Procédures modérées
Formation aux différentes voies d’administrations et aux prélèvements sanguins chez la souris.
- Formation professionnelle
Chaque souris est tuée puis autopsiée après l'apprentissage d'un seul geste, pour valider la maîtrise technique du participant qui l'a manipulée. 300 souris vont être utilisées dans ce projet de formation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections sous la peau, dans le péritoine ou dans la veine de la queue, jusqu'à huit fois sur un mois pour cette dernière, un gavage d'eau, ou une prise de sang à la joue ou à la patte, sur animal vigile immobilisé dans un tube. Le porteur indique qu'une sonde de gavage mal introduite peut provoquer une détresse respiratoire et que l'animal sera alors tué immédiatement s'il s'étouffe, et présente le recours à des souris transgéniques "de réforme", déjà destinées à la mise à mort, comme une contribution à la réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.
Objectifs
Ce projet concerne la réalisation du tutorat au sein de l’établissement pour contrôler les compétences ou la formation du personnel et des utilisateurs, selon une méthodologie définie et finalisée par une validation de la maitrise du geste technique. Il concerne les techniques d’administration par injections sous-cutanées, dans le péritoine, dans la veine de la queue, ou par gavage, et de prélèvements sanguins dans la veine de la patte ou en veine submandibulaire, chez la souris. Dans le cadre de l’expérimentation animale, l’administration de substances, peut se réaliser selon différentes voies choisies selon les volumes et le produit à administrer. Les prélèvements sanguins permettent de suivre différents paramètres physiologiques. Afin de limiter son impact sur l’animal, des recommandations quant au volume à prélever et la fréquence de ces prélèvements doivent être suivies. Ces techniques doivent être maitrisées pour être correctement réalisées, en respectant le bien-être des animaux, et limiter le stress de l’animal et de l’expérimentateur. Conformément à la règlementation, les personnes amenées à expérimenter sur des animaux doivent justifier de la maitrise des gestes techniques qu’ils doivent réaliser dans le cadre d’un projet. Ainsi, ce tutorat sera destiné uniquement aux personnes sélectionnées selon leur besoin de maîtriser un de ces techniques requis spécifiquement dans le cadre d’un projet ayant obtenu une autorisation. La formation sera adaptée à chaque participant et ne concerna que les gestes techniques requis et non réalisables systématiquement par un autre personnel de l’établissement. La supervision par le tuteur se fera jusqu’à l’autonomie de l’expérimentateur en formation et observation du geste sur les premiers animaux du projet. La formation devra être réalisée juste en amont du démarrage du projet. Ces formations seront progressives et encadrées par du personnel qualifié référent identifié au sein de l’établissement. Les compétences validées lors de cette formation répondent à un certain nombre de critères définis à chaque étape de la formation. Si les gestes ne sont pas acquis à une étape, le tuteur peut exiger la reprise du geste dès la première étape sur animal simulateur ou sur un animal mort. Après validation, la formation sera inscrite dans leur livret de compétences. Ainsi, les participants pourront réaliser leurs travaux de recherche selon les bonnes pratiques d’expérimentation animale et en accord avec la règlementation.
Bénéfices attendus
Cette formation s’adresse aux personnels sélectionnés selon leur besoin de maîtriser une ou plusieurs gestes techniques dans le cadre de la réalisation de projets ayant obtenu une autorisation. Elle permettra de s’assurer de la bonne réalisation de gestes techniques fréquemment utilisés en expérimentation animale pour l’administration de substances/cellules et les prélèvements sanguins, selon les bonnes pratiques d’expérimentation animale (raffinement), afin d’assurer le bien-être des animaux et de répondre aux exigences réglementaires. De plus, les souris de réforme, qui sont des souris systématiquement mises à mort car elles sont non utilisables dans les projets et non re-plaçables (souris transgéniques), seront utilisées dans le cadre éducatif, permettant la réduction du nombre d’animaux à produire pour l’apprentissage de ces gestes.
Procédures
Une souris sera soumise à un seul des gestes techniques enseigné, c’est-à-dire soit des injections sous la peau, soit dans le péritoine, soit dans la circulation sanguine via la veine de la queue, soit une administration d’eau par gavage, soit des prélèvements de sang (en veine submandibulaire ou en saphène au niveau de la patte postérieure). Toutes les injections se feront avec des solutions injectables type sérum physiologique stérile avec des volumes bien inférieurs aux recommandations et aux lignes directives en vigueur. Les administrations réalisées qu’une seule fois, à l’exception des injections dans la veine de la queue. En effet, cette technique nécessite un apprentissage plus long, et le geste sera répété au maximum 8 fois espacés d’une semaine, sur une durée totale de 1 mois. Les volumes de prélèvement de sang seront adaptés en fonction du poids de l'animal, en respectant la physiologie de la souris mais aussi les recommandations. Le prélèvement sanguin sera effectué une seule fois pour chaque animal. L’apprentissage se fera sur animal simulateur et sur cadavre quand c’est possible ou sinon si ça n’est pas possible sur animal anesthésié ; puis, une fois les gestes maitrisés, ils seront effectués sur des animaux vigiles, immobilisés par une contention ou dans un tube à contention adapté à la taille de la souris.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis, selon le geste effectué, au stress de l’anesthésie ou de l’immobilisation par contention. L’injection d’une solution de sérum physiologique par voie sous-cutanée, ou dans le péritoine ou intraveineuse ne devrait induire qu’une légère douleur due à la piqure. Le gavage de la souris pourra induire un inconfort, voire une irritation due à la sonde. Si la sonde n’a pas été introduite correctement, l’animal peut montrer des signes de détresse respiratoire ; dans ce cas, elle sera ressortie très délicatement et l’animal sera surveillé jusqu’à un retour à un état normal ou mis à mort immédiatement par le tuteur si l’animal s’étouffe. En effet, si un animal montre des signes de souffrance, présente des difficultés respiratoires ou une modification motrice/de posture qui perdure lors de la procédure, il sera mis à mort. Le prélèvement sanguin en veine submandibulaire pourra induire une douleur légère lors de la piqure si la zone est mal anesthésiée. Il est possible d’observer un saignement à l’oreille ou au nez si la piqure est mal réalisée. Le prélèvement sanguin en veine saphène ou l’injection en intraveineuse entrainera en plus de la douleur légère induite par la piqure, un inconfort de la souris quand le geste technique sera réalisé sur la souris vigile et immobilisée dans un tube de contention.
Devenir
Les animaux utilisés sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent pour les études, sans pathologie, non utilisables en protocole et non replaçables, et qui sont systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet de tutorat. Chaque animal est mis à mort après chaque apprentissage d’un geste pour réaliser ensuite une autopsie afin de valider la formation du geste et vérifier que la souris n’a subi aucune autre atteinte non souhaitée.
Remplacement
La formation des expérimentateurs sert à valider sur animaux vigiles la réalisation de gestes techniques de prélèvement et d’injection afin de les réaliser ensuite de façon autonome et en respectant les bonnes pratiques et le bien-être animal. Même si une partie de l’apprentissage sera d’abord réalisée sur des modèles d’imitation de la souris (Simulateur Mimicky souris) et des cadavres (pour l’administration par voie sous cutanée et intrapéritonéale), il est nécessaire de valider l’ensemble de ces gestes techniques sur des souris vigiles, avant la réalisation des procédures expérimentales incluant des groupes plus importants d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été optimisé en tenant compte de l’expérience relative à la validation des compétences de l’établissement. La validation des compétences d’un utilisateur expérimenté ne peut nécessiter qu’un animal sur les trois prévus dans un apprentissage complet. De plus, les gestes techniques seront réalisés d’abord sur des modèles imitant une souris ou sur une souris décédée afin d’utiliser le moins possible d’animaux vivants. Enfin, un geste maitrisé par un utilisateur représente un raffinement pour la réalisation des projets, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux analysés par groupe. Il est aussi important de préciser que la totalité des animaux utilisés lors de ces formations sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent pour les études et non replaçables, systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet de tutorat. L’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux uniquement pour l’apprentissage des gestes techniques. Ainsi, le nombre d’animaux vivants a été limité à 3 souris maximum par geste technique par participant.
Raffinement
Les animaux seront manipulés régulièrement par des personnes compétentes avant le début du projet afin qu’ils soient habitués avant leur premier contact avec les participants de la formation. Une attention particulière sera portée à l’apprentissage initial la préhension et contention de l’animal avant l’apprentissage et la réalisation de tous les gestes enseignés. La présence du tuteur lors de la réalisation du geste garantira la qualité de l’apprentissage de manière individuelle pour chaque participant. Les gestes techniques seront réalisés d’abord sur des modèles imitant une souris et sur une souris mises à mort, avant de valider le geste sur un animal vigile, afin de générer le moins de stress possible. Enfin, un seul geste technique ne sera réalisé par animal, ce qui justifie le nombre de procédures.
Choix des espèces
Lorsqu’il n’y a pas de méthodes de remplacement permettant de répondre à une question scientifique sans recours à l’animal, notre établissement utilise principalement des souris transgéniques pour ses projets scientifiques. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en reproduisant la physiologie de l’homme, et en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyses disponibles. Les souris seront âgées au minimum de 8 semaines pour afin d’assurer l’apprentissage sur des animaux de taille adulte, avec un poids minimal de 25g.
Évaluation du profil pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution d’un médicament développé pour le traitement du diabète de type II chez le primate non humain.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Pour savoir dans quels organes s'accumule un candidat médicament contre le diabète de type 2, quatre macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois reçoivent le produit par injection lente dans une veine de la jambe, isolée de la circulation générale par un garrot, sous anesthésie et pendant une heure environ. Ils subissent ensuite seize prises de sang sur dix-sept semaines et quatre biopsies sur chaque quadriceps, avec des œdèmes, des hématomes et une boiterie aiguë parmi les effets attendus, puis sont mis à mort cent treize jours après l'injection pour que leurs organes soient prélevés. Le quatrième, dit "pilote", sert uniquement à roder la technique d'injection et reste en vie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de comprendre comment un nouveau candidat médicament contre le diabète de type 2 agit dans le corps : comment il circule, combien de temps il reste actif, quels effets il produit et dans quels organes il s’accumule. Le candidat médicament testé bloque sélectivement avec certains gènes impliqués dans la résistance à l’insuline, mécanisme central du diabète de type 2. Contrairement aux traitements qui contrôlent principalement la glycémie, ce candidat médicament vise donc à corriger la cause physiopathologique sous-jacente de la maladie. L’hypothèse est qu’une administration unique de ce médicament permettra d’induire une amélioration durable de la sensibilité à l’insuline des patients et, par conséquent, un meilleur contrôle métabolique. Cette étude préliminaire sur primate est nécessaire pour déterminer les caractérisitiques principales du produit une fois administré dans un organisme entier, avant de futurs études précliniques et cliniques. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat médicament. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, les dosages utilisés dans ce projet sont efficaces mais a priori non toxiques (d’après des études toxicologiques préliminaires).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché d’un traitement innovant pour le diabète de type 2, qui pourrait être administré en une seule injection et offrir des effets durables. Ce médicament pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients en réduisant les contraintes liées aux traitements chroniques.
Procédures
Après plus un mois d’acclimatation et d’habituation, 3 animaux recevront une seule fois le candidat médicament par injection intra-veineuse sur membre isolé (injection lente du produit dans une veine sur une jambe coupée de la circulation sanguine générale à l’aide d’un garrot). L’intervention durera environ une heure et sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun de moins de 16h). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration du candidat médicament sur animal vigile afin d'étudier sa concentration dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (16 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 17 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. 4 biopsies de muscles seront réalisées sur chaque quadriceps (à minimum un mois d’intervalle). L’intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun) durera environ 30 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 113 jours après administration de du candidat médicament et les 3 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes. Un 4eme animal sera utilisé uniquement pour la mise au point technique et au raffinement de la procédure d’administration de du candidat médicament (l’animal ne subira aucun prélèvement ou autre manipulation au cours du projet). Cet individu recevra une injection de solution physiologique inerte et ne sera pas exposé au du candidat médicament. L’animal bénéficiera d’une période d’acclimatation et d’un suivi clinique rapproché au même titre que les 3 animaux du projet principal. Il sera gardé en vie à l’issue du projet.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux. L’administration du candidat médicament (sous anesthésie et analgésie) peut provoquer une douleur légère, un œdème aigue (durant environ 24h maximum), des hématomes et une boiterie aigue (se résorbant en quelques heures). Les biopsies de muscles sous anesthésie et analgésie pourront provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site de ponction ou une infection post-opératoire. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions (biopsies et administration) pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).
Devenir
Les 3 animaux qui recevront une injection du candidat médicament seront mis à mort afin de récolter leurs organes pour déterminer dans quels tissus le produit s’accumule. Seul l’animal « pilote » n’ayant pas reçu le candidat médicament sera gardé en vie.
Remplacement
Les études pharmacocinétique, pharmacodynamie et de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer combien de temps un médicament reste actif, son efficacité et sa localisation dans les tissus. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, les paramètres étudiés dans ce projet dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 4 animaux seront utilisés, 3 pour le projet principal qui subiront l’ensemble des manipulations et 1 animal « pilote » utilisé uniquement pour la mise au point technique du modèle d’administration du médicament. Concernant les 3 premiers animaux : Chaque animal recevra une dose différente du candidat thérapeutique (faible, intermédiaire, élevée). Cette approche permet de tester l’ensemble des doses potentiellement efficaces chez l'Homme, sans multiplier les groupes. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grands groupes d’animaux pour réaliser des tests statistiques. En amont de l’utilisation de ces 3 animaux, un 4eme animal sera utilisé uniquement pour la mise au point technique de la procédure d’administration du médicament. L’ajout de cet animal « pilote » permet de sécuriser et d’optimiser la procédure avant l’administration du candidat thérapeutique, évitant ainsi toute perte ou souffrance inutile. En fonction des résultats obtenus à partir de cet animal, l’administration du médicament pourra donc être adaptée pour raffiner la procédure.
Raffinement
Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant un mois avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les biopsies et l’administration du candidat médicament seront réalisées sous anesthésie et analgésie et un traitement analgésique post-opératoire sera mis en place. L’animal « pilote » bénéficiera d’un programme d’enrichissement, d’une période d’acclimatation et d’un suivi clinique rapproché au même titre que les 3 animaux du projet principal. En fonction des résultats obtenus à partir de cet animal, l’administration du candidat médicament pourra être optimisée afin de raffiner la procédure. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).
Choix des espèces
Les primates sont utilisés comme modèle de recherche avant de tester certains traitements chez l’Homme. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre le traitement. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier combien de temps le traitement reste actif, comment il agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis du candidat médicament testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.
Mécanismes physiopathologiques de la surdité dans les maladies de l’inflammasome.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Surexposées au bruit pendant quelques heures ou injectées trois jours de suite dans l'abdomen pour déclencher une inflammation de l'oreille, 4 660 souris sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes tuées à l'issue. Leur audition est mesurée environ toutes les deux semaines, chaque séance durant une heure, et une partie subit une chirurgie de deux heures sans réveil. L'équipe cherche à identifier les mécanismes de la perte auditive chez les patients porteurs de mutations d'un gène de l'inflammasome, symptôme qu'elle décrit comme le plus invalidant de la maladie. Le porteur affirme pourtant que ces mêmes atteintes auditives sont "largement compensées" chez la souris et n'entraînent pas de phénotype dommageable, et que les chirurgies terminales ne sont "pas susceptibles d'entraîner une douleur".
Objectifs
Les patients atteints de syndrome auto-inflammatoire rare appelé syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) présentent une inflammation chronique, une fièvre intermittente et des douleurs articulaires, ainsi que des caractéristiques très spécifiques comme une éruption type urticaire (> 95 % des patients) et des caractéristiques neuroinflammatoires telles qu'une perte auditive neurosensorielle (60 %). Les traitements actuels ciblant certaines molécules stabilisent la maladie ; cependant, dans la plupart des cas, ils ne font pas régresser la perte auditive, qui reste le symptôme le plus invalidant. Les mécanismes qui sous-tendent le phénotype de perte auditive chez les patients restent inconnus, ce qui empêche le développement de tests audiologiques et de traitements appropriés. Nous avons récemment découvert que certaines mutations pour un gène entraînaient une forme atypique de maladie avec perte auditive mais où la plupart des autres symptômes sont atténués. Notre projet a pour but i) d'identifier et de caractériser de manière approfondie chez la souris les événements responsables de la perte auditive progressive chez les individus porteurs de mutations de ce gène aux niveaux moléculaire, cellulaire et tissulaire, et ii) de décrire, aux niveaux moléculaire et cellulaire, le nouveau mécanisme physiopathologique qui sous-tend la perte auditive chez les patients porteurs de mutations. Le projet bénéficiera de modèles animaux spécifiques pour les formes classiques et atypiques de cette maladie.
Bénéfices attendus
En caractérisant les atteintes auditives dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les patients porteurs des mutations du gène étudiées. -Ce gène étant impliqué dans un complexe impliqué dans l’immunité innée, notre travail ouvrira la porte à l’identification d’autres protéines du complexe comme potentiellement impliquées dans la surdité -Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes et avec un travail similaire qui est en cours chez les patients porteurs de mutations dans ce gène, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à une mutation de ce gène. Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients porteurs de mutations de ce gène. L’existence de médicaments capables d’inhiber le complexe dont fait partie cette molécule rend cette perspective très concrète.
Procédures
Les interventions seront : - Une inflammation de l’oreille sera induite sur les modèles animaux de deux façons possibles : i) soit par une surexposition sonore de quelques heures soit ii) par l’injection d’une faible dose d’une substance dans l’abdomen sur trois jours par doses croissantes pour mimer une petite infection. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de l’activation de l’inflammation dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu approximativement toutes les deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par l’inflammation de l‘oreille. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie terminale de 2h pour faire des mesures fonctionnelles dans l’oreille.
Impact sur les animaux
La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système sensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies, celles-ci sont terminales et donc ne sont pas susceptibles d’entraîner une douleur. -En ce qui concerne l’induction de la réaction inflammatoire, celle-ci sera limitée à l’oreille et pourrait causer une douleur légère et/ou un inconfort léger. - Les doses typiquement utilisées sont 4-5 fois inférieures à celles utilisées pour induire une réaction inflammatoire forte qui peut entraîner des pertes de poids importantes les deux premiers jours après injection puis une reprise de poids les jours suivants. Aux doses plus faibles, on s’attend à pas d’effet ou un effet mineur. De plus, une douleur légère au point d’injection de et une réduction de l’activité et de la mobilité peut survenir pendant quelques jours.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.
Réduction
La détermination du nombre d’animaux a été réalisée en tenant compte à la fois des contraintes techniques (coût, hébergement, temps, etc.) et de l’expertise développée dans l’équipe sur des expériences similaires. Pour les procédures qui en nécessitent, une analyse de puissance détaillée a été effectuée. Dans toutes les procédures, des cages standard de 5 animaux seront utilisées.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des enregistrement de données sous anesthésie, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratation sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel hydrique.
Choix des espèces
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades différents. Nous étudierons les conséquences de l’inflammation principalement à des âges adultes mais nous serons amenés à considérer de temps en temps des expériences de suivi chez la jeune souris afin de s’assurer (en cas de doute) qu’il n’y a par exemple pas d’inflammation spontanée avant son induction. L’étude utilisera des animaux âgés de 0 jour (naissance) à l’âge adulte (15 mois maximum).
Évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie de quatre formulations d’anticorps chez le singe cynomolgus
- Recherche appliquée
- Cancers
8 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit trois administrations d'anticorps sur une chaise de contention, quarante minutes par séance, subit vingt-trois prélèvements sanguins pour 74 ml au total, quatre biopsies de peau sous anesthésie, et cinq isolements de moins de six heures sans eau ni nourriture pour récolter son urine. Le porteur s'attend à des lésions cutanées, à de la fièvre et à d'éventuelles déhiscences de plaie. Il présente cette étape comme "indispensable", son objet immédiat restant de choisir laquelle des quatre formulations passera en étude de toxicité réglementaire, et affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information qu'un "organisme vivant entier".
Objectifs
Ce projet va permettre d’évaluer les effets et le devenir de quatre formulations composées d’anticorps administrées à la même dose de manière répétée (x3) chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) dans le cadre du développement d’un traitement anti-cancéreux chez l’homme. L’étude permettra de sélectionner la formulation la plus pertinente pour une future étude de toxicité réglementaire. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de sélection du candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’une nouvelle modalité d'anticorps multifonctionnels capable de créer une monothérapie anticancéreuse ciblée et puissante. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de sélectionner le meilleur candidat mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.
Procédures
Tous les animaux du projet auront les mêmes procédures. Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à trois reprises un candidat médicament. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Les animaux auront également 23 prélèvements de 1 à 9,3ml, pour une volume total prélevé de 74 ml sur 5 semaines. Les animaux seront vigiles. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris) Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie comprise) Cinq récoltes d’urine (environ 2 ml) seront également réalisées. Pour cela, les animaux seront isolés dans les compartiments de la volière afin de réaliser une collecte d’urine individuelle. Les urines seront récoltées de manière non invasive L’isolement durera moins de 6 heures. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Une réaction systémique de type fièvre peut éventuellement apparaître les jours suivant les administrations. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieur à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). La récolte d'urine sera réalisée directement dans le module d'isolement présent dans les volières d'hébergement L'animal sera physiquement isolé de ses congénères pendant une durée inferieur à 6h, ce qui peut induire un stress léger. Pendant cet isolement l’animal n’aura pas accès à l’eau et à l’alimentation ce qui pourra engendrer un stress et un inconfort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité des candidats médicaments.
Remplacement
Les études de pharmacocinétique et de toxicité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la biodisponibilité des candidats médicaments et permettent d’affiner la connaissance de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.
Réduction
Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 8 primates répartis en 4 lots de 2. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables.
Raffinement
Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.
Choix des espèces
La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. De plus, une analyse de la conservation phylogénétique de la cible de l’anticorps testé a montré une divergence de séquence et une conservation incomplète des profils d'expression chez la souris et le rat alors que les séquences de cette cible chez les primates se sont révélées identiques à 95–100 % à la séquence humaine. Ces résultats démontrent rigoureusement que les espèces de primates constituent des modèles fiables pour tester la pharmacocinétique (PK) et la toxicité de cet anticorps. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau pendant l’étude et des prélèvements d’organes seront réalisés en fin d’étude dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.
Évaluation de plusieurs modalités de contention chez le porc
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
75 porcs de six à dix semaines subissent chacun dix contentions au lasso réparties sur quatre semaines, plus vingt prélèvements de salive, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le filin d'acier serré autour de la mâchoire supérieure peut provoquer des douleurs aux points de contact avec le corps, sur un groin que le porteur décrit lui-même comme un organe sensible. Une prise de sang à la jugulaire et un écouvillonnage nasal accompagnent les contentions. Le projet est déclaré au titre du bien-être des animaux non-humains, et se termine par la dissection des 75 porcs pour vérifier l'état de leur groin et chercher des ulcères gastriques.
Objectifs
Certains actes vétérinaires, en élevage commercial ou lors de projets de recherche, nécessitent l’immobilisation complète des porcs pour la sécurité des animaux eux-mêmes comme des opérateurs qui les réalisent. Cette contention est communément effectuée par l’utilisation d’un filin généralement en acier (dit « lasso ») disposé autour de la mâchoire supérieure de l’animal. Le groin étant un organe sensible, la pression exercée par un lasso sur le groin peut se révéler douloureuse. Cette opération peut aussi être dangereuse pour les opérateurs compte tenu des réactions parfois violentes des animaux. Que ce soit pour l’amélioration du bien-être des animaux, des opérateurs réalisant les actes vétérinaires ou par souci de rendre les résultats des projets scientifiques de meilleure qualité, les recherches sur l’impact de la contention des animaux sont cruciales. L’outil communément utilisé ne donne pas entière satisfaction. Son remplacement ou son perfectionnement sont par conséquent primordiaux pour les études chez le porc. À notre connaissance, il existe également aucune étude qualifiant les niveaux de stress des animaux placés en contention. Notre projet se propose donc d’évaluer l’état de stress des porcs en croissance lors de deux actes vétérinaires communément réalisés sous contention au lasso pour obtenir des valeurs de référence : une prise de sang à la veine jugulaire et un écouvillonnage nasal. Conjointement, deux dispositifs alternatifs de contention pressentis pour générer moins de stress chez l’animal (un lasso recouvert d’une gaine de protection en matière plastique et une cage de contention) seront mis à l’épreuve. Ces évaluations des niveaux de stress s’appuieront sur l’utilisation d’indicateurs physiologiques et comportementaux. Le bien-être de l’opérateur réalisant la contention étant tout aussi important et pouvant directement affecté le bien-être des animaux (approche OneWelfare), nous réaliserons en parallèle une évaluation de l’ergonomie des différents outils et une appréciation du ressenti des opérateurs.
