Procédures modérées

Une session d'ultrasons de trente secondes à une minute, précédée d'une injection de microbulles de gaz par un cathéter, puis trente minutes d'imagerie sous anesthésie, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet existe parce qu'une étude précédente de la même équipe a laissé la moitié des animaux léthargiques après la séance d'ultrasons, des hémorragies cérébrales étant retrouvées chez 80 % de ceux qui ont ensuite été tués et examinés. Le porteur maintient que la technique est "prometteuse" et déjà en voie d'utilisation chez l'être humain, tout en cherchant à caractériser la neuroinflammation qu'elle provoque. Toutes les souris sont tuées pour des analyses complétant l'imagerie.

Objectifs

Le traitement des pathologies neurologiques, en particulier des maladies neurodégénératives, est limité par la présence de la barrière cérébrale qui complique le passage de molécules thérapeutiques au niveau du cerveau. Pour pallier cela, l’utilisation de la technique des ultrasons thérapeutiques semble une approche prometteuse. Cependant, lors d’une de nos précédentes études combinant l’utilisation des ultrasons, des microbulles et d’un composé thérapeutique, nous avons constaté un état léthargique chez environ 50% des animaux dans les heures suivant la session d’ultrasons. Après euthanasie de ces animaux, nous avons constaté, chez 80% des animaux, l’apparition d’hémorrhagie cérébrale. L’objectif de cette étude est donc de s’intéresser aux effets de ce schéma thérapeutique sur le cerveau et notamment sur l’inflammation. En effet, une augmentation locale de l’inflammation cérébrale suite à l’application des ultrasons associés aux microbulles est reportée dans la littérature. Nous souhaitons donc expliquer les effets des US après une ou deux sessions d’ultrasons grâce à l’imagerie basée sur la radioactivité et à l’analyse des molécules impliquées dans l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet va apporter des informations sur les effets des ultrasons cérébraux aigus et subaigus, notamment sur la neuroinflammation. En effet, l’utilisation des ultrasons pour perméabiliser la protection cérébrale est en voie d’utilisation chez l’homme et nous souhaitons caractériser la neuroinflammation induite. Cette étude vise à développer des nouveaux traitements dans les maladies neurologiques chez l'Homme

Procédures

Les animaux auront une session d’ultrasons d’une durée de trois minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection de microbulles de gaz (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse. Ce groupe aura également une session d’imagerie TEP d’une durée de 30 minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection du radiotraceur (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse. Ces animaux seront maintenus en contention lors du prélèvement sanguin en sous-mandibulaire (1 minute).

Impact sur les animaux

Injection des différentes molécules : un hématome au niveau de la queue à la pose ou au retrait de l’aiguille peut être ressenti. Session d’ultrasons : les souris ayant reçu les ultrasons peuvent présenter des difficultés à récupérer dans les heures suivant la session d’ultrasons. L’apparition d’hémorragies cérébrales est également possible du fait de la ou des sessions d’US.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des études ex vivo complémentaires aux études d’imagerie.

Remplacement

Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie utilisée basée sur la radioactivité est intégralement transférable à la clinique. A l’heure actuelle il n’existe de méthode alternative permettant d’étudiant les conséquences de l’ouverture de la barrière de protection sur le tissu cérébral.

Réduction

L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 20 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter par sexe, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Des analyses statistiques seront réalisées dans ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés quotidiennement. En cas de blessures, la plaie sera nettoyée et désinfectée jusqu’à la cicatrisation complète. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement. Le protocole expérimental sera mené avec une attention particulière portée au bien-être animal, notamment grâce à l'application de points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en condition normale et pathologique, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra utilisée en imagerie reposant sur la radioactivité. Adulte (6 mois) car les traitements US en clinique, notamment pour les maladies neurologiques, ne concernent que des sujets adultes. Les groupes d’animaux seront composés à 50% de mâles et 50% de femelles afin d’éviter les biais dus au sexe.

