Procédures modérées

Opérés une à deux heures pour l'implantation d'un émetteur télémétrique, maintenus en chaise de contention jusqu'à quatre heures pour les perfusions et hébergés seuls jusqu'à trente heures, 216 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les produits leur sont administrés par voie orale, intramusculaire, intraveineuse, intra-articulaire, vaginale, rectale, sous-rétinienne ou intravitréenne, à des doses supérieures ou égales aux doses thérapeutiques humaines. Le porteur écrit pourtant que les paramètres sont enregistrés "sans induire de stress aux animaux" et que les actes ajoutés par cette modification "n'induisent aucune nuisance ou effet indésirable supplémentaire". 120 de ces macaques sont déclarés réutilisés d'une étude à l'autre, et aucun ne peut être placé ni adopté du fait de l'émetteur implanté, le porteur indiquant qu'ils sont tués après avoir participé à plusieurs études.

Objectifs

Le but de ce projet est de décrire les études permettant d’identifier les propriétés pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments chez le primate non humain conscient. Ces études de pharmacologie de sécurité permettent d’enregistrer les paramètres cardio-respiratoires vitaux tels que l’électrocardiogramme, les paramètres respiratoires ainsi que la température et l’activité de l’animal par accéléromètre. Les animaux sont équipés d’émetteurs télémétriques implantés chirurgicalement (télémétrie interne) ou d’un gilet (télémétrie externe) permettant de transmettre en continu les signaux de respiration, de température et d’électrocardiogramme (ECG). En télémétrie interne ou externe, les paramètres sont enregistrés en continu sans induire de stress aux animaux. Les fonctions cardiaque, respiratoire et du système nerveux central sont ensuite évaluées après une ou plusieurs administrations d’un candidat médicament. Le présent projet comprend trois procédures de pharmacologie de sécurité chez le primate non humain (singe cynomolgus) conscient (procédures 1, 2 et 4) et une procédure de chirurgie (procédure 3). 1/ Evaluation du système cardio-respiratoire par télémétrie interne (avec implantation d’un émetteur de télémétrie), 2/ Evaluation du système cardio-respiratoire par télémétrie externe (avec ou sans implantation d’un émetteur de télémétrie pour la pression artérielle), 3/ Implantation chirurgicale des émetteurs de télémétrie : Implants de télémétrie pour utilisation en procédure 1 et implants de mesure de pression artérielle pour utilisation en procédure 2 ; l’utilisation du site de l'artère iliaque pour la pose du cathéter de pression artérielle nécessite une modification du projet initial sans d’ajout d’animaux. 4/ Evaluation du système nerveux central par batterie de tests fonctionnels.

Bénéfices attendus

Le projet, réalisé dans un cadre réglementaire, a comme objectif d’évaluer les effets pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments chez le primate non humain. Conformément aux lignes directrices éditées par l’International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH), l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament chez un non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de pouvoir démarrer les essais cliniques chez l'Homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale d’une durée de 1 à 2 heures environ, pour implantation d’émetteurs de télémétrie servant à mesurer des paramètres cardiorespiratoires et/ou la pression artérielle. Dans un second temps, les paramètres cardiovasculaires sont mesurés par télémétrie (non invasif) sur les animaux, ce qui peut nécessiter un hébergement individuel qui ne dépasse pas 30 heures ou le port d’un gilet de télémétrie. Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, intra-articulaire, vaginale, rectale, sous-rétinienne ou intravitréenne), le plus souvent en dose unique, pour évaluer un potentiel effet pharmacodynamique indésirable d’un candidat médicament. Des prélèvements sanguins sont également possibles pour l’évaluation de l’exposition au produit et/ou bilan hémato-biochimique, et réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Une contention en chaise (maximum 4 heures pour des perfusions IV, avec habituation préalable) ou dans les bras (quelques minutes au maximum) est nécessaire pour les administrations et/ou les prélèvements. (Modification) Les actes ajoutés n’induisent aucune nuisance ou effet indésirable supplémentaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont rares et correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré [ex : action au niveau du système nerveux central, du système cardio-respiratoire (variation de fréquence cardiaque ou respiratoire ou du niveau de pression artérielle)] ou à des effets systémiques (ex : perte de poids, baisse de consommation alimentaire). Ces effets sont très rares en pratique compte tenu des faibles doses utilisées dans le cadre de ces études de pharmacologie de sécurité et qui sont le plus souvent déterminées en fonction des résultats des études de toxicologie réalisées auparavant. D’autres effets indésirables peuvent être associés aux procédures (contraintes liées au port du gilet de télémétrie, à l’implantation chirurgicale des émetteurs de télémétrie et à la contention lors des manipulations, prélèvements sanguins dans le but de vérifier l’exposition au candidat médicament, évaluation pharmacocinétique ou autres biomarqueurs sanguins). (Modification) Les actes ajoutés n’induisent aucune nuisance ou effet indésirable supplémentaire.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les animaux reçoivent des doses pharmacologiques supérieures ou égales aux doses thérapeutiques humaines et sont par conséquent, le plus souvent réutilisés. Ces animaux dont la majorité portent un émetteur de télémétrie ne peuvent pas être replacés ou adoptés. Après avoir participé à plusieurs études et en fonction des produits administrés et de leurs potentiel effet pharmacologique, les animaux sont sacrifiés suivant les procédures éthiques en vigueurs.

