Procédures modérées

Une injection de cellules cancéreuses directement dans le foie, par un acte chirurgical de quinze minutes sous anesthésie, ouvre le protocole. 5 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles génétiquement modifiées pour avoir un système immunitaire compromis. Les tumeurs hépatiques attendues se développent "sans affecter de manière importante l'animal", indique le porteur, qui explique aussitôt que le foie est peu innervé et que les tumeurs sont collectées tant qu'elles restent petites. La mise à mort intervient à la fin de chaque procédure, pour collecter les foies.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le principal cancer primitif du foie, dont l'incidence est en croissance constante. Il constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde. Cela est notamment dû à un manque d’options thérapeutiques efficaces, et la survie à 5 ans est inférieure à 10% des patients. Il est donc crucial de développer de nouveaux médicaments pour cette maladie. Notre projet de recherche vise au développement de nouveaux outils thérapeutiques anti-tumoraux basés sur l’activation du système immunitaire contre la tumeur. Il s’agit d’établir une preuve de concept de l’efficacité de ces molécules dans le contexte du carcinome hépatocellulaire et de réaliser les études précliniques préalables au développement d’un essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de valider l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques contre le cancer du foie, qui provoque plus de 900 000 décès par an à l’échelle mondiale, et de tester leur absence de toxicité pour le foie. Ces étapes sont requises avant de pouvoir lancer un essai clinique chez l’homme. Par ailleurs, si ces composés se confirment être efficaces, leur utilisation pourra possiblement être étendue au traitement d’autres cancers.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection des cellules dans le foie, nécessitant un acte chirurgical sous anesthésie (15 minutes par souris), ou bien à une injection de solution saline contenant de l’ADN (30 secondes par souris). Les animaux recevront les différents composés thérapeutiques par une injection unique. Quelques gouttes de sang seront prélevées au cours des procédures pour réaliser des analyses de marqueurs plasmatiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont l’apparition et la croissance de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte que modérément le fonctionnement de l’organe. Il existe également un stress induit par la contention de l’animal, et une gêne possible liée à la cicatrice. Enfin, le composé thérapeutique peut entrainer un léger état fiévreux pour l’animal dans les 24 heures suivant son administration. Il existe également les effets transitoires de l'anesthésie (ralentissement des fonctions physiologiques et baisse de la température corporelle). Les animaux sont évalués quotidiennement pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et analyser le développement de tumeurs dans cet organe.

Remplacement

Nous avons réalisé le plus d’expériences possible en laboratoire sur des cellules en culture. Cela nous a permis d’obtenir des résultats importants tout en limitant l’usage d’animaux. Cependant, pour tester l’efficacité de nos candidats-médicaments pour le cancer du foie, nous, nous devons maintenant passer à des expériences chez la souris. En effet, la formation et la croissance des tumeurs dépendent de nombreux facteurs qu’on ne peut pas reproduire entièrement dans une boîte de culture : l’environnement du foie, les interactions avec d’autres organes, et la réponse globale de l’organisme. De plus nos composés fonctionnent via l’activation des défenses immunitaires contre les tumeurs, ce qui impose d’étudier leur efficacité au niveau de l’organisme entier.

Réduction

En collaboration avec notre service de statistiques, nous avons soigneusement calculé le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il en ressort qu’il nous faut 10 animaux par groupe expérimental pour pouvoir répondre de manière rigoureuse à notre question scientifique. Par ailleurs, nous avons restreint nos expériences au strict nécessaire, en nous focalisant rapidement sur les trois composés thérapeutiques les plus prometteurs et en réduisant le nombre de moments d’analyse, afin de réduire au maximum l’impact sur les animaux tout en conservant la validité des résultats.

Raffinement

Nous avons soigneusement planifié et optimisé notre protocole expérimental, en suivant les recommandations européennes, afin de réduire au maximum les contraintes pour les animaux. Concrètement, nous avons choisi de combiner un analgésique avec une anesthésie plus légère, nous avons réduit la durée de la chirurgie et nous utiliserons un tapis chauffant pour stabiliser la température corporelle, ainsi que l’application d’une crème réparatrice pour favoriser la cicatrisation. Après la chirurgie, nous donnons aux souris une pâtée enrichie, énergétique, pour favoriser leur récupération. Ensuite, grâce à une grille de surveillance, nous suivrons les animaux quotidiennement pour intervenir si nécessaire et éviter qu’ils ne développent un inconfort lié à la tumeur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est proche de la maladie humaine. Ces approches sont soutenues par de multiples publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. . Nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées, avec un système immunitaire compromis, pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse aux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

Toutes les femelles qui ont mis bas seront tuées, leurs petits aussi, pour prélèvement de structures du cerveau, tandis que les femelles non fécondées restent en vie et seront réutilisées. 350 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 d'entre elles étant gardées vivantes. Les femelles gestantes sont hébergées seules pendant toute la gestation, puis soumises à trois séances de stress de 45 minutes par jour pendant sept jours, les descendants recevant ensuite des injections dans le péritoine, jusqu'à cinq chez les adultes, et quatre gavages espacés de douze heures. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe pas de culture in vitro capable de reproduire "l'environnement complexe caractéristique de l'hippocampe en développement".

Objectifs

Le stress prénatal, subi durant le développement foetal, est associé à un risque accru de développer des troubles comportementaux, caractérisés notamment par des déficits de mémoire et une altération émotionnelle, et à une vulnérabilité à développer des troubles psychiatriques (dépression, stress post-traumatique, troubles anxieux...). Il a été montré que ces troubles dépendent d'une altération des neurones dans une région clé du cerveau impliquée dans le controle de la mémoire et des émotions. Notre objectif est de comprendre les mécanismes par lesquels le stress prénatal peut impacter ces neurones en utilisant un modèle animal. Pour cela, nous utiliserons 2 approches: dans la première nous comparerons la croissance des neurones entre les animaux contrôles et stressés à 2 moments clés du développement (premières semaines de vie et âge adulte); dans la seconde, nous déterminerons si le stress prénatal modifie l'expression de molécules clés durant le développement des neurones.

Bénéfices attendus

En caractérisant l’effet du stress prénatal sur le développement des neurones de l'hippocampe, cette étude pourrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels un stress précoce peut entrainer des modifications à long terme dans la structuration d'une structure clé pour la gestion de nos émotions et de nos capacités cognitives. L'objectif ultime est de repérer des biomarqueurs ouvrant la voie à des stratégies de prévention et d'intervention ciblées.

Procédures

Hébergement individuel des femelles gestantes pendant la duré de la gestation. Stress: 3 sessions de 45 min par jour pendant 7 jours. Injections intrapéritonéales : 1 pour les animaux en développement, 5 pour les animaux adultes, espacées de 24h. Chaque injection dure moins d'1 minute, préhension de la cage inclue. Gavage: 4 espacées de 12h . Chaque intervention dure moins d'1 minute, préhension de la cage inclue.

Impact sur les animaux

1) l'hébergement individuel des femelles gestantes engendre une nuisance légère en limitant les interactions sociales directes; 2) Le stress appliqué aux femelles gestantes engendre un état de stress transitoire avec une baisse de la prise de poids associée à la gestation. 3) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un incomfort de courte durée. 4) Le gavage nécessite une préhension de l'animal et peut générer un inconfort modéré de faible durée.