Un écoulement de sang ou un ulcère sur la tumeur déclenche la mise à mort de l'animal. 2 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Prélevées à la queue à six jours pour le génotypage, elles reçoivent selon les groupes cinq jours d'injections ou de gavage, une irradiation de dix minutes, un transfert de cellules par une veine derrière l'œil, une greffe de cellules tumorales, puis un suivi de la tumeur pendant deux à huit semaines. Le porteur indique que la suppression des protéines étudiées dans les lymphocytes T peut déclencher une auto-immunité avec amaigrissement, inflammation de la peau, prostration et perte d'activité sévère, auquel cas les souris sont tuées et le traitement raccourci à cinq doses.

Objectifs

La modulation des réponses immunitaires par les lymphocytes T grâce aux immunothérapies est à présent mise en place comme un traitement standard contre divers cancers. Dans ce contexte, l'activation des lymphocytes T dépend d’une régulation hautement dynamique des programmes génétiques pour la production de molécules effectrices qui éliminera les cellules tumorales. Nos données préliminaires montrent que les fonctions effectrices et régulatrices des lymphocytes T sont modulées par les protéines de liaison à l'ARN (RBPs). Nous émettons l'hypothèse que les RBPs sont essentielles pour le développement de la réponse antitumoraux par les lymphocytes T. Avec l'utilisation de modèles de souris transgéniques, notre projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires qui contrôlent l'amplitude et l’étendue des réponses immunitaires contre les tumeurs. Plus précisément, les objectifs spécifiques de notre projet sont : 1 - Comprendre la fonction des RBPs pour la maintenance de populations de lymphocytes T saines. 2 - Étudier l’importance de ces protéines pour l’activation des lymphocytes T effectrices et régulatrices dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous avons sélectionné les protéines TIA1, TIAL1, G3BP1 et G3BP2 comme modèles pour évaluer l'importance des mécanismes post-transcriptionnels clés des ARNm jusqu'à la synthèse des protéines. Pour certains cancers, l’expression de TIA1 et TIAL1 dans les lymphocytes T a été utilisé comme un marqueur pronostique, mais sa fonction moléculaire reste inconnue. G3BP1 et G3BP2 sont des protéine impliques dans l’apparition de cancer. Donc, nos études apporteront d'importantes connaissances sur la biologie de ces protéines et sur le fonctionnement des lymphocytes T qui permettra de mieux optimiser les stratégies pour la détection ou traitement de cancers.

Procédures

Les animaux sont soumis à une contention de 3-5 minutes pour un prélèvement de tissu (queue) lorsqu’elles ont 6 jours pour le génotypage (détermination des modifications génétiques) et, dans certains cas, un prélèvement du sang. Les animaux transgéniques n’expriment pas les protéines TIA1, TIAL1, G3BP1 et G3BP2 dans les lymphocytes T après un traitement spécifique par injection intra-péritonéale ou gavage oral (chaque intervention dure 2 minutes) pendant 5 jours, ou par régime alimentaire (sans manipulation). Ils serviront comme modèles tumoraux ou de donneurs de cellules T pour nos expériences de transfert cellulaire. Le transfert de cellules se fait dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes par une injection de 100-200μL en voie intraveineuse, par injection rétro-orbitale. Certains animaux seront irradiés, une fois pendant maximum 10 minutes, avant la reconstitution du système immunitaire avec le transfert de cellules souches par injection intraveineuse de 100-200μL dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes. Dans les modèles de cancers murins, l'implantation des cellules tumorales se fait dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes par injection sous-cutanée (sc) au niveau du flanc. Les animaux sont soumis à une contention de 2-3 minutes pour mesurer la tumeur tous les 2-3 jours (pendant 2-8 semaines selon les expériences) jusqu’au point d’analyse. Toutes les souris seront euthanasiées avant le prélèvement des organes le jour du point d’analyse.