Remplacement

L'évaluation des effets pharmacodynamiques indésirables d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'Homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Les interactions entre les différentes fonctions physiologiques et composantes de l’organisme qui participent aux réponses pharmacodynamiques d’un candidat médicament, ne peuvent pas être identifiées aujourd’hui par des procédures in vitro de types cellules ou organes isolés. Le choix du primate non-humain par rapport aux autres espèces non-rongeurs est justifié par la nature du candidat médicament (biologiques) et de l’homologie des voies métaboliques et relations pharmacodynamiques/pharmacocinétiques chez l’homme par rapport au primate non-humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est déterminé par la réglementation cadrant les études de pharmacologie de sécurité et est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude. La méthode d’investigation en pharmacologie de sécurité implique le plus souvent un traitement croisé (cross-over design), permettant l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux (de 4 à 8 animaux par étude – le plus souvent d’un seul sexe), sans impacter la fiabilité des données, les résultats et les objectifs de l’étude. Dans le cas d’un candidat médicament du type biologique nécessitant un protocole d’étude en groupes parallèles avec un groupe véhicule et deux doses de produit (n=4 animaux par dose ou groupe et n=12 au total), le nombre total d’animaux peut être réduit à 8 au lieu de 12, en ré-utilisant le groupe véhicule pour évaluer une des doses du candidat médicament. Par ailleurs, l’analyse continue des données de télémétrie améliore considérablement la qualité et la fiabilité des données enregistrées avec un nombre réduit d’animaux. Pour éviter d’inclure systématiquement l’évaluation d’un produit de référence positif dans chaque étude portant sur les effets de candidat médicament sur le système cardiovasculaire et en accord avec les nouvelles recommandations ICH, les résultats des effets d’un produit de référence positif, évalué en cross-over à trois doses et un véhicule, peuvent être utilisés pour plusieurs études, et réévalués séparément à un intervalle régulier de 3 et 6 années.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteurs, …) sont fournis aux animaux, leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex. : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). Les animaux sont habitués aux contraintes expérimentales telles que le port du gilet et la contention en chaise. En cas d’administration par perfusion intraveineuse, des friandises peuvent être proposées pendant la perfusion. Après les chirurgies pour implantation des émetteurs, les animaux sont suivis quotidiennement en période post-opératoire (suivi de la fréquence cardiaque, de la température corporelle sur 10 jours, voire plus si l’état de l’animal l’exige) et des actions post-chirurgie sont mises en place pour permettre une bonne récupération rapide de la chirurgie (distribution de rations additionnelles de fruits et de légumes pour favoriser la prise alimentaire et éviter la perte de poids, regroupement des animaux dès leur réveil complet pour permettre les interactions physiques entre congénères et favoriser le retour au comportement physiologique, dont la consommation alimentaire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se feront sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe social et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

L’utilisation des non-rongeurs est une exigence réglementaire. Le choix du primate non humain est justifié par : - les homologies avec l'Homme, - la disponibilité d'études de toxicologie réglementaire dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique/pharmacodynamie. Le primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques de composés biologiques (ex : vaccins thérapeutiques anti-Alzheimer). Le choix de l’espèce de primate non humain (singe cynomolgus) est le plus souvent déterminé par des études in vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’Homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’Homme. La pharmacocinétique du candidat médicament et les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique sont prises en compte. Les animaux intégrés dans ces études sont des animaux adultes ou jeunes adultes. L’âge minimal est d’au moins 24 mois. Pour les études de pharmacologie de sécurité, les animaux peuvent être utilisés dans le cadre de plusieurs études, par conséquent l’âge des animaux peut être plus important. Des individus matures ou jeunes adultes sont utilisés pour que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec les composés et ainsi garantir une évaluation adéquate des paramètres ciblés.

