Procédures modérées
Modification du projet : Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 2/3
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 70 d'entre elles recevant en plus un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Elles subissent des injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline et de dexaméthasone, des mesures de pression artérielle en tube de contention, des échographies cardiaques sous anesthésie et des transferts entre trois établissements. Toutes sont tuées après les seize semaines pour prélever des organes, une partie de ces prélèvements étant redistribuée à d'autres chercheurs du laboratoire pour des mises au point techniques.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.
Procédures
Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Colonisation et impact des archées méthanogènes sur la physiologie de l’hôte MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
142 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées par prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil. Des souriceaux au microbiote défini reçoivent jusqu'à six administrations orales, jusqu'à cinq administrations rectales sous anesthésie et jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois précédées d'un traitement antibiotique. Cinq stratégies de colonisation par des archées méthanogènes sont mises en concurrence, la plus efficace étant ensuite reproduite deux fois pour en mesurer la variance, ce qui revient à mettre au point un modèle avant toute question biologique. Le porteur reconnaît utiliser des lignées cellulaires et des organoïdes pour explorer le même sujet, et conclut malgré tout qu'il n'existe "pas de méthodologie alternative".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle de colonisation des archées dans le tractus intestinal de souris au microbiote défini Oligo-MM12 (OMM12). Ce modèle va permettre l’étude de l’impact de la colonisation sur la physiologie intestinal et immunitaire de l’hôte. De plus, grâce à la grande stabilité intrinsèque du microbiote OMM-12, nous pourrons examiner quels sont les conséquences des archées sur la communauté microbienne tant en termes de stabilité, d’abondance ainsi que des modifications du métabolisme lié à l’hydrogène. Afin d’atteindre cet objectif, nous allons tester 5 stratégies de colonisation des souris avec les archées intestinales : 1.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 2.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux axéniques 3.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique 4.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique avec l’aide d’un traitement antibiotique 5.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 avec 5 gavages Enfin, après avoir sélectionné l’approche la plus efficace pour la colonisation des archées, nous la reproduirons deux fois indépendamment afin d’en évaluer la reproductibilité et la variance (Etude 6).
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront d’établir un modèle murin de colonisation avec des archées méthanogènes dans un microbiote définit. Ces études permettront de mieux comprendre les déterminant de la colonisation des archées intestinales chez la souris et par extension chez l’humain (dynamique temporelle, impact des bactéries, régime alimentaire). A ce jour, différentes publications montrent des corrélations entre la présence des archées et différentes pathologies chez l’humain mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les interactions archées-microbiote-hôte. Grâce à ce modèle nous pourrons étudier par la suite le rôle de ces micro-organismes, uniques en termes de structures et de métabolisme, dans le contexte de maladies inflammatoires de l’intestin et d’allergie.
Procédures
- Administrations orales : 1 à 6 fois par une solution non-irritante, chaque administration durant moins d’une minute. - Administrations rectales : 1 à 5 fois par une solution non-irritante, chaque administration durant moins d’une minute. - Injection par voie intrapéritonéale : 1 à 5 lors des administrations rectales, quelques secondes
Impact sur les animaux
Un premier essai de colonisation dans les souris OMM-12 adultes a montré que le gavage par des archées méthanogènes n’induit pas d’effet indésirable comme la perte de poids ou une augmentation du stress des animaux. L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer un inconfort léger de courte durée. Les administrations rectales seront réalisées sous anesthésie ce qui limitera le stress des animaux et ne devrait pas induire d’effet indésirable au-delà de l’anesthésie elle-même.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements terminaux, effectués en fin de procédures et sous anesthésie, ne permettant pas leur réveil. Ces prélèvements sont nécessaires pour évaluer la colonisation des bactéries étudiées et analyser l’impact sur la physiologie de l’hôte.
Remplacement
Nous utilisons des stratégies de remplacements in vitro en utilisant des lignées cellulaires et des organoïdes afin d’explorer le rôle des archées intestinales sur l’inflammation et la barrière intestinale. Cependant ces modèles de remplacement son limité et ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre le microbiote et l’hôte. Toutefois, l’utilisation d’un modèle murin est nécessaire pour tester notre hypothèse car il n’existe pas de méthodologie alternative permettant d’analyser les interactions hôtes-microbiotes dans le contexte intestinal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux dans les différentes études, nous n’entreprendrons certaines études du projet uniquement si elles sont pertinentes scientifiquement. Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’outil de modélisation statistique (Shade) et les conseils d’une statisticienne. Le nombre d’animaux est limité au stricte nécessaire et suffisant pour déterminer si la colonisation des archées est réussie. Des tests statistiques seront menés afin de valider l’impact sur le poids des souris, la stabilité de la colonisation, de quantifier les potentielles modifications du microbiote et de déterminer la variance du modèle. Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à pris en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet portée, microbiote, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Les procédures expérimentales de ce projet sont légères ou modérées du fait de la répétition des injections. Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une évaluation régulière des animaux et à la mise en place de points limites pertinents. Le gavage et l’administration rectale seront pratiqués avec du matériel adapté : sondes de gavage souples adaptées à l’âge de souris et à usage unique. Cela permettra de réduire significativement les nuisances liées aux gestes techniques eux-mêmes. De plus, si la colonisation fonctionne avec une seule administration, les autres administrations ne seront pas pratiquées. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée D’après les données provenant d’expériences précédentes, l’administration des antibiotiques dans l’eau de boisson ne provoque pas de nuisances chez les animaux.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin nous permet d'analyser l'interaction des trois composants : le microbiote, les archées et la réponse de l’hôte. Il n’est pas possible de mener cette étude en utilisant les poissons zèbres ou des invertébrés car ceux-ci ne possèdent pas de microbiote anaérobie similaire aux humains et ni les conditions physico-chimiques nécessaires à la vie des archées méthanogènes. Les souris auxquelles nous allons recourir seront des souriceaux à la naissance que nous suivrons entre la période postnatale et la période adulte (6-10 semaines) ainsi que des adultes.
Vectorisation d’acides ribonucléiques circulaires à visée thérapeutique EU2/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un lymphœdème est provoqué chirurgicalement chez des souris femelles de cinq semaines, sous anesthésie générale, avec trois injections intradermiques d'un vecteur au cours de la même intervention. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, transportées entre deux établissements pour que les prélèvements terminaux se fassent ailleurs. Le porteur décrit le lymphœdème comme une pathologie douloureuse et handicapante survenant après une chirurgie du cancer, puis résume les effets sur les souris à des douleurs modérées et un léger stress. Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure pour collecter les échantillons.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est également implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.La réalisation des procédures dans un 2eme établissement utilisateur nécessite la modification d’un projet initial autorisé sans ajout d’animaux
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes. Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subissent des injections intradermiques et une procédure chirurgicale (15 min par animal) . Dans le second établissement utilisateur, les procédures terminales sont réalisées
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de lymphoedème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal
Devenir
Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphoedème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphoedème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endotheliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permette de repondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement
Raffinement
Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport)
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera réalisée chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 a 12 semaines.
Evaluation de thérapeutiques pour lutter contre l’obésité
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
100 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 60 réutilisés dans d'autres procédures et 40 placés à l'adoption, une partie étant tuée pour des prélèvements après la mort au cours des études d'efficacité. Sélectionnés parce que leur score de condition corporelle dépasse 7, donc déjà obèses, ils reçoivent une à trois administrations, jusqu'à neuf prélèvements sanguins et des périodes d'alimentation individuelle qui provoquent stress, baisse de prise alimentaire et perte de poids. Le bénéfice mis en avant pour les chiens obèses passe par l'autorisation de mise sur le marché de produits vétérinaires, objet réel du dossier. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune méthode ne permet d'évaluer la pharmacocinétique sans travailler sur un "organisme entier".
