Procédures modérées

Élevées pour porter la mutation SOD1G93A qui détruit progressivement leurs neurones moteurs, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Cette gravité tient au prélèvement d'un morceau de queue pour le génotypage et à un tatouage des doigts, réalisés sur animal vigile. Le protocole ne produit aucune donnée scientifique par lui-même, il alimente d'autres projets en animaux malades, et le porteur prévoit de tuer les mâles reproducteurs si les atteintes motrices apparaissent avant trois mois. Les souris dont le génotype ou le sexe ne sert ni à l'élevage ni aux expériences sont tuées, les autres partent vers des projets scientifiques.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), également connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie qui entraîne une dégradation progressive des neurones moteurs – les cellules chargées de transmettre la commande motrice produite par le cerveau vers les muscles. Chez l’homme, cette maladie est fatale dans les 3 à 5 ans suivant le diagnostic. La découverte de mutations génétiques à l’origine des formes familiales de SLA chez les patients a permis l’élaboration de modèles de souris génétiquement modifiées qui sont atteintes de la SLA. Cette demande d’autorisation de protocole concerne l’élevage d’une de ces lignées de souris transgéniques qui est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour essayer de comprendre pourquoi les neurones moteurs dégénèrent dans la SLA.

Bénéfices attendus

Les recherches que nous effectuons sur ce modèle animal pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ou ralentir la progression de la SLA.

Procédures

Pour l’ensemble des animaux : une biopsie d’1 à 2 mm de queue sera réalisée pour le génotypage ainsi qu’un tatouage au niveau des doigts des pattes pour identification sur les souris vigiles. Ces deux gestes s’effectuent en quelques secondes.

Impact sur les animaux

La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices des membres antérieurs mais surtout postérieurs. Afin de déterminer le génotype des animaux, une biopsie de queue sera faite durant la seconde semaine de vie des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux à part les femelles reproductrices issues d'un fournisseur privé, sont dans une procédure modérée liée au prélèvement caudal dans le but du génotypage. Les animaux dont le génotype/sexe n’a pas d’intérêt dans le cadre de l’élevage ou des expérimentations seront euthanasiés. Des males porteurs de la mutation génétique à l'origine de la maladie de Charcot seront utilisés comme géniteurs, les autres animaux seront tous utilisés dans le cadre des projets scientifiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment prédictive qui permettrait de se passer de l’utilisation d’animaux pour étudier la maladie de Charcot. Lorsqu’on s’intéresse aux altérations physiologiques induites par la dégénérescence neuronale il est impossible de se passer d’un modèle d’étude animal mammifère et de travailler sur des invertébrés ou des cellules différenciées.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par l’expérience que nous avons acquise au laboratoire depuis de nombreuses années sur ce modèle animal dans lequel il y a une variabilité interindividuelle importante quant à l’évolution des processus neurodégénératifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié). Les animaux présentant des atteintes motrices seront suivis quotidiennement. Si de façon exceptionnelle ces altérations étaient visibles avant trois mois, les mâles reproducteurs seront euthanasiés. Les mâles étant agressifs entre eux, leur nombre est limité à 4 dans une cage de taille moyenne et à 6 dans une grande cage. Nous ne regroupons jamais des animaux de portées différentes. Nous maintenons les animaux par portée d’origine et ne les séparons pas en fonction du génotype afin de limiter le stress du regroupement. De l’enrichissement sera aussi ajouté pour permettre un maximum de cachettes (maison en carton, tunnel, sizzlenest). Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Les animaliers sont formés à leur détection et préviennent les chercheurs dès les premiers signes.

Choix des espèces

L’identification de mutations génétiques à l’origine des formes héréditaires de SLA chez l’humain a permis l’élaboration de modéles murins de cette pathologie qui se développe à l’âge adulte avec l’apparition des premiers symptômes moteurs autour de 90 jours après la naissance.

Opérés d'un bypass gastrique ou d'une bipartition du transit sous anesthésie générale, 240 rats et 80 cochons vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les cochons portent un cathéter posé une seule fois et laissé en place pendant tout le protocole, les rats sont saignés par la queue. Le porteur prévoit douleur, perte de poids, chute importante de l'appétit et mobilité réduite pendant toute la période postopératoire, trois mois chez les rats et un mois chez les cochons, et indique que les biopsies intestinales de fin de protocole sont incompatibles avec la survie. Il justifie le recours au miniporc par une anatomie digestive et un métabolisme du glucose proches de l'humain, et celui du rat par la possibilité d'y faire de l'imagerie.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique et un problème de santé publique majeur qui touche près de 17% de la population française. Son incidence est en constante augmentation depuis plusieurs années. Actuellement, la chirurgie de l’obésité, qui enlève une partie de l’estomac et souvent court-circuite une partie de l’intestin est le traitement de référence de l’obésité quand celle-ci est dite morbide (IMC ≥ 40). L’intervention chirurgicale de référence est appelée « Bypass Gastrique Roux-en-Y » (RYGB en anglais). Cependant près de 20% des patients sont en échec à long terme après cette chirurgie. Nous étudions les changements métaboliques entraînés par différents types de chirurgies de l’obésité, les voies de signalisation entre différents organes cibles (foie, intestin, pancréas) et leur dialogue en fonction des différentes chirurgies. Ces différentes chirurgies seront comparées à l’intervention de référence, le bypass gastrique. Nos hypothèses de travail portent sur les effets bénéfiques rapportés par la chirurgie bariatrique sur l’amélioration de la glycémie chez les patients diabétiques ou non. Ces effets bénéfiques peuvent être dus à la perte de poids mais aussi aux modifications des voies de signalisations hormonales entraînées par la chirurgie. Nous pensons que chaque type de chirurgie bariatrique crée un résultat différent sur l’amélioration de l’obésité et de ses comorbidités. Nous défendons ici l'idée qu’une forte composante de cette réponse à la chirurgie est associée aux sécrétions d’une facteur de croissance peu étudiée. Notre objectif est de découvrir quel type de chirurgie génère le meilleur résultat sur la sécrétion de ce facteur de croissance et de les rapporter aux bénéfices cliniquement intéressants des chirurgies à l’étude. Nous nous attacherons également à explorer le rôle de la partie court-circuitée de l’intestin et notamment son rôle dans la sécrétion d’hormones digestives et le rôle que cela peut avoir sur l’amélioration de l’état de santé lié à l’obésité. Nous utiliserons des rats afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables en 2 à 3 ans en raison de la réalisation d’une imagerie faisable uniquement chez les rongeurs. L’utilisation de porcs est également très intéressante afin d’obtenir une meilleure transposition des résultats chez l’Homme. En effet, le porc présente des caractéristiques anatomiques digestives très proches de l’être humain, bien plus que celles du rat.

Bénéfices attendus

À court et moyen terme, ce projet aboutira à une meilleure compréhension des mécanismes de l’obésité chez l’Homme et des moyens de la traiter efficacement par la chirurgie ou par les médicaments. Les résultats de ce projet de recherche pourraient permettre d’offrir une médecine plus personnalisée et adaptée à chaque patient atteint d’obésité. Plusieurs publications scientifiques et à des communications orales lors de congrès, tant au niveau national qu’international seront réalisées, même en cas de résultat non probants, afin de compléter les connaissances scientifiques à ce sujet. À long terme, cette étude contribuera à une meilleure compréhension des voies de signalisation entre les différents organes, ouvrant la voie à de potentiels développement de traitements médicamenteux, pour éviter une chirurgie si elle n’est pas nécessaire. Cette innovation vise également à améliorer l'efficacité des interventions chirurgicales tout en réduisant les effets indésirables post-opératoires, offrant ainsi des soins de meilleure qualité.

Procédures

Les animaux seront opérés d’une des différentes chirurgies à l’étude, sous anesthésie générale (animal endormi ; durée environ 1 heure pour les rats à 2 heures pour les porcs). Ils auront un repas test préopératoire et un postopératoire, accompagnés des prises de sang par prélèvements à la queue pour les rats ou par cathéter pour les porcs. Le cathéter pour la prise de sang chez le porc est mis en place une seule fois par animal et laissé pour toute la durée du protocole. Toutes les procédures sont réalisées pour infliger le moins de douleur possible à l’animal (analgésie ou anesthésie générale). L’euthanasie se fera sous anesthésie générale (animal endormi). La durée totale du protocole est de 6 mois pour les rats (en comptant la phase de prise de poids) et de 1 mois pour les porcs.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des procédures de classes modérées. Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids modérée, diminution importante de l’appétit, mobilité réduite. Ces effets pourront survenir pendant toute la période postopératoire du protocole (3 mois rats, 1 mois porcs).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure (3 mois pour les rats, 1 mois pour les porcs) qui comporte des prélèvements de tissus. En effet, la réalisation de biopsies terminales en fin de procédure, en particulier intestinales, n'est pas compatible avec la survie de l'animal.

