Procédures modérées

Toutes tuées en fin de protocole pour le prélèvement de leurs organes, 304 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant six mois, sont pesées chaque semaine et passent une imagerie sous anesthésie deux fois par mois pendant les traitements, puis une fois par mois ensuite. Le porteur cherche à savoir si bloquer une voie de réponse au stress cellulaire retarde les effets du vieillissement, avec l'ambition affichée de développer des molécules anti-vieillissement. Le projet peut durer vingt-quatre mois, soit à peu près l'espérance de vie d'une souris de laboratoire, sans que cette durée soit justifiée autrement que par le suivi du vieillissement.

Objectifs

Bien que les mécanismes conduisant au vieillissement ne soient pas encore complètement connus, il est maintenant établi que les effets du vieillissement sont corrélés à une augmentation du nombre de cellules sénescentes dans les tissus. Les cellules sénescentes se distinguent par de nombreux changements morphologiques et métaboliques et leur élimination (génétiquement ou pharmacologiquement) peut prévenir ou retarder le dysfonctionnement des tissus et ainsi prolonger la durée de vie chez la souris. La sénescence a longtemps été considérée comme un mécanisme suppresseur de tumeurs via l’arrêt permanent du cycle cellulaire. Cependant, certaines molécules sécrétées par la cellule sénescente peuvent contribuer à un microenvironnement favorable à la transformation de cellules pré-cancéreuses. Ce rôle promoteur de tumeurs est également souligné par le fait que des cellules sénescentes sont trouvées dans des tumeurs bénignes et que des cellules épithéliales en culture peuvent échapper de façon spontanée à la sénescence et ré-entrer dans le cycle cellulaire avec des caractéristiques néoplasiques. Par ailleurs, la sénescence est également associée à de nombreuses pathologies liées au vieillissement comme les fibroses tissulaires conduisant à terme à des défaillances d’organe. Ainsi, l’étude des mécanismes de sénescence au cours du vieillissement nous semble particulièrement intéressante. La modulation de ces mécanismes pourrait ainsi permettre de bloquer dans le même temps le développement de pathologies fibrotiques et/ou cancéreuses ou plus généralement des pathologies liées à l’âge. Nous avons montré dans nos précédentes études dans des modèles de cellules que l’inhibition d’un certain nombre de facteurs associés à une voie de signalisation spécifique ("voie de réponse aux protéines mal conformées") provoque un retournement des caractéristiques observées dues à la sénescence. Une étude plus approfondie de ces différents acteurs pourrait permettre de mieux comprendre l’implication de cette voie au cours de la sénescence mais surtout pourrait potentiellement aboutir au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Nous souhaitons, au travers de cette étude, déterminer si le ciblage de la voie de réponse aux protéines mal conformées dans un modèle animal pourrait avoir des effets et, ainsi, retarder ou réduire les pathologies liées au vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre les mécanismes régissant le vieillissement et pouvant conduire à la mise en place de processus pathologiques. Les résultats que nous obtiendrons pourraient permettre d’envisager l’inhibition spécifique d'une branche de la voie de signalisation impliquée dans les phénomènes de sénescence dans des conditions physiologiques et pathologiques et de déterminer quels inhibiteurs présenteront le meilleur potentiel thérapeutique. A terme, nous souhaitons développer des molécules « médicaments » ayant des effets anti-vieillissement et par conséquent des effets bénéfiques sur l’apparition de maladies liés au vieillissement, y compris la fibrose et le cancer.

Procédures

Après leur arrivée, tous les animaux (304 souris) seront acclimatés à leur zone d'hébergement pendant une semaine puis seront habitués à la manipulation humaine pendant une semaine supplémentaire. Les animaux recevront ensuite une injection de traitement ou de solution contrôle (durée : 1 min) à raison de 2 fois par semaine sur une durée de 6 mois. Les animaux seront pesés une fois par semaine (durée : 1 min) tout le long de la procédure. Dès la première semaine de traitements, l'effet de ces derniers sur la sénescence des cellules sera évalué par imagerie. Pour cela les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse, tondus pour faciliter l'imagerie (durée : 30 sec.) et l'injection d'une molécule facilitant la lecture des images sera réalisée (durée : 30 sec). Après la lecture, les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil (durée totale anesthésie : 30 minutes). Cette lecture sera réalisée deux fois par mois pendant les 6 mois de traitements puis une fois par mois jusqu'à la fin du projet. A la fin des traitements, les souris seront maintenues en hébergement pour suivre leur vieillissement (durée maximale du projet : 24 mois).

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un stress léger de courte durée au moment de la manipulation lié à la nécessité de réaliser une contention et une injection pour l'administration des traitements. Les étapes nécessitant une anesthésie gazeuse pourraient également être source d'un stress léger et de courte durée.

Devenir

Afin d'étudier les effets de nos traitements sur la sénescence des cellules de différents organes, il nous est nécessaire de pouvoir les récupérer à la fin du projet. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Avant de procéder à l'étude in vivo, nous avons évalué les différents inhibiteurs des effecteurs de la voie de signalisation qui nous intéresse ainsi que leur efficacité in vitro. Nous avons pu identifier et caractériser les cibles d'intérêt de notre projet. Ces étapes préliminaires réalisées dans des modèles n'impliquant pas d'animaux ont ainsi permis de réduire le nombre d'animaux impliqués dans cette étude. Afin de valider dans un modèle complexe les différents inhibiteurs identifiés, l'utilisation d'un modèle animal à la fois jeune et âgé demeure cependant nécessaire.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nos cibles d’intérêts ont déjà été identifiées et caractérisées et l’efficacité des inhibiteurs a déjà été évaluée dans un modèle n'utilisant pas d'animaux. Le nombre de souris par groupe a été déterminé par une approche statistique tout en se basant sur les connaissances et l'expertise du laboratoire sur la manipulation de ce type de souris dans une expérience à long terme afin d'obtenir des résultats robustes. De plus, l'utilisation d'un système permettant le suivi longitudinal par imagerie de l'expression de notre facteur d'intérêt permet de réduire le nombre total d'animaux en évitant la mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires.