Greffées sous la peau avec des cellules de cancer humain, pesées dix fois, injectées par voie intraveineuse de lymphocytes CAR-T, mesurées quinze fois au pied à coulisse sur cinq semaines et prélevées de sang à cinq reprises sous anesthésie, 1 500 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que la tumeur grossit sur le flanc et que des effets indésirables apparaissent en fin d'expérience, surtout dans les groupes témoins laissés sans traitement. L'objectif déclaré est de sélectionner le meilleur lymphocyte CAR-T anticancéreux en vue d'essais cliniques. Toutes sont tuées pour que leurs tumeurs et leurs tissus soient prélevés et analysés.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d'un nouveau traitement anti-O-Acétyl GD2 (OAcGD2) dans un modèle de souris greffées en sous cutanée avec des cellules de cancers humains ou PDX (Patient-Derived Xenograft, en bref des tumeurs de patient d'origine humaines.) Cette possibilité d’utiliser ce nouveau traitement plutôt que des anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients sans les contraintes des multiples injections. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester nos différentes constructions sur des modèles de tumeurs xénogéniques.

Bénéfices attendus

Le meilleur CAR-T thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles thérapies sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Implantation de la tumeur sur animal vigile : 1 injection, maximum 1 minute/ animal Injection intraveineuse CAR-T sur animal vigile (1 injection, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 24 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (5 prélèvements, 2 minutes maximum chacune + temps de mise en boîte de contention + prélèvement, soit 10 minutes au total). Mesure de la tumeur tous les 3/4 jours sur environ 5 semaines (15 mesures, maximum 1 minute / animal = 15 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liés à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration de la tumeur puis du traitements (injections sous-cutanées puis intraveineuse). Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation d’une tumeur sur le flanc de l’animal, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les CAR-T (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des CAR-T et de réaliser également des analyses complémentaires

Remplacement

Avant de réaliser ce projet, les CAR-T cells ont été caractérisés in vitro afin de vérifier que les cellules CAR-T ont bien été modifiées et qu'elles expriment le récepteur chimérique correct. De plus, un test fonctionnel permettant de visualiser en temps réel la destruction des cellules tumorales par les CAR-T a été également réalisé. Cependant, aujourd’hui il est impossible de reproduire les tissus tumoraux dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation et le développement du modèle par notre partenaire, nous a permis d’optimiser les injections, les prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris maximum par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application d'un anesthésique local sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence en immunologie. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe partenaire a déjà évalué des traitements de d’autres CAR-T et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 7 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 7 semaines avaient également été utilisées dans des traitements avec des anticorps.

Une injection dans la moelle épinière sous anesthésie générale, puis des injections systémiques sous sédation tous les deux jours pendant huit jours : 120 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'objectif déclaré est d'étudier le rôle des cellules gliales dans l'installation d'une hypersensibilité douloureuse, dans un modèle de migraine chronique. Le porteur attend explicitement le développement de cette hypersensibilité, et prévoit la mise à mort des rats perdant plus de 20 % de leur poids initial. Il annonce des tests de mesure de la douleur deux fois par semaine, qu'il décrit comme peu douloureux, sans préciser lesquels.

Objectifs

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades. L’objectif de ce projet va consister à étudier l’implication des cellules gliales dans un modèle de migraine chronique.

Bénéfices attendus

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques.

Procédures

Les expériences sont effectuées par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques de l'expérimentation animale. 1 groupe: 1 injection intra médullaire (1 par animal:20min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (2 fois par semaine) 1 groupe: 1 injection intra médullaire (1 par animal:20min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (2 fois par semaine) injection systémique sous sédation ( tous les 2 jours pendant 8j)

Impact sur les animaux

Nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Les mesures de sensibilité cutanée sont peu douloureuses, puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil, avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles, autre que le retrait moteur de la zone stimulée Les injections peuvent entraîner une légère inflammation de courte durée au niveau du site d'injection. Lors de l'injection, dans de rare cas, les animaux peuvent ne pas se réveiller suite à l'anesthésie. Très rarement, l'injection peut causer des traumatismes au niveau des vaisseaux sanguins. Ces procédures présentent des risques de stress physiologique chez les rats.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.

Réduction

Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 8 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la face en réponse à un pincement de la patte postérieure. Nous utiliserons un analgésique lors de la phase per opératoire et un anti inflammatoire en phase post opératoire. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire au niveau de la face, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Le poids est mesuré quotidiennement. La nourriture sera humidifiée pour faciliter son absorption. Si la perte de poids excède 20% du poids initial, les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique avec sédation préalable. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.