Impact sur les animaux

Pour minimiser les effets indésirables, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales, puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de une taille tumorale maximale. Parfois, des nécroses peuvent apparaître au centre de certaines tumeurs et commencer à s’ulcérer ou à saigner. Si se le cas, les souris seront suivies par le/la vétérinaire. L’apparatition d’écoulement de sang ou d’ulcère avec un écoulement de liquide est un point limite, et le souris seront euthanasiées. Pour les animaux transgéniques qui n’expriment pas nos protéines d'intérêt dans les lymphocytes T, il y a la possibilité de développer un épisode d'auto-immunité associé à une perte de lymphocytes T régulateurs. L’auto-immunité peut être caractérisée par un amaigrissement, une inflammation cutanée, une peau rugueuse et/ou squameuse, une déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés, une absence de toilettage, ou une absence d’activité sévère. Si les animaux présentent un des phénotypes cités en amont, ils seront euthanasiés et nous remplacerons le traitement continu par un traitement limité à cinq doses de médicament (1 par jour durant 5 jours) où la perte de poids sera inférieure à 5 %, sans aucune inflammation cutanée et une activité physique normale. Nous n’avons observé aucun autre phénotype dommageable lié aux croisements de lignées génétiquement modifiées. Dans tous les cas, la santé de l’ensemble de nos souris sera surveillée au minimum 3 fois par semaine et les souris seront euthanasiées si elles perdent plus de 20% de leur poids initial ou présentent une posture voutée ou prostrée, des poils hérissés, des salissures ou écoulements ou une absence de toilettage. La souffrance, la douleur et le stress associés à la manipulation d'animaux, l’injection de substances et cellules (nuisances légères), l'irradiation de souris (nuisance modérée), et de prélèvement de sang et/ou d’une biopsie pour le génotypage (nuisances légères) sont limités en raison de la formation constante de notre personnel.

Devenir

Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés à la fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Les réponses immunitaires contre le cancer sont des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains et permettent l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Dans la mesure du possible, nous remplacerons les souris avec des cultures cellulaires in vitro, mais ces cultures se limiteront à la description des interactions moléculaires entre nos RBPs et l’ARN.

Réduction

Nous suivons les directives ARRIVE afin de garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d'animaux. La stratégie d'élevage produit le même nombre des souris tests et contrôles. Les souris sont classées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d'animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistiques. Sur la base de nos données préliminaires, pour avoir la plus grande puissance statistique, nous aurons besoin de 7 souris par groupe. Pour la reproductibilité de résultats concluants, nous répéterons chaque expérience 3 fois pour permettre un test statistique et une bonne reproductibilité. Finalement, dans certains cas, le transfert des lymphocytes T matures ou la reconstitution du système immunitaire avec des cellules souches permettra la reconstitution des lymphocytes T chez plusieurs souris réceptrices non-transgéniques, réduisant ainsi l'élevage des animaux transgéniques.

Raffinement

Les souris sont hébergées par 5 maximum dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. Les souris ne seront jamais laissées seules dans leur cage. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. De l’essuie-tout, des copeaux et du rouleau en carton et une maison en plastique rouge sont rajoutés en tant qu’enrichissements pour permettre aux souris de se détendre. Les animaux sont suivis au quotidien par les zootechniciens dès leur naissance. Les animaux disposent d'une semaine d'acclimatation avant le début du protocole. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Dans chaque procédure, nous avons mis en place des points limites (activité, posture, aspect et/ou respiration anormale, amaigrissement, inflammation cutanée, présence d'une anomalie ou avec une tumeur de taille anormale [ayant atteint 1500mm3], ulcère ou sanglante). Si l’un de ces critères est atteint, les souris seront euthanasiées. Les utilisateurs ont reçu des formations spécialisées et officielles qui leur permettent l’évaluation des souris et le raffinement des procédures. Les zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que les grimaces, l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage. L’anesthésie gazeuse (2% isoflurane + mélange air/oxygène, débit : 2 L/min pour la boîte et 0.2 L/min pour le masque) sera utilisée pendant le prélèvement du sang ou l’injection des cellules pour réduire le stress.