Raffinement

Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 6 animaux par cage dans un environnement enrichi (carré de coton pour la nidification) et dans des conditions classiques d'hébergement (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés avant la mise en place de l’expérimentation afin de procéder à une habituation. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant les procédures pouvant induire un stress ou une angoisse ainsi qu’avant la mise à mort. Des points limites ont été définis préalablement à l’expérience et un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance excessive nécessitant l’arrêt de la procédure et leur mise à mort (qui sera réalisée à distance des autres animaux). Les souris vieillissantes risquant de développer des pathologies non rencontrées chez des souris jeunes, nous apporterons des points de vigilance supplémentaires à leur suivi. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence permettant la réalisation d’un score basé sur ce qui a été décrit dans la littérature

Choix des espèces

L’utilisation de souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques préexistants de manière à suivre l’évolution de la sénescence. De plus, la souris est un modèle largement étudié par la communauté scientifique ce qui permet de comparer les résultats avec les autres laboratoires et d’utiliser certaines conditions comme témoin de la validité de nos résultats. Les procédures expérimentales étant très encadrées, les paramètres de douleur ou de souffrance éventuelle sont plus facilement contrôlables. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (2 mois), c’est-à-dire après la phase de croissance ainsi que des souris adultes âgées (9 mois), âge auquel l’accumulation de cellules sénescentes devient détectable. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (2 mois), c’est-à-dire après la phase de croissance ainsi que des souris adultes âgées (9 mois), âge auquel l’accumulation de cellules sénescentes devient détectable.

Pour sélectionner des composés contre l'hyperactivité de la vessie, 960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une irritation de la vessie leur est provoquée par de la capsaïcine ou de la prostaglandine, et l'effet des molécules est mesuré par cystométrie, jusqu'à quatre heures avec un cathéter posé dans la vessie sous anesthésie. Certains animaux reçoivent une pompe implantée sous la peau, des prélèvements de sang et des collectes d'urine en cage individuelle de moins de vingt-quatre heures, le protocole étant arrêté en accord avec une entreprise pharmaceutique partenaire. Le porteur présente le recours au rat comme un choix limitant "l'utilisation d'animaux tels que le chien".

Objectifs

L’hyperactivité de la vessie touche environ 15 % de la population, et devient plus fréquente avec l’âge. Elle entraine des envies urgentes et fréquentes d'uriner, des incontinences et des lever nocturnes qui perturbent grandement la vie au quotidien des patients souffrants de cette pathologie. Les causes de ce trouble sont encore mal connues, mais on pense qu’il est lié à un fonctionnement anormal du muscle de la vessie. Les traitements actuels reposent principalement sur des médicaments appelés antimuscariniques dont le but est d'inhiber les contractions involontaires de la vessie en agissant sur certains récepteurs. Cependant, leur efficacité est souvent limitée, et ils provoquent des effets secondaires (sécheresse de la bouche, constipation, troubles de la vision...) qui amènent de nombreuses personnes à arrêter leur traitement. Il est donc important de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Pour cela, des recherches sont menées à l’aide de modèles expérimentaux qui reproduisent les symptômes de l’hyperactivité de la vessie. Ce projet vise à tester de nouveaux composés destinés à traiter l’hyperactivité vésicale. Certains de ces composés testés agissent différemment des traitements actuels, tandis que d'autres utilisent les mêmes mécanismes, mais avec moins d'effets secondaires. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat, dans lequel une irritation temporaire de la vessie est provoquée à l’aide de substances comme la capsaïcine (un composé extrait du piment). Ces tests permettront d’évaluer l’efficacité des traitements avant d’envisager leur utilisation chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de l’hyperactivité vésicale sont souvent mal tolérés, peu efficaces, ou contraignants à utiliser. Beaucoup de patients finissent par les abandonner, faute de résultats satisfaisants. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques, mieux adaptées aux besoins des malades. L’objectif de ce projet est justement de contribuer à la mise au point de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux supportés. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat, qui permet de reproduire certains symptômes du trouble observé chez l’humain. Ce modèle permet de tester rapidement et de manière fiable l’efficacité et l’innocuité de nouvelles molécules. À terme, ce travail pourrait aboutir à des traitements innovants qui améliorerait significativement le quotidien des patients. Il pourrait aussi permettre de mieux comprendre les causes de ce trouble, ce qui ouvrirait la voie à d'autres avancées médicales. Enfin, en réduisant les complications liées à l’hyperactivité de la vessie, comme les infections à répétition ou les problèmes rénaux, ces recherches pourraient également contribuer à diminuer les hospitalisations et les coûts de santé.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront le traitement à tester ou bien un placébo. La durée et la fréquence du traitement dépendront du médicament étudié, mais resteront en général inférieures à six mois. L'administration du traitement sera rapide : elle dure moins d'une minute lorsque l'animal est éveillé, moins de 30 minutes si une anesthésie est nécessaire, et au maximum 45 minutes si le produit doit être injecté dans la vessie sous anesthésie profonde. Dans certains cas, un examen spécifique pourra être réalisé pour évaluer l'effet du traitement sur la vessie. Cet examen, appelé cystométrie, permet de mesurer le fonctionnement de la vessie pendant quelques heures (jamais plus de 4 heures) et nécessite l’installation préalable d’un petit tube dans la vessie. Au cours de l’étude, des prélèvements pourront être faits (sang, urine) afin de procéder à des analyses pour mieux comprendre les effets du traitement. Chaque prise de sang dure moins de 3 minutes, et la collecte d’urine se fait sur moins de 24 heures dans une cage adaptée. Il est important de souligner que tous les animaux ne subiront pas toutes ces procédures. Les interventions seront limitées à ce qui est strictement nécessaire, selon les objectifs du projet, et en accord avec les recommandations établies dans le cadre de notre collaboration avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

Certaines étapes du projet peuvent entraîner un inconfort temporaire pour les animaux, bien que tout soit mis en œuvre pour les limiter. Les effets indésirables possibles incluent : - Un léger stress ou une gêne lors de l’administration du traitement, car nécessitant que l’animal soit maintenu immobile pendant un court instant. - Une douleur ou gêne temporaire liée à l’implantation d’une petite pompe sous la peau, ou bien à l’administration du composé à tester directement dans la vessie. - Un stress léger lié à la collecte d’urine (sur une période inférieure à 24h) ainsi qu'aux prises de sang.