Devenir

Toutes les femelles ayant mis bas sont mises a mort, parce qu'elles ne peuvent être réutilisées. Les femelles non fécondées sont maintenues en vie. Les animaux issus des reproduction et utilisées en expérience sont mises à mort pour prélèvement de structure.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant d’étudier les propriétés des neurones de l'hippocampe après exposition à un stress prénatal, il est nécessaire de réaliser ces manipulations sur des animaux vivants. De plus, les caractéristiques des neurones sont dictées en partie par l'environnement cérébral et dépendent donc de l'intégrité du cerveau. Il n’existe pas à l'heure actuelle de modèle en culture ou in vitro permettant de reproduire l’environnement complexe caractéristique de l'hippocampe en développement. Ceci justifie donc l’utilisation des animaux pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir la robustesse et la fiabilité des analyses statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les frères et soeurs d’une même portée seront répartis entre les différents lots. Enfin, les femelles mises en reproduction mais non gestantes seront conservés en vie et réutilisés pour des expériences ultérieures, ce qui contribuera à limiter le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Pour l'ensemble des animaux, un suivi sera assuré en utilisant des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence physique (poil hérissé, apathie...) et du comportement (comportements répétés, vocalisations..) . Ces grilles permettent d'établir des points limites au-delà desquels une décision de traitement ou de retrait de l'expérience est prise. Ainsi, si un animal montre des signes de détérioration rapide de son état de santé évalué sur ces critères avant la fin des procédures, celles-ci seront ajustées ou stoppées pour éviter toute souffrance prolongée ou excessive.

Choix des espèces

La neurogenèse (création de nouveaux neurones) a été largement étudiée chez les rongeurs, lesquels représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses physiologiques au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. La souris a été choisie dans ce projet car 1) les études précédentes sur lesquelles il se base ont été réalisées sur des souris , et 2) une partie du projet repose sur l'utilisation de souris transgéniques, seul modèle disponible pour isoler les cellules d'intérêt et mener à bien le projet. Les souris utilisées pour la reproduction ont entre 7 et 8 semaines puisqu'il s'agit de l'âge optimal pour la reproduction. Les descendants étudiés seront âgés de 3 jours à 5 mois puisque nous étudions les neurones pendant le développement précoce et à l'âge adulte.

Irradiées moins de quatre minutes sur animal vigile, opérées de la peau pendant trente minutes sous anesthésie, puis prélevées au sang jusqu'à trois fois, 1 160 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunodéficientes, donc plus exposées aux infections, et reçoivent une greffe de moelle osseuse issue de souris immunocompétentes. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les organes lymphoïdes, le projet cherchant à savoir si l'expression en deux copies d'un gène du chromosome X explique la plus forte réponse immunitaire des femelles. Le porteur conclut que peu de nuisances sont attendues, sans dire à quoi sert la chirurgie cutanée, ce que vise l'irradiation, ni pourquoi 1 160 souris sont prévues quand il annonce cinq souris par groupe.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes génétiques liés au chromosome X responsables de la plus grande susceptibilité des femmes aux maladies autoimmunes. Nous nous intéressons aux mécanismes responsables de l’émergence de cellules immunitaires dans lesquelles un gène de l’X est exprimé à partir des deux chromosomes et leur rôle dans la réponse immunitaire chez les souris femelles. Pour cela nous réaliserons des greffes de cellules, provenant de nos différents modèles génétiques qui permettent de suivre et quantifier l’expression de ce gène dans des souris immunodéficientes.

Bénéfices attendus

Les femelles développent des réponses immunitaires de plus forte amplitude et de meilleure qualité que les mâles, mais sont plus susceptible de développer des maladies auto-immunes. Ce projet vise à démonter s’il existe un lien direct de causalité entre l’expression en deux copies d’un gène du chromosome X dans les cellules immunitaires et une réponse humorale de meilleure qualité et plus robustes chez les femelles.

Procédures

Les animaux pourront subir : une irradiation légère de moins de 4 minutes sur animal vigile ; une chirurgie cutanée légère (30 min) sous anesthésie, des injections (durée moins de 1 minute) 2 fois sur animal vigile ou anesthésié; des prélèvements veineux sur animal vigile (1 min) au maximum tous les 15 jours (3 fois) durant la procédure.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficientes et peuvent donc être davantage susceptibles de développer des infections. L'irradiation peut entrainer un stress et de légers troubles cutanés. Les injections peuvent entrainer une douleur modérée et un stress transitoire. Cependant ces souris immunodéficientes seront reconstituées avec de la moelle osseuse de souris immunocompétentes et possèderont donc un système immunitaire équivalent aux souris sauvages. Globalement peu de nuisances sont attendues sur les animaux. Pour les gestes réalisés sur animal vigile (contention, injection intrapéritonéale), un léger inconfort, du stress et des douleurs légères sont à prévoir, mais cela sera transitoire car les substances injectées ne sont pas irritantes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever les organes lymphoïdes pour analyses cytométriques et/ou transciptomiques et/ou histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro pour reproduire les différentes étapes de développement et différentiation des lymphocytes B dans la moelle osseuse et les organes lymphoïdes.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'expériences effectuées nous utilisons un nombre d'animaux suffisant par expérience pour 1) obtenir des résultats statistiquement interprétables et 2) faire des analyses différentes. De manière générale, nous avons estimé que 2 lots expérimentaux devront être produits afin de reproduire les expériences de façon indépendante et que d’après nos données expérimentales un effectif de 5 souris/ groupe serait suffisant. Le calcul d’effectif a été réalisé avec un logiciel approprié.

Raffinement

Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé à l’expérimentation animale. Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d’infection des animaux immunodéficients ils seront placés dans des cages sur portoirs ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (igloo, sizzelnest, rouleau en carton). Les animaux seront manipulés sous hotte. La définition des points limites adaptés à la procédure et les critères d’arrêts sont définis suivant un arbre décisionnel validé par le SBEA. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé une fois par semaine.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle expérimental pour étudier les mécanismes d’échappement à l’inactivation du chromosome X et les conséquences sur l’immunité chez les souris femelles car il s’agit d’un modèle approprié proche de ce qui se passe dans l’espèce humaine. Nous avons déjà développé des modèles génétiques uniques et originaux chez la souris pour suivre les cellules immunitaires d’intérêt. Ces modèles ont tous été validés et serviront de source de cellules pour un transfert dans des souris immunodéficientes. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte entre 7-8 semaines.

Ouvertes par laparotomie pendant une heure pour atteindre les embryons, les femelles gestantes servent de voie d'accès à une greffe d'interneurones humains injectés in utero. D'autres souris sont greffées à deux ou quatre jours de vie, brièvement séparées de leur mère, d'autres encore à l'âge adulte par une chirurgie de trois heures qui ouvre le crâne et y scelle une fenêtre permanente. Suivent des séances d'imagerie répétées, tête immobilisée, sur des souris parfois éveillées, à un, trois et sept mois après la greffe. 998 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, le prélèvement du cerveau interdisant, écrit le porteur, toute réutilisation, replacement ou adoption.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment un gène propre à l’être humain, influence la formation et le fonctionnement des réseaux cérébraux. L’objectif général est de déterminer comment ce gène modifie la survie, la migration, la maturation, l’intégration synaptique et l’activité d’interneurones humains greffés dans un cerveau vivant. Ces cellules jouent un rôle de « frein » et limitent les excès d’activité. Deux contextes pathologiques seront étudiés séparément : la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. Dans l’axe « Schizophrénie », le projet s’appuie sur les associations génétiques rapportées entre le gène et cette pathologie. La schizophrénie est associée à des anomalies de maturation des circuits corticaux inhibiteurs. Le projet testera si la présence, l’absence ou le dosage de ce gène modifie le développement d’interneurones humains greffés avant ou juste après la naissance, en étudiant leur migration, leur maturation, leur capacité à établir des connexions et l’organisation de leur activité. Dans l’axe « Maladie d’Alzheimer », les effets de ce gène seront étudiés dans un cerveau adulte présentant un environnement amyloïde. Le projet déterminera si le gène augmente ou réduit la vulnérabilité fonctionnelle et moléculaire de ces cellules. Le projet n’a pas d’objectif comportemental, car le nombre de cellules humaines greffées est insuffisant pour modifier le comportement de la souris. Les conclusions reposeront sur des analyses cellulaires, histologiques, transcriptomiques et sur des mesures répétées de l’activité calcique, complétées par des analyses du cerveau en fin d’étude. Les bénéfices attendus sont l’identification de mécanismes reliant le gène à la fragilité ou à la résistance des circuits, ainsi que de signatures pouvant orienter les stratégies ciblant les réseaux impliqués dans la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