Choix des espèces

Les mécanismes moléculaires régulés par les protéines de liaison à l'ARN étudiées dans ce projet, ainsi que la dynamique des réponses immunitaires observées chez la souris sont similaires à celle observées chez l'homme. Donc, nos modèles de souris nous permettent d’identifier les mécanismes responsables d’une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Tout particulièrement, nous pouvons évaluer le maintien et le fonctionnement des cellules lymphoïdes dans un environnement tumoral complexe et difficile à modéliser in vitro, et ainsi analyser l'impact des réponses immunitaires systémiques en dehors du site tumoral. Toutes les procédures seront effectuées sur des souris âgées de 6 à 20 semaines présentant un système immunitaire mature mais non vieillissant.

Tuées par injection létale à la fin du second geste chirurgical, sans avoir été réveillées, 260 souris de réforme vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une biopsie de peau de 4 millimètres avec deux points de suture, se réveille, puis retourne sur la table moins de vingt-quatre heures plus tard pour l'ablation de la rate ou la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire, gestes exécutés par des stagiaires. Le porteur qualifie les effets indésirables attendus de "très limités" et les ramène à l'inconfort d'une plaie de petite taille si les sutures lâchent. La finalité tient à l'obligation réglementaire de former les personnels, formation agréée par le ministère de l'Agriculture dont une partie des exercices se fait sur cuisse de poulet.

Objectifs

La réglementation encadrant l'utilisation des animaux à des fins scientifiques impose la formation de tous les personnels impliqués avec une formation spécifique en chirurgie pour les personnels concevant ou réalisant des procédures chirurgicales. Ce projet répond aux exigences réglementaires de formation des personnels et a reçu un agrément du Ministère de l'Agriculture. Elle vise à initier les personnels aux bases de la chirurgie.

Bénéfices attendus

Etre sensibilisé et initié aux bonnes pratiques chirurgicales est essentiel, et obligatoire d'un point de vue réglementaire, pour concevoir ou mettre en oeuvre des actes de chirurgicaux dans le cadre de projets utilisant des animaux à des fins scientifiques ou éducatives. Cette initiation passe par une formation réalisée par des experts (vétérinaires et ingénieurs/techniciens compétents) et doit être complétée ensuite par un encadrement adapté pour la mise en oeuvre d'une procédure chirurgicale en particulier dans le cadre d'un projet autorisé. Cette formation n’a pas vocation à transformer les stagiaires en chirurgiens accomplis mais doit leur permettre d'acquérir les notions élémentaires et les gestes de base fondamentaux pour réaliser une procédure chirurgicale et une prise en charge per-opératoire adaptées. Les bénéfices attendus de ce projet sont ceux découlant des objectifs de toute formation en chirurgie : éduquer et former sur les bases fondamentales en chirurgie et sur la prise en charge per-opératoire afin de minimiser les risques de douleur, inconfort ou souffrance des opérés. Cette formation participe à la bien- taitance des animaux utilisés à des fins scientifiques.

Procédures

Les ateliers proposés dans cette formation sont l’anesthésie, l’analgésie, l'asepsie, les points de suture et sont mis en application à travers une expérience chirurgicale simple et peu invasive : la réalisation d'une biopsie cutanée de 4 mm2 sur animal anesthésié (anesthésie générale et locale associée à une analgésie) avec réveil de l'animal. L'intervention chirurgicale dure environ un quart d’heure. La majeure partie du temps de cette procédure est consacrée à la préparation de l'animal (Anesthésie, tonte, désinfection, préparation du chirurgien et du matériel). Dans les 24 heures suivant le réveil, une deuxième chirurgie plus invasive (ablation de la rate ou la pose d'un cathéter à la veine jugulaire qui est une veine superficielle) est réalisée sous anesthésie générale et analgésie appropriée (temps chirurgical estimé à une demi heure ) sans réveil de l'animal qui reçoit une injection létale en fin de chirurgie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress léger lié à la préhension /contention et à l'injection pour l'administration de l'anesthésie .Les effets indésirables attendus sur les animaux sont légers et liés à la biopsie cutanée. Le choix des gestes mis en oeuvre dans cette formation réglementaire a été fait en prenant en compte les attentes réglementaires (mise en situation des stagiaires) et en minimisant l'impact pour les animaux. C'est pour cela qu'une biopsie cutanée est proposée (degré de contrainte léger attendu, pas d'ouverture de cavité abdominale ou thoracique) avec réveil des animaux puis le lendemain réalisation d'une intervention sans réveil : avec une incision latérale mineure pour l'ablation de la rate ou d'une intervention sans ouverture de cavité anatomique pour la pose de cathéter à la veine jugulaire, avec suivi de l'anesthésie et analgésie adaptée et sans réveil des animaux. Les effets indésirables attendus sont donc très limités et pourraient correspondre à l'inconfort d'une éventuelle plaie cutanée de petite taille (4 mm de diamètre) si les 2 points de sutures réalisés par les stagiaires lachaient dans les 24 heures suivant l'intervention. Le protocole anesthésie pour l'ablation de la rate ou la mise en place du cathéter comporte un antalgique et la dose d'anesthésique est adaptée pour la durée de l'intervention attendue qui dure moins d'une heure.