Objectifs
L'obésité chez le chien est un problème de santé majeur, sachant que plus d'1 chien sur 3 est en surcharge pondérale et que l'obésité est associée à des désordres métaboliques comme le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires ou des troubles articulaires. L'objectif de ce projet est d’évaluer des produits vétérinaires destinés à lutter contre l’obésité chez le chien. Avant qu’un traitement ne soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’obésité de l’animal. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation.
Bénéfices attendus
Ces études permettent de définir l’innocuité et l’efficacité des produits vétérinaires testés et d’expliquer la relation entre la dose et la réponse, c'est-à-dire, l'effet du produit. Ce sont des informations nécessaires au choix de la posologie et de la voie d’administration du produit, préalable à la réalisation des études réglementaires d’efficacité et d’innocuité. Ces informations sont nécessaires à l’obtention d'une autorisation de mise sur le marché de nouveaux produits. Les bénéfices de ce projet sur la population canine obèse sont d’améliorer leur bien-être en réduisant les risques liés à l’obésité, désordres métaboliques comme le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires ou des troubles articulaires
Procédures
Les administrations s'effectuent sur animal vigile ou anesthésié, 1 ou 3 fois selon l'objectif de l'étude et durent environ 3 minutes. Les prélèvements sanguins s'effectuent sur animal vigile ou anesthésié en fonction du comportement de l'animal, 1 à 9 fois selon le protocole et durent environ 3 minutes. Enfin, un examen physique complet (incluant pesée et body condition score) de tous les animaux en vigile est prévu 1 fois ou plus si jugé nécessaire et dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les produits à l’étude ont déjà fait preuve de leur innocuité chez d’autres espèces (rongeurs). Les nuisances attendues sur les animaux sont : stress dû à la contention ; douleur / inconfort suite aux injections ou aux prélèvements ; stress pendant les périodes d’alimentation individuelle et baisse de prise alimentaire et perte de poids durant les périodes de traitement ; signes cliniques secondaires à l’obésité (apparition potentielle de troubles métaboliques, de douleurs articulaires, troubles cardio-vasculaires,...).
Devenir
Les animaux seront réutilisés et/ou adoptés. Dans le cadre de certaines études d'efficacité, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post mortem.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative au recours à l’animal permettant d’évaluer la pharmacocinétique ou la pharmacodynamie des produits pharmaceutiques vétérinaires. Les modèles in silico et/ou in vitro/ex vivo permettent de sélectionner des molécules potentiellement efficaces. Après cette première étape, les études de pharmacocinétique ou pharmacodynamie nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques d’un futur candidat médicament.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires de pharmacocinétique/Pharmacodynamique (3 ou 4 animaux par groupe). Il sera ensuite calculé pour les études suivantes selon la variabilité entre individus observée antérieurement et pourra atteindre jusqu’à 10 animaux. Compte-tenu de la variabilité individuelle, les études d’innocuité et d’efficacité seront réalisées sur des groupes de 8 à 12 animaux. Ces effectifs s'évaluent en fonction de la bibliographie, de l'historique ou des objectifs de l'étude. Lorsque le statut des animaux le permet les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures et peuvent ensuite être réutilisés dans une future procédure. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par le vétérinaire désigné, sont réutilisables.
Raffinement
Une période d’acclimatation optimale de 7 jours est prévue. Les chiens ont à disposition des méthodes d’enrichissement afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. Pour limiter le stress lié à l’alimentation individuelle, celle-ci est réduite au minimum (~1h30-2h), sans isolement visuel, olfactif et auditif. Afin d’identifier et gérer tout signe clinique secondaire à l’obésité, des examens cliniques, évaluation du body score, des pesées et des suivis sanguins réguliers sont réalisés. Un training est réalisé en renforcement positif (friandises, caresses), afin de limiter le stress lié aux actes techniques (contention, administrations, prélèvements) et aux conditions d’études. Pour réduire l’inconfort provoqué par les prélèvements, les opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée de l’animal et une anesthésie et/ou analgésie et/ou un changement du site pourra être mis en place. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal (spontané ou provoqué) et/ou toute anomalie physique non attendue. Des points limites spécifiques au projet sont appliqués. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de la procédure, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge pour maximiser leur confort et leur bien-être. La SBEA garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Il s’agit des espèces cibles pour les produits. Des données concernant l’espèce doivent être fournies au dossier pour l’obtention de l’autorisation de mise sur le marché. Les animaux inclus sont des chiens présentant au minimum un score de condition corporelle supérieur à 7. Les chiens utilisés ont plus de 9 mois. L’âge dépend de l’objectif de l’étude et du scope d’utilisation du produit testé.
Élevage d’un modèle de souris reproduisant un cancer colorectal conduisant à des altérations du système musculaire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris de cette lignée sont modifiées pour développer des polypes intestinaux, un cancer du côlon qui leur fait perdre force et masse musculaires et provoque une anémie. 420 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toute la portée, y compris les souriceaux dont le génotype ne sert à rien pour l'étude, subit à sept à dix jours un prélèvement de tissu pour analyse génétique. Les mâles reproducteurs sont tués à quatorze semaines, âge auquel le porteur affirme que l'atteinte musculaire reste sans incidence notable, et 210 animaux repartent vers l'élevage ou vers un prélèvement de tissus après leur mise à mort.
Objectifs
Le développement d’une tumeur au sein du corps humain à des répercussions sur l’organise entier. Plus particulièrement, il a été démontré que la croissance d’une tumeur réduit la force et la masse musculaire mais les mécanismes biologiques sont encore mal connus. Le projet vise à décrire la procédure d’élevage d’un modèle de souris qui développe des polypes intestinaux, correspondant à un cancer du côlon.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus seront l’identification génétique de la lignée à partir d’une biopsie de tissu pour optimiser la gestion de l’élevage. Ce projet permet aussi d’organiser au mieux la production de cohortes d’animaux pour nos projets scientifiques (utilisation continue vers des projets liés à l’étude des dysfonctions musculaires liées au cancer).
Procédures
Pour sélectionner les souris génétiquement modifiées nécessaires à l’étude, un morceau de tissu sera prélevé à l’âge de 7-10 j sur toutes les souris de la portée (souris d’intérêt pour ce projet, mais aussi les souris de génotype non pertinent ou ne présentant pas phénotype dommageable) pour analyser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Les souris atteintes d’un cancer du côlon seront utilisées jusqu’à l’âge de 14 semaines, stade au cours duquel les atteintes musculaires restent légères et sans incidence notable sur la capacité des animaux à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, on prélève un morceau de tissu pour analyser l’ADN des souris génétiquement modifiée. Ceci peut entrainer une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés mais le geste est rapide (quelques secondes). Le risque de saignement est très faible. La nuisance liée au phénotype dommageable est principalement induite par une anémie et une légère diminution de la masse et de la force musculaire à l’âge d’utilisation des animaux qui n’impacte par leur capacité à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter.
Devenir
Les mâles reproducteurs du modèle de cancer du côlon âgés de 14 semaines seront mis à mort. Les animaux WT (mâles et femelles) âgés de moins de 8 mois pourront être réutilisés par des expérimentateurs de l’équipe dans le système d’élevage en vue du maintien de lignées ou pour un prélèvement de tissus post-mortem. Dans le cas contraire ils seront mis à mort.
Remplacement
Des analyses in vitro, utilisant des cultures cellulaires ont déjà été réalisées afin d’établir une évidence des processus biologiques. Afin de démontrer la pertinence des résultats, l’analyse des tissus ou des cellules de l’animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en connaissant le schéma d’accouplement et le nombre de lots de souris nécessaires pour chaque projet d’expérimentation.