Devenir

Les animaux recevront les traitements à tester, soit en une seule fois, soit de manière répétée sur une période plus longue, selon les besoins de l’étude. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par différents moyens, notamment : - L’analyse de la quantité d’urine produite sur une période de moins de 24 heures, - Un examen permettant d’étudier le fonctionnement de la vessie, - L’analyse d’échantillons de sang, d’urine ou d’organes. À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur garantissant l’absence de douleur. Cette étape sera réalisée par du personnel formé, expérimenté et autorisé à le faire, conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet se justifie par l’absence de méthode alternative permettant d’étudier efficacement l’hyperactivité de la vessie. Cette maldie dépend de nombreux mécanismes complexes (nerveux, hormonaux, métaboliques…) qui interagissent entre eux dans un organisme vivant. Aujourd’hui, aucun modèle en laboratoire ne permet de reproduire cette complexité de manière fiable. L’utilisation de modèles animaux reste donc indispensable pour développer de nouveaux traitements mieux adaptés aux patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été calculé avec soin, afin d’être le plus faible possible tout en garantissant des résultats fiables. Une méthode statistique a été utilisée pour déterminer le nombre minimum nécessaire par groupe. De plus, lorsque cela sera possible, deux traitements seront testés en même temps. Cela permettra de limiter encore le nombre d’animaux en évitant de répéter inutilement certaines expériences, notamment pour les groupes qui ne reçoivent pas de traitement ou qui reçoivent un traitement de référence déjà connu.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long du projet. - Les rats sont hébergés par deux dans une même cage, dès que cela est possible, afin de préserver leur bien-être en favorisant le contact social. - Chaque jour, les soigneurs spécialisés vérifient l’état de santé général de chaque animal, leur comportement et la propreté de leur environnement. - Des critères de surveillance précis ont été définis. Si un animal montre des signes de douleur ou de souffrance, les responsables du projet sont immédiatement alertés, et les soins nécessaires sont apportés sans délai. - Les interventions chirurgicales, comme l’implantation de pompes ou les injections dans la vessie, sont réalisées sous anesthésie générale avec des médicaments contre la douleur. Un traitement antibiotique est également donné pour prévenir les infections. - D’autres procédures, comme la pose de petits cathéters (tubes) pour les examens de la vessie, ainsi que les examens eux-mêmes, sont aussi réalisés sous anesthésie complète, afin que l’animal ne ressente aucune douleur.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude d’une fonction physiologique complexe telle que l’hyperactivité vésicale. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitant l’utilisation d’animaux tels que le chien. Le choix des protocoles est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chances d’obtenir des résultats satisfaisants. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines d'âge). Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection destinée à déclencher un cancer du foie, d'un volume équivalant à environ 9 % de leur poids corporel, qui dilate le foie et augmente le volume sanguin, puis jusqu'à quinze échographies hépatiques sous anesthésie et huit injections de traitements immunomodulateurs sur trois à six mois. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur peut dégrader l'état général des animaux, fatigue et perte de poids comprises. Les retombées annoncées se limitent à de futurs outils de diagnostic et de pronostic, le porteur affirmant que la souris est le "seul modèle préclinique" permettant d'éteindre ou d'activer des gènes tissu par tissu.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC, Carcinome Hépato-Cellulaire) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent à caractériser fonctionnellement les populations immunitaires notamment celles impliquées dans la réponse anti-tumorale. Ce projet sera axé sur les cellules lymphocytes. La compréhension de la fonctionnalité des cellules immunitaires servira de bases fondamentales pour le développement d’immunothérapie pour combattre le cancer du foie. Ce projet sera mené pour une durée de 5 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle d’acteurs clés de la réponse immunitaire, lors du développement du cancer du foie. Ces travaux pourraient ainsi permettre le développement de nouveaux outils diagnostic/pronostic pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Des animaux recevront une injection unique visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 15 échos maximum) jusqu’à euthanasie à la fin de la procédure expérimentale (3-6 mois) par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer l’initiation tumorale (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs (4 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer la progression du cancer du foie (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 10 échos maximum) jusqu’à l’euthanasie à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons une injection qui peut provoquer un léger inconfort de courte durée, lié au passage de l’aiguille à travers la peau. De plus, le fait de maintenir l’animal pendant l’injection peut entraîner un stress temporaire. L’injection intra-veineuse comporte des risques de saignement local et/ou d’hématome. L’injection correspond à un volume de liquide équivalant à environ 9 pourcents du poids de l’animal. Elle peut provoquer une douleur passagère et entraîne une dilatation importante mais temporaire du foie (moins de 30 minutes), ainsi qu’une augmentation du volume total de sang. Lors de l’anesthésie par gaz utilisée pour l’échographie du foie, une baisse de la pression sanguine et de la température corporelle peut survenir. Enfin, la croissance prévue de la tumeur au niveau du foie pourrait entraîner une dégradation de l’état général des animaux (fatigue, perte de poids, etc.).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 4032 animaux seront étudiés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les souris utilisées dans ces procédures seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 8 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.

Hôte naturel de la bactérie Lactococcus petauri et poisson le plus élevé en France, la truite arc-en-ciel est retenue pour 308 individus utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont plongés quatre, huit ou seize heures dans une eau chargée de bactéries, vingt-huit d'entre eux recevant en plus une injection intramusculaire, avec deux prises de sang sous anesthésie à trois semaines d'intervalle. Le porteur dimensionne les lots à quatorze poissons en tablant sur une mortalité d'environ 50 % liée à l'infection, de façon à conserver au moins sept survivants par condition. Aucun poisson potentiellement infecté ne pouvant être relâché ni réutilisé, tous sont tués en fin de protocole.

Objectifs

Afin de limiter l’usage des antimicrobiens, la vaccination est considérée comme l’une des meilleures options pour contrôler les maladies infectieuses en aquaculture. Cette demande d'autorisation de projet s’inscrit dans le cadre d’une étude plus globale portant sur l'efficacité de protocoles vaccinaux utilisant différentes voies d'administration, telles que la balnéation ou l’injection intrapéritonéale. Le présent projet constitue une extension de la demande d’autorisation de projet précédemment soumise. La DAP initiale avait pour objectif de déterminer la souche bactérienne et la modalité d’infection les plus appropriées pour établir un modèle de challenge infectieux, par balnéation ou par injection intramusculaire, chez la truite arc-en-ciel. Cette nouvelle demande vise à compléter les résultats obtenus lors de cette première expérimentation, en affinant spécifiquement le protocole de challenge infectieux par balnéation. Cette manipulation est nécessaire pour confirmer la reproductibilité du modèle, ajuster certaines conditions expérimentales (notamment la dose infectieuse et la durée d’exposition), et ainsi valider un protocole robuste permettant d’évaluer de manière fiable l'efficacité des stratégies vaccinales testées.