Devenir

Les interventions réalisées sur les animaux par des personnels en formation ne permet pas de garantir un confort de vie aux animaux. Le choix d’euthanasier les animaux encore anesthésiés à la fin d'un geste opératoire est donc fait pour éviter tout risque d'inconfort post-chirurgical. De plus les animaux utilisés dans cette formation sont des animaux de réforme de l'animalerie, c'est-à-dire ne pouvant pas être utilisés dans un projet ou replacés.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux et une mise en situation des participants sont attendues pour l'agrément des formations à la chirurgie expérimentale. Une partie des travaux pratiques est réalisée sur supports inertes (blanc ou cuisse de poulet) et préalablement aux interventions réalisées sur animaux anesthésiés. Il y a donc un remplacement "partiel" de l'animal avec ces étapes pratiques préalables qui permettent aux stagiaires d'acquérir une certaine assurance et automatisme des gestes avant leur mise en oeuvre sur animaux vivants et anesthésiés, limitant ainsi la contrainte pour l'animal qui serait liée à un geste technique mal exécuté. Cette étape permet à la fois un remplacement, une réduction du nombre total d'animaux utilisés et une réduction des contraintes pour les animaux.

Réduction

L'entrainement aux gestes de suture se fait sur matière inerte afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et pour limiter les contraintes imposées aux animaux pendant la formation. C'est pour cela qu'une intervention mineure est réalisée (punch biopsie cutanée) avec un réveil, suivi d'une intervention plus invasive sur le même animal qui ne sera pas réveillé à la suite de cette deuxième intervention. Ainsi un seul animal par expérimentateur sera utilisé, sachant que ces animaux sont des animaux de réforme de l’animalerie n’ayant subi aucune procédure autre qu'une identification et génotypage. Au total 260 souris seront utilisées.

Raffinement

Comme tous les autres animaux de l’animalerie ils sont suivis quotidiennement pour évaluer leur comportement général. Le choix des gestes mis en œuvre dans cette formation réglementaire a été fait en prenant en compte les attentes réglementaires (mise en situation des stagiaires) tout en minimisant l'impact pour les animaux. Les actes chirurgicaux réalisés sont peu invasifs: une biopsie cutanée associée à deux points de suture et une chirurgie simple d'ablation de la rate avec une incision cutanée de petite taille et sont réalisés sous anesthésie générale et locale en associant un antalgique. Ils sont maintenus sur un tapis chauffant thermostaté pendant toute la durée de l'anesthésie afin de limiter le risque d'hypothermie lié à l'anesthésie. Les animaux sont réveillés uniquement après la biopsie cutanée et sont suivis pendant leur réveil. Ils sont maintenus réveillés moins de 24 heures avant d’être de nouveau anesthésiés pour un deuxième acte chirurgical plus technique (ablation la rate ou mise en place d'un cathéter sur la veine jugulaire qui est superficielle) sans réveil cette fois. La deuxième intervention étant réalisée dans les 24 heures suivant la biopsie cutanée, la durée d'un inconfort potentiel post-opératoire reste limitée en intensite et en durée et les animaux ne sont pas réveillés à l'issue de la deuxième chirurgie. Les chirurgies sont réalisées sur les animaux après un entraînement des stagiaires leur permettant d'acquérir une assurance dans la maitrise de leurs gestes avant de les appliquer sur l'animal anesthésié. Cet apprentissage est encadré par des vétérinaires.