À l’échelle du projet, les bénéfices attendus sont d’abord mécanistiques. Dans l’axe « Schizophrénie », les expériences permettront de déterminer si le gène étudié modifie la migration, la maturation, l’identité et l’activité d’interneurones humains pendant des fenêtres précoces du développement cérébral. Elles permettront de distinguer un effet sur la survie d’un effet sur la vitesse ou la qualité de maturation. Dans l’axe « Alzheimer », le plan déterminera si le gène étudié modifie spécifiquement la réponse des interneurones humains à un environnement amyloïde, notamment les programmes de stress, de maturation synaptique et l’activité calcique. La combinaison de l’histologie, de la transcriptomique et de l’imagerie longitudinale doit produire des résultats interprétables à plusieurs niveaux : localisation et maturation des cellules, mécanismes moléculaires et fonctionnement au cours du temps. Les résultats pourront identifier des signatures de vulnérabilité ou de résilience dépendantes de ce gène et améliorer la pertinence des modèles précliniques portant sur le récepteur α7, puisque les souris ne possèdent pas naturellement de ce gène. Aucun bénéfice thérapeutique immédiat ni effet comportemental n’est attendu. À plus long terme, les mécanismes identifiés pourront orienter des études pharmacologiques ciblant l’axe étudié et aider à sélectionner des marqueurs cellulaires ou fonctionnels pour de futurs projets. L’utilisation des animaux imagés pour les analyses terminales maximise les informations obtenues et pourra réduire les effectifs de travaux ultérieurs.

Procédures

- Chirurgie abdominale chez la souris gestante. Chaque chirurgie dure environ 60 min, en excluant les temps de préparation de l’animal et les temps post-opératoires. - Greffe de cellules chez l’embryon de souris au dernier tiers de gestation : injection 30 secondes au total. - Greffe de cellules chez la souris nouveau-né au dernier tiers de gestation : injection 45 secondes au total par hémisphère. - Greffe de cellules chez la souris adulte par injection dans le cerveau : injection 60 min /souris. - Pour les animaux inclus dans le suivi d’imagerie longitudinale, une fenêtre crânienne chronique est implantée au moment de l’intervention adulte; la chirurgie complète (craniotomie, injection éventuelle, pose de fenêtre et fixation) dure au maximum 3 heures, hors préparation et réveil.

Impact sur les animaux

Chez les nouveau-nés, les effets indésirables attendus sont liés à la manipulation et au geste d’injection d’une durée courte (quelques minutes) : stress transitoire associé à une courte séparation d’avec la mère (et réciproquement, stress de la mère vis-à-vis de la portée), ainsi qu’une douleur modérée (de quelques jours, lié à la chirurgie). Chez les femelles gestantes subissant une chirurgie abdominale (laparotomie pour accès in utero), les nuisances attendues comprennent une douleur post-opératoire modérée et une gêne transitoire liées à la cicatrisation. Chez les adultes subissant une chirurgie stéréotaxique, les effets indésirables attendus correspondent principalement à une douleur post-opératoire modérée, une baisse transitoire d’activité et, plus rarement, une perte de poids modérée immédiatement après l’intervention. Pour les animaux qui sont inclus dans la procédure d’imagerie avec fenêtre crânienne, des nuisances additionnelles sont attendues. Dans les jours suivant la craniotomie et la pose de la fenêtre, certains animaux peuvent présenter un inconfort local et un grattage autour de la zone opérée ou du matériau de scellement ; ce comportement est généralement transitoire et diminue au cours de la première semaine. Enfin, l’imagerie in vivo nécessite une phase d’habituation (manipulations répétées, installation sur le dispositif et, lorsque l’enregistrement est réalisé chez l’animal éveillé, contention légère et immobilisation de la tête). Ces étapes peuvent entraîner un stress et un inconfort léger, surtout lors des premières séances, parfois suivis d’une irritabilité transitoire.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Les objectifs du projet reposent sur l’analyse détaillée du cerveau ce qui nécessite le prélèvement des tissus cérébraux et donc ne permet pas de conserver l’animal en vie. En conséquence, les animaux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ni proposés à l’adoption, car le prélèvement du cerveau est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

L’objectif central du projet est de recréer un contexte cérébral in vivo pour analyser le développement, l'intégration et le fonctionnement de neurones d'origine humaine au sein de réseaux nerveux intacts, et leur modulation dans des contextes pathologiques pertinents pour la maladie d'Alzheimer et la Schizophrénie. Ce niveau d'organisation (architecture tridimensionnelle, vascularisation, interactions cellulaires, connectivité à longue distance, activité des circuits) n'est pas accessible in vitro. Les protocoles nécessitent des méthodes standardisées chez les rongeurs, avec des outils robustes. La souris est un modèle de choix : élevage maîtrisé, lignées génétiques, suivi longitudinal. La xénogreffe de neurones humains permet d'étudier des gènes humains dans un cerveau vivant, indispensable pour relier mécanismes cellulaires et phénotypes de réseau. Les organoïdes cérébraux et les systèmes microphysiologiques sont des avancées majeures, mais ne reproduisent pas un cerveau fonctionnel intact. Ils modélisent certaines étapes du développement et des interactions locales, mais sans vascularisation perfusée, système immunitaire, innervation périphérique ou interactions systémiques. Ces limites restreignent leur maturation et empêchent d'étudier la connectivité à longue distance, la régulation neurovasculaire, les réponses métaboliques/hormonales et les propriétés pharmacocinétiques/pharmacodynamiques. Outils complémentaires in vitro, ils demeurent insuffisants pour la dynamique fonctionnelle, la plasticité et les interactions de réseaux dans un cerveau vivant. Les approches in vivo restent indispensables pour comprendre l'intégration de cellules humaines dans un environnement cérébral complet, en conditions physiopathologiques réalistes.

Réduction

Le projet combine des approches transversales (prélèvements terminaux à des temps définis pour différents analyses) et longitudinales (suivi répété des mêmes animaux, notamment par imagerie fonctionnelle), afin de maximiser l’information obtenue par animal. Une partie des animaux suivis longitudinalement est ensuite utilisée pour les analyses terminales, ce qui permet de relier des phénotypes fonctionnels à des mesures tissulaires et moléculaires sans augmenter les effectifs. Les tissus non immédiatement analysés peuvent être conservés dans des conditions adaptées afin d’éviter de nouveaux prélèvements. Les analyses sur cellule ou noyau unique reposent sur des protocoles déjà établis, capables de générer une grande quantité d’information à partir d’un nombre limité d’échantillons, ce qui contribue directement à la réduction du nombre d’animaux. Pour les greffes in utero, la taille des portées permet de limiter le nombre de femelles gestantes nécessaires. Le stade d’injection retenu a été optimisé lors d’études précédentes et assure une bonne survie de la progéniture. Les mâles et les femelles sont inclus avec une répartition aussi équilibrée que possible. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole car les objectifs nécessitent le prélèvement du cerveau ; ils ne peuvent donc pas être réutilisés.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie. L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie sous anesthésie et analgésie multimodale. Les points limites spécifiques et précoces pour chaque étape du projet serons appliqués. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance renforcée, de soins pré- et post-opératoires adaptés, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Un renforcement des mesures de bien-être animal sera systématiquement appliqué à chaque étape. Il inclut une surveillance accrue durant la période critique post-opératoire, une évaluation plus fréquente de la douleur et de l’état général des animaux, et l’intervention rapide en cas de signes de gêne ou de souffrance. Le renforcement de l’enrichissement des cages sera intensifié par l’ajout de matériaux de nidification, de dômes en carton et d’éléments favorisant le comportement naturel. L’utilisation et l’état des cotons et nids seront surveillés pour s’assurer du confort thermique et comportemental des animaux.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer et la Schizophrénie ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). La Procédure 1 utilise des femelles adultes en fin de gestation. Cette intervention permet l’accès aux embryons à E17.5 et la réalisation des greffes in utero décrites dans la Procédure 2. Les descendants sont ensuite analysés à 1, 3 et 7 mois post-greffe. Ces temps correspondent respectivement à la prise de greffe et à la migration initiale, à une phase intermédiaire de différenciation et de maturation, puis à une maturation plus avancée et à l’intégration fonctionnelle. La Procédure 3 utilise des souriceaux à P2-P4. Ce stade postnatal précoce reste compatible avec une forte plasticité cérébrale, tout en permettant d’étudier la survie, la maturation et l’intégration d’interneurones humains dans un hôte immunodéficient permissif. Les analyses sont réalisées aux mêmes temps, à 1, 3 et 7 mois post-greffe. La Procédure 4 utilise des souris adultes âgées d’au moins 2 mois, dont les circuits cérébraux sont établis. Les analyses à 3, 4 et 7 mois post-greffe permettent d’évaluer successivement l’intégration initiale, les réponses précoces, puis les effets plus tardifs sur la maturation et l’activité des cellules greffées. Les modèles embryonnaire, néonatal et adulte répondent ainsi à des questions complémentaires et ne seront pas interprétés comme une comparaison reposant uniquement sur l’âge de greffe.

Mises à mort par exsanguination après un unique prélèvement sanguin, pour que leurs organes soient prélevés un à un, 640 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection sous anesthésie gazeuse ou une administration orale sur animal vigile, d'une molécule radiomarquée dont la répartition dans le corps est suivie par imagerie. L'objet est de choisir la dose et la voie d'administration avant une future étude d'efficacité contre les tauopathies, dont la maladie d'Alzheimer. Le porteur écrit compter cinq rongeurs par type d'analyse et dix souris par groupe d'imagerie, sans que ces chiffres rendent compte des 640 prévus.

Objectifs

Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale en vue d’une application en santé humaine. Les objectifs du projet sont de compléter un programme initial de développement de nouvelles thérapies pour le traitement des tauopathies telles que la maladie d’Alzheimer. Un nouvel agent a en effet permis de diminuer le développement de la tauopathie dans un modèle de souris malades. En utilisant maintenant une version de la molécule associée à un traceur radioactif (molécule radiomarquée), nous souhaitons évaluer les paramètres pharmacocinétiques de cette molécule et déterminer sa biodistribution dans l’organisme de la souris par imagerie. L’ensemble de ses informations sont nécessaires afin de sélectionner la dose et la voie d’administration pour mener par la suite une étude d’efficacité thérapeutique de la molécule.

Bénéfices attendus

Aucun traitement curatif n'existe actuellement pour le traitement des tauopathies, ensemble de maladies neurodégénératives caractérisées par l’accumulation dans les neurones d’agrégats toxiques de la protéine Tau, et dont la plus connue est la maladie d'Alzheimer. Cette étude intervient dans le développement de nouvelles thérapies pour ces pathologies n'ayant montré que peu d'effet lors des essais cliniques. Ce projet permettra de définir l’action d’une nouvelle classe de composés à visée thérapeutique sur les tauopathies en étudiant leurs paramètres pharmacocinétiques et de biodistribution dans un organisme entier afin de pouvoir initier la mise en place d’un premier dossier clinique pour démarrer des essais cliniques chez l’humain.

Procédures

Un opérateur spécialisé réalisera une injection (30 secondes) sur animal sous anesthésie gazeuse ou une administration orale (30 secondes) sur un animal vigil. Un seul prélèvement de sang (1 minute) sera réalisé par animal sous analgésie et anesthésie chimique générale puis les animaux seront mis à mort par exsanguination afin de prélever les différents organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs à la manipulation sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection ou un stress lié à la contention des animaux lors de l’administration orale.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de la procédure car l’étude de la biodistribution de la molécule nécessite de prélever les organes.

Remplacement

De premières manipulations réalisées en laboratoire sur des cellules de neurones ont permis de diminuer les taux des protéines impliquées dans le développement la maladie d’Alzheirmer. Cependant, la maladie d’Alzheirmer est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère qu’il est possible de modifier génétiquement pour qu’elle exprime cette maladie, il est donc indispensable d’utiliser ces animaux pour développer des médicaments utilisables chez l’homme par la suite.

Réduction

Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse. Pour l’étude des tissus par imagerie, nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux par groupe (n=10 : 5 mâles et 5 femellesDe plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux, seule la dose de la molécule et la voie d’administration optimales sélectionnées à l’issu des expériences sur les souris saines seront testées sur les souris développant la maladie d’alzheimer.

Raffinement

La douleur engendrée lors des administrations est de courte durée et limitée par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse lorsque cela est possible. Les prélèvements présentent une douleur potentiellement plus importante, ils seront donc réalisés sous analgésie et anesthésie chimique générale. Bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, souffrance et angoisse associées à l’administration des composés, les animaux seront sous surveillance accrue durant les 24H de la manipulation et donc au moment même de l’apparition du moindre problème.

Choix des espèces

La tauopathie est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère qui peut être modifiée génétiquement pour modéliser la maladie d’alzheimer. (Ce modèle est disponible chez les éleveurs agréset est reconnu par la communauté scientifique, il a déjà été utilisé dans de nombreux projets scientifiques et est bien caractérisé. Les études de pharmacocinétique seront réalisées chez la souris, portant un fond génétique proche des souris porteuses de la maladie. Nous utiliserons des souris adultes car dans ce modèle la phase précoce de la tauopathie, apparaît entre 2,5 à 4 mois. Le projet prévoit l'utilisation des 2 sexes (même nombre d'animaux dans les deux sexes), la tauopathie étant décrite pour se développer de manière légèrement différente chez les mâles et les femelles dans le modèle.

Dès qu'une souris présente des signes importants de souffrance, elle est mise à mort : c'est le critère d'arrêt annoncé pour 14 730 souris infectées par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur écrivant qu'aucune réutilisation ni remise en liberté n'est envisageable après exposition à des agents pathogènes. Les infections provoquent perte de poids, posture voûtée, hypothermie et déshydratation, et pour certaines atteintes fongiques du cerveau des troubles de la coordination et des mouvements anormaux, sur des souris pesées et traitées plusieurs fois par jour. Ces effectifs servent à cribler des candidats médicaments et à ajuster des schémas d'administration, une activité de sélection étalée sur cinq ans.

Objectifs

Le projet a pour objectif de développer et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques destinées au traitement des infections systémiques d’origine bactérienne ou fongique. Ces infections, souvent graves, peuvent évoluer rapidement et entraîner des complications importantes. Le développement de nouvelles options thérapeutiques est donc essentiel, en particulier dans un contexte d’augmentation des résistances aux traitements actuels. Dans ce cadre, des modèles murins d’infection systémique sont utilisés afin d’étudier l’efficacité de candidats thérapeutiques dans des conditions se rapprochant le plus possible de celles observées chez l’Homme. Ces modèles permettent d’évaluer la capacité des traitements à réduire la charge infectieuse, à limiter la propagation des agents pathogènes dans l’organisme et à améliorer l’état général. Le projet comprend plusieurs étapes complémentaires. Dans un premier temps, des modèles expérimentaux sont développés et optimisés afin de garantir leur fiabilité et leur reproductibilité. Dans un second temps, ces modèles sont utilisés pour tester différents composés, en mesurant leur efficacité et leur comportement dans l’organisme (distribution, durée d’action). Ces données permettent d’identifier les candidats les plus prometteurs et d’adapter les schémas d’administration. Les résultats attendus à court terme sont la sélection de composés présentant une activité thérapeutique significative. À moyen terme, ils permettent de mieux comprendre les relations entre la dose administrée et l’effet observé, afin d’optimiser les traitements. À long terme, ce projet contribue au développement de nouveaux médicaments susceptibles d’être évalués chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des infections systémiques d’origine bactérienne ou fongique, qui représentent un enjeu majeur de santé publique. Ces infections peuvent être graves et difficiles à traiter, notamment en raison de l’augmentation des résistances aux traitements existants. À court terme, ce projet permet d’identifier et de sélectionner des candidats thérapeutiques prometteurs en évaluant leur capacité à réduire la présence des agents infectieux dans l’organisme et à limiter leur dissémination vers différents organes. Ces résultats contribuent à orienter les choix de développement des composés les plus efficaces. À moyen terme, les données générées permettent de mieux comprendre le lien entre la dose administrée, la distribution du traitement dans l’organisme et son effet thérapeutique. Cela contribue à optimiser les schémas d’administration et à améliorer l’efficacité des traitements étudiés. À long terme, ce projet participe au développement de nouvelles options thérapeutiques susceptibles d’être évaluées chez l’Homme. Il contribue ainsi à améliorer la prise en charge des infections systémiques, en particulier dans des situations où les traitements disponibles sont limités ou moins efficaces.

Procédures

Dans le cadre du projet, les animaux sont soumis à différentes interventions nécessaires à l’induction de l’infection, à l’administration des traitements et au suivi des paramètres biologiques. Les principales interventions incluent : • la pesée des animaux (plusieurs fois par jour, environ 30 secondes, sur animal vigile), • l’administration de composés (une à plusieurs fois par jour selon le protocole, environ 30 secondes à 2 minutes selon la voie), par voie orale (gavage), sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire ou intradermique. • l’inoculation de l’agent infectieux (1 fois, environ 30 secondes), réalisée par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée • des prélèvements sanguins de faible volume (environ 30 secondes), réalisés sur animal vigile ou anesthésié selon la fréquence et la technique, dans le respect des limites réglementaires. Dans certaines procédures spécifiques, des animaux peuvent être utilisés porteurs de cathéters implantés en amont par le fournisseur. Dans ce cas, des manipulations liées au maintien du dispositif (vérification, rinçage) sont réalisées par du personnel formé afin d’assurer son bon fonctionnement. La fréquence des interventions varie selon les objectifs de l’étude (évaluation de la charge infectieuse, paramètres pharmacocinétiques/pharmacodynamiques). Les procédures aiguës sont de courte durée (jusqu’à 3 jours), tandis que les modèles subaigus peuvent s’étendre jusqu’à 14 jours. L’ensemble des interventions est réalisé par du personnel qualifié, dans des conditions adaptées, afin de limiter la durée de contention, le stress et l’inconfort des animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en œuvre dans ce projet peuvent entraîner chez les animaux une altération légère à modérée de l’état général, principalement en lien avec l’infection systémique induite. Les effets observés peuvent inclure une perte de poids, une diminution de l’activité, une posture voûtée, un pelage modifié et une réduction de la prise alimentaire. Selon la progression de l’infection, des signes supplémentaires peuvent apparaître tels qu’une hypothermie, une déshydratation ou une fatigue accrue. Certains agents infectieux peuvent entraîner des effets spécifiques. Par exemple, certaines infections fongiques peuvent provoquer une atteinte de certains organes, comme le cerveau. Dans ce dernier cas, des signes neurologiques modérés tels que des troubles de coordination ou des mouvements anormaux peuvent être observés. Les manipulations nécessaires à l’étude peuvent également générer un inconfort temporaire. Les injections, prélèvements sanguins et manipulations répétées peuvent entraîner un stress lié à la contention, ainsi qu’une gêne ou une douleur locale de faible intensité. Dans le cadre de certaines études, l’utilisation d’animaux porteurs de cathéters peut également être associée à des effets locaux au niveau du site d’implantation (irritation ou inflammation). Lorsque des traitements modifiant le système immunitaire sont administrés, ils peuvent induire des effets transitoires tels qu’une perte de poids ou une diminution de l’état général. L’ensemble de ces effets reste généralement limité dans le temps et de sévérité légère à modérée grâce à une surveillance clinique rapprochée, à la mise en place de mesures de soutien et à l’application de critères d’arrêt précoces.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux sont systématiquement mis à mort. Aucune réutilisation, remise en liberté ou maintien en vie après la procédure n’est envisageable. En effet, les animaux ont été exposés à des agents infectieux potentiellement pathogènes et les procédures impliquent généralement des atteintes physiologiques incompatibles avec une récupération complète dans des conditions garantissant leur bien être. Le recours à la mise à mort permet également la réalisation de prélèvements terminales indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Cette approche garantit à la fois la qualité des données générées et le respect des exigences en matière de bien être animal, en évitant toute utilisation ultérieure inappropriée des animaux.

Remplacement

Avant de recourir à l’utilisation d’animaux, des méthodes alternatives sont systématiquement mises en œuvre afin de limiter leur utilisation. Les molécules testées sont d’abord étudiées en laboratoire, en dehors de l’organisme, grâce à des tests réalisés sur des micro organismes (bactéries ou champignons) et des cellules. Ces approches permettent de vérifier si les candidats traitements sont susceptibles d’être efficaces et d’éliminer ceux qui ne présentent pas d’intérêt. Des modèles informatiques et des analyses de données existantes sont également utilisés pour mieux comprendre le comportement des médicaments et sélectionner les doses appropriées avant toute expérimentation animale. Ces méthodes permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés en ne testant que les molécules les plus prometteuses. Elles sont systématiquement privilégiées dès que cela est possible. Cependant, certaines questions scientifiques ne peuvent pas être étudiées sans recourir à un organisme entier. Les infections étudiées impliquent des interactions complexes entre l’agent infectieux et l’ensemble de l’organisme, notamment la circulation du pathogène dans différents organes et la réponse globale de l’organisme. À ce jour, ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal reste donc nécessaire dans certaines situations, mais il est limité au strict nécessaire, et uniquement lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues autrement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est limité au strict nécessaire grâce à plusieurs mesures mises en place dès la conception des études. Avant toute expérimentation, les chercheurs s’appuient sur les données déjà disponibles (littérature scientifique, résultats internes) afin d’éviter de répéter des études déjà réalisées. Des tests préalables en laboratoire permettent également d’identifier les conditions les plus adaptées avant d’utiliser des animaux. Les modèles sont d’abord optimisés avec un nombre réduit d’animaux afin de définir précisément les paramètres expérimentaux (dose d’infection, durée de l’étude). Ces informations permettent ensuite de concevoir les études de manière plus efficace et d’éviter d’avoir à les répéter. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé à l’aide de méthodes statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux nécessaire. Par ailleurs, les études sont organisées de manière à limiter le nombre de manipulations réalisées sur chaque animal. Lorsque les besoins expérimentaux sont importants, des groupes distincts d’animaux (appelés cohortes) sont utilisés afin d’éviter d’imposer un trop grand nombre de prélèvements ou d’injections à un même animal. Enfin, plusieurs types de données (par exemple observations cliniques et mesures biologiques) sont recueillis chez un même animal lorsque cela est possible, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. L’ensemble de ces approches permet de concilier la qualité scientifique des résultats avec une utilisation raisonnée et limitée des animaux.

Raffinement

Le projet met en œuvre différentes mesures afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long des études. Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées et contrôlées, avec un enrichissement du milieu (matériel de nidification, abris, tunnels) qui favorise leur bien être et leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils sont acclimatés avant toute expérimentation afin de réduire le stress lié au changement d’environnement. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en utilisant des techniques adaptées pour limiter l’inconfort et la durée de contention. Lorsque cela est nécessaire, une anesthésie est utilisée pour certaines procédures. Des traitements contre la douleur peuvent également être administrés si des signes de gêne apparaissent. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière (plusieurs fois par jour) afin de détecter rapidement toute dégradation de leur état de santé. Des grilles de suivi permet d’évaluer leur état de manière objective. Des mesures de soutien sont mises en place en cas de besoin, comme l’apport d’eau ou de nourriture facile d’accès, ou un environnement chauffé si les animaux présentent des signes de fragilité. Des critères d’arrêt précoces sont définis : dès qu’un animal présente des signes importants de souffrance, il est pris en charge ou mis à mort afin d’éviter toute dégradation de son état. Enfin, l’organisation des études permet de limiter le nombre de manipulations par animal, notamment grâce à l’utilisation de groupes distincts lorsque nécessaire. L’ensemble de ces mesures permet de réduire autant que possible l’impact des procédures sur les animaux tout en garantissant la qualité des résultats scientifiques.

Choix des espèces

La souris est l’espèce choisie pour ce projet car il s’agit d’un modèle largement utilisé en recherche médicale. Elle permet d’étudier de manière fiable le développement des infections et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans un organisme entier. De nombreuses connaissances scientifiques existent déjà sur ce modèle, ce qui facilite l’interprétation des résultats et permet de limiter la répétition d’expériences. L’organisme de la souris présente des similitudes importantes avec celui de l’Homme pour l’étude des infections, notamment en ce qui concerne la manière dont les agents infectieux se propagent dans le corps et la façon dont l’organisme réagit. Cela en fait un outil pertinent pour améliorer les connaissances et développer de nouveaux traitements. Les animaux utilisés sont des adultes. Ce choix permet de travailler sur un organisme dont les fonctions sont totalement développées et stables, ce qui garantit des résultats plus fiables et reproductibles. Chez les adultes, le système immunitaire et les caractéristiques physiologiques sont mieux établis, ce qui est essentiel pour étudier correctement les infections. Ce choix d’espèce et de stade de développement permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en utilisant le modèle le plus adapté et le mieux caractérisé.

Jusqu'à quatre-vingts administrations d'antibiotique par animal, une à deux fois par jour pendant deux mois : 5 604 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour compter les bactéries dans leurs organes. Elles sont d'abord infectées sous anesthésie par Mycobacterium abscessus ou Mycobacterium avium, le porteur cherchant à contourner l'élimination spontanée des bactéries par un "artifice" destiné à créer une infection chronique. L'infection provoque une perte de poids, et les administrations répétées peuvent causer microlésions, irritations et fausses routes. Sur le remplacement, le porteur affirme que le recours à la souris "ne peut être remplacé", les tests in vitro ne servant selon lui qu'à sélectionner en amont les composés les plus actifs.

Objectifs

Mycobacterium abscessus et Mycobacterium avium sont des mycobactéries pathogènes opportunistes responsables d'infections pulmonaires chroniques. Pour mieux comprendre l'impact de l'hôte, des modèles précliniques sont indispensables. Les modèles murins actuellement utilisés pour évaluer de nouveaux traitements antibiotiques, concernent soit des animaux immunodéprimés, ce qui ne reflètent pas la majorité des patients, soit des animaux immunocompétents mais qui éliminent spontanément les bactéries. Afin de contourner cette élimination, nous souhaitons mettre au point un modèle murin d’infection par Mycobacterium abscessus et Mycobacterium avium. Cet artifice va permettre de créer une infection chronique ressemblant à celle observée chez les patients. Une fois notre nouveau modèle d'infection validé, la deuxième partie de notre projet consistera à tester des nouvelles molécules mises sur le marché dans le traitement des infections mycobactériennes. En effet, les antibiotiques utilisés actuellement pour traiter les infections à Mycobacterium avium sont limités et quasiment inexistants pour Mycobacterium abscessus. Les composés les plus actif seront sélectionnés dans un premier temps in vitro et seuls les composés les plus efficaces seront testés in vivo.

Bénéfices attendus

En France, l’incidence annuelle estimée des nouvelles infections à Mycobacterium abscessus et Mycobacterium avium dans les infections pulmonaires humaines est de 1 pour 100 000, avec une prévalence de 6 pour 100 000. Les dépenses annuelles liées à l’infection sont coûteuses (environ 25 000 euros chez les patients infectés par ces bactéries, contre 3500 euros chez les patients contrôles). Les infections pulmonaires à ces bactéries sont associées à une morbidité chronique importante, à des difficultés thérapeutiques ainsi qu’à un risque élevé de rechute, nécessitant des traitements prolongés et complexes. Notre projet vise ainsi à trouver de nouvelles molécules ou de nouvelles associations de molécules afin d’améliorer le traitement des infections à Mycobacterium abscessus et Mycobacterium avium et la prise en charge des patients. En effet, les antibiotiques utilisés actuellement pour traiter les infections à Mycobacterium avium sont limités et quasiment inexistants pour Mycobacterium abscessus.

Procédures

Pour induire la maladie, les animaux sous anesthésie générale seront infectés par la bactérie responsable (durée: entre 30 et 60 secondes par animal, fréquence: 1 fois). Les antibiotiques seront administrés aux animaux vigiles (durée: moins de 30 secondes par animal; fréquence 1 à 2 fois par jour sur 2 mois soit au maximum 80 administrations). Un prélèvement sanguin sera effectué sur un groupe restreint d'animaux (durée: moins de 30 secondes par animal; fréquence: 1 fois par animal). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure pour prélèvements et analyses bactériologiques.

Impact sur les animaux

L'infection chronique par les bactéries peut entrainer une perte de poids modérée. L’anesthésie pourrait engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Les manipulations des animaux lors des contentions effectuées aux différentes étapes pourraient induire un stress de courte durée. Les traitements effectués pourraient induire des microlésions, des irritations, une fausse route ou une douleur de courte durée aux animaux. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.

Devenir

Afin d'évaluer l'efficacité des molécules dans le traitement des infections à mycobactéries, tous les animaux seront euthanasiées par une méthode réglementaire à l'issu de la procédure afin de récupérer les organes d'intérêt pour évaluer les charges bactériologiques.

Remplacement

Les études dans le modèle murin sont un prérequis indispensable à la compréhension de la maladie humaine. Il s'agit d'une étape indispensable pour pouvoir affiner au mieux les stratégies thérapeutiques qui seront évaluées chez l'homme dans un essai incluant le moins de patients possible. Notre projet s'inscrit en amont des études d'activités d'antibiotiques chez l'homme et le modèle animal ne peut être remplacé. Les composés les plus actifs seront sélectionnés dans un premier temps in vitro et seuls les composés les plus efficaces seront testés in vivo afin de réduire le nombre d’animaux.

Réduction

5604 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les composés à tester seront réduits aux plus actifs grâce aux test in vitro préalablement réalisés. Ainsi, afin de réduire le nombre d’animaux, seuls les composés les plus efficaces seront testés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum). Ils ont un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement par des personnes compétentes. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les animaux sont manipulés par des personnes compétentes ce qui favorise le bien-être des animaux. Pour les inoculations et les traitements, le matériel a été choisi afin qu’il soit le plus adapté à la taille des souris (le plus petit possible). Pour les traitements, la voie d’administration a été choisie afin d’être la plus physiologique possible afin de limiter les nuisances. L’anesthésie nécessaire lors de l’infection a été choisie pour minimiser la durée d’endormissement des animaux et une récupération rapide. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Le modèle murin est actuellement le modèle de référence utilisé pour l'évaluation de l’activité des antibiotiques dans les infections à mycobactéries avant un essai clinique chez l'homme. Il est nécessaire de garder le même modèle pour obtenir des résultats reproductibles et éviter les doublons d’expériences. Les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure à 5 semaines après avoir observés une semaine d'acclimatation. Dans la littérature, les animaux utilisés dans d’autres infections mycobactériennes ont habituellement 4 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature, c’est pourquoi nous utiliserons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer nos résultats à ceux de la littérature et d’être reproductibles.

Les souris utilisées sont d'une souche fortement immunodéficiente, donc plus exposées aux infections opportunistes, et reçoivent en plus une chimiothérapie avant la greffe. 128 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse du sang et des tissus. Sous anesthésie générale, des supports contenant des cellules de patients atteints de syndrome myélodysplasique leur sont implantés sous la peau, et si la greffe ne prend pas, les cellules sont injectées directement dans l'os. Le porteur présente ce changement de souche comme une correction : la précédente, écrit-il, "ne nous a pas permis de reproduire correctement les résultats obtenus dans nos travaux antérieurs".

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité d’un nouveau traitement contre une maladie grave du sang appelée syndrome myélodysplasique. Ce traitement repose sur des cellules immunitaires modifiées (appelées CAR-T cells) capables de reconnaître et détruire les cellules malades. Pour cela, nous utilisons des souris dans lesquelles nous greffons des cellules humaines provenant soit de patients, soit de lignées cellulaires. Cela permet de reproduire la maladie humaine chez l’animal et d’évaluer si le traitement est efficace dans des conditions proches de celles rencontrées chez les patients. Cette demande correspond à la poursuite d’un projet déjà autorisé, avec deux améliorations importantes : l’utilisation d’un nouveau type de souris, mieux adapté à l’implantation de cellules humaines ; l’ajout d’un traitement léger avant la greffe, afin de faciliter l’installation des cellules humaines. Ces modifications sont nécessaires car le modèle utilisé précédemment ne nous a pas permis de reproduire correctement les résultats obtenus dans nos travaux antérieurs. L’objectif est donc d’améliorer la fiabilité du modèle, afin d’obtenir des résultats pertinents tout en évitant l’utilisation inutile d’animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de confirmer l’efficacité d’un nouveau traitement d’immunothérapie contre les cellules cancéreuses responsables des syndromes myélodysplasiques, dans un modèle animal. L’efficacité de ce traitement a déjà été démontrée en laboratoire sur des cellules (in vitro). Cette étape supplémentaire chez l’animal est nécessaire pour vérifier que le traitement fonctionne également dans un organisme vivant, dans des conditions plus proches de la réalité. En cas de résultats positifs, ce travail pourrait permettre le développement d’un essai clinique chez l’Homme (phase 1), première étape vers une utilisation thérapeutique chez les patients.

Procédures

Ils recevront tout d’abord une injection de chimiothérapie (30 sec) afin de préparer l’organisme à la greffe de cellules humaines. Une intervention chirurgicale, réalisée sous anesthésie générale (20 min), permettra ensuite l’implantation sous la peau de supports contenant les cellules humaines. Si la greffe ne prend pas correctement, une procédure alternative pourra être réalisée, consistant en une injection de cellules directement dans l’os, également sous anesthésie générale (10 min). Les animaux recevront ensuite une injection du traitement étudié ou d’un traitement contrôle. Au cours du suivi, des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie brève. Des examens d’imagerie non invasive seront également effectués pour suivre l’évolution de la maladie et l’effet du traitement. À la fin de l’étude, les animaux seront mis à mort afin de permettre l’analyse des tissus.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour les animaux sont limitées et principalement liées aux différentes procédures expérimentales. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner une douleur légère et un stress transitoire lié à la manipulation des animaux. La procédure d’implantation sous la peau de supports contenant les cellules humaines et d’injection dans l’os (réalisée pour la greffe ou son contrôle) peut provoquer une douleur légère à modérée. Enfin, en raison de l’immunodéficience des souris utilisées, le développement de la maladie (prolifération de cellules tumorales humaines) est attendu au cours de l’étude. Cette immunodéficience entraine également une sensibilité plus importante aux infections et aux agents pathogènes opportunistes.

Devenir

La mise à mort des animaux en fin d’étude est nécessaire pour permettre la réalisation d’analyses indispensables, notamment l’étude des cellules sanguines, l’évaluation de l’efficacité du traitement et l’analyse de certaines cibles biologiques. Ces données ne peuvent pas être obtenues autrement et sont essentielles pour interpréter correctement les résultats du projet. Cette étape est réalisée dans le respect des règles éthiques, sous anesthésie appropriée, afin de limiter au maximum la souffrance des animaux. Elle permet également de ne pas prolonger inutilement l’expérimentation.

Remplacement

À ce jour, il n’est pas possible de reproduire en laboratoire (in vitro) l’ensemble des mécanismes impliqués dans les syndromes myélodysplasiques, notamment les interactions complexes entre les cellules malades et leur environnement dans la moelle osseuse. Ces interactions sont essentielles pour évaluer correctement l’efficacité du traitement étudié. Elles ne peuvent pas être modélisées de manière fiable par des systèmes expérimentaux simplifiés ni par des approches informatiques ou mathématiques. Des expérimentations in vitro ont déjà été effectués en amont avec des résultats encourageants. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour étudier l’efficacité du traitement dans des conditions biologiques représentatives de la maladie humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été limité au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables sur le plan scientifique. Ce nombre a été déterminé à partir d’hypothèses statistiques et des tests d’analyse prévus. L’utilisation de souris immunodéprimées favorise l’implantation et le développement des cellules humaines greffées, ce qui augmente la fiabilité du modèle expérimental. Cette meilleure prise de greffe réduit le risque d’échec des expériences et permet ainsi de limiter le nombre total d’animaux nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. L’efficacité du traitement sera évaluée grâce à une technique d’imagerie permettant de suivre l’évolution de la maladie chez les animaux. Le critère principal sera la diminution du signal mesuré, reflétant la réduction des cellules malades sous l’effet du traitement. Nous attendons une diminution importante de ce signal chez les animaux traités par la molécule d’intérêt, en comparaison avec les groupes contrôles.

Raffinement

Certaines procédures réalisées dans le cadre du projet peuvent entraîner une gêne ou un stress modéré chez les animaux. Afin de limiter au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse, une surveillance attentive de leur état de santé sera assurée tout au long de l’étude, permettant une prise en charge rapide et adaptée dès l’apparition du moindre signe d’inconfort. Les interventions telles que l’injection de cellules humaines, les prélèvements médullaires et les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie générale afin de réduire la douleur et le stress. Les aiguilles d'injection utilisées seront de taille 27 gauge en 13mm de long et seront changées entre chaque animal. Le projet sera conduit dans un établissement autorisé à l’expérimentation animale, par du personnel formé et qualifié. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées, en environnement enrichi et stérile pour limiter l'impact de l'immunodépression des animaux, avec un suivi quotidien permettant d’identifier précocement les critères d’arrêt définis pour préserver leur bien-être. La mise à mort des animaux sera réalisée conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

La souche de souris utilisée dans ce projet est fortement immunodéficiente, ce qui permet l’implantation et le développement de cellules humaines. Cette caractéristique est indispensable pour établir un modèle de xénogreffe pertinent à partir d’échantillons issus de patients. Les animaux seront utilisés à un âge compris entre 8 et 10 semaines, correspondant à une période optimale pour ce type de greffe. En raison du délai nécessaire à l’implantation et au développement des cellules humaines (environ 1 à 3 mois), les injections doivent être réalisées précocement afin de garantir la réussite du modèle expérimental.

Greffées avec des adipocytes bruns, puis exposées jusqu'à quatre fois à une température de 4 degrés pendant vingt-quatre heures, 1 238 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent des prélèvements sanguins répétés, des chirurgies sous anesthésie et un isolement pouvant durer deux semaines en cage métabolique. L'objet est de tester si une greffe de tissu adipeux brun corrige les troubles métaboliques et reproductifs du syndrome des ovaires polykystiques, que le porteur dit toucher 13 % des femmes en âge de procréer. Cent soixante femelles et cinquante-quatre mâles passent d'une procédure à l'autre et sont réutilisés pour les tests de fertilité avant d'être mis à mort, le porteur indiquant que le prélèvement des organes interdit de les garder en vie.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer les effets de la transplantation d’adipocytes bruns, obtenus à partir de tissu adipeux murin ou d'adipocytes bruns humains obtenus in vitro en 3 dimensions (BAToïdes), sur les altérations métaboliques, hormonales et reproductives associées au syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le SOPK est une pathologie fréquente, touchant environ 13 % des femmes en âge de procréer. Elle se caractérise par des troubles métaboliques, hormonaux et reproductifs, souvent associés à une altération de la qualité de vie. À ce jour, il n’existe pas de traitement curatif, et la prise en charge repose principalement sur des approches symptomatiques. L’objectif est de déterminer si cette approche de thérapie cellulaire permet de moduler les déséquilibres physiopathologiques observés dans cette pathologie, en particulier au niveau des interactions entre les systèmes métaboliques, endocrinien et reproducteur. Le recours à un modèle animal est indispensable à ce stade afin d’évaluer, dans un organisme entier, la faisabilité, la tolérance et les effets de cette approche. En effet, la complexité des interactions systémiques impliquées dans le SOPK ne peut pas être reproduite de manière fiable par des approches in vitro ou in silico. Cette étape préclinique constitue un préalable nécessaire à l’évaluation de la pertinence de cette stratégie dans une perspective translationnelle. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d’explorer une stratégie innovante visant à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués et à identifier de nouvelles pistes d’intervention thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les troubles métaboliques et endocriniens, tels que ceux observés dans le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK), représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur prévalence, de leur impact sur la qualité de vie et des coûts socio-économiques associés. Le SOPK est notamment caractérisé par des altérations métaboliques (dont la résistance à l’insuline) et des dysfonctionnements de la reproduction, pour lesquels les options thérapeutiques actuelles restent limitées et essentiellement symptomatiques. Dans ce contexte, ce projet vise à améliorer la compréhension des interactions entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur, en particulier le rôle du tissu adipeux brun dans la régulation de ces fonctions. En explorant les effets de la transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin pertinent de SOPK, ce travail permettra d’identifier de nouveaux mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette pathologie. Les connaissances générées pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles d’intervention et ouvrir des perspectives pour le développement de stratégies innovantes dans la prise en charge des troubles métaboliques et de la fertilité. Plus largement, ce projet s’inscrit dans les priorités actuelles de recherche en santé, notamment en lien avec la santé des femmes, et pourrait participer à l’amélioration de la prise en charge de pathologies chroniques ayant un impact important sur la qualité de vie et le bien-être à long terme.

Procédures

Pour l’ensemble des gestes décris dans les 3 procédures, nous aurons recours à l’utilisation d’anesthésiques (uniquement dans une procédure) et d’analgésiques aussi souvent que cela sera nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par voie gazeuse. Une injection d’analgésique adapté sera réalisée avant la chirurgie et/ou après si nécessaire. Les injections n’excèderont jamais 20 μl/g de poids corporel. Les animaux feront l'objet d'administration de traitements et de prélèvements selon les volumes et fréquences recommandées par la littérature et dans le respect de la réglementation en vigueur. Des prélèvements sanguins par différentes voies réalisés au cours des procédures de phénotypage seront effectués avec des fréquences et volumes inférieurs aux recommandations bibliographiques et à la réglementation en vigueur. Un isolement de maximum 2 semaines (sans rupture du lien olfactif ou visuel) sera nécessaire pour une partie des animaux afin de pouvoir mesurer des caractéristiques de manière individuelle.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations expérimentales sont susceptibles d’induire un stress, une fatigue ou un inconfort transitoire chez les animaux. Afin de limiter ces effets, l’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé et compétent, et les animaux seront préalablement habitués aux manipulations. Certaines interventions, telles que les injections, les prélèvements sanguins ou les procédures chirurgicales, peuvent entraîner des douleurs de courte durée. Celles-ci seront systématiquement limitées par l’utilisation de protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés, ainsi que par une surveillance attentive des animaux pendant et après les interventions. Dans le cadre de certaines analyses, notamment en cages métaboliques, les animaux pourront être hébergés individuellement pendant une durée limitée. Cet isolement sera restreint au strict nécessaire et réalisé dans des conditions permettant le maintien d’interactions sensorielles (contacts visuels, olfactifs et auditifs) avec les congénères, afin de réduire le stress associé. Plus généralement, une surveillance régulière de l’état général, du comportement et du poids des animaux sera mise en place tout au long du protocole, permettant d’identifier précocement tout signe de mal-être et d’adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Afin d’étudier l’influence de la température sur la réponse métabolique, les animaux seront exposés à une température de 4°C (atteinte progressivement) pour une durée maximale de 24h et sous surveillance constante. Cette exposition sera effectuée au maximum 4 fois.

Devenir

Les animaux décrits en procédure 1 seront transférés en procédure 2 ou 3 et seront mis à mort à la fin de ces dernières. Les 160 femelles et 54 mâles du projet seront réutilisés pour les tests de fertilité en procédure 3 puis seront mis à mort à l’issue de celle-ci. La nécessité de prélever les organes pour analyses ne nous permet pas de les garder en vie.

Remplacement

Dans la mesure du possible, des approches alternatives seront utilisées afin de réduire le recours à l’expérimentation animale. Celles-ci incluent notamment des cultures cellulaires, des modèles dérivés de cellules souches ainsi que des modèles tridimensionnels de type organoïdes ou adipocytes bruns différenciés in vitro. Dans le cadre de ce projet, des adipocytes bruns humains générés in vitro seront également utilisés afin de limiter le recours à des tissus animaux. Par ailleurs, certains tissus et cellules issus des animaux utilisés dans les procédures expérimentales pourront être exploités ex vivo pour la réalisation de cultures primaires et d’analyses fonctionnelles, permettant ainsi de réduire le nombre de composés et d’expérimentations complémentaires à réaliser in vivo. Cependant, l’étude des interactions complexes entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur dans le contexte du syndrome des ovaires polykystiques nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme entier. Les effets attendus de la transplantation d’adipocytes bruns sur le métabolisme, la fonction hormonale et la fertilité impliquent des communications multi-organes (tissu adipeux, cerveau, gonades, foie) qui ne peuvent actuellement pas être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro ou in silico. Bien que des modèles cellulaires et computationnels soient en cours de développement et puissent contribuer à certaines étapes exploratoires, ils ne permettent pas à ce jour de reproduire la complexité des régulations systémiques étudiées dans ce projet. Ainsi, le recours au modèle animal demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les connaissances générées pourront néanmoins contribuer au développement futur de modèles alternatifs et à la réduction progressive du recours à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à ce projet est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’effectif de chaque groupe par procédure a été calculé à l’aide d’outils statistiques spécifiquesen tenant compte de (i) la définition de la taille minimale des groupes expérimentaux à utiliser pour obtenir des résultats probants, qui seront ajustés en fonction des différentes variables, elles-mêmes évaluées dans chaque expérience et (ii) la coordination des études à leur conception afin de permettre la collecte de plusieurs échantillons / tissus chez les mêmes individus ou d'entreprendre des analyses multiples chez des animaux individuels chaque fois que possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard d’hébergement définis par la réglementation. L’eau et la nourriture sont fournies ad libitum. Un enrichissement est ajouté dans la cage (à minima des cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation). Les périodes d’isolement sont limitées, justifiées et un enrichissement adapté est apporté. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé, et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Une attention particulière est accordée au principe de raffinement, en portant l’attention aux différentes procédures expérimentales appliquées aux animaux afin de minimiser la peur, l'angoisse (ex: regroupement et enrichissement de l'environnement) ou la souffrance (ex : soins péri-opératoires, asepsie, anesthésie et analgésie) qu'ils pourraient endurer. Toutes les procédures potentiellement invasives sont réalisées sous anesthésie adaptée, associée à une analgésie préventive et postopératoire lorsque nécessaire, afin de prévenir toute douleur. Une observation continue des animaux est assurée jusqu’au réveil complet après toute intervention nécessitant une anesthésie. Par la suite, une surveillance quotidienne de l’état général et du comportement est réalisée tout au long des procédures expérimentales, incluant l’évaluation de l’activité, de la posture, de l’aspect du pelage, de la prise alimentaire et hydrique ainsi que du poids corporel. Des critères d’arrêt sont définis et appliqués. Tout animal présentant des signes de souffrance, de détresse persistante, de perte de poids excessive ou d’altération de l’état général sera immédiatement retiré de l’étude et, si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre le lien entre les différents organes afin d’identifier de nouvelles thérapies pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. La souris, modèle d’étude largement validé en physiologie intégrée, nous permet de nous appuyer sur un socle de connaissances scientifiques solide. De plus, le modèle que nous utilisons dans ce projet est un modèle établi dans le laboratoire (présentant l’avantage d’une durée de gestation courte dans le cadre de notre étude) et validé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux. Des souris mâles et femelles seront utilisées à deux stades de développement correspondant aux greffes : P21 (post sevrage) et 6 semaines (jeunes adultes), afin d’évaluer l’impact du timing de transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin de SOPK.