Bénéfices attendus

La lactococcose est une maladie bactérienne dont l'impact augmente actuellement en Bretagne en lien avec le réchauffement des eaux de surface. La maitrise par vaccination est nécessaire pour contrôler cette maladie et réduire l'usage d'antibiotiques. La maitrise du challenge infectieux par Lactococcus petauri est obligatoire et indispensable pour tester des solutions innovantes de contrôle, notamment la vaccination, facilitant leur mise en oeuvre dans les élevages et limitant le stress des animaux.

Procédures

Prises de sang : deux prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés (temps T0 et Tfinal 3 semaines plus tard). Chaque intervention, incluant l’induction de l’anesthésie, le prélèvement et la récupération, durera environ 15 à 20 minutes. Infection par balnéation : les poissons seront exposés à une suspension bactérienne de L. petauri pendant 4 h, 8 h ou 16 h selon les modalités, dans un volume d’eau restreint mais oxygéné en continu. Infection par injection (lot témoin positif uniquement, 28 poissons au total) : une injection intramusculaire sera réalisée sous anesthésie. La durée totale (induction, injection, réveil) sera d’environ 15 à 20 minutes.

Impact sur les animaux

L'évaluation de l'efficacité vaccinale nécessite d'infecter des truites par L. petauri. Les manifestations cliniques de l'infection expérimentale peuvent entrainer de la douleur chez les poissons. Le protocole sera arrêté dès l'observation de poissons moribonds (mélanisme, nage erratique sur le dos, arrêt d'alimentation) ou de signes caractéristiques de la lactococcose (exophtalmie).

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons sanitaires (impossibilité de relâcher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par L. petauri)

Remplacement

L'évaluation de l'efficacité d'un vaccin nécessite la réalisation d'un challenge infectieux et ne peut se faire que sur animaux vivants. La présente demande est une étape initiale de ce projet sur l'efficacité vaccinale

Réduction

Dans cette nouvelle phase, 11 modalités expérimentales seront testées, correspondant à différentes combinaisons de doses infectieuses et de durées d’exposition. Chaque modalité sera réalisée en duplicat afin de limiter l’effet « bac » et de valider la reproductibilité du protocole. Chaque lot contiendra 14 poissons, ce qui représente un total de 22 lots (11 modalités × 2 répétitions), soit 308 poissons au total (14 × 22 = 308). Ce nombre est déterminé pour permettre une analyse statistique robuste. En considérant un taux de mortalité d’environ 50 % lié au challenge infectieux, 14 poissons par lot permettent de garantir au moins 7 individus survivants par condition. Une analyse immunologique sérique sera réalisée en fin d’expérimentation sur l’ensemble des poissons survivants, afin de vérifier l'infection et de documenter la réponse immune.

Raffinement

Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute la durée du protocole. Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène < 80 %) et ne peuvent pas être rectifiés, l'expérimentation sera arrêtée. Les points limites concernent d'autre part la santé et le comportement des poissons. Les poissons moribonds seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés. La densité sera de 20 kg/m3 environ, ce qui est bien en dessous de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3) et les bacs seront enrichis de tubes permettant aux poissons de se cacher et de fuir.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est un hôte naturel de Lactococcus garvieae/petauri. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est important d'améliorer l'efficacité vaccinale. Les truites utilisées pèseront environ 100 à 150g. La lactococcose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage. L'étude sur des poissons de poids de 150 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant entrer dans l'étude. De plus, les protocoles vaccinaux par balnéation seront testés sur des alevins de 4 à 5 g et la durée de l'efficacité vaccinale après quelques mois d'élevage, lorsque les truites atteindront 100 -150 g environ. A ce poids, les truites sont considérées comme immunocompétentes.

Congeler du sperme et des embryons pour disposer d'un stock de secours des lignées de l'établissement : 550 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles subissent une vasectomie, les femelles un transfert embryonnaire par ouverture de l'abdomen, avec un risque d'hémorragie et d'arrêt cardiaque sous anesthésie que le porteur classe parmi les effets pouvant aller jusqu'au grave. Les mâles vasectomisés sont ensuite accouplés à des femelles pour déclencher leur ovulation et sont tués après plusieurs échecs successifs, les femelles porteuses étant gardées jusqu'au sevrage des petits. Le porteur présente cette gestion de stock comme une "alternative plus éthique" au maintien de lignées non utilisées, la finalité réelle restant l'intendance des lignées de l'animalerie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de cryoconserver des lignées murines de l'établissement utilisateur afin de disposer d’un stock dit de « backup » en cas de perte de la lignée ou pour toute autre nécessité, telle que la non-utilisation prolongée des lignées. Ces lignées pourront ainsi être redérivées ultérieurement dès que nécessaire (nouveaux projets, rafraîchissement ou perte de la lignée, etc.).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de proposer une alternative plus éthique au maintien ou au stockage de lignées non utilisées, autre que par la génération d’individus, afin de limiter fortement le nombre d’animaux mis à mort. Il en est de même pour le rafraîchissement de lignée, où plusieurs croisements (backcross) et donc plusieurs générations d’individus sont nécessaires avant l’utilisation des nouveaux animaux dits « rafraîchis » ou « backcrossés ».

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule de ces interventions (Procédures chirurgicales): vasectomisation ou transfert embryonnaire soit une seule chirurgie par animal et une fois seulement.

Impact sur les animaux

Pour la partie cryoconservation, des nuissances ou effets indésirables possibles de type légères à modérées sont attendues tels que: des douleurs ou du stress lié à l'injection, des effets liés aux hormones utilisées, ou des gênes dues à la stimulation de l’ovulation. Pour la partie redérivation (procédure chirurgicale), les effets secondaires peuvent aller de légers à graves, comme : un refroidissement important du corps pendant l’opération, pouvant provoquer un arrêt cardiaque à cause de l’anesthésie, des douleurs à cause de l’ouverture du ventre (gérées par des médicaments contre la douleur), un risque de saignement important si les vaisseaux sanguins ou les organes sont mal manipulés. Si cela arrive, l’animal est euthanasié. Après l’opération, les effets attendus sont en général légers à modérés : perte de poids importante (plus de 15 % en 3 jours), souvent causée par un manque d’activité ou d’appétit, signes de douleur ou d’inconfort (comme du stress ou un comportement apathique). Un outil spécial (le "Mouse Grimace Scale") est utilisé pour évaluer la douleur. Si l’animal souffre trop, il est euthanasié.

Devenir

Les animaux vasectomisés serviront tous à l'accouplement de stimulation des femelles ou seront mis au repos en vue du prochain accouplement. Les mâles ne donnant plus de résultats ( plusieurs échec successif aux accouplements) seront mis à mort. Les femelles ayant subit un transfert embryonnaire seront gardées jusqu'au sevrage des petits. Les femelles n'ayant pas subit de FIV seront réaccouplées jusqu'à l'obtention d'un bouchon vaginal.