Choix des espèces

La souris représente l'espèce la plus utilisée à des fins scientifiques (68 pour cent des animaux selon les statistiques Ministère de la Recherche en France). La mise en application des gestes basiques de chirurgie sur la souris correspond à la majorité des situations rencontrées par les expérimentateurs qui réaliseront des actes de chirurgie dans leurs projets. Nous utiliserons des souris adultes de 6 à 8 semaines d'âge. Le stade de développement de ces animaux est largement utilisé dans la recherche in vivo et leur taille, à ce stade, est optimale pour la réalisation des gestes chirurgicaux décrits dans les procédures de ce projet.

Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie pendant une trentaine de minutes pour une électroporation in utero qui modifie le cerveau des embryons qu'elles portent. 288 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées, les souriceaux pour prélèvement de tissus, les femelles opérées parce que le porteur écarte une seconde intervention "pour raison éthique", les reproducteurs âgés faute de possibilité de replacement. Deux mutations d'un gène du développement cérébral produisent chez ces souris des défauts de comportement social que le porteur rapproche des troubles du spectre autistique. Il indique que les tests de comportement social sont bien établis dans cette espèce, sans nommer un seul de ceux qu'il emploiera.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris. Le projet nécessite une prolongation dans son exécution sans ajout d’animaux et un changement des deux Etablissements Utilisateurs (MODIFICATION).

Bénéfices attendus

Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.

Remplacement

Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.

Identifiées par une puce sous la peau, anesthésiées, puis infestées dans l'abdomen par la forme larvaire d'Echinococcus multilocularis, 500 souris voient la masse parasitaire grossir pendant cinq mois au moins, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées chaque mois puis chaque semaine jusqu'à un poids limite de 65 grammes, et le porteur indique que la masse abdominale finit par gêner leur locomotion. Une ulcération de la peau du ventre frottant contre la cage entraîne la mise à mort immédiate. Les autres sont tuées pour récolter le parasite, qui servira à infester des renards en captivité et à produire des œufs.

Objectifs

L’échinococcose alvéolaire due à une infection par le parasite Echinococcus multilocularis est une maladie rare en France. Cependant, elle est fatale si non traitée et nécessite un traitement quotidien à vie qui peut entrainer des effets secondaires importants. La longue période asymptomatique (5-10 ans) rend extrêmement difficile l’identification des sources de contamination (contact avec carnivore, sol, aliments souillés, …) par ingestion accidentelle d’œufs microscopiques excrétés dans l’environnement par les carnivores infestés. La disponibilité de matériel biologique du stade larvaire du parasite permet notamment l’infestation de renards. La production de fèces de renards contenant des œufs est indispensable pour la mise au point, validation et matériel de référence pour la réalisation d’analyses de diagnostic chez l’animal dans le cadre de la surveillance du parasite mais aussi la détection de la contamination environnementale et alimentaire ainsi que l’évaluation de la viabilité des œufs dans ces matrices ou le test de molécules en vue d’améliorer le traitement chez l’humain. L’objectif du projet est de maintenir au laboratoire un isolat du parasite Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires afin de pouvoir disposer facilement d’un matériel parasitaire de bonne qualité. La maîtrise de l’infection des hôtes intermédiaires en captivité permettra : 1/ De fournir du matériel larvaire de référence pour la mise au point de nouveaux outils diagnostiques. 2/ De produire des larves parasitaires pour les infestations de renards (hôtes définitifs).