Remplacement

Les modèles animaux sont essentiels pour étudier les mécanismes physiopathologiques de l’obésité et évaluer les interventions chirurgicales avant leur application clinique. Ils permettent une compréhension approfondie des effets métaboliques des procédures chirurgicales, difficilement réalisables uniquement par des études cliniques. Les modèles animaux (rat et porc) de chirurgie de l'obésité sont centraux pour les études expérimentales sur les mécanismes des maladies et les stratégies thérapeutiques. Les miniporcs présentent des similitudes anatomiques et physiologiques significatives avec les humains, notamment en ce qui concerne le système digestif et le métabolisme du glucose. De plus, les miniporcs ont été utilisés pour des recherches semblables et ont démontré leur utilité. Bien que les modèles in vitro et informatiques offrent des informations précieuses, ils ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des interactions présentes dans un organisme vivant. Les modèles animaux, tels que les miniporcs, permettent l’étude de la physiologie, du métaboliques et du comportement aux interventions chirurgicales, fournissant des données cruciales pour la compréhension et l’amélioration des techniques chirurgicales. En conclusion, l’utilisation des miniporcs en chirurgie de l'obésité est justifiée par leurs similitudes avec l’homme et leur capacité à fournir des informations détaillées sur les effets globaux des interventions, informations qui ne peuvent être obtenues par d’autres méthodes.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimum d’animaux pour notre étude pré-clinique (avant une potentielle étude chez l’Homme). Il est difficile d’établir un nombre précis d’individus nécessaires mais des calculs statistiques de nombre d’individus nécessaires par des logiciels prévus à cet effet nous ont permis d’estimer au plus près le nombre d’animaux nécessaires sans devoir prévoir une « marge » trop importante. Cette marge a été réduite au minimum par les calculs de puissance statistique. Grâce à ces estimations, nous pourrons réduire encore le nombre d’animaux utilisés en cours de protocole si l’effet attendu est atteint avec un plus petit nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d’optimiser le bien-être animal, des mesures de raffinement rigoureuses seront appliquées.Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires : logement individuel, cycle lumineux de 12 h et enrichissement adapté. Les rats disposeront de tunnels en carton, briques en bois, papier kraft et coton. Les porcs bénéficieront de balles, de Kongs garnis de bouillie, de luzerne et de friandises.Les procédures seront réalisées dans des salles dédiées, distinctes des espaces d’hébergement. Une prise en charge analgésique optimale sera assurée. Les soins seront réalisés sous avis vétérinaire en cas de complications (infection des cathéters…).Un suivi quotidien, voire pluriquotidien, garantira une évaluation rigoureuse. Les critères de retrait immédiat incluront :Douleurs sévères non soulagées sous morphiniques (12 h),Perte de poids excessive (≥20 % chez le porc, ≥20 % chez le rat),Infections résistantes après 48 h,Prostration, absence de réaction ou escarres.En cas d’infection locale, une réintervention sous anesthésie sera réalisée avec nettoyage chirurgical et rinçage antiseptique. L’analgésie pourra être renforcée. Une infection généralisée nécessitera une antibiothérapie adaptée . Un antiémétique sera administré si besoin.Une phase d’adaptation de 10 jours précédera toute expérimentation. Un suivi minutieux de la cicatrisation assurera un rétablissement optimal, garantissant des conditions expérimentales rigoureuses et éthiques.

Choix des espèces

Rat: Permet la chirurgie métabolique (modèle largement utilisé pour ce genre de recherche, et souris trop petite) et permet l’utilisation de l’imagerie. De nombreux articles ont étudié ces effets sur le rat, nous apportant une source de validation externe indispensable. Miniporc: Régime alimentaire omnivore, anatomie et métabolisme digestif semblables à l'Homme Nous utiliserons des rats mâles adultes âgés de 12 semaines minimum rendus obèses par un régime riche en graisses durant 12 semaines, avec un poids minimal de 200g au départ.

Aucun de ces animaux ne sortira vivant du projet, le porteur estimant que leur maintien en vie dans de bonnes conditions ne peut être garanti après des crises d'épilepsie provoquées à répétition. 1 255 rats et 475 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont opérés pour recevoir des électrodes dans le cerveau, puis stimulés une à deux fois par jour, cinq jours par semaine, pendant deux à quatre semaines, jusqu'à ce que la stimulation déclenche une crise partielle qui évolue en crise généralisée avec redressement et perte d'équilibre, et ils vivent seuls tout ce temps pour protéger l'implant. La phase de test peut durer dix semaines de plus, et un état épileptique permanent peut apparaître, l'animal étant alors tué s'il ne récupère pas en dix minutes.

Objectifs

Le projet consiste à tester l'efficacité de substances pharmacologiques en développement préclinique pour lutter contre les épilepsies de type partielle, c'est-à-dire qui sont localisées dans une région spécifique du cerveau. Les épilepsies partielles sont à l'origine de décharges électriques anormales dans une région cérébrale spécifique et de symptômes qui peuvent se traduire par des contractions involontaires des membres supérieurs ou inférieurs, des hallucinations, des troubles du langage ou encore des troubles du rythme cardiaque et respiratoire. De plus, ce type d'épilepsie altère la qualité de vie des patients avec une perte progressive de contact avec l'extérieur et une perturbation de la mémoire. Dans certains cas, les épilepsies partielles peuvent progresser vers des épilepsies généralisées, avec l'apparition de symptômes convulsifs plus intenses et conduire à la mort. Il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". Dans ce projet, un modèle murin de crises épileptiques partielles évoluant vers des crises généralisées sera utilisé afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques en développement.

Bénéfices attendus

La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou les traitements sont inefficaces (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet antiépileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.

Procédures

Le projet consiste à opérer des rats pour placer des électrodes dans une structure cérébrale spécifique ainsi qu'à la surface du cerveau. L'implant va permettre de stimuler l'animal dans une structure cérébrale spécifique pour le sensibiliser à l'induction de crises partielles. Chez la souris, une phase chirugicale est nécessaire si l'activité cérébrale est enregistrée. La phase de sensibilisation correspond à une période de 2 à 4 semaines, 1 à 2 stimulations de 2 à 4 secondes par jour ,5 jours par semaine. Dans certains cas, une phase de stabilisation à la stimulation est ajoutée chez le rat et correspond à une série de 3 à 20 stimulations de 1 seconde, une fois par jour, 5 jours par semaine sur 2 semaines. Lors de la phase de test, les rongeurs sont soumis à une stimulation de 2 à 4 secondes sur 2 jours consécutifs pendant un maximum de 10 semaines. L'électroencéphalogramme eput- être enregistré sur 10 à 20 minutes avec une seule stimulation de 2 à 4 secondes ou une série de stimulations (entre 3 et 20) de 1 seconde sur 2 ou 3 jours consécutifs lors d'un traitement aigu. Dans le cadre d'un traitement chronique, 3 ou 4 enregistrements peuvent être réalisés sur une semaine (1 enregistrement par jour). Des prélèvements sanguins terminaux ou d'organes peuvent également être envisagés pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques. Concernant l'administration des candidats traitements, les administrations par bolus rapide (voies orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) durent quelques secondes; l'administration par perfusion lente (intraveineuse) peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Un traitement peut également être injecté par voie intracranienne, au moment de l'implantation des électrodes.

Impact sur les animaux

Les rats sont soumis à une chirugie, pour délivrer la stimualtion électrique. Le protocole décrit dans ce projet conduit à l'apparition d'une crise partielle (clignement des yeux, mastication, mouvements des vibrisses ou de tête, mouvements involontaires des pattes avant) qui est suivie d'une crise généralisée (redressement de l'animal et perte d'équilibre) suite à une stimulation éléctrique de faible intensité chez la souris et la rat. Dans de rares cas, un état épileptique permanent peut apparaitre. Les rats sont hébergés seuls pendant toute la durée de la procédure dès lors qu'ils sont opérés, afin de protéger l'implant semi-externe de leurs congénères.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque étude. Des crises épileptiques ont été induites de manière répétée chez les animaux soumis à une procédure de kindling, leur maintien en vie dans de bonnes conditions ne peut pas être garantie (même s’il n’est pas attendu de crises épileptiques spontanées chez ces animaux).

Remplacement

Il existe des techniques alternatives in silico ou ex-vivo permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et l'activité cérébrale.

Réduction

Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Lors de la procédure chirurgicale, une analgésie est assurée avant le début de la chirurgie et pendant les 48 heures après l'opération. Une analgésie locale est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'oeil. Une attention particulière sera portée sur la récupération des animaux à la suite de la chirurgie. Ces derniers seront pesés 24 et 48 heures suite à la chirurgie. L’implant sera désinfecté, le cas échéant et une antibiothérapie sera réalisée en cas de suspicion d’infection. L’administration d’huile naturelle peut être préconisée dans le cas d’un ralentissement du transit intestinal. Au cours du test, l'enregistrement de l'électroencéphalogramme permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. L'ajout d'une phase pour déterminer le seuil de stimulation pour induire une crise partielle et une crise généralisée permet de réduire le seuil de stimulation pour chaque animal testé, et par conséquent, limiter la douleur chez ce dernier. Le seuil de stimulation minimum pour une crise partielle correspond à l'apparition d'une crise de quelques secondes sur l'électroencéphalogramme, en présence ou non de symptômes comportementaux mesurés d'après l'échelle de Racine. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure. Notamment, dans de rares cas, un état épileptique peut apparaître. L’animal sera euthanasié s’il ne récupère pas dans les 10 minutes suite à la stimulation électrique. Les animaux isolés sont hébergés dans un environnement enrichi avec du matériel à ronger. Les cages sont transparentes afin que chaque animal puisse voir ses congénères. Pour les souris, l'implant sera interne et permettra d’héberger les animaux en groupes sociaux tout au long de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le modèle du kindling par stimulation électrique d'une structure cérébrale est utilisé principalement chez le rat, en raison de la taille de l'animal (implantation chirurgicale d'électrodes de stimulation et d'électrodes pour enregistrer l'électroencéphalogramme). Chez la souris, le modèle sera également développé en utilisant une méthode de stimulation différente : stimulation cornéale. Les rats et souris sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Les procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs sevrés jusqu'à l'âge adulte.

2 323 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par chirurgie terminale pour prélever leurs organes. Rendues obèses et diabétiques par leur alimentation, elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie cérébrale de quarante minutes pour activer ou inhiber un groupe de neurones, jusqu'à six sessions de deux heures de prélèvements sanguins à la queue toutes les quinze minutes après mise à jeun, et quinze jours d'isolement en cage d'enregistrement. Le bénéfice avancé, de nouvelles pistes contre la "diabésité", reste une perspective, quand le protocole décrit des atteintes datées et répétées. Le porteur conclut qu'un modèle in vivo intégré est "obligatoire" et qu'il n'existe "pas d'alternative non-animale".

Objectifs

Depuis plus de vingt ans, il est clairement établi que des systèmes de régulation situés dans l’hypothalamus jouent un rôle central dans le contrôle de l’équilibre énergétique et glycémique de l’organisme. Un dysfonctionnement de l’un de ces systèmes pourrait ainsi contribuer au développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Ces pathologies sont étroitement liées, donnant naissance au terme « diabésité ». Aujourd’hui elles touchent des centaines de millions de personnes dans le monde et constituent un enjeu majeur de santé publique. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces maladies permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux traitements pour leur prévention et leur prise en charge. Néanmoins, notre connaissance des réseaux de neurones et systèmes moléculaires impliqués dans ces processus de régulation reste encore très limitée. Ce projet s’intéresse plus particulièrement à une population de neurones hypothalamiques impliqués dans la régulation de la balance énergétique et glucidique. Ces observations nous ont conduits à proposer le présent projet. Celui-ci vise à étudier chez des souris rendues obèses et diabétiques les altérations du fonctionnement, de l’activité et de la signalisation de ce réseau de neurones, dans son rôle régulateur de la glycémie. L’objectif est donc de déterminer si ce circuit neuronal peut représenter une cible thérapeutique pertinente pour améliorer le contrôle de la balance énergétique et glycémique dans un contexte d’obésité et de diabète de type 2.

Bénéfices attendus

De récentes études ont permis d’élucider le rôle et le fonctionnement d’une population neuronale dans la régulation de la balance énergétique et glucidique en condition physiologique. L’objectif de cette présente étude est donc d’étudier les potentielles altérations fonctionnelles, et potentiels défauts de l’activité électrique et de signalisation de cette population de neurones en condition pathologique d’obésité/diabète. Ces recherches apparaissent cruciales non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi dans la lutte contre la pandémie de « diabésité », afin de proposer des solutions innovantes dans la prévention, la prise en charge et le traitement de ces maladies.

Procédures

- Afin d'activer ou d'inhiber les neurones à 26RFa ou bien d’administrer des composés pharmacologiques dans le système nerveux central, les animaux subiront une chirurgie réalisée sous anesthésie / analgésie durant 40 minutes. - Pour établir le profil glycémique des souris, leur glycémie sera suivie par un prélèvement sanguin à l’extrémité de la queue, pendant moins de 10 secondes toutes les 15 minutes, au cours de sessions expérimentales de deux heures. Chaque animal sera soumis à 6 expérimentations au maximum, chacune espacée d’une semaine de repos. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement durant 15 jours dans des cages d’enregistrement, permettant d'évaluer les paramètres métaboliques, avant d’être réunis avec leurs congénères préalablement connus. - Afin de prélever des tissus à l’issus des tests physiologiques, les animaux subiront une chirurgie terminale sous profonde anesthésie / analgésie.

Impact sur les animaux

Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. - Afin d'être génotypés, les animaux subiront une biopsie de l'extrémité de la queue. Nuisances prévues : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. - Afin de moduler l’activité de la population neuronale d’intérêt, les souris subiront une chirurgie. Nuisances prévues : douleurs post opératoires minorées par des analgésiques. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun avant chaque test physiologique et une incision à l’extrémité de la queue permettant la ponction de gouttes de sang. Nuisances prévues : perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test, une semaine de repos minimum entre chacun d'entre eux ; douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages d’enregistrement. Nuisance prévue : hébergement individuel des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.

Remplacement

Afin de mieux comprendre la physiopathologie de l’obésité/diabète, et de caractériser dans ce contexte le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme, l’utilisation d’un modèle in vivo intégré est obligatoire. Il est nécessaire de pouvoir étudier la communication qu’il existe entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second ; dans notre cas l’influence du réseau de neurones à 26RFa/orexines sur la régulation de la glycémie et du métabolisme énergétique (tel le comportement alimentaire ou l’activité physique). La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. Il n’existe alors à ce jour pas d’alternative non-animale.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, une planification expérimentale a été réalisée en amont. De plus, pour chaque expérience, le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé afin d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés. Anticiper ainsi les effectifs adaptés permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, de diminuer le risque de devoir répliquer une expérience avec de plus gros effectifs ainsi que le double emploi. Ces estimations ont été réalisées avec le site BiostaTGV® qui calcule le nombre d’animaux requis en fonctions de plusieurs paramètres : la force de l’effet attendu, la variabilité entre individus, et les paramètres statistiques souhaités. Le design de nos expérimentations prévoit quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple) qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Ils seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter l’isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. La taille des cages est réglementaire. L’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement. L’établissement de points limites nous permettra de veiller au bon suivi des animaux et de leur apporter au besoin les soins adéquats. Si les points limites sont dépassés, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et l’animal sera en fonction des cas, écarté des expérimentations ou mis à mort. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie/analgésie (locale ou générale). Il sera prévu, pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, une période de rétablissement minimum d’une semaine entre chaque test, leur permettant une stabilisation de leur poids corporel et la reconstitution initiale de leur volume sanguin après prélèvement.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre d’étudier la physiopathologie de l’obésité/diabète, et de caractériser dans ce contexte le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.