Raffinement
Pour vérifier la modification génique, la biopsie sera réalisée sur une zone peu innervée à l’âge de 7-10 jours pour limiter la douleur liée à la petite incision. Lors de la contention des nouveau-nés, le zootechnicien se frottera les mains dans la litière pour limiter le stress des animaux. La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. L’âge de la mise à mort des animaux a été fixé à 14 semaines pour les mâles reproducteurs, stade au cours duquel les atteintes musculaires restent légères et sans incidence notable sur la capacité des animaux à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l’homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle strié squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes permettant ainsi de réaliser des études plus spécifiques.
Évaluation pharmacologique de la fonction cardiovasculaire chez le chien, par télémétrie implantée (pharmacologie de sécurité).
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Un émetteur de télémétrie est implanté chirurgicalement dans le corps de chaque chien, puis des molécules en développement leur sont administrées, seules ou de façon répétée, avec des prélèvements sanguins pouvant atteindre 64 ml en sept jours. 90 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 20 réutilisés dans une autre procédure avant d'être tués, aucun ne pouvant être rendu à l'adoption à cause de l'implant. L'objet réel du projet est la production d'un rapport réglementaire joint aux demandes d'essai clinique. La chirurgie d'implantation, qui décide pourtant du sort de tous les animaux, n'apparaît pas dans la liste des procédures décrites, et le porteur n'indique ni le nombre d'études par chien ni la nature des molécules testées.
Objectifs
La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique de molécules thérapeutiques. Préalablement aux études cliniques, les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire les effets pharmacologiques de molécules thérapeutiques. Seule l’expérimentation animale permet de définir leur innocuité afin de sécuriser les premiers essais chez l’humain. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec recommandations médicales internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de molécules sur le système cardiovasculaire du chien. L’évaluation de la fonction cardiovasculaire chez le chien se fera par électrocardiographie implantée, avant et après administration d’une molécule thérapeutique. La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses de chaque molécule testée sur la fonction cardiovasculaire. Ce rapport, requis par la réglementation, fera partie intégrante de la demande d’essai clinique.
Bénéfices attendus
À l’échelle mondiale, les maladies cardiovasculaires demeurent la première cause de décès avec environ 17,9 millions de morts par an, suivies des cancers (10 millions/an), des maladies neurologiques (9 millions/an), des maladies infectieuses (7,7 millions/an), des maladies respiratoires chroniques (3,9 millions/an) et du diabète (1,5 million/an).Pour ces pathologies, il n’existe à ce jour aucune solution thérapeutique satisfaisante. Ce projet vise à couvrir une étape indispensable dans le développement de solutions thérapeutiques innovantes. La pharmacologie de sécurité est une phase règlementaire indispensable au développement préclinique, préalable aux études cliniques. Elle permet de caractériser les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) chez l’animal. 10 à 12 % de ces composé thérapeutiques échouent en essais cliniques en raison de problèmes de sécurité cardiovasculaire. Ces risques cardiovasculaires sont mieux identifiés et anticipés aujourd’hui grâce à l'intégration des études de pharmacologie de sécurité. A court terme, le bénéfice premier de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique, spécifique à la fonction cardiovasculaire, d’un composé. A long terme, les données obtenues de ces études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers de mise sur le marché. Ces études réduiront les risques cardiovasculaires lors des essais cliniques et contribueront à :: 1. améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. améliorer la sécurité des patients, en identifiant/caractérisant les effets cardiovasculaires indésirables 3. optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et les profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. réduire les coûts de santé en améliorant la sécurité/efficacité des traitements 6. répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité afin d’obtenir l’autorisation d’essais cliniques
Procédures
Les animaux seront soumis à l'administration, unique ou répété, d'une molécule thérapeutique en phase de test ou d'un composé de référence (témoin). Chaque administration dure quelques minutes ou quelques dizaines de minutes. Des prélèvements sanguins peuvent être effectués (5 minutes environ). La quantité et la fréquence acceptables dépendent du volume sanguin total (VST). Chez un chien, il est estimé à 850 ml pour un chien de 10 kg Environ 10 % du VST peut être prélevé en toute sécurité toutes les 2 semaines (soit 85ml) , 7,5 % tous les 7 jours (64 ml) selon les recommandations EFPIA/ECVAM, et ressources du NIH. En cas de cinétique, les temps de prélèvement sont déterminés sont les caractéristiques du xénobiotique tout en respectant le volume maximal possible de 7,5% sur 7 jours glissant. Par exemple : prélèvement avant administration, puis 3h, 6h, 12h et 24h après, 1 à 2 ml à chaque temps.
Impact sur les animaux
Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration répétée d'une molécule peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque de lésions ou d’infection lors d’administration intrathécale, intracraniale (lésions neurologiques, paralysie partielle) ou intra-articulaire (boiterie, arthrite). - Liées à une toxicité du xénobiotique testé : il n’est pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie en raison de la faible dose administrée de xénobiotique ou d'une administration unique.
Devenir
A l'issus de la procédure, les animaux seront euthanasiés car l'implant télémétrique les rends inaptes à une réhabilitation. Dans la mesure du possible, ils seront inclus dans une autre procédure sans réveil afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, sur avis vétérinaires. Ils pourront être aussi réutiliser dans une procédure légère ou modéré, mais seront in fine euthanasié dans le cadre de ces procédures en raison de la chirurgie d'implantation initiale.
Remplacement
La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule et une ou plusieurs cibles liées au système cardiovasculaire. Ces interactions englobent les effets de la molécule ou de ses produits de dégradation, sur des cibles, mais aussi l’influence éventuelle de ces cibles sur la molécule. Une compréhension fine des mécanismes de toxicité est donc indissociable d’une connaissance approfondie des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. À ce jour, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes impliqués dans la toxicité cardiovasculaire ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe pas, en conséquence, de modèle de substitution. C’est pourquoi la réglementation impose l’évaluation de la sécurité pharmacologique d’une molécule thérapeutique avant toute administration chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie cardiovasculaire de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • des études pilotes seront réalisées, si nécessaire, sur un nombre limité d’animaux. L’objectif sera d’identifier les doses les plus favorables et les moins toxiques • un même animal instrumenté pourra participer à plusieurs études si et seulement si : o les composés testés précédemment n’ont présenté ni effets cardiovasculaires irréversibles, ni effets toxiques o les profils pharmacocinétiques sont connus et permettent de définir une période de repos adéquate o les paramètres biochimiques et hématologiques évalués avant l’étude se situent dans les valeurs de référence attendues pour cette espèce Le nombre d’animaux par étude est de 4 (4 males) et peut aller jusqu’à 8 (4 males et 4 femelles). Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation statistique pertinente des données, et la caractérisation correcte des effets cardiovasculaires potentiels.
Raffinement
Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse : à leur arrivé sur site, les animaux seront acclimatés (2-3 semaines) aux conditions d’hébergement, et suivent un programme d’entrainement aux procédures expérimentales. Ils seront également hébergés en collectivité, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la souffrance : un opérateur observera matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement. Dès les premiers signes de douleur, une intervention vétérinaire sera effectuée. Certains administrations seront faites systématiquement sous anesthésie • des soins vétérinaires adaptés si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotique, analgésique • l’intégration de points limites stricts afin de limiter toutes souffrances prolongées. Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie (émetteur envoyant les données physiologiques de l'animal en temps réel, à distance). Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface est en cours d'évaluation.
Choix des espèces
Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont encadrées par des recommandations médicales et pharmaceutiques internationnales. Elles peuvent être réalisées chez des espèces rongeurs ou non rongeurs. Le chien, en raison de sa valeur prédictive, est l’une des espèces non rongeurs retenue pour ce type d’étude.