Bénéfices attendus

L’ensemble des prélèvements récoltés permettra de produire du matériel de référence pour le développement d’outils de diagnostic qui contribueront à une meilleure connaissance de la répartition/ circulation des pathogènes étudiés et à une meilleure compréhension des mécanismes qui aboutissent à la contamination de l’homme par ce parasite. Les larves de parasite produits permettront de compléter, suite à l’infestation des renards en captivité, le cycle parasitaire d’Echinococcus multilocularis pour obtenir des vers adultes et des œufs de parasite.

Procédures

identification par puce sur animaux anesthésiés par voie sous-cutanée :

Impact sur les animaux

L'infection par le parasite, entraine une prise de poids progressive des souris, en raison du développement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion. En cas d’ulcération cutanée lié aux frottements de l’abdomen sur les parois de la cage les animaux seront immédiatement mis à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort afin de récolter la masse parasitaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour produire des protoscolex en laboratoire, en dehors de l’infestation des hôtes intermédiaires.

Réduction

Le projet utilisera environ 100 souris par an, soit 500 sur 5 ans. Cela se justifie par un temps de développement de la forme larvaire qui est de 5 mois minimum et par un succès du maintien de la forme productrice de larves parasitaires qui est d’environ 66%. Ces paramètres nous obligent pour assurer le maintien des trois souches larvaires de répéter l’infestation tous les trois/quatre mois sur des lots d’environ 15 souris. Aucune analyse statistique n'est prévue.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de carton, abris plastique et cellulose, bâton de bois dans les cages... Les animaux sont surveillées tous les jours et seront pesés mensuellement jusqu’à 3 mois, puis à partir du 4eme mois les pesées seront hebdomadaires afin de contrôler si les animaux atteignent le poids limite de 65 gr. De la nourriture et de l'hydrogel seront disposés au sein même de la cage en cas de problème d’accès à la mangeoire située sur la grille. Une anesthésie par isoflurane est assurée pour les infestations par voie intra-péritonéale. Une grille de score est mise en place pour vérifier l'atteinte des points limites définis dans le projet, et l'atteinte d’un score supérieur ou égal à 60, entrainera l’administration d’un analgésique dans l’eau de boisson.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires du parasite Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement les campagnols. Comme il n'existe pas de méthode alternative pour produire des parasites, il est nécessaire d'utiliser le modèle souris, pour obtenir du matériel parasitaire larvaire utilisable pour le développement des outils diagnostiques et pour l’infestation des hôtes définitifs en captivité. Notre expérience a montré que le stade de développement n'avait pas d'influence sur la sensibilité du parasite et le développement de la forme larvaire. Les animaux seront commandés au stade adulte et au poids de 30-35 gr.

Un assemblage de biomatériaux est implanté chirurgicalement chez 54 rats sous anesthésie générale, et la moitié d'entre eux reçoit ensuite six séances d'irradiation réparties sur trois semaines. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et le porteur y attend des douleurs postopératoires, une dermatite radio-induite, des difficultés d'alimentation, de l'anxiété et de l'agressivité. Le texte annonce 54 animaux puis décrit la moitié du groupe comme "25 rats", écart que rien ne vient expliquer. Trois mois après la dernière intervention, tous sont tués et le dispositif retiré, les analyses d'intégration ne se faisant pas sur animal vivant.