Remplacement

Dans ce projet, nous cherchons à conserver et restaurer des lignées de souris génétiquement modifiées en congelant du sperme, des embryons ou des ovocytes, puis en les réimplantant pour faire naître de nouveaux animaux. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative (en laboratoire, sur ordinateur ou sur tissus isolés) permettant de créer un animal vivant et fertile uniquement à partir de matériel génétique. Des techniques comme la culture cellulaire, la modélisation informatique ou les analyses moléculaires sont utilisées en amont pour vérifier la qualité du matériel et éviter de recourir inutilement à l’animal. Toutefois, pour obtenir des souris vivantes, le transfert d’embryons dans des femelles reste indispensable. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire à cette étape. Tout est mis en œuvre pour limiter le nombre d’animaux utilisés et leur souffrance : des méthodes alternatives (PCR, analyses informatiques, bases de données) sont privilégiées dès que possible pour réduire les procédures. La souche CBA/C57 a été choisie car elle s’occupe bien de ses petits, même en cas de petite portée, ce qui n’est pas toujours le cas chez d’autres souches.

Réduction

Ce projet vise à conserver des lignées de souris génétiquement modifiées ou présentant un intérêt particulier, en congelant leur sperme ou leurs embryons. À chaque étape, tout est fait pour limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant une conservation fiable du matériel génétique. a) Détermination du nombre d’animaux : Le nombre d’animaux nécessaires est basé sur les recommandations de réseaux spécialisés (EMMA, INFRAFRONTIER), les données historiques et les besoins techniques pour assurer une conservation réussie. Pour congeler du sperme : 2 à 3 mâles fertiles par lignée sont utilisés. Pour les embryons : les accouplements sont planifiés pour obtenir 40 à 50 embryons, en accord avec les standards (avec un taux de survie après décongélation supérieur à 90 %). b) Approche statistique : Aucune analyse statistique formelle n’est requise, car le projet ne teste pas d’hypothèses scientifiques. Le nombre d’animaux est défini de manière raisonnée, en s’appuyant sur l’expérience, des protocoles optimisés et les bonnes pratiques partagées dans la communauté scientifique. c) Réduction du nombre d’animaux : Plusieurs mesures concrètes permettent de réduire le recours aux animaux : Études pilotes pour vérifier à l’avance la qualité des échantillons, selection du génotype le plus adapté (homozygote ou hétérozygote) pour éviter de produire des animaux inutilisables, mutualisation des procédures entre équipes travaillant sur les mêmes lignées, réutilisation d’animaux quand c’est possible, production limitée aux seuls animaux nécessaires ; par exemple, les femelles ne sont produites que si elles sont requises pour une procédure.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera vérifié deux fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, par du personnel formé. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie générale et des traitements contre la douleur seront systématiquement appliqués et adaptés au cas par cas après l’intervention. Une attention particulière sera portée à la phase de réveil : les animaux seront placés dans un environnement chaud, sécurisé et confortable. Un suivi post-opératoire régulier sera effectué à l’aide d’outils validés pour évaluer leur état de santé et ajuster les soins si nécessaire. Des mesures de confort seront systématiquement mises en place : cage chauffée, enrichissement du milieu de vie, réduction du stress et des manipulations. En cas de douleur persistante ou de souffrance malgré les soins, des actions complémentaires seront envisagées, y compris une euthanasie si nécessaire, dans le respect des règles en vigueur.

Choix des espèces

Les lignées transéniques à conserver étant murines, cette espèce n'est donc pas rempaçable. Les mâles pour la vasectomie seront utilisés à 8 semaines de vie et les femelles entre 8-10 semaines, la maturité sexuelle devant être atteinte pour pouvoir réaliser la procédure.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant huit anesthésies gazeuses totalisant quatre-vingt-dix minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées dans le cerveau au cours d'une intervention de trente-cinq minutes, suivies de deux injections d'un virus modifié et de trois séances d'imagerie nucléaire avec produit radioactif. Le porteur retient la souris parce que sa petite taille permet de réduire les quantités de radioactivité injectées. Il annonce comme bénéfice attendu une régression tumorale sans perte de poids ni effet secondaire notable, alors que les nuisances listées dans le même document comprennent une perte de poids, une encéphalite induite par le virus et des troubles de l'équilibre.

Objectifs

Malgré les traitements existants, les tumeurs cérébrales restent parmi les cancers ayant les plus mauvais pronostiques à court terme. La chirurgie n’est pas toujours possible, et même lorsqu’elle l’est, cette solution n’est souvent pas suffisante, comme en témoigne l’émergence de récidives dans la majorité des cas. La radiothérapie et la chimiothérapie ne sont pas plus efficaces, car elles engendrent rapidement une sélection des population cellulaires résistantes responsable des récidives. Ces aspects limitent l’espérance de vie des patients à 1 ou 2 années malgré la prise en charge thérapeutique. L’échec de ces thérapies est généralement lié à la récidive tumorale engendrée par des cellules résistantes aux traitements conventionnels surexprimant un marqueur tumoral spécifique. Le projet vise à développer un protocole complémentaire aux thérapies traditionnelles basé sur l’utilisation de virus capables d’éliminer les cellules cancéreuses. A ce jour le test le plus avancé pour l’utilisation de ce type de virus dans le cadre des glioblastomes (tumeur cérébrale) repose sur l’injection d’un adénovirus directement dans la tumeur. Toutefois cet adénovirus n’est pas sélectif des cellules cancéreuses. Même s’il les élimine moins efficacement que les cellules cancéreuses, il est aussi capable d’infecter les cellules saines. Cette non sélectivité induit une perte d’efficacité de la thérapie, des effets secondaires et complique son administration aux patients. Afin d’éliminer ces problèmes, nous utiliserons un virus innovant, capable de sélectionner préférentiellement les cellules résistantes exprimant le marqueur spécifique. La modification principale du virus consiste modifier une protéine de surface permettant d’obtenir un virus ciblant spécifiquement les cellules tumorales porteuse du marqueur spécifique. Il a été montré, en culture de cellules, que cette ce virus modifié se réplique préférentiellement sur les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales. L’objectif du projet est de montrer que l’utilisation de ce vecteur viral conduit à l’élimination ou la régression de tumeurs obtenues par l’injection des cellules tumorales directement dans le cerveau via une administration intraveineuse. Ceci représenterait une avancée importante pour le traitement des patients. Le suivi de l'effet théraputique ce traitement sera réalisés en imagerie nucléaire avec l'injection de molécules radio-actives ciblant spécifiquement la tumeur.

Bénéfices attendus

Le traitement standard du glioblastome en clinique n’a pas évolué depuis 2005 avec un taux de survie à 5 ans qui n’excède pas 5%. Il est donc indispensable d’améliorer la prise en charge de cette maladie. Les bénéfices attendus sont : la mise en évidence d’une régression tumorale suite à l’injection du virus testé (en mono ou bi injection) sans perte de poids ou effet secondaire notable lors d'une administration systémique.

Procédures

Chaque animal sera sourmis à 1) 8 anesthésies gazeuses d'une durée de 3 à 30 minutes soit un total de 90 minutes sur la durée de l'étude, 2) une intervention chirurgicale (injection de cellules cancéreuses ) d'une durée de 35 minutes maximum, 3) 3 séances d'imagerie sous anesthésie d'une durée de 14 minutes chacune, 4) 2 injections de virus d'une durée de 4 minutes maximum

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - hématome transitoire au niveau du site d'injection (72h maximum) , - perte de poids de l'animal, - développement de tumeur suite à l'injection de cellules tumorales, - encéphalite induite par le virus, - trouble de l’équilibre induit par la tumeur grossissante

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des études complémentaires ex vivo sur les tissus et organes prélevés.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux testés, la spécificité des virus utilisés a déjà été étudiée en culture cellulaire in vitro. Le virus non modifié n’a pas montré de sélectivité particulière pour les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales , alors que le virus modifié permet une infection 210 fois plus sélective des cellules cancéreuses par rapport aux cellules non tumorales. La capacité des 2 virus à générer la mort cellulaire des modèles cellulaires tumorales a aussi été démontrée dans des expériences préliminaires (ainsi que dans la littérature). Il est maintenant indispensable de tester l’effet antitumoral de l’administration du virus sur un modèle animal de glioblastome. En effet, le modèle cellulaire ne peut pas recréer le micro-environnement tumoral ni les interactions avec le système immunitaire

Réduction

L’imagerie TEP (Tomographie à Emission de Positon) est peu invasive qui permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin, il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Cet effectif est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude en raison d’atteinte de point limite. Le test statistique utilisé est adapté pour les petits effectifs.

Raffinement

Les animaux sont placés à plusieurs par cage, ont accès à l' eau et à la nourriture à volonté, et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et permettre une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite sa thermorégulation ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. les injections de cellules et les séances d'imagerie sont réalisées sous anesthésie générale. Une analgésie pré et post opératoire est également administrée lors de la chirurgie. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de points limites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.

Choix des espèces

Des tests cellulaires in vitro ont déjà été réalisés. Cependant, le modèle animal est indispensable pour évaluer l’effet thérapeutique des virus dans des modèles tumoraux, en l’occurrence le glioblastome. La souris est l’espèce la plus adaptée pour répondre à cette question. De plus par sa taille, elle permet de réduire les quantités de radioactivité injectées à l’animal et donc les effets secondaires. Nous utiliserons des souris adultes de 7 semaines conformément à la littérature et aux protocoles expérimentaux déjà réalisés dans les projets précédents pour valider l'efficacité de ces virus dans le traitement du glioblastome

De la collagénase bactérienne est injectée dans le striatum de 1 188 rats pour provoquer une hémorragie cérébrale, au cours d'une chirurgie de quinze à vingt minutes. Ces rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec IRM sous anesthésie jusqu'à six fois et batteries de tests sensorimoteurs répétées jusqu'au vingt-et-unième jour. Le porteur qualifie les déficits fonctionnels de légers à court et moyen terme tout en décrivant des pertes d'équilibre et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. À la fin, la cage thoracique de chaque animal est ouverte pour une ponction cardiaque, suivie d'une perfusion du cerveau avant prélèvement.

Objectifs

En clinique, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS) ou AVC hémorragiques, non traumatiques, résultent d'une irruption plus ou moins importante de sang dans le tissu cérébral faisant suite à la rupture d'un vaisseau cérébral. À ce jour, aucune stratégie thérapeutique pharmacologique permettant de réduire les effets délétères d'un hématome sur le parenchyme cérébral n'est disponible. L'objectif de ce projet préclinique longitudinal est de tester des stratégies thérapeutiques innovantes dans un modèle d'AVC hémorragique chez le rat afin d'étudier leur impact sur les volumes hémorragiques et lésionnels grâce à l’IRM, ainsi que sur la récupération fonctionnelle. Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d'AVC hémorragique consistant en l'injection latéralisée de collagénase bactérienne dans le striatum. Cette chirurgie, bien documentée, reproduit fidèlement la physiopathologie de l'AVC hémorragique, permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. L'AVC sera induit sur des rats adultes d’environ 300 g (environ 8 semaines), chez des individus femelles et mâles, afin de reproduire la diversité clinique.

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie ne repose sur aucun traitement pharmacologique. Ainsi, il est indispensable depuis des décennies de développer des stratégies thérapeutiques innovantes dans le domaine de l’AVC hémorragique. C’est l’objectif fondamental de ce projet qui consiste en l'exploration de diverses approches thérapeutiques, en employant différents modes d'administration distincts, afin d'évaluer leur incidence sur les aspects cruciaux de l’AVC explicités dans les paragraphes précédents. En cas de résultats défavorables, les différents tests thérapeutiques auront contribué à élargir le champ des connaissances scientifiques dans le domaine de l'accident vasculaire cérébral hémorragique, offrant des enseignements précieux pour orienter de futures recherches et guider le développement de stratégies thérapeutiques novatrices. En présence de résultats encourageants, les molécules fournies par les partenaires industriels seront soumises à des essais cliniques, avec pour objectif ultime la mise sur le marché dans les années à venir. Ces résultats auront également un impact sur la communauté scientifique, stimulant la collaboration entre le secteur public et privé. Les résultats bénéfiques permettront non seulement d'offrir un nouvel espoir aux patients victimes d'AVC, mais également d'encourager la poursuite des travaux de recherche sur des axes thérapeutiques spécifiques. Cette collaboration renforcée entre public et privé favorisera un échange continu d'idées et d'expertise, créant ainsi un environnement propice à l'innovation et à la progression des connaissances dans le domaine. Pour finir, en obtenant l'approbation réglementaire, certaines des thérapies que nous souhaitons tester pourront donc bénéficier à un grand nombre de patients, marquant ainsi une avancée importante dans la prise en charge de l'AVC hémorragique.

Procédures

Les 1188 animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin d’injecter de la collagénase dans le cerveau des rats dans le but d’obtenir un AVC hémorragique. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 30 minutes. La pose d’un cathéter dans la veine de la queue sera nécessaire pour certains animaux afin d’administrer un traitement en intraveineux. La pose de cathéter à travers la peau prendra moins d’une minute. À J0, J1, J5, J7, J14 et J21 en fonction des sous-groupes, les animaux seront soumis à l'IRM sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 40 minutes. Tous les animaux ne passeront pas chaque jour. Les animaux passeront également une batterie de tests comportementaux ayant pour but de contrôler les déficits sensorimoteurs après AVC et la récupération fonctionnelle au cours du temps. Ces tests se dérouleront jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 ou J21. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, afin d’éviter que chaque animal ne participe à l'ensemble des jours d'acquisition et à l’ensemble des tests. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une ouverture de la cage thoracique pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales due à l’hématome et à l’œdème au niveau cortical et striatal. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Les tests comportementaux réalisés par du personnel entraîné ne sont pas destinés à induire de la souffrance animale, mais leur répétition fréquente au fil du temps peut engendrer du stress chez les animaux. Un animal trop stressé et incapable de réaliser un test particulier sera exclu de celui-ci. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation ou frais pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font du rat le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, rattus norvegicus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : des tunnels en carton et briques aspen, ainsi qu’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Pendant l’opération chirurgicale conduisant à l’AVC hémorragique, l’animal sera et aura une couverture analgésique administrée en sous-cutanée (entre 30 minutes et 1h avant) avant la première incision expérimentale. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles proches du conduit auditif du rat, une anesthésie locale sera appliquée. De plus, chaque site d’incision de peau sera précédé d’une tonte préalable du pelage, d’une désinfection ainsi que de l’injection d’un anesthésiant local en sous-cutané. Les yeux de l’animal seront protégés avec du gel ophtalmique pendant toute la durée de la chirurgie. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Des injections d’analgésique seront réalisées dans les premières heures suivant la chirurgie (relais de l’injection pré-opératoire) puis le lendemain de la chirurgie afin de maintenir une couverture analgésique post-chirurgicale. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort par injection léthale de pentobarbital. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération.

Choix des espèces

Le rat (Rattus Norvegicus) occupe une place importante dans la recherche en neurosciences et plus particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prépondérance découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rat, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font du rat un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC hémorragique, l'utilisation du rat devient incontournable. En effet, il offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront adultes le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen d’environ 300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponibles dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Cinq semaines à 32 °C pendant tout un cycle de spermatogenèse : 903 médakas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles sont anesthésiés, sortis de l'eau et pressés sur le ventre pour recueillir un à deux microlitres de sperme, opération répétée sur plusieurs générations. Les poissons exposés à la chaleur et leurs descendants sont tous tués, et parmi les témoins 214 seulement pourront être réutilisés, les autres étant tués pour prélever leurs testicules. Le médaka est retenu pour son court temps de génération et parce que son spermatozoïde à histones le rapproche des modèles mammifères, l'objectif étant de savoir si la chaleur modifie ce que le père transmet à sa descendance.

Objectifs

Les poissons présentent une importante plasticité phénotypique (grande capacité d'adaptation) face aux variations environnementales. A l’interface entre l’environnement et l’ensemble des gènes, des molécules dites «méthyle » (groupements CH3), constituent un code dit « épigénétique » ou méthylation de l'ADN. Elles sont capables d’interagir avec l’ADN sous l’influence de l’environnement et permettre par exemple, la mise en place d'un métabolisme adapté à un changement de température. On appelle méthylome l'ensemble des groupes méthyle pour une cellule ou pour un tissu donné. Chez la truite arc-en-ciel, une augmentation de 4°C de la température d’élevage durant la spermatogénèse entraîne des modifications de la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes produits. Ces spermatozoïdes sont cependant fonctionnels, et donc susceptibles de transmettre leurs modifications épigénétiques à la descendance, et d’en impacter leurs performances, ou au contraire, favoriser leur adaptation à un environnement changeant. Les gènes impactés concernent la spermiogénèse (fonction de reproduction) et de métabolisme lipidique (fonction de croissance). Dans un contexte de réchauffement climatique, ces résultats soulignent la nécessité de tester comment des variations épigénétiques du spermatozoïde induites par une augmentations de température peuvent impacter les performances des descendants de première (F1), voire puis seconde (F2) génération. L'objectif de ce projet est donc d'aborder le rôle de la méthylation de l'ADN dans la transmission paternelle inter et transgénérationnelle des effets de température chez le poisson. Pour ce type d'étude, l'espèce modèle médaka (Oryzias latipes) est parfaitement adaptée, du fait de son court temps de génération, et de l'importance des ressources génétiques disponibles. Notre première hypothèse de travail : le méthylome de l'ADN du sperme de médaka est sensible à la température d'élevage au cours de de la spermatogenèse. La deuxième hypothèse : le méthylome de l'ADN du sperme contribue au développement embryonnaire et adulte et module les phénotypes. La troisième hypothèse : les altérations du méthylome de l'ADN sont transmises de génération en génération à travers la ligné germinale mâle et persistent même lorsque les individus ne sont plus exposés à la température élevée.

Bénéfices attendus

Nous nous intéressons au gamète mâle, comme vecteur intergénérationnel d'information sur les conditions de vie des individus (potentiellement changeantes). L'objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse des poissons à une augmentation de température, à l'échelle inter- puis trans-générationnelle, dans un contexte de changement climatique. Il s'agit donc d'évaluer leur aptitude à s'adapter au fil des générations, ou au contraire, mettre en évidence les possibles challenges de performances auxquels ils font face en étudiant plus particulièrement les effets sur les capacités reproductives. Pour les espèces d'aquaculture ces connaissances pourront influencer les pratiques d'élevages. En effet, la température de l’eau est une composante particulièrement difficile à moduler en élevage ouvert classique, et la période estivale coïncide avec des étapes clefs de la gamétogénèse chez de nombreuses espèces domestiques, dont les salmonidés. L’augmentation des températures estivales ces dernières années pose la question de la plasticité de ce processus gamétogénétique et de la façon dont les dernières étapes de la spermatogénèse peuvent être affectées. Le développement récent des élevages en système clos (eau recirculée) permet dans une certaine mesure de contrôler ce paramètre, mais les coûts de réfrigération de l’eau imposent de bien connaître les limites de température qui permettent de maintenir le bien-être et les performances des animaux. Aborder l’impact des températures d’élevage pendant la gamétogénèse est donc un enjeu important pour l’aquaculture à la fois continentale et marine.

Procédures

Les interventions prévues sont des prélèvements de sperme. Ils seront réalisés sous anesthésie et durent moins d'une minute. Pour cela,après anesthésie, les poissons sont sortis de l'eau et placés sous loupe binoculaire. Grâce à une légère pression exercée sur la partie ventrale, environ 1 à 2 µL de sperme sont émis et collectés dans une pipette. Les poissons sont alors placés en bac de réveil. Pour cette procédure, les expérimentateurs sont munis de gants en latex et les animaux sont pêchés délicatement à l'aide d'une petite épuisette.

Impact sur les animaux

Une première expérience a permis de déterminer la température et la durée d’exposition. La température d’exposition à 32°C pendant 5 semaines a été validée : les poissons médaka élevés à 32°C pendant un cycle de spermatogénèse présentent une forte diminution de la motilité des spermatozoïdes, mais néanmoins, les mâles testés étaient toujours capables de féconder des œufs et de produire une progéniture, (embryons éclos). D'après la littérature et nos premières observations, l'exposition à 32 °C pendant 5 semaines pendant la spermatogenèse ne produit pas de phénotype dommageable chez la descendance. De plus, aucun comportement de type pathologique n'a été observé après exposition à 32°C lors de notre expérience précédente. Les risques potentiels attendus : stress thermique ; modifications de la prise alimentaire et métabolisme énergétique ; altération de la spermatogénèse ; stress de capture.

Devenir

Les animaux élevés à 32°C et leurs descendants ne pourront être réutilisés. En effet nous suspectons que ce dispositif expérimental affecte un certain nombre de paramètres biologiques, dont l'épigénétique des poissons. Ils seront euthanasiés. Parmis les animaux contrôles ou issus de contrôles (élevés à 25°C), certains devront être euthanasiés afin de prélever leurs testicules pour des analayses moléculaires ou cellulaires. En revanche, 214 animaux contrôles ou issus de contrôles (élevés à 25°C) pourront être réutilisés après avoir participé au test de fécondance ou à la génération suivante (procédure ne nécessitant pas de prélèvement).

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous recherchons précisément les mécanismes intervenant pendant une spermatogénèse à température augmentée.

Réduction

Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre des analyses statistiques fiables malgré les fortes variabilités entre les individus. En outre, nous organisons l'emploi des animaux et les méthodes de manière à réutiliser les animaux pour plusieurs approches : les femelles utilisées pour les tests de motilité du sperme seront également utilisées pour la génération des F1, les mâles analysés en motilité du sperme permettront également de réaliser les analyses moléculaires (méthylation ADN et transcriptomique), et les mâles étudiés au niveau histologique seront également testés pour la qualité mitochondriale de leur sperme.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèce (photopériode, qualité d'eau, densité, conditions sanitaires) à l'exception du lot de mâles exposés à 32°C. Il s'agit cependant précisément de l'objet de l'étude (effet du réchauffement) et la littérature ne montre pas de mortalité chez des médakas élevés à cette température. Les bacs seront enrichis (ajout de plantes artificielles), les animaux toujours manipulés délicatement, avec des gants en latex et pêchés avec une petite épuisette. Les mesures de taille et de poids, ainsi que les prélèvements d’oeufs et de spermes sont des gestes doux, très rapides et non invasifs. Les prélèvements de sperme, nécessitant un geste précis, seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Les mesures de taille et poids seront réalisées lors de la même anesthésie et très rapidement (moins de deux minutes par animal, mesures poids, taille, et prélèvement du sperme compris).

Choix des espèces

Choix de l'espèce medaka Oryzias latipes : - court temps de génération en prévision d'étude d'effets inter- et transgénérationnels - spermatogénèse continue (et non saisonnière) - techniques édition génome et épigénome accessibles - ressource importante pour intégration de données bio-informatiques, bibliographie, outils moléculaires (anticorps par exemple) - spermatozoïde à histones (contrairement au zebrafish), plus proche des modèles mammifères Nous travaillerons avec des adultes de 4.5 mois car nous souhaitons étudier la spermatogénèse qui a lieu chez les mâles adultes, et la capacité des spermatozoïdes à féconder des oeufs (émis par des femelles adultes de 4.5 mois).

Toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 6 030 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections, subissent une chirurgie sous anesthésie et sont placées jusqu'à cinq fois en cage métabolique pendant six heures pour la collecte d'urine, avec une échographie cardiaque dans un second établissement. L'hypertension artérielle maligne induite peut atteindre le cœur, les reins et la rétine, et les souris hypertendues urinent assez pour imposer un changement de cage fréquent. Le porteur justifie l'effectif de 6 030 par un plan expérimental stéréotypé et conclut que le recours au modèle animal est "nécessaire", la culture cellulaire ne reproduisant pas les interactions entre organes.

Objectifs

L’hypertension artérielle maligne est définie par l’association d’une tension artérielle élevée à des signes objectifs de l’atteinte des organes cibles de l’hypertension artérielle : reins, cerveau, rétine, coeur. Les objectifs du projet seront d'étudier une voie protectrice des vaisseaux sanguins dans l'hypertension artérielle. L’intérêt de ce projet est donc de comprendre deux systèmes modifiant la tolérance des vaisseaux sanguins à l’hypertension artérielle en particulier dans le coeur et les reins. Le projet se déroulera dans 2 établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aboutir à l'identification de paramètres sanguins et de variants génétiques qui pourraient être des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. Si l'hypothèse proposée se confirme, ceci pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'une hypertension artérielle maligne.

Procédures

Etablissement 1: Injections (5 x 30 secondes), chirurgie légère sous anesthésie générale avec analgésie (1 x 5 minutes), prélèvement d'urine en cage métabolique ( jusqu'à 5 fois, 6h à chaque fois), prélèvement sanguin sur animal anesthésié (1 fois au moment de la mise à mort). Etablissement 2: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (1 fois 20 minutes)

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines). Stress lié au transport des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus

Remplacement

Différentes approches sont utilisées pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'hypertension artérielle comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi le recours au modèle animal est nécessaire, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un maximum d'organes d'intérêt par animal est prélevé afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront élévés en cages enrichies et surveillés quotidiennement pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées dès que nécessaire. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasives, sont réalisées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, le modèle d'hypertension artérielle utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Nous utilisons des souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux