettre aux animaux de récupérer du transport et de s’habituer à leur nouvel environnement. Ils seront surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Après chaque intervention technique, leur comportement et leur état général seront observés avec attention pour détecter rapidement toute réaction anormale ou signe de douleur. Si nécessaire, une surveillance renforcée sera mise en place, en lien avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les seuils définis dans le cadre du projet seront scrupuleusement respectés pour assurer une détection précoce de toute souffrance. Les animaux seront pesés au moins deux fois par semaine après le début des traitements, afin d’adapter précisément les volumes administrés. Pour les injections répétées (intrapéritonéales ou sous-cutanées), les sites d’administration seront régulièrement changés pour limiter les réactions locales. Concernant les interventions chirurgicales, les animaux seront placés sous anesthésie générale / analgésie pendant toute la durée de l’opération. Une analgésie locale préventive sera administrée, avec une injection 10 minutes avant l’incision, ainsi qu’une application locale d’un mélange anesthésique au niveau du site opératoire. Le maintien de la température corporelle (tapis chauffant), le suivi pendant l’opération (monitoring) et des techniques chirurgicales stériles seront appliqués pour limiter les complications. Une solution ophtalmique sera appliquée sur les yeux pendant l’anesthésie pour éviter leur dessèchement, et une injection de solution saline tiédie à la fin de la chirurgie permettra d’assurer l’hydratation. Enfin, une analgésie post-opératoire sera assurée par l’ajout d’un traitement antidouleur dans l’eau de boisson pendant deux jours.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées sur la souris et le rat, deux modèles couramment utilisés en neurosciences pour étudier les mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes majeures avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des circuits neuronaux et les mécanismes synaptiques. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés pour explorer les bases du fonctionnement normal du cerveau ainsi que les processus altérés dans les maladies affectant la mémoire. Grâce à un cerveau moins complexe tout en restant suffisamment proche de celui de l’humain, les souris et les rats permettent d’étudier des fonctions essentielles telles que la plasticité neuronale, l’apprentissage et la mémoire, souvent perturbées dans les pathologies du système nerveux central. Ces modèles offrent ainsi la possibilité d’observer et de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux du fonctionnement cérébral, fournissant des données précieuses pour le développement de traitements ciblés contre ces maladies. Les animaux seront utilisés du jeune l’âge adulte, c’est-à-dire à partir de 4 semaines. Ils seront suivis jusqu’à environ 8 mois, ce qui couvre la période d’âge adulte sans atteindre le stade de vieillissement avancé soit avant l’apparition des altérations liées à l’âge ou à d’éventuelles pathologies. Les données obtenues chez ces animaux fourniront une base fiable pour la comparaison avec des modèles pathologiques plus avancés.