73 100 animaux non-humains vont être utilisés sur la durée du projet, 26 000 souris, 26 000 rats, 11 500 lapins, 4 800 cobayes et 4 800 hamsters dorés, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun reçoit des administrations par voie orale, intraveineuse, intra-artérielle, sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire ou intranasale, possiblement quotidiennes jusqu'à la mise à mort, avec des prélèvements répétés. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer des douleurs aux sites d'administration et de prélèvement, ainsi que celles liées à la toxicité éventuelle de la substance testée. Il s'agit d'une prestation pour l'industrie pharmaceutique et agroalimentaire, une centaine d'études par an, dont le bénéfice annoncé, améliorer la santé humaine, reste énoncé comme une finalité générale.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la pharmacocinétique, l'immunogénicité et la biodistribution de substances pour l’industrie pharmaceutique chez les rongeurs, de type rat, souris, hamster et cobaye et chez les lagomorphes de type lapin. La pharmacocinétique permet d'étudier le devenir d'une substance, contenue dans un médicament, dans l'organisme après son administration selon différentes voies d'administration. L’immunogénicité permet d’étudier une réponse immunitaire induite par les vaccins et les adjuvants. La biodistribution permet d’étudier le devenir d'un candidat médicament dans l'organisme par l'analyse de l'évolution de ses concentrations dans l'urine, les fèces et le/les organe(s) cibles au cours du temps. Le nombre d'étude par an est d'environ 29 études pour la pharmacocinétique, 36 études pour l'immunogénicité et 36 études pour la biodistribution. Le nombre d'études par espèces est le suivant : Pour les pharmacocinétiques : - Rats : 10 études/an - Souris : 10 études/an - Cobayes : 3 études/an - Hamsters : 3 études/an - Lapins : 3 études/an. Pour les biodistributions : - Rats : 10 études/an - Souris : 10 études/an - Cobayes : 3 études/an - Hamsters : 3 études/an - Lapins : 10 études/an. Pour l'immunogénicité : - Rats : 10 études/an - Souris : 10 études/an - Cobayes : 3 études/an - Hamsters : 3 études/an - Lapins : 10 études/an.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’évaluer les essais de pharmacologies ainsi que la reponse de l’organise face a des substances et dispositifs pharmaceutiques ou agro-alimentaires sur des modèles animaux. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances ou dispositifs sur l’Homme afin de proposer des vaccins, des traitements ou des produits agro-alimentaires. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.

Procédures

Les animaux sont utilisés dans le cadre d’études de pharmacocinétique, de biodistribution ou d’immunogénicité. Les animaux recevront des administrations par voie orale, intraveineuse, intra-artérielle, sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire, ou encore intra-nasale selon les besoins de l’étude. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. La durée de chaque traitement ne dépassera pas 10 minutes par animal. Les prélèvements durent 10 minutes maximum par animal. Le nombre maximum de prélèvements peut varier en fonction de l'étude mais ne peut dépasser les volumes et fréquences défini dans Diehl et al., A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes, J. Appl. Toxicol. 21, 145-23 (2001).

Impact sur les animaux

La procédure de pharmacocinétique peut provoquer des douleurs au niveau des sites d’administration et de prélèvements et du stress lié aux prélèvements répétés. La procédure de biodistribution et d’immunogénicité peut provoquer des douleurs diverses dues à la potentielle toxicité de la substance test. Ainsi que des douleurs liées aux prélèvements répétés pouvant se dérouler en cours d’étude.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.

Remplacement

Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique et des essais réglementaires, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les procédures décrites dans ce projet permettent d’obtenir des informations relatives au temps que passe la substance dans l’organisme pour la pharmacocinétique. La biodistribution permet d’obtenir des informations sur le déplacement de la substance dans l’organisme. Et l’immunogénicité perme d’assurer le potentiel protecteur et l’innocuité des vaccins et adjuvants testés. Ces signes ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.

Réduction

Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel, comme décrit dans les procédures internes.

Raffinement

De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton ou encore des jouets sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration et en fonction de l’observation des animaux, si les points limites adaptés sont atteints, nous mettrons en place une analgésie adaptée. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) est mis en place en fonction des observations quotidiennes. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème au niveau du site d’administration) après chaque traitement peut être réalisée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.

Choix des espèces

Les rongeurs et les lagomorphes sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.

Deux injections intrapéritonéales par semaine pendant 30 à 36 semaines, sur animal maintenu en contention, précèdent un acte chirurgical mené sous anesthésie profonde sans réveil. 192 souris d'un modèle de maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les tests de mémoire, de locomotion, d'anxiété et d'anhédonie, jusqu'à trois expositions à six tests différents, sont décrits comme n'engendrant "aucune nuisance chez l'animal", alors que le porteur attend par ailleurs un stress physique et une douleur liés aux injections répétées. Toutes sont mises à mort à la fin de l'étude et leurs cerveaux prélevés pour des analyses post-mortem.

Objectifs

Plusieurs données de la littérature indiquent que l’inhibition d’une enzyme cérébrale, appelée phosphodiestérase, pourrait s’avérer être une stratégie intéressante pour traiter les troubles de la mémoire induits par la maladie d’Alzheimer. En parallèle, il a également été montré que l’activation de certains récepteurs cérébraux de la sérotonine engendrait des effets bénéfiques sur la mémoire chez l’animal. Notre hypothèse de recherche est que l’activation de ces récepteurs, conjuguée à l’inhibition des phosphodiestérases, exercerait des effets bénéfiques puissants sur la mémoire. Notre étude vise à démontrer, chez l’animal, la preuve de l’intérêt de cette association. Cette étude sera réalisée sur un modèle animal mimant la pathologie cérébrale et les troubles de la mémoire caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de valider la preuve de concept de l’intérêt d’une association de deux agents pharmacologiques pour lutter contre les troubles de la mémoire chez la souris et permettra d’identifier les mécanismes cérébraux sous-jacents.

Procédures

Toutes les souris du projet seront exposées à : - 1 injection 2 fois par semaine pendant 36 semaines (Cohorte 1) ou 30 semaines (Cohorte 2) d’agents pharmacologiques. Cette injection (voie intra-péritonéale) nécessite une contention de l’animal et prendra environ une minute par souris. - Au maximum 3 expositions à 6 tests comportementaux d’une durée maximale de 10 minutes par exposition, selon le test utilisé. Les tests comportementaux choisis n’engendrent aucune nuisance chez l’animal. Ces tests ont pour but de tester la mémoire de reconnaissance, la mémoire de travail, la mémoire spatiale, les performances locomotrices, l’anxiété et l’anhédonie des animaux suite au traitement. Enfin, l’ensemble des souris du projet seront exposées à un acte chirurgical sans réveil, mené sous analgésie et anesthésie profonde, d’une durée inférieure à 5 minutes.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux vont être exposés à des administrations par voie intra-péritonéale nécessitant une contention (nuisance modérée). Un stress physique et une douleur dus aux injections sont attendus lors de ces manipulations. Les animaux seron exposés à un acte chirurgical mené sous anesthésie et analgésie profondes (acte sans réveil).

Devenir

A l’issue de ce projet, les 192 souris seront mises à mort. Les cerveaux de tous ces animaux seront prélevés afin de réaliser des études post-mortem complémentaires.

Remplacement

Ce projet vise à favoriser le développement de nouveaux médicaments susceptibles d’avoir un intérêt dans le cadre de la prévention et/ou le traitement de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer. Or la recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive (ici des tests évaluant différents types de mémoire). Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé.

Réduction

Un total de 192 souris sera nécessaire pour cette étude. En faveur d’une réduction du nombre d’animaux utilisé, nous avons choisi d’utiliser à la fois des souris femelles et des souris mâles. En utilisant des mâles et des femelles issus des mêmes portées, nous éviterons une production excessive d’animaux. Cela permettra de limiter le nombre d’animaux excédentaires issus de l’élevage, qui, sans cette stratégie, seraient mis à mort sans avoir été utilisés. Nous avons également choisi de réaliser successivement les études comportementales d’une seule étude sur les mêmes souris et de poursuivre ces études comportementales par des mesures post-mortem.

Raffinement

Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place sous la forme de manipulation (handling) dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Ils seront surveillés quotidiennement et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Le site d’administration (droite ou gauche) pour les injections intra-péritonéales sera utilisé en alternance. Afin de réduire la douleur liée aux administrations chroniques, nous avons choisi de réaliser le traitement deux fois par semaine. Des points limites précoces et compatibles avec les objectifs scientifiques de notre recherche a ont été choisis. Pour la procédure chirurgicale sans réveil, les animaux seront analgésiés et anesthésiés profondément pour éviter toute douleur durant cette procédure.

Choix des espèces

Les souris font partie des espèces animales les plus exploitées en recherche biomédicale du fait de leur facilité de reproduction et de la similarité du système nerveux central qu’elles présentent avec l’Homme. Leur comportement est bien décrit et il est possible d’en mesurer les modifications. Les modèles murins possèdent une bonne faculté d’apprentissage justifiant leur utilisation dans l’étude de la mémoire. Des souris adultes (minimum 8 semaines d’âge) seront utilisées