Restauration de la signalisation BMP dans les maladies vasculaires pulmonaires
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
868 rats vont être utilisés, chacun recevant jusqu'à neuf injections sous-cutanées espacées de trois jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypertension pulmonaire ou une atteinte hépatique leur est induite, certains subissent une chirurgie abdominale de vingt minutes, tous passent deux échographies sous anesthésie légère puis une procédure terminale de trente minutes avec mesures de pression et prélèvement des poumons, du cœur, du foie et de la rate. Le porteur annonce une fatigue progressive, une réduction de la prise de poids et, dans le modèle hépatique, une jaunisse, et prévoit d'utiliser les rats témoins non malades dans plusieurs analyses pour éviter d'en commander d'autres. Les plus jeunes arrivent à quatre semaines et pèsent une centaine de grammes, tandis que le bénéfice espéré, de nouveaux traitements pour deux maladies vasculaires graves, reste suspendu à des résultats positifs.
Objectifs
L’hypertension pulmonaire est une maladie vasculaire rare et progressive caractérisée par une augmentation de la pression dans la circulation pulmonaire, résultant du rétrécissement des petites artères pulmonaires. Cette augmentation de pression impose une surcharge au ventricule droit, menant progressivement à une insuffisance cardiaque. Malgré les traitements actuels, cette pathologie reste associée à une mortalité élevée. Des avancées récentes ont mis en évidence le rôle central de certaines voies de signalisation impliquées dans l’équilibre vasculaire pulmonaire. En particulier, des anomalies dans les mécanismes régulant la prolifération et la survie des cellules vasculaires contribuent au remodelage pathologique des vaisseaux pulmonaires. Ainsi, le ciblage de ces voies moléculaires constitue une stratégie prometteuse pour améliorer les options thérapeutiques actuelles. Ce projet vise à évaluer l’impact de nouvelles approches pharmacologiques agissant sur ces mécanismes. L’objectif est d’analyser leur capacité à atténuer le remodelage vasculaire et à améliorer la fonction pulmonaire et cardiaque dans des modèles expérimentaux. Par ailleurs, ces stratégies seront également explorées dans le cadre d’une autre pathologie pulmonaire secondaire à une atteinte hépatique, partageant des altérations similaires des voies de signalisation vasculaire. L’ensemble de ces travaux contribuera à préciser les mécanismes physiopathologiques sous-jacents et à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant directement les causes du dysfonctionnement vasculaire pulmonaire.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer le traitement de maladies vasculaires graves, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et le syndrome hépato-pulmonaire (SHP), qui sont encore aujourd’hui mal prises en charge. Il s'appuie sur des résultats encourageants issus de recherches récentes pour tester de nouvelles approches thérapeutiques combinées. L’objectif est d’agir plus efficacement sur les vaisseaux pulmonaires et le cœur afin de ralentir la progression de ces maladies. Si les résultats sont positifs, ils pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour les complications pulmonaires liées à certaines maladies du foie ou à des atteintes chroniques du système vasculaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions expérimentales selon les objectifs des modèles étudiés. Injections sous-cutanées : Chaque animal recevra jusqu’à 6 injections pour 2 procédures et 9 injections pour une autre, dans le cadre de traitements expérimentaux ou de l’induction des pathologies. Une injection est prévue en début de procédure puis les autres sont réalisées tous les 3 jours. Chaque injection dure moins de 1 minute et est réalisée sous anesthésie locale. Échographies cardiaques ou hépatiques : Deux échographies par animal sont prévues, à des temps définis selon le modèle. Chaque séance dure environ 5 minutes sous anesthésie légère. Intervention chirurgicale (dans une procédure uniquement) : Une chirurgie abdominale est réalisée une fois par animal sous anesthésie générale. L’intervention dure environ 20 minutes, suivie d’une période de surveillance post-opératoire. Procédure terminale : Réalisée une fois par animal, sous anesthésie générale profonde. Elle dure environ 30 minutes et inclut des mesures hémodynamiques et des prélèvements d’organes. Chaque intervention est répartie selon les phases expérimentales, avec un suivi rigoureux du bien-être des animaux tout au long du protocole.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dans ce projet concernent les interventions expérimentales ainsi que les manifestations liées aux pathologies induites : • Les injections sous-cutanées peuvent provoquer une douleur modérée et transitoire au point d'injection • La chirurgie abdominale peut entraîner une douleur postopératoire modérée, localisée dans la zone opérée. • Les échographies peuvent générer un stress léger et temporaire dû à la contention et à l’anesthésie. • Les procédures terminales sont réalisées sous anesthésie générale et ne génèrent pas d’effet indésirable postérieur. • Les modèles de pathologies peuvent provoquer : une fatigue progressive et une réduction de la prise de poids dans les modèles d’hypertension pulmonaire ; une jaunisse et une réduction de la prise de poids dans le modèle de pathologie hépatique.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés car des prélèvements d'organes (poumons, cœur, foie et rate) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques.
Remplacement
Ce projet repose sur des résultats prometteurs obtenus à partir d’échantillons humains et d’études in vitro sur des cultures cellulaires. Ces données ont mis en évidence des altérations dans des voies de signalisation clés impliquées dans le remodelage vasculaire pulmonaire, avec un potentiel de restauration significatif grâce à l’utilisation de molécules expérimentales. Ces approches ont montré des effets importants sur des phénomènes cellulaires tels que la prolifération, la résistance à l’apoptose et la migration cellulaire. Toutefois, pour valider l’impact de cette restauration sur le remodelage vasculaire pulmonaire, la fonction cardiaque et les anomalies hépato-pulmonaires, des modèles animaux restent indispensables. Les modèles choisis pour ce projet sont des outils largement validés dans la recherche préclinique, permettant d’étudier de manière approfondie des mécanismes physiopathologiques complexes dont la voie signalisation, cible de notre projet, est impactée. Ces modèles permettent d’examiner l'interaction entre plusieurs organes (cœur, poumons et foie) et de tester l’efficacité de la molécule dans un contexte systémique. L’utilisation combinée des modèles in vivo pour l’hypertension pulmonaire et le syndrome hépatopulmonaire constitue une approche complémentaire essentielle pour établir une preuve de concept robuste, en intégrant les différentes dynamiques systémiques et pathologiques associées à ces maladies. C’est pourquoi, dans ce projet, les approches in vitro et in silico, bien que précieuses dans l’étude de mécanismes cellulaires spécifiques, sont limitées car elles ne prennent pas en compte les interactions multi-organiques qui sont des processus physiopathologiques dynamiques et majeurs. De plus, les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire l’environnement tissulaire complexe ni les effets systémiques d’une thérapie sur un organisme entier. De même, les modèles informatiques, bien qu’outils complémentaires pour des analyses prédictives, ne sont pas encore en mesure de capturer avec précision les réponses biologiques complexes à l’échelle d’un organisme vivant. Le recours aux modèles animaux est donc indispensable pour évaluer l’efficacité et la tolérance des molécules dans un cadre physiologique réaliste, prenant en compte les interactions entre les systèmes cardiovasculaire, pulmonaire et hépatique. À ce jour, aucune alternative ne permet d’obtenir ces données de manière aussi fiable et transposable.