Bénéfices attendus
Ces évaluations complètes des niveaux de stress vont nous permettre d’obtenir des valeurs de référence sur les niveaux de stress ressentis par les porcs lors des contentions classiques réalisés au lasso filin acier ; ainsi qu’avec deux outils de contention alternatifs. Cela devrait nous permettre d’émettre des recommandations pour le développement de futurs outils de ce type aussi bien en faveur du bien-être des animaux, de la sécurité et du confort des opérateurs, tout en s’assurant de la qualité des actes vétérinaires effectués. S’il s’avère qu’un des dispositifs alternatifs testés dans le projet minimise le stress des animaux et des opérateurs, il pourrait également directement être recommandé en substitution des lassos communément utilisés. La mise en évidence d’un outil fonctionnel, bénéfique pour les animaux et les opérateurs, qui de surcroît garantit la qualité des actes effectués représenterait une formidable opportunité pour la réalisation de nombreuses recherches à venir par la facilité de prélèvements sur les animaux.
Procédures
Les porcs seront soumis à 10 contentions au total réparties sur 4 semaines. Les contentions dureront 1 minute. Lors de ces contentions, une prise de sang à la veine jugulaire ainsi qu’un écouvillonnage nasal seront réalisés. Ils auront également 20 prélèvements salivaires répartis sur 5 semaines. Ces prélèvements seront effectués par mâchouillement volontaire et spontané des animaux préalablement habitués.
Impact sur les animaux
Afin de rendre compte du stress subi par les animaux lors des contentions, ces derniers vont nécessairement être exposés à des contentions multiples ainsi qu’à des actes de prélèvements de type vétérinaires. Il est attendu que ces contentions génèrent des stress de courtes durées liés aux manipulations. Les animaux pourront aussi potentiellement ressentir des douleurs aux points entre les dispositifs de contention et leur corps (ex : pression de la sangle du lasso serrée autour de la mâchoire supérieure), tout comme aux zones de réalisation des actes invasifs (cou pour la prise de sang à la veine jugulaire ; naseau pour l’écouvillonnage nasal).
Devenir
En fin d’essai, au cours des autopsies, les animaux seront disséqués afin d’apprécier l’état des parties anatomiques en contact avec les outils de contention (ex : groin), ainsi que la présence d’ulcères gastriques (signe de stress chronique chez l’animal).
Remplacement
Le projet concerne spécifiquement l’espèce porcine. Les animaux eux-mêmes sont nécessaires, le processus de stress étant un état complexe et dynamique que l’on ne peut pas recréer sans considérer l’individu dans son entièreté.
Réduction
Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de porcs utilisés tout en conservant un effectif suffisant pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Le stress ressenti lors d’une manipulation est propre à chaque individu. Par ailleurs, il existe également une variabilité inter-individuelle de réponse propre aux différents dispositifs de contention qui vont être testés. Le groupe des animaux témoins pour lequel l’absence de dispositif de contention n’engendrera pas de variabilité supplémentaire a été par conséquent légèrement réduit.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine leur sera distribuée. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal pendant toute la durée de la procédure expérimentale.
Choix des espèces
Ce projet concerne directement la filière porcine, affectée par la problématique des prélèvements invasifs à effectuer sur animal vigile. Le porc est l’espèce cible. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs de ladite étude. Les animaux seront testés de 6 à 10 semaines d’âge, ce qui correspond à la fin de la période du post-sevrage en élevage. Ce choix est fait en raison de la facilité de mis au point des alternatives utilisées dans les essais (taille restreinte des outils) et sera, de toute façon, déclinable sur des animaux plus agés en augmentant au besoin la taille du dispositif.
Evaluation de nouveaux traceurs d’imagerie dans un modèle murin femelle sous-cutané de glioblastome
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Trois heures d'imagerie sous anesthésie gazeuse, avec l'hypothermie que cela entraîne : 290 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent d'abord une greffe de cellules de glioblastome sous la peau, dont la croissance dégrade leur état général, puis une injection de radiotraceur par cathéter, geste qui peut laisser un hématome. Le travail vise à repérer par imagerie deux enzymes du métabolisme d'un acide aminé, marqueurs possibles de cancers et de maladies du système nerveux. Le porteur retient des souris immunodéficientes de six à dix semaines, jeunes précisément pour qu'une "légère immunocompétence" ne fasse pas rejeter la greffe.
Objectifs
Nous développons de nouveaux outils d’imagerie médicale appelés traceurs, qui permettront d’observer directement dans le corps deux enzymes importantes liées au métabolisme d'un acide aminé présent dans de nombreux tissus et cellules du corps humain. Quand ce métabolisme est perturbé, cela peut être lié à de nombreuses maladies, allant du cancer à des troubles du système nerveux (comme certaines maladies du cerveau). Ces perturbations entraînent souvent une augmentation de la quantité de ces enzymes. Pouvoir les détecter dans le corps pourrait donc aider à diagnostiquer certaines maladies, notamment les tumeurs, ou même à développer de nouveaux traitements. Il existe déjà des traceurs à base de tryptophane pour ce type d’imagerie, mais ils sont difficiles à fabriquer à cause de la complexité du processus de marquage radioactif. Une autre solution consiste à créer de nouveaux traceurs à partir de petites molécules capables de se fixer directement sur ces enzymes, plutôt que d’utiliser l'acide aminé lui-même.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traceurs d’imagerie capables de se lier spécifiquement à deux enzymes majeures du métabolisme de l'acide aminé. Après une caractérisation plus précise de leurs propriétés, ces traceurs pourraient être proposés pour le diagnostic, le suivi et le traitement de nombreuses affections cancéreuses ou neurologiques.
Procédures
Injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse 1 fois pendant 10 min par animal. injection sous anesthésie gazeuse suivi d'une imagerie de 3h, 1 fois par animal pendant 5 min.
Impact sur les animaux
La manipulation avant l’anesthésie entraine un léger stress chez l’animal. L’injection des cellules peut infliger une douleur correspondant à celle d’une piqûre d’aiguille. La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale. Une hypothermie durant l’imagerie induite par l’anesthésie gazeuse. Un hématome peut se former suite à la cathéterisation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des études d’immunohistochimie cérébrales complémentaires aux études d’imagerie.
Remplacement
L’objectif du projet étant de développer un traceur d’imagerie utilisable chez l’humain, aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier, étant donnée la complexité des processus mis en jeu telles que les interactions avec le microenvironnement tumoral et ne permet d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution et le développement de nouveaux radiotraceurs d'imagerie.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. La première étude permet grâce à l’imagerie d’évaluer la cinétique du radiotraceur après une injection intra-veineuse. Les moyennes de captation du traceur dans la tumeur et les différents tissus seront comparés entre les 2 groupes d’animaux par des tests statistiques. Nous prévoyons d’inclure un total de 28 animaux par traceur (2 groupes de 14 animaux) et par lignée cellulaire, toutefois, ce nombre de 14 animaux par groupe représente une valeur maximale car les sessions d’imagerie seront réalisées séquentiellement, à raison de 2 à 3 animaux/groupe. Pour exemple, si un traceur ne se fixe pas du tout dans la tumeur car il ne passe pas la barrière tumorale alors les sessions d’imagerie ne seront pas répétées et le nombre d’animaux utilisé sera moindre. Ces sessions d’imagerie seront répétées si nécessaire, jusqu’à atteindre, le cas échéant, le plafond des 14 animaux/groupe.
Raffinement
Dès leur arrivée, les souris seront hébergées en portoir ventilé afin d’empêcher l'installation du phénotype dommageable lié à l’immunodéficience. Elles seront hébergées en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique) et observées quotidiennement. Lors de l’injection tumorale en sous cutanée, les souris seront anesthésiées en gazeux et placées sur un tapis chauffant et une protection oculaire sera appliquée. Après ces implantations, les animaux seront récompensés (morceau de fruit...) et auront une surveillance accrue jusqu'à l'imagerie. Nous prendrons soin de mesurer tous les jours pendant 5 jours, l’évolution de la tumeur grâce à un pied à coulisse. Avant l'imagerie, les animaux auront une phase d'habituation à l'environnement de la pièce pour éviter le stress lors de l'imagerie. Pour cette dernière (maximum 3h), les animaux seront anesthésiés en gazeux, une protection oculaire sera appliquée, les souris seront maintenues dans un lit thermorégulé (environ 37°C) et la température corporelle sera monitorée. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Etude de la maladie chronique rénale associée à la glycogénose de type 1a dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Un morceau d'oreille prélevé sur des nouveau-nés de sept à dix jours, un rein retiré par chirurgie à deux ou trois mois pour accélérer la maladie, puis quinze mois de suivi : 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent six recueils d'urine et quatre prises de sang en tube de contention, sur animal éveillé, avant un jeûne de six heures le dernier jour. Le porteur décrit une maladie rénale qui reste silencieuse jusqu'à un stade très avancé, autour de quinze mois, où les souris commencent à perdre du poids, à se toiletter moins, à se prostrer et à moins se déplacer. Toutes sont tuées pour qu'on prélève leurs reins, leur intestin, leur foie, leur hypophyse, leur hypothalamus et leurs gonades.
Objectifs
La glycogénose de type 1 est une maladie génétique rare caractérisée par une incapacité de l’organisme à produire du sucre en dehors des repas. La maladie se caractérise par des chutes des taux de sucre dans le sang (hypoglycémies) sévères, rapidement entre les repas. A l’âge adulte, la plupart des patients développent une maladie rénale, qui reste longtemps silencieuse mais détectable par mesure de marqueurs urinaires (présence d’albumine dans les urines ; albuminurie). En progressant lentement, elle évolue vers une insuffisance rénale caractérisée par une perte de la fonction du rein et l’accumulation de déchets dans le sang. A ce stade, les patients présentant aussi des kystes (formation d’un « sac » rempli de liquide) sur la surface des reins ou dans les reins. Des études récentes ont montré que dans cette maladie les cellules du rein ont la capacité de se multiplier de façon anormale ce qui favorise le développement de kystes et possiblement de cancers (2 cas décrits chez des patients atteints de glycogénose de type 1. A l’exception d’un contrôle nutritionnel, il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour limiter l’avancée de la maladie rénale. La dialyse puis la transplantation rénale sont les seules solutions lorsque l’insuffisance rénale est atteinte. Le développement de cette maladie a été reproduit chez la souris en ciblant la mutation génétique de la glycogénose de type 1 uniquement dans les reins, ce qui permet d’éviter les épisodes d’hypoglycémie car le foie peut produire du sucre dans ce modèle animal. Comme chez l’homme, l’évolution de la maladie rénale est lente et silencieuse mais irréversible et mène à une insuffisance rénale au bout de 15 mois environ, avec l’apparition de kystes. Les premiers signes cliniques (albuminurie) apparaissent entre 6 et 9 mois, et la maladie peut être suivie par le dosage des mêmes marqueurs biologiques que chez les patients. Le but de ce projet est d’identifier les cellules et les mécanismes impliqués dans le développement des kystes, voire des cancers rénaux. Pour accélérer le développement de la maladie rénale, un rein sera enlevé au cours d’une chirurgie peu invasive. Dès les premiers signes d’insuffisance rénale, les reins seront prélevés pour des études moléculaires. Cette étude sera réalisée chez des animaux des deux sexes et devrait également permettre de comprendre les mécanismes à l’origine du retard d’apparition de la maladie chez les femelles par rapport aux mâles.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif qui permette d’endiguer la mise en place de l’insuffisance rénale sévère sur le long-terme. Cette complication est pourtant importante chez les patients atteints de glycogénose de type 1 puisque plus de 70-80% développent une maladie chronique rénale. Du fait du faible nombre de patients, nous n’avons pas le recul nécessaire pour évaluer les risques associés à l’apparition de kystes chez les patients, ni l’incidence de cancers rénaux. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’évolution de la maladie à long-terme, permettant ainsi une meilleure prise en charge des patients. Plus précisément, identifier d’éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques est primordial pour développer des thérapies efficaces
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Les animaux subiront une intervention chirurgicale courte (durée d’environ 15 minutes) à l’âge de 2/3 mois permettant l’ablation d’un des deux reins, sous anesthésie générale (maximum 30 minutes d’anesthésie) et après injection d’analgésiques (2 injections le jour de la chirurgie et 1 injection/jour pendant les 2 jours post-chirurgie, nécessitant quelques secondes/injection). Au cours du temps, les souris vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les 3 mois à partir de 6 mois. L’animal peut subir un léger stress (qui entraine le déclenchement de la production d’urine), même si ce geste ne nécessite pas forcément la contention de l’animal. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 12 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine. La piqûre peut engendrer une faible douleur et un stress lié à l’immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, 6 prélèvements d’urine et 4 prélèvements de sang seront réalisés. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Même si la glycémie reste constante, les animaux peuvent subir un léger stress. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
A l’âge de 7-10 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie au bord de l’oreille afin d’analyser leurs gènes. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. À l’âge de 2 ou 3 mois, les souris subiront l’ablation d’un rein sous anesthésie générale. Après l’opération, elles peuvent ressentir un peu de douleur et d’inflammation. Dès 6 mois, les souris peuvent développer une maladie rénale sans impact sur le bien-être animal jusqu’au stade très avancé de la maladie caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois). A ce stade, les animaux commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Pour suivre le développement de la maladie, des prélèvements urinaires spontanés seront effectués, ce qui peut provoquer un très léger stress. Les animaux subiront aussi des prises de sang après leur immobilisation dans un tube de contention. Ces gestes peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. Enfin, en fin de protocole, les animaux sont mis à jeun pendant 6h ce qui peut entrainer un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin, du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et des testicules ou ovaires afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires
Remplacement
Aujourd’hui, il est possible de fabriquer en laboratoire de petits modèles de reins (appelés organoïdes) qui reproduisent les différents types de cellules présentes dans cet organe. Mais ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution de la maladie rénale ni le développement de tumeurs sur une longue période. Pour cela, il est indispensable d’avoir recours à des études chez l’animal, sur plusieurs mois. Le modèle de souris utilisé dans ce projet est le seul à reproduire fidèlement tous les problèmes rénaux observés dans la glycogénose de type 1. Ce modèle a été créé grâce à une méthode spécifique à la souris. De plus, le métabolisme de la souris est très proche de celui de l’être humain. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale été faite chez la souris. Il existe donc beaucoup de données scientifiques et d’outils disponibles pour poursuivre ces recherches dans ce modèle. Enfin, il est très difficile de mener ce type d’étude chez l’humain, car la glycogénose de type 1 est une maladie très rare (environ 1 naissance sur 100 000), ce qui rend les recherches sur des patients très limitées.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 24 souris, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, les souris « contrôles » qui ne présenteront pas la perte du gène ciblé dans les reins seront issues des mêmes reproductions. Les expériences que nous prévoyons exigent de petites quantités de tissu rénal pour différentes analyses en laboratoire. Comme les échantillons disponibles sont très limités, nous devons organiser les prélèvements de manière à pouvoir réaliser toutes les analyses prévues sans gaspillage. Le protocole durera 15 mois, donc nous devons aussi anticiper la possibilité que certaines souris ne puissent aller jusqu’au bout de l’étude, en prévoyant une marge de sécurité (une souris en plus par groupe). En tout, nous aurons 4 groupes expérimentaux, chacun composé de 6 souris, soit 24 souris par série d’expérience. L’étude sera réalisée sur des souris des 2 sexes car des résultats précédents suggèrent une progression plus lente de la maladie rénale chez les femelles ; nous doublerons ces groupes, ce qui portera le nombre total de souris à 96 : 48 souris malades et 48 souris saines servant de témoins. Enfin, nous veillerons à limiter la production d’animaux en n’utilisant que les souris nécessaires, et en utilisant les animaux surnuméraires uniquement pour maintenir nos lignées. Une fois le nombre requis atteint, les reproductions seront arrêtées. Nos lignées de souris sont d’ailleurs conservées à long terme par congélation, ce qui nous évite d’avoir à produire des animaux en continu. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera au maximum 96 souris, incluant l’obtention de 48 souris transgéniques atteintes de la maladie rénale de la glycogénose de type 1 et de 48 souris contrôles, sans signes de maladie.
Raffinement
Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10 jours après la naissance, un âge où les nerfs ne sont pas encore complètement développés. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et au contact avant le début des procédures. Un petit tunnel sera aussi utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. La glycogénose de type 1 sera déclenchée uniquement dans les reins, ce qui permet aux souris de continuer de produire du sucre normalement grâce au foie, et ainsi d’éviter de baisses de sucre dans le sang. Lors du retrait d’un rein, les souris recevront un médicament contre la douleur avant et après l’opération. Une crème analgésiante sera aussi appliquée sur la peau, et la température corporelle sera maintenue pendant la chirurgie grâce à une plaque chauffante. Les interventions se feront dans des conditions stériles pour éviter les infections. Après l’opération, les souris seront isolées au chaud et surveillées pour s’assurer qu’elles se réveillent bien et sans souffrance. Elles retrouveront leur groupe au réveil. Pour les prises de sang, la veine sera dilatée par le chaud pour faciliter le prélèvement. Le volume de sang prélevé sera très limité selon les recommandations. Les souris seront habituées aux tubes dans lesquels elles seront placées pendant ces prélèvements, pour réduire leur stress. Les analyses d’urine se feront sans manipulation forcée : nous attendrons que les souris urinent spontanément, ce qui évite de les isoler dans des cages spéciales. Concernant la maladie elle-même : Les premiers signes ne provoquent pas de souffrance visible (c’est une maladie dite « silencieuse »). Les symptômes graves, comme une forte perte de poids ou une dégradation de l’état général, apparaissent tardivement, et indiquent la fin du protocole. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude, ou plus tôt si leur état de santé se détériore, afin de prélever les différents organes dont les reins.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans le corps. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, ce modèle de souris est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatale. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement puisque la perte de la fonction rénale qui est progressive. Voici comment se dérouleront les principales étapes du suivi : • Un prélèvement de tissu sera réalisé entre 7 et 10 jours après la naissance pour sélectionner les souris porteuses de la maladie. • À l’âge de 2 à 3 mois, une intervention chirurgicale peu invasive (le retrait d’un rein) sera réalisée. • Ensuite, nous effectuerons des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole.
Evaluation de l’effet de principes actifs sur la perte osseuse induite par ovariectomie chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
L'ablation des deux ovaires sert ici à fabriquer un modèle d'ostéoporose post-ménopausique sur lequel seront évaluées de nouvelles molécules candidates. 500 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées et autopsiées à l'issue. Après une chirurgie de 30 à 40 minutes, elles reçoivent des traitements répétés pendant cinq mois, deux injections sous-cutanées de marqueurs osseux et des prises de sang à la jugulaire, sur animal éveillé, jusqu'à une fois par semaine. Le porteur liste parmi les effets possibles des molécules testées des cris, de l'agitation, des difficultés respiratoires, des diarrhées et une nécrose au site d'administration, puis conclut que l'utilisation d'animaux est "indispensable".
Objectifs
Avec l’allongement de l’espérance de vie, l’ostéoporose et les fractures qui lui sont associées représentent un problème de santé publique important : autour de l’âge de 65 ans, on estime que 39% des femmes souffrent d’ostéoporose. En effet, la ménopause est une période clé pour la santé de la femme car elle s’accompagne de modifications physiologiques comprenant, notamment, une modification de la composition corporelle (baisse de la masse maigre et augmentation de la masse grasse) et un changement de la répartition des graisses corporelles conduisant notamment à un risque élevé pour la santé cardiovasculaire, métabolique , ostéo-articulaire et musculaire (perte de densité osseuse, fonte musculaire, …). A ce jour les traitements existants réduisent la perte osseuse mais présentent des effets secondaires importants qui peuvent altérer la qualité de vie des patients. Le présent projet a donc pour but d’évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques pouvant cibler la perte osseuse dans un contexte d’ostéoporose sans induire d’effets néfastes. L’objectif du projet est donc d’évaluer l'effet de nouvelles molécules thérapeutiques sur le processus de formation et de résorption de l’os dans un modèle d’ostéoporose induite par ovariectomie chez le rat (modèle qui consiste à retirer les ovaires de l’animal, mimant l’ostéoporose post-ménopause rencontrée chez l’Homme, décrit et reconnu par la communauté scientifique), afin de proposer aux professionnels de la santé et aux patients des approches thérapeutiques plus appropriées. Ce modèle d’ostéoporose induite par ovariectomie a pour principaux avantages (i) de mimer le développement d’une ostéoporose post-ménopause, avec une reproductibilité élevée pour analyser de manière robuste et efficace les mécanismes mis en jeu dans le développement de la pathologie et dans la réponse induite par les nouvelles molécules thérapeutiques testées (ii) d’accéder à de plus amples informations indispensables au développement de nouvelles approches thérapeutiques (iii) d’être prédictif en clinique de l’activité des nouvelles molécules thérapeutiques testées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra à court terme d’obtenir des informations sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité des nouvelles molécules thérapeutiques étudiées au niveau général et osseux (ii) l’efficacité des nouvelles molécules thérapeutiques étudiées dans un contexte d’ostéoporose. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle des modifications physiologiques ayant lieu post-ménopause, d’établir des diagnostics robustes et de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une opération chirurgicale unique réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie pré- et post-opératoire afin de réaliser l’ablation des ovaires. Cette opération dure 30 à 40 minutes par animal. Les traitements à tester seront appliqués plusieurs jours avant et/ou après l’induction du modèle et répétés tout au long de la durée de l’étude, 5 mois maximum après l’ablation des ovaires. Chaque administration dure 1 à 2 min. La fréquence d’administration des traitements sera définie selon le mode d’administration ainsi que selon le ou les nouvelles molécules thérapeutiques utilisées pour chaque étude. Des injections sous-cutanées de produits permettant le suivi de la formation osseuse seront réalisées dans les 2 dernières semaines du protocole. Chaque animal recevra 2 injections à 1 semaine d’écart, chacune durant de 1 à 2 min. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire pourront également être réalisés, ces prélèvements auront lieu sur animal éveillé, dureront moins de 5 min par animal, et pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.
Impact sur les animaux
Des nuisances liées au modèle et à l’induction et au développement de l’ostéoporose. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par l’acte chirurgical, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de l’incision réalisée pour l’ablation des ovaires. Des nuisances liées aux nouvelles molécules thérapeutiques à tester peuvent être rencontrés, tels qu’une perte de poids, un comportement anormal de l’animal (prostration, état défensif, hérissement des poils, vocalisation anormale, …), une toxicité durant l’administration (cri, agitation, difficultés respiratoires, diarrhées, inflammation/nécrose au site d’administration). Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyés d’une veille bibliographique inhérente aux nouvelles molécules thérapeutiques à tester.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les os, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et synoviaux seront utilisés pour doser le principe actif et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les principes actifs et/ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.
Remplacement
De manière générale, les nouvelles molécules thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des molécules thérapeutiques testées, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies rhumatismale, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes et la complexité de la pathologie. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture in vitro. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs à tester, 10 animaux par groupe et 10 conditions (groupes) au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le raffinement du nombre des animaux. Ce nombre d’animaux a été déterminé à partir de nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu à la baisse après analyse des premiers résultats avant chaque protocole et dans le cas où le traitement évalué est connu (e.g., traitement de référence), afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des traitements anti-douleur dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué ainsi qu’un suivi approfondi au minium 2 fois par semaine, avec prise de poids et observations des caractéristiques spécifiques au modèle, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de l’incision réalisée pour l’ovariectomie. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs point(s) limite(s) (repérés le plus précocement possible grâce au suivi clinique et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort (lors de l’administration du traitement expérimental, des prélèvements de sang et lors des prises de mesures).
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et des réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observées chez l'Homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent d’extrapoler assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent l’extrapolation des petits animaux aux humains (première dose de principe actif chez l’homme) connue sous le nom de dose équivalente humaine (HED)) dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux molécules thérapeutiques. Les rats femelles et adultes auront dépassé la majorité squelettique (âgés de plus de 10 semaines). Autrement-dit leur squelette ne sera plus en phase de croissance.
Etude des réseaux de gènes impliqués dans la comorbidité entre la douleur chronique et les troubles anxio-dépressifs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant une chirurgie de 45 minutes qui installe une douleur neuropathique durable, sept tests comportementaux, un jeûne de 24 heures et un isolement de 24 heures. Le porteur écrit que la douleur et le phénotype anxio-dépressif "ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que le protocole consiste précisément à produire une douleur chronique doublée d'un état anxio-dépressif et à la laisser durer. L'effectif de 1 440 animaux est rapporté à la littérature, à l'expérience de l'équipe et à la variabilité entre individus, sans qu'aucun calcul soit donné.
Objectifs
La douleur chronique est étroitement liée aux troubles émotionnels et constitue la principale cause d’invalidité, impactant de manière significative la qualité de vie des patients. Elle représente un fardeau économique majeur pour la société, avec des coûts estimés à plus de 800 millions d’euros en Europe. Environ 30 % des patients souffrant de douleur chronique développent des troubles anxio-dépressifs. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette comorbidité. À travers une étude transcriptomique, nous avons identifié une liste de gènes potentiellement impliqués dans cette pathologie. Pour valider ces cibles, nous prévoyons de manipuler leur expression sur un modèle murin in vivo à l’aide d’une approche virale, afin d’évaluer leur impact sur la chronicisation de la douleur et le développement du phénotype anxio-dépressif.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’élucider les réseaux de gènes impliqués dans la chronicisation de la douleur neuropathique et de ses conséquences anxio-dépressives et donc éventuellement la mise en place d'une stratégie thérapeutique permettant de soulager et prévenir la douleur et les troubles émotionnels associés.
Procédures
- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale de 45 minutes - Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur (15 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 4 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test) - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental et un isolement unique de 24h pour un autre test avec un délai minimal d’une semaine entre les 2 tests. - Les animaux subissent une chirugie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 1/3 MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Anesthésiées vingt minutes, ouvertes sur un centimètre d'abdomen, injectées de cellules tumorales dans le foie : les souris de ce protocole repassent ensuite sous anesthésie jusqu'à sept fois en six semaines pour des échographies et des imageries. Entre le troisième et le dix-septième jour après la greffe, elles reçoivent jusqu'à six injections de traitement, dont la moitié sous anesthésie. 882 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur présente ce suivi répété du même individu comme une réduction "drastique" du nombre d'animaux. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure et leurs organes prélevés.
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale avec l’action de virus capable d’éliminer préférentiellement des cellules cancéreuses dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm comportant des modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’effet protecteur et curatif de la vaccination, ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus ciblant les cellules cancéreuses, seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins en cours de test contre le cancer du foie utilisent surtout de petits morceaux de protéines fabriqués en laboratoire pour apprendre au système immunitaire à reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. De récentes avancées dans l’utilisation de l’ARNm et des nanoparticules ouvrent la voie à une nouvelle génération de vaccins contre le cancer. Par exemple, des essais sur le cancer de la peau ont montré qu’associer une immunothérapie ciblée avec un vaccin à ARNm transporté par des nanoparticules lipidiques pouvait renforcer la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Le projet présenté ici innove en combinant deux approches puissantes : d’une part, des virus spéciaux qui attaquent directement la tumeur et facilitent l’accès du système immunitaire aux cellules cancéreuses, et d’autre part, un vaccin à ARNm qui entraîne le système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales. Cette stratégie combinée vise à : (1) apprendre au système immunitaire à cibler précisément la tumeur grâce au vaccin, et (2) intensifier la destruction des cellules cancéreuses par l’action des virus, tout en stimulant davantage la réponse immunitaire.
Procédures
Un lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, réalisé dans l’EU1. Un autre lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), puis 7 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (5 imageries réalisées dans l’EU2 et 2 échographies réalisée dans l’EU3). D’autres lots d’animaux auront une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), avec anesthésie (5 minutes pour l’injection) pour la moitié des animaux, entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 5ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection) sous anesthésie (5 minutes) entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2). Un 6ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une à deux injections de 30 secondes selon la pousse tumorale, suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 7ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une à deux injections (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2).
Impact sur les animaux
Un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal dans le cadre des différentes interventions (injection, anesthésie, mesure de la taille des tumeurs) et une douleur légère peut apparaitre au point d'injection (cellules tumorales et traitement). La chirurgie pour injecter les cellules tumorales dans le foie peut entrainer une douleur post-opératoire au niveau de la suture, voire une infection locale. Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe complexe composé de nombreux types de cellules, dont les hépatocytes et des cellules immunitaires. Les modèles classiques en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permettent pas de reproduire cette complexité. Des modèles plus avancés, comme les organoïdes ou les organes sur puce, imitent mieux certaines fonctions du foie et seront utilisés pour évaluer la toxicité des traitements. Cependant, ce projet repose sur des interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et l’environnement du foie. Aucun modèle de laboratoire ne permet aujourd’hui de recréer cette dynamique, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal
Réduction
Les traitements seront analysés et présélectionnés par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleurs traitements contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans le projet et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seuls les traitements présentant un intérêt seront testés chez la souris. Un suivi au cours du temps, sur un même individu, de la taille des tumeurs sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance de la tumeur par mise à mort des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Pour limiter la souffrance animale, la taille des tumeurs sera suivie afin qu’elles ne dépassent jamais les limites acceptées en recherche sur le cancer. Nous améliorerons aussi notre protocole en nous appuyant sur des études montrant que les nanoparticules utilisées sont bien tolérées et que le moment de la journée où la greffe est réalisée peut influencer son succès. Ainsi, nous choisirons le moment le plus adapté. L’utilisation d’analgésique et d’anesthésique sera réalisée lorsque nécessaire et des points limites prédictifs et précoces, basés sur des grilles score adaptés aux interventions sur l’animal, avec des critères d’arrêt seront mis en place afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur compétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Étude d’une famille d’enzyme, les métalloprotéases matricielles, en tant que biomarqueurs pour le diagnostic non-invasif de la fibrose du foie.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Les souris dont l'état moribond persiste malgré les soins sont tuées pour abréger leur agonie, seuil que le porteur inscrit noir sur blanc dans ses points limites. 972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent d'abord deux à quatre semaines d'un régime alimentaire qui déclenche une fibrose du foie, atteinte dont le porteur chiffre lui-même la durée à une à six semaines, puis certaines reçoivent une pompe implantée par chirurgie et passent 24 heures seules sur une grille pour qu'on recueille leurs urines. L'objectif est un test urinaire de diagnostic de la fibrose hépatique, dont le bénéfice pour les malades est renvoyé au long terme, quand la maladie induite chez les souris, elle, est immédiate.
Objectifs
La fibrose du foie est un problème de santé publique en France et dans le monde car elle concerne un grand nombre de malades. Elle est la conséquence de toutes les maladies chroniques du foie et aboutit inéluctablement à la cirrhose en l’absence de traitement, voire au cancer du foie. Cette maladie implique directement des composants biologiques appelés les métalloprotéases matricielles (MMP) qui sont produites par presque toutes les cellules du foie. Les MMP jouent ainsi un rôle dans l’initiation, la progression et la résolution de la fibrose du foie. L’expression et l’activation de ces MMP varient en fonction du stade pathologique, ce qui en fait des marqueurs biologiques potentiellement pertinents pour le diagnostic précis de la fibrose du foie et le suivi de sa régression potentielle ou de sa progression vers des formes sévères. De plus, certains inhibiteurs de MMP pourraient permettre de guérir certaines formes de fibrose du foie. Ainsi, ce projet a pour objectif de développer et valider de nouveaux outils de diagnostic de la fibrose hépatique qui permettent de détecter l’activité des MMP de manière non-invasive dans des échantillons urinaires. Ce projet a aussi pour but de tester in vivo l’effet de certains inhibiteurs de MMP sur l’évolution de la maladie.
Bénéfices attendus
Les études réalisées dans ce projet vont permettre de valider de nouveaux outils pour le diagnostic plus précis de la fibrose du foie, de son évolution et de la réponse des malades aux traitements. C’est donc la prise en charge même des malades qui devrait bénéficier de ces travaux à terme. De plus, le projet devrait conduire à l’identification de composés aux effets thérapeutiques. A terme, c’est donc le pronostic des malades qui pourrait bénéficier de ce projet.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier pendant 2 à 4 semaines qui permet le développement de la fibrose du foie. Certains animaux recevront une seule dose du composé de diagnostic étudié (1 min), tandis que d’autres animaux auront une seule intervention chirurgicale courte de 5-10 minutes pour placer une pompe permettant de diffuser en continu un inhibiteur de MMP testé comme traitement de la maladie. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus lors de l’étude sont une souffrance occasionnée par le développement de la fibrose du foie (qui s’étendra sur 1 à 6 semaines), une éventuelle douleur et/ou une potentielle légère infection au niveau du point d’administration du composé de diagnostic étudié (qui durera quelques minutes à quelques heures), un stress dû aux manipulations des animaux pendant les procédures expérimentales (qui ne durera que de brèves minutes) et un stress lié à l’hébergement individuel sur une grille pendant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines.
Devenir
L’étude de nouveaux composés pour le diagnostic et le traitement de la fibrose du foie nécessite de connaitre exactement le stade de développement de la fibrose au moment du diagnostic et/ou du traitement. Pour cela, il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin de récupérer leur foie et de procéder à son analyse.
Remplacement
Etudier les propriétés de diagnostic et de traitement des composés nécessite le recours à des organismes entiers, pour suivre les effets locaux et systémiques. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les composants biologiques qui entrent en jeu dans la fibrose du foie.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux : - les doses des composés qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum (deux doses par composé); - chaque procédure expérimentale sera réalisée sur le plus petit nombre d’animaux par groupe déterminé via l’utilisation d’une application calculant les tailles d'échantillons minimales nécessaires pour qu’elles soient valables sur le plan statistique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi comprenant des maisons et des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoir en papier pour leur nid, et des bâtonnets en bois à ronger. Les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue tout au long du déroulement des expériences. Afin de détecter et de limiter la souffrance et/ou la détresse des animaux, une surveillance de leur état général et leur comportement sera réalisée grâce à une grille de suivi utilisant un ensemble d’indicateurs suffisamment prédictifs et spécifiques au projet. Si un état moribond persiste malgré l’application de soins appropriés, les animaux concernées seront mis à mort pour arrêter leurs souffrances au plus vite. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs à l’administration unique de l’outil de diagnostic, un collyre sera appliqué localement sur le site d’injection et l’injection sera réalisée dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par la chirurgie permettant de placer une pompe qui diffuse en continue le traitement, une analgésie locale sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse. Pendant toute la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis au chaud à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Enfin, pour réduire ou supprimer le stress lié à l’hébergement individuel sur grille durant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines, les animaux maintiendront un contact visuel, olfactif et auditif car les cages sont transparentes, semi-ouvertes et localisées sur le même portoir dans la même pièce. De plus, des bâtonnets à ronger et des jeux suspendus seront ajoutés dans ces cages.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour l’étude des maladies du foie. Il s’agit d’un mammifère dans lequel le modèle de fibrose de foie utilisé dans cette étude est bien validé. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte entre 8 et 14 semaines car la pathologie étudiée se développe essentiellement chez les adultes. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des modifications des fonctions du foie dues à l'âge qui pourraient interférer avec nos résultats.
Dissection de la connectivité entre le thalamus de la ligne médiane et le cortex préfrontal chez le rat et la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 20
200 souris et 20 rats subissent une craniotomie de trente minutes à une heure pour recevoir une injection de virus dans le cerveau, puis sont exsanguinés une semaine à dix mois plus tard. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et aucun animal n'est gardé vivant. Le porteur qualifie pourtant l'ensemble de "courte chirurgie" "minimisée", tout en décrivant par ailleurs une chirurgie invasive et des souris porteuses d'une mutation Alzheimer qui développent des troubles de la mémoire dès huit mois et, parfois, des crises d'épilepsie. La mise à mort sert à prélever les cerveaux pour des enregistrements sur tranches, dans un projet dont le porteur reconnaît que l'impact pour les patients "ne sera pas immédiat".
Objectifs
Les objectifs de cette étude sont 1- d’évaluer la mise en place de la connectivité thalamocorticale au cours du développement, 2- de comparer les projections de deux populations thalamiques distinctes dans le cortex chez l’adulte, 3- d’évaluer l’évolution de la transmission thalamocorticale au cours du vieillissement dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer, 4- de comparer ces résultats obtenus chez la souris avec la connectivité thalamocorticale chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet est principalement un projet de recherche fondamental dont l’impact pour les familles et les patients ne sera pas immédiat. Néanmoins, ce projet comporte des aspects translationnels car nous cherchons à comprendre comment évolue la boucle thalamocorticale dans un modèle de souris transgéniques récapitulant des aspects de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, ce projet s’inscrit dans un projet plus large visant à comprendre l’importance de cette boucle dans la régulation du sommeil, qui est crucial pour la consolidation de la mémoire et pour l’évacuation des déchets du métabolisme. Enfin comprendre comment cette boucle se met en place pendant le développement pourrait permettre de mieux appréhender d’un point de vue thérapeutique la prise en charge des problèmes de sommeil dans des pathologies du neurodéveloppement qui sont très fréquents par exemple chez les enfants atteints de troubles du spectre autistique. Ces travaux permettront donc de mieux comprendre les fonctionnements du sommeil en contexte physiologique pathologique et pourraient permettre d’identifier des nouvelles pistes thérapeutiques pour améliorer la qualité du sommeil.
Procédures
Les animaux subissent une chirurgie invasive nécessitant une craniotomie pour permettre l’injection de virus qui dure entre 30 minutes et une heure ; suivi par une exsanguination 1 semaine à 10 mois plus tard. Cette deuxième étape dure 15 minutes.
Impact sur les animaux
Certaines souris utilisées pour ce projet seront un modèle génétique de la maladie d’Alzheimer. Ces animaux présentent des troubles de la mémoire à partir de 8 mois ainsi que dans de rares cas des crises d’épilepsie. Si tel est le cas, il est préconisé de leur permettre de récupérer dans un environnement enrichi et calme. C’est pourquoi ces animaux seront hébergés avec des enrichissements supplémentaires (grande roue et tunnel) et leur cage sera placée dans le bas du portoir afin de leur assurer le plus de calme possible. Toutes les procédures faites sur ces animaux seront de degré de sévérité modéré du fait de la chirurgie. Cette chirurgie peut entrainer des douleurs post-opératoires qui sont minorées par les antalgiques.
Devenir
tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour prélever leurs cerveaux afin de faire des enregistements sur tranche de cerveau.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet nécessite le maintien intégral de deux structures le thalamus et le cortex ainsi que leur communication, ce qui n’est pas encore possible dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales. De plus, ce projet vise à évaluer l’évolution de la connectivité au cours du vieillissement ce que les modèles in vitro ne permettent pas de faire.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques appropriés qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests puissants permettent d'inclure des animaux même en cas de données manquantes et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées, dans notre cas le nombre de neurones enregistrés par animal. Les enregistrements électrophysiologiques sur tranche de cerveau permettent d’optimiser le nombre de neurones enregistrés et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour mener à bien cette étude. Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été évalué d’après notre expérience lors de projets impliquant des techniques similaires.
Raffinement
Cette étude consiste en une courte chirurgie suivie après un délais de 1 semaine à 10 mois du sacrifice et du prélèvement du cerveau. La chirurgie est minimisée pour diminuer le niveau de souffrance et améliorer la récupération. Les souris ont des enrichissements supplémentaires par rapport aux autres animaux de l'animalerie : grande roue et tunnels. La mise à mort sera précédée d’une analgésie et anesthésie profondes avec des antalgiques et anesthétiques très puissants.
Choix des espèces
Ce projet requiert l’utilisation de souris car nous comparerons ici l’évolution de la connexion thalamocorticale chez les individus sains et dans un modèle de souris transgénique de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, l’utilisation de rats dans la procédure 4 nous permettra de comparer les résultats obtenus chez les souris dans la procédure 3 et les rats, permettant de soutenir le caractère translationnel entre espèces de nos résultats. Finalement, les stratégies de transduction virale sont largement utilisées chez les rongeurs ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec ceux de la littérature. Les animaux seront utilisés à partir de 1 jour pour les injections puis ils seront sacrifiés entre 14 jours et 12 mois en fonction du groupe auquel ils seront assignés. En effet, ce projet vise à étudier l’évolution au cours développement jusqu’au vieillissement de la connectivité thalamocorticale chez des animaux sauvages et modèles murins de la maladie d’Alzheimer.