Objectifs

La présente demande couvre une partie d’un large projet multidisciplinaire qui vise à développer une solution innovante pour résoudre un problème clinique pour lequel les solutions actuelles ne sont pas optimales : la reconstruction osseuse immédiate et personnalisée pour les cancers de la tête et du cou, tout en limitant la morbidité. Nous souhaitons modifier le procédé chirurgical standard de reconstruction des os du visage - qui consiste actuellement à utiliser un fragment d’os du patient - en proposant un dispositif idéal, combinaison de 4 biomatériaux. Le succès de ce projet permettra donc d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le projet repose sur un consortium de 7 partenaires experts dans le domaine de la recherche clinique humaine et vétérinaire, du dispositif médical, et de la caractérisation des biomatériaux. Le dispositif médical mis au point sera constitué par un assemblage de 4 éléments distincts qui seront associés le jour de l’intervention. Plus particulièrement la partie du projet qui fait l’objet de cette présente demande d’autorisation a pour but d'évaluer l’efficacité de cet assemblage en termes de capacité à s’intégrer avec ou sans radiothérapie. La tenue du dispositif médical post-irradiation reste un challenge, compte tenu de l’impact de la radiothérapie sur les tissus environnant. La biocompatibilité sera évaluée par analyse du tissu autour de l’implant dans les différentes conditions. Cet essai est nécessaire avant l’essai clinique de reconstruction osseuse faciale par la procédure mise au point sur des animaux de compagnie souffrant de cancers de la cavité orale dans le cadre d’une médecine « One Health », puis sur des patients atteints de cancers de la tête et du cou.

Bénéfices attendus

A moyen terme, le projet permettra d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et aux animaux de compagnie ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le dispositif médical mis au point dans le cadre du projet pourra également bénéficier aux animaux de compagnie, pour lesquels il n’existe actuellement pas de solution de reconstruction des os de la face. Plus particulièrement, cette étude de chez le rat irradié est cruciale puisqu’elle permettra de donner les premières preuves de faisabilité d’utilisation du dispositif médical suite à une radiothérapie avant de passer à des essais cliniques sur des animaux de compagnie souffrant de cancer de la tête et du cou.

Procédures

Les 54 rats vont subir 1 chirurgie d’implantation du dispositif sous anesthésie générale d’environ 30 minutes. La moitié des animaux (25 rats) sera ensuite irradiée 2 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 6 séances d’une heure maximum par animal à chaque fois), 4 semaines après l’implantation. 3 mois après la chirurgie (groupe contrôle),ou 3 mois après la dernière séance d’irradiation (groupe expérimental) seront mis à mort et explantés pour analyse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience : 1. Douleurs post-opératoires qui seront prise en compte par une antalgie adaptée 2. Difficultés à l'alimentation 3. Infection du site opératoire 4. Mauvaise cicatrisation 5. Dermatite radio induite 6. Effets secondaires systémiques : tels que des effets sur le poids corporel, le métabolisme, ou d'autres paramètres physiologiques. 7. Problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés trois mois après la dernière intervention (implantation ou radiothérapie, selon le groupe). Les analyses qui seront faites pour vérifier l’intégration des DMs ne permettent pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Cette étude vise à évaluer l’intégration d’un nouveau dispositif médical (DM) dans un de tissu irradié (modèle de radiothérapie). Il n’existe à ce jour et à notre connaissance aucun modèle in vitro permettant une telle évaluation. Il est nécessaire de vérifier la tolérance du biomatériau dans une étude préalable à l’utilisation chez l’Homme

Réduction

Le projet s’inscrit dans la démarche One Health (une seule santé). En effet, il est prévu que le DM mis au point soit aussi testé chez des chats et chiens atteints de cancers oraux dans le cadre d’une étude clinique vétérinaire. Les données générées lors de cette étude permettent de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire tout en offrant une solution de reconstruction pour les animaux participant à cette étude clinique. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le protocole d’irradiation a été défini avec la société européenne d’oncologie vétérinaire .

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux,. Les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire, notamment en post-opératoire). Les animaux seront surveillés avec attention chaque jour (comportement, cicatrice) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. La douleur sera prise en charge dès que nécessaire. La taille des DM a été adaptée à la morphologie des animaux. Dans les jours suivants la chirurgie et les séances d’irradiation, une surveillance renforcée des animaux sera mise en place (Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.

Choix des espèces

Le rat est un modèle établi pour les tests de biocompatibilité.. De plus, comme nous cherchons à reproduire le protocole de soins, et en particulier la radiothérapie subit par les patients et les animaux de compagnie atteints de cancer de la tête et du cou. Le projet visant la mise au point d’un DM permettant la reconstruction faciale chez l’adulte, les procédures ne concerneront que des rats adultes.