Réduction
Les effectifs ont été soigneusement calculés en utilisant des outils statistiques avancés, en tenant compte des données issues de nos études préliminaires et des résultats disponibles dans la littérature sur les thérapies vasculaires et l’étude des voies BMP. Les critères hémodynamiques, tels que la pression artérielle pulmonaire moyenne et l'évaluation du remodelage vasculaire, sont les principaux paramètres utilisés pour évaluer l’efficacité des traitements, ce qui permet de concentrer les analyses sur des mesures précises et pertinentes, réduisant ainsi la nécessité d’effectuer des évaluations multiples ou prolongées. De plus, les animaux non malades, ou les témoins utilisés dans le cadre de ces études, seront réutilisés pour des analyses complémentaires, lorsque cela est possible, afin d'éviter l’utilisation de nouveaux animaux pour des expériences supplémentaires. Cette stratégie permet de tirer parti des données obtenues tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires à l’ensemble du projet. Par ailleurs, les résultats de ces expérimentations pourront être exploités dans le cadre d'autres projets de recherche, contribuant à une utilisation optimale des ressources animales disponibles.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un système de surveillance basé sur des points limites sera appliqué afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Une attention particulière est portée à la gestion de la douleur : une analgésie est administrée avant les interventions douloureuses, notamment avant la chirurgie, et toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie adaptée (anesthésie générale pour la chirurgie, anesthésie locale pour les injections). Cela permet de réduire efficacement toute douleur ou stress potentiel. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de référence dans l’étude des pathologies cardiovasculaires et pulmonaires, notamment en raison de sa taille permettant les mesures hémodynamiques, de sa physiologie bien caractérisée, et de la robustesse des modèles expérimentaux développés. Il présente également une bonne transposabilité des mécanismes physiopathologiques à l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour l’évaluation thérapeutique et la compréhension des maladies ciblées dans ce projet. Des rats âgés de 4 semaines (environ 100 grammes) seront utilisés pour les modèles ciblant les phases précoces du développement de l’hypertension pulmonaire. Ce choix permet de reproduire les conditions expérimentales couramment utilisées dans la littérature scientifique, facilitant ainsi la comparaison et l’interprétation des résultats. Des rats âgés de 8 semaines (environ 200 grammes) seront utilisés pour les modèles nécessitant une exposition prolongée ou une intervention chirurgicale, afin de garantir une meilleure tolérance aux procédures et une récupération post-opératoire optimale. Ce stade est également en cohérence avec les pratiques décrites dans les études de référence.
Modulation des acteurs cellulaires dans le développement de la cardiomyopathie atriale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, donc porteuse d'un phénotype dommageable dès le départ. 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre comment les cellules immunitaires participent à la maladie de l'oreillette qui accompagne l'obésité. Certaines subissent l'ablation de la rate, puis quatre mois de régime gras, une prise de sang hebdomadaire sur animal vigile, deux tests métaboliques de deux heures avec huit prélèvements chacun, des échocardiographies et des électrocardiogrammes sous anesthésie, d'autres l'implantation sous-cutanée d'une pompe. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever les tissus, une mise à mort que le porteur présente comme "la seule solution éthique permettant d'obtenir des résultats fiables".
Objectifs
La fibrillation atriale est l’arythmie cardiaque la plus fréquente en pratique clinique. Elle est la principale cause d’accidents vasculaires cérébrales et de l’insuffisance cardiaque. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population. Les thérapies actuelles sont limitées, ce qui en fait un enjeu majeur de santé publique. De nombreux facteurs de risques y sont associés tels que le vieillissement, l’hypertension et les syndromes métaboliques comme l’obésité. Chez les patients obèses, son incidence augmente avec l’indice de masse corporel. A l’échelle du tissu, l’oreillette est dilatée et accumule du tissu gras. Ce remodelage tissulaire est une cardiomyopathie atriale qui évolue par une disparition du tissu gras et un remplacement par une matrice, la fibrose. Comme les autres tissus affectés par l’obésité, une réponse systémique active l’inflammation et le système immunitaire contribuant ainsi à l’activation de précurseurs qui sont à l'origine du tissu gras et de la fibrose. L’hypothèse est que les cellules immunes sont impliquées dans le développement de la maladie. Les objectifs sont 1-d’identifier la nature et la source des cellules immunes, et 2-de moduler leur rôle dans la maladie. Pour développer ces objectifs, des modèles murins soumis à une alimentation enrichie en régime gras sera utilisée pour induire l’obésité et le développement de la cardiomyopathie. L’étude du rôle des cellules immunes sera aussi effectuée dans des modèles de souris génétiquement modifiés.
Bénéfices attendus
Le projet porte sur la compréhension du remodelage atrial dans le contexte de l'obésité et sur la modulation de molécule cible. Cette étude permettra de développer une thérapie ciblée en vue d'une meilleure prise en charge des patients. En effet, le but de se projet est de pouvoir cibler des biomarqueurs précoce afin de ralentir le dévelopement de la maladie et de prévenir la fibrillation atriale.
Procédures
Une partie des animaux subiront une chirurgie d’ablation de la rate (1 fois, 10-15 minutes par animal) effectuée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique pré et post-opératoire. Les animaux seront ensuite placés sous régime enrichie en graisse pendant 4 mois. Après 1 semaine de régime, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin chaque semaine sur animal vigile (1 fois par semaine, quelques secondes par animal). Après 2 mois (8 semaines) et 4 mois (16 semaines) de régime, 2 tests métaboliques seront réalisés afin d’évaluer les syndromes métaboliques (2 tests, 2 fois à 2 mois et 4 mois, espacés de 5 jours, durée 2h par test). Ces tests consistent à administrer une molécule (1 fois, quelques secondes sur animal vigile) et à prélever une goutte de sang 8 fois sur une période de 2 heures pour tester l'évolution de la glycémie (8 fois, quelques secondes sur animal vigile). Des échocardiographies cardiaques seront effectuées sous anesthésie générale (2 fois à 2 mois d’intervalle, 15 minutes par animal) suivi 5 jours après d’un électrocardiogramme effectuées sous anesthésie générale et analgésie (2 fois à 2 mois d’intervalle, moins de 5 minutes par animal). Une seconde partie des animaux seront préalablement placés sous régime riche enrichie en graisse pendant 2 mois. Après 4 semaines de régime, ils subiront une chirurgie d'insertion sous-cutanée d'une pompe osmotique à délivrance contrôlée de molécules (1 fois, 5 minutes par animal). La réalisation est effectuée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique pré et post-opératoire. Après 1 mois (4 semaines) de régime, 2 tests seront réalisés afin d’évaluer syndromes métaboliques (2 tests, 1 fois à 1 mois, espacés de 5 jours, durée 2h par test). Ces tests consistent à administrer une molécule (1 fois, quelques secondes sur animal vigile) et à prélever une goutte de sang 8 fois sur une période de 2 heures pour tester l'évolution de la glycémie (8 fois, quelques secondes sur animal vigile). Des échocardiographies cardiaques seront effectuées sous anesthésie générale (1 fois après 2 mois de régime, 15 minutes par animal) suivi 5 jours après d’un électrocardiogramme effectuées sous anesthésie générale et analgésie (1 fois après 2 mois de régime, 3 mintues par animal). A la fin de chaque période de maintien, les animaux subiront un dernier prélèvement sanguin sous anesthésie avant l’euthanasie par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements sanguins pourront induire une douleur aux animaux. Les régimes alimentaires spéciaux pourront entrainer une prise de poids ou une perte de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Les tests métaboliques sont une nuisance associée à la sensation de faim liée à la mise à jeun, le stress et la douleur de courte durée lors des administrations de molécule puis celles associés aux prélèvements sanguins de faible volume et un risque de saignement. Le régime gras peut engendrer des démangeaisons cutanées. Le gavage par canule apporte un stress à l'animal notamment par la contention au niveau de la nuque et peut également irrité la cavité buccale/œsophage de l’animal. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). Elle engendre aussi des difficultés de déplacements et une fragiltié à s'alimenter et peut engendrer une douleur post opératoire. Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Des animaux à phénotype dommageable (immunodéficience) seront utilisés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée, afin de permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Les prélèvements post-mortem permettent de réaliser des analyses de type histologique, immunologique, transcriptomique ou moléculaire, qui ne peuvent pas être effectuées sur des animaux vivants sans entraîner une souffrance importante ou des biais expérimentaux. L’euthanasie est donc justifiée scientifiquement et a été retenue comme la seule solution éthique permettant d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le bien-être animal.
Remplacement
Des lignées de cellules de macrophages sont étudiées in vitro. Néanmoins le statut métabolique et le phénotype des macrophages sont un biais dans la véracité des résultats. D'autre part, l'étude porte essentiellement sur un dialogue inter-organe influencant le phénotype des cellules et l'environnement du tissu. Ainsi, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de la cardiomyopathie atriale (CMA) et est indispensable dans la mise en oeuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité du système immunitaire et son impact dans l'organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement cardiaque.
Réduction
1000 animaux seront utilisés. Le nombre d'animaux pour notre étude est calculé statistiquement afin d'obtenir des résultats fiables. Le nombre d'animaux est aussi calculé suite à des études antérieures. Les paramètres échocardiographie et d'obésité seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les anesthésies utilisés sont adaptés selon la procédure. Lors de la procédure de chirurgie, les animaux sont placés sus un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle. Les analgésiques sont utilisés par injection. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 animaux maximum par cage) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les animaux sont mis en présense de jouet de raffinement (tunel, maisonnette). Leur cage est enrichi avec des objects réglementaires d'enrichissements, des batonnets. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement sur les critères de prise de poids et de l'état de la cicatrice post-chirurgie. Les points limites seront définis pour ce projet.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié pour nos études car elles sont vulnérables à la fibrillation atriale (FA) et susceptibles de développer la cardiomyopathie atriale (CMA). C’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées déficientes pour l’expression des gènes que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Souris adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.
Effet de l’âge et du poids sur les potentialités des cellules souches musculaires de truites arc en ciel
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Améliorer les pratiques d'élevage piscicole et mieux maîtriser la croissance musculaire de la truite : c'est d'abord à cela que sert ce projet, où 125 truites arc-en-ciel sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La procédure tient en une privation alimentaire d'un an, les poissons n'étant nourris que le lundi et le jeudi, ce qui les laisse jusqu'à cinq jours par semaine dans une sensation de faim que le porteur qualifie de modérée. Sur les 125 truites affamées, dix seulement serviront à produire les résultats, les autres étant là pour maintenir une densité correcte dans les bacs. La piste médicale évoquée, un traitement de l'atrophie musculaire, arrive après les objectifs zootechniques.
Objectifs
La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, la croissance musculaire est continue tout au long de la vie de l’animal mais la formation de nouvelles fibres (hyperplasie) diminue avec l’âge et(ou) le poids, et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons précédemment montré que la fonctionnalité de la niche (environnement des cellules souches musculaires) diminuait rapidement pour atteindre un minimum dès 500g. Lors d'une expérience préliminaire nous avons montré que cette diminution était liée au poids et pas à l'âge. Notre objectif est maintenant de déterminer quelles sont les gènes différentiellement exprimés avec le poids qui peuvent expliquer cette diminution.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'identifier les gènes différentiellement exprimés en fonction du poids et pas de l'âge des animaux. Cette question qui existe également chez les mammifères, ne peut être résolue que grâce à l’utilisation de poissons avec une croissance continue et une très forte plasticité de croissance comme la truite. Cette connaissance devrait permettre d’améliorer les pratiques zootechniques afin de maîtriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite. Au-delà de ces aspects agronomiques, une meilleure compréhension des impacts de l’âge et du poids sur les capacités des cellules souches à se différencier, pourrait fournir de nouvelles pistes dans le traitement de certaines pathologies d’atrophie musculaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une restriction alimentaire afin de ralentir leur croissance pendant 1 an, puis ils seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être nourris uniquement 2 jours par semaine (lundi et jeudi) ce qui engendre une sensation modérée de faim pendant au maximum 5 jours par semaine. Néanmoins ces animaux, de par leur métabolisme, peuvent aisément gérer des périodes sans nourriture.
Devenir
A l'issue de la procédure les animaux seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables du projet et des prélèvements de tissus musculaires seront réalisés pour analyser l'expression de l'ensemble des gènes.
Remplacement
Les objectifs du projet étant de déterminer l’impact de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques du muscle, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
Pour soumettre le minimum d’animaux à la restriction alimentaire modérée, nous allons utiliser des bacs de petite taille afin de maintenir une densité optimale avec 125 poissons/bac au maximum. Parmi ces animaux, 10 seront utilisés pour obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité) et leur manipulation sera réduite au maximum avec un suivi du bien-être à l'aide d'une grille. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Un enrichissement particulier sera mis en place avec des plantes et tubes en plastique pour limiter l'agressivité potentielle.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). C’est une des rares espèces qui permet de tester séparément l’effet de l’âge et du poids compte tenu de sa croissance continue et de sa très grande plasticité de croissance. Nous allons utiliser des poissons de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques de la niche étaient bien différentes à 10g (~6 et 12 mois) et 1kg (12 mois).
Vaccin pour Induire une Immunité Mucosale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une injection unique de vaccin, puis une prise de sang par semaine pendant cinq semaines, puis, entre cinq et douze semaines plus tard, une infection par un virus ou une bactérie : 2 160 souris suivent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque une perte de poids et une variation de la température corporelle, et l'animal dont la grille de score atteint sa valeur maximale est tué. Le projet vise des vaccins qui déclenchent une immunité au niveau des muqueuses, que les vaccins actuels induisent peu, et le porteur affirme que ce modèle doit être évalué à l'échelle de l'"organisme entier". Toutes les souris sont tuées le jour de l'expérience, pour prélever les poumons et les autres organes où sont analysées les cellules immunitaires.
Objectifs
La vaccination est parfois la seule option clinique pour lutter contre les maladies infectieuses face à une évolution rapide et croissante de la résistance aux médicaments (antibiotiques, antiparasitaires par exemple) ou le faible nombre de médicaments anti-viraux sur le marché. Ainsi, les vaccins ont permis d'éliminer des infections telles que la variole ou la poliomyélite, et atténuer les effets d'autres infections comme la grippe ou le COVID-19. Il est clair que l’objectif de la vaccination est de permettre à un individu de développer une protection active spécifique vis-à-vis d’un microbe, en utilisant les ressources naturelles de l’immunité afin de générer une immunité dite « mémoire ». Toutefois, les vaccins induisent très peu l’immunité dite « mucosale », qui protège les muqueuses des organes tel que les poumons. Ceci peut donc expliquer la recrudescence de certaines pathologies respiratoires comme la coqueluche contre laquelle 86% de la population mondiale est vaccinée (40 millions de cas et 300000 décès d’enfants par an dans le monde). Ainsi, l'amélioration des vaccins et l'optimisation des stratégies de vaccination sont donc aujourd’hui plus que nécessaires, afin de mettre en place une immunité « mucosale » vis-à-vis de n’importe quel microbe pour prévenir une infection quelles qu’en soient la porte d’entrée ou les manifestations cliniques. Ce projet de recherche ambitionne d’aider au développement de stratégies vaccinales innovantes en améliorant les vaccins existant afin de mettre en place une immunité mucosale protectrice à long terme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d’une protection à long terme de cellules immunitaires générées par la vaccination. En effet, la majorité des vaccins disponibles sur le marché ne permettent pas de mettre en place une immunité mucosale favorisant la recrudescence de plusieurs infections.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (anesthésie -d'une durée de 20 minutes comptant la phase d'endormissement, du geste technique et de reveil-, pesées - d'une durée de 30 secondes-, administration de vaccin - d'une durée de 30 secondes- , injections de virus ou bactérie - d'une durée de 30 secondes- et prise de sang - d'une durée de 30 secondes-). Les animaux recevront une seule injection de vaccin pour mettre en place une immunité protectrice. Nous verifierons si le vaccin a un effet protecteur en analysant les cellules du système immunitaire présentes dans le sang des souris, 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Puis, 5 à 12 semaines plus tard, les animaux seront infectés une seule fois par un virus ou une bactérie afin de vérifier l’effet protecteur des cellules immunitaires mises en place par le vaccin sur le court et long terme. A l’issue de l’exprimentation, les animaux seront mis à mort pour une analyse précise des cellules immunitaires au sein des tissus tel que les poumons.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tels que : l’anesthésie, pesées, administration de vaccin, injections de pathogène, transfert adoptif et prise de sang. De plus, l’infection peut provoquer une perte de poids et une variation de la température corporelle.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’expérience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire.
Remplacement
Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle de souris est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.
Réduction
Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Ainsi, le nombre utilisé pour ces expériences est de 5 animaux par groupe expérimental, les deux sexes confondus, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expériences. Dans la mesure du possible, les expériences sont regroupées afin d’utiliser un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests.
Raffinement
Les souris seront hébergées, en zone d’expérimentation A2L2 (dans un laboratoire de biosécurité car nous utilisons des organismes pathogènes pour lesquels il y a un traitement curatif et/ou préventif), par groupe de 5 au maximum par cage et de même sexe afin d’éviter le stress de l’isolement. L’accès à l’eau et à la nourriture sera à volonté. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de plusieurs éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid, durant leur hébergement. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des procédures . Les souris seront observées quotidiennement et une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation expérimentale . Si un des points limite est atteint (valeur maximale de la grille de score) cela entrainera la mise à mort de l’animal . Pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation des animaux affaiblis par l’infection, de la nourriture hydratée et du lait en poudre appétant seront aussi fournis directement dans la cage. Suivant les cas, des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le SBEA (structure du bien-être animal) et le vétérinaire référent. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’anti-inflammatoire entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésiques qui pourraient interférer avec nos résultats et masquer l’expression des marqueurs d’intérêt. Toutefois, l'utilisation d'anesthesie pourra être utilisée pour certaines procédures comme les injections intra-nasales.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont similaires à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons uniquement des animaux adultes, de plus de 6 semaines, avec un poids supérieur ou égal à 20g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant en début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues au protocole.
Développement de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement du diabète de type 2. Effets physiologiques de deux biomimétiques, HB2 et K1K1, sur des modèles diabétiques de rongeurs (souris).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées pour la plupart afin de prélever pancréas, foie, muscles et tissu adipeux, 885 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une centaine devant être réutilisées ailleurs ou cédées à d'autres équipes. Elles sont obèses et diabétiques, par lignée, par régime gras ou par destruction chimique de leurs cellules pancréatiques, et reçoivent jusqu'à une injection intrapéritonéale par jour pendant trois semaines. La mesure de la glycémie exige une petite incision de la veine caudale tous les deux jours, plusieurs fois par heure les jours de test de tolérance, et le porteur décrit une polydipsie qui peut multiplier par dix la prise de boisson. Il conclut qu'il n'existe "aucun modèle non animal utilisable" pour ces études, les inconnues étant selon lui trop nombreuses pour bâtir un modèle informatique fiable.
Objectifs
Le diabète et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandus, touchant des millions de personnes dans le monde, et souffrent encore d’un manque de traitements pharmacologiques efficaces. Un diabète non maîtrisé, peut, au fil du temps, provoquer de graves lésions cardiaques, vasculaires, oculaires, rénales et nerveuses. Les cellules béta-pancréatiques sont au cœur du problème, car elles ne fournissent pas suffisamment d’insuline aux organes pour éviter la maladie, en raison de leur défaillance, mais aussi de leur destruction. Malgré les efforts de recherches, peu d’options thérapeutiques sur le traitement des cellules Bêta sont disponibles. Récemment, 2 composés peptidiques biomimétiques (1 et 2) développés par notre laboratoire, et visant à protéger les cellules bêta et à maintenir leur fonctionnement, ont démontré leur efficacité et leur non-toxicité à travers plusieurs approches in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 2 composés peptidiques chez 4 modèles d’animaux diabétiques différents. Procédure 1 : test du composé 1 chez un modèle de souris obèse et diabétique de type 2. Procédure 2 : test du composé 2 chez deux modèles de souris diabétiques (type 1 pour l’un et type 2 pour l’autre), procédure 3 : test des 2 composés chez un modèle de souris rendues obèses et diabétiques suite à une alimentation riche en graisse, procédure 4 : test du composé 2 dans un modèle de souris rendue diabétique de type 1 suite à la destruction des cellules bêta pancréatiques. Aussi, pour améliorer l’adhésion au traitement, nous prévoyons de formuler ces nouvelles molécules pour pouvoir les administrer par voie orale. Pour ce faire, nous utiliserons les propriétés d’un polysaccharide issu d’une algue brune, l’alginate, que nous réduirons sous la forme de nanoparticule, une taille permettant de mieux encapsuler les molécules. Notre maitrise dans ce domaine, confirme que les nanoparticules d’alginate sont un adjuvant efficace pour encapsuler les substances et les délivrer à leur organes cibles. L’objectif de cette demande est de déterminer l’effet de ces deux composés associés ou pas avec l’alginate sur l’amélioration de l’état diabétique de modèles murins diabétiques et obèses. Cette étude sera réalisée sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique, ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires actuelles du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, peu d’options thérapeutiques restent disponibles pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. L’exploitation de molécules protégeant les cellules bêta pancréatiques et potentialisant leur fonctionnement est prometteuse dans le développement d’un traitement anti-diabétique. Grâce aux nanotechnologies, et dans une vision de gestion durable et biologique, dont les avancées permettent d’améliorer et d’optimiser la délivrance des médicaments (peptide/nanoparticule), nous utiliserons l’alginate, un polysaccharide naturel provenant d’une algue brune comme nanoparticule. L’alginate est déjà utilisé dans le milieu industriel comme adjuvant et comme excipient de médicaments.
Procédures
Le type d'intervention se limite à des injections intra-péritonéales, et des prélèvements sanguins au niveau de la queue pour mesurer la glycémie. La mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre nécessite une petite incision au niveau de la veine caudale pour prélever une quantité de sang d’environ de 2 à 2,5 μL. Ce type de prélèvement dure 3-4 secondes. Les injections s'effectueront sur une durée de 3 semaines, selon une fréquence pouvant aller au maximum jusqu'à 1 fois/jour. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. La mesure de la glycémie se fera à une fréquence une fois tous les 2 jours sauf lors des tests de tolérance au glucose ou les tests de tolérance à l'insuline, où dans ce cas s'effectueront à plusieurs reprises dans un temps limité de 2h ou 1h30 respectivement. Il est également prévu de mesurer l'insuline et les triglycérides en prélevant 20 μl et 50μl de sang, respectivement de la queue, une fois par semaine et lors des tests de tolérance.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles engendrent peuvent être une source de dérèglements internes, tels que une hyperphagie, polydipsie, un problème de thermorégulation, une hyperlipémie et une augmentation des productions hormonales de la glande hypophyse et des glandes surrénales. Ces désordres métaboliques entrainent une polyurie et une activité physique amoindrie. Ainsi les risques de déshydratation sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Enfin, pour les souris dont le diabète de type 1 est induit (procédure 4), un état d’inconfort et de douleur peut être identifié suite au développement de la maladie et de l’hyperglycémie. Il peut s’ensuivre un arrêt de la croissance pondérale, voire une perte de poids, une hypoinsulinémie, une polydipsie (la prise de boisson pouvant être multipliée par 10), une polyurie et une hyperphagie.
Devenir
Tous les animaux diabétiques et certains de leur contrôles seront utilisés dans les procédures et seront pour la majorité mis à mort pour le prélevement d'organes (pancréas, foie, muscles; tissu adipeux). Les animaux non euthanasiés pourront éventuellement être réutilisés dans d'autres procédures. Par exemple, pour les groupes contrôles, ils pourront être communs à plusieurs études non refaites, voire si possibilité, être donnés à d'autres groupes.
Remplacement
Ce projet propose des substances novatrices pour lesquelles les informations ne sont pas encore disponibles dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales, telles que les lignées cellulaires ou organoïdes, soient un atout précieux pour la recherche, ces dernières ne peuvent reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez la souris, qui est étroitement liée à celle de l'homme. En raison de la grande complexité des troubles physiopathologiques du diabète et de l’obésité et de leur intégration complexe dans l’organisme, les inconnues sont trop nombreuses pour créer des modèles informatiques fiables. Par conséquent, il n'existe aucun modèle non animal utilisable pour ces études.
Réduction
Des expériences in vitro préalables ont été effectuées dans le but de déterminer les conditions optimales de délivrance des molécules, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 5 animaux par groupe expérimental sont nécessaires. Une réduction de ce nombre pourrait être problématique car quelques animaux peuvent être perdus au cours des expériences (pour cause de mort naturelle). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux (soit un triplicat d’expériences avec 5 souris/groupe) par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie. Le nombre de souris sera également limité puisque l’établissement d’un profil métabolique et l’isolement post-mortem des organes cibles s’effectuera sur un même individu. Enfin, dès que possible, le groupe contrôle sera commun à plusieurs études non refaites.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en œuvre pour minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par l’utilisation systématique d’analgésiques et d’anesthésiques adaptés, la surveillance accrue des animaux avec des points limites spécifiques, ainsi que par l’enrichissement de leur environnement pour favoriser leur bien-être physique et social. Les animaux seront hébergés par groupe de 5, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels et de matériaux de nidification. Un suivi quotidien sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les animaux étant diabétiques, leurs cages seront changées tous les jours afin d'éviter les désagréments causés par le syndrome polyuro-poydipsique. Les nids préalablement construits par les animaux seront éventuellement remis dans leur nouvelle cage pour plus de confort et de sentiment de sécurité. Les points limites sont les suivants : troubles du comportement ; signes d’absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale) ; perte de poids de 15 % à 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques, physiologiques, endocriniens et inflammatoires de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de la conception d’un dispositif de délivrance de molécules à visée thérapeutique. Les animaux atteints du diabète de type 2 ou diabète de type 1 utilisés dans le projet (souris db/db, souris sauvages soumises à un régime HFD, souris NOD souris sauvages traitées par la Streptozotocine) sont les modèles standards couramment employés pour étudier l’efficacité thérapeutique de la méthode (baisse de la glycémie recherchée). Il est important de travailler avec des animaux dont le stade de développement est terminé, sans pour autant travailler avec des animaux trop âgés pour ne pas biaiser les résultats. Ainsi, les protocoles démarreront avec des souris âgées d’au moins 5-6 semaines pour les souris db/db et les souris C57Bl6N. Pour le modèle des NOD, il sera préférable de travailler avec des souris agées de 12 semaines minimum.
Réaction de sevrage, métabolites microbiens et régulation du système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, présentent du sang dans les selles ou restent voûtées en permanence sont mises à mort. 5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines reçoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant quatorze jours, d'autres un gavage à l'âge de deux semaines, une instillation intranasale sous anesthésie ou des prises de sang hebdomadaires, et une partie est rendue immunodéprimée avant une greffe de moelle osseuse. Le porteur cherche à comprendre comment le microbiote intestinal du nouveau-né éduque son système immunitaire, sans expliquer ce qui fixe l'effectif à 5 400 animaux au-delà de la variabilité du microbiote et des effets de portée et de cage.
Objectifs
L’objectif global de ce projet est de comprendre comment le microbiote intestinal, par la production de métabolites, éduque le système immunitaire pendant la période néonatale et permet de maintenir un état symbiotique. Pour se faire, le projet visera à : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, produits bactériens et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour diminuer la susceptibilité de développer des pathologies inflammatoires ; (ii) comprendre par quels mécanismes les métabolites microbiens participent à la persistance des effets bénéfiques de la période néonatale jusqu’à l’âge adulte. Répondre à ces deux objectifs permettrait d’identifier de nouveaux traitements comme des pro/pre/post-biotiques, ainsi que de nouveaux biomarqueurs au début de la vie afin de diminuer la prévalence aux maladies inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le projet devrait faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire.
Procédures
- Prélèvement sanguin 1 ou 2 fois maximum par procédure ou 1 fois par semaine pendant trois semaines et terminal sous anesthésie. Quelques secondes à chaque fois - Injection par voie intrapéritonéale une fois tous les deux jours, par animal, pendant 14 jours ou 1 ou 6 fois maximum par procédure. Durée : quelques secondes - une instillation intranasale. Durée : 2 min sur souris anesthésiée - Gavage 1 fois à l’âge de 2 semaines. Durée : quelques secondes - Injection intraveineuse 1 fois à l’âge adulte. Durée : quelques secondes sur souris anesthésiées
Impact sur les animaux
L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage de substances, effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer inconfort de courte durée. Certains traitements entraînent une pathologie intestinale avec diarrhée transitoire et une perte de poids qui peut varier de 10 à 20%. Un traitement peut entraîner une perte de poids au jour 4 chez certains individus (
Devenir
Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules dans les tissus intestinaux et d'autres organes. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.
Remplacement
Aucune alternative non-animale n’est disponible pour accomplir ce projet. L’interaction complexe que représentent les milliards de bactéries du microbiote intestinal et son hôte ne peut être reproduite in vitro. Les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels ne peuvent pas représenter la grande variété de cellules immunitaires dans l’intestin ainsi que le recrutement de ces dernières, ou encore mimer les différents signaux produits par notre système nerveux central, qui joue un rôle prépondérant dans l’éducation du système immunitaire. De ce fait, pour répondre aux questions de ce projet, il est toujours essentiel et nécessaire d’utiliser des modèles animaux.
Réduction
D'après la littérature et nos résultats antérieurs, les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et étant donné que le projet inclut des effets portée et cage. Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. De plus, les expériences ont été conçues afin d’utiliser un maximum d’organes de la même souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons utilisé une aide statistique pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles ajustés sur plusieurs facteurs (âge, sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences entrainant une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être précisément suivie par une perte de poids, l’aspect général et un marqueur d’inflammation présents dans les fèces. De cette façon, l’expérimentateur peut estimer la douleur. Au cours de procédures comportant des maladies inflammatoires l’état des souris sera monitoré chaque jour visuellement et tous les 2 jours par une pesée, un contrôle de l’aspect général et l’inspection des selles. Lors de procédures comportant des maladies inflammatoires, l'utilisation de gel hydrique ou/et une réhydratation sous-cutanée sera pratiquée en cas de besoin. Si la perte de poids excède 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou qu’une présence de sang dans les selles est observée, l’expérience sera interrompue et les souris présentant un ou plusieurs de ces symptômes seront mises à mort. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée.
Choix des espèces
Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. De plus, les traitements antibiotiques ont déjà été validés dans cette espèce. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences sur le système immunitaire et le microbiote intestinal, bien connus dans cette espèce. Les souris que nous utiliserons seront des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), des souris adultes (8-15 semaines) et des souris âgées (plus de 6 mois). Ce projet étudie l'influence du microbiote au début de la vie sur les résultats de l’inflammation de différents organes à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 15 semaines et à un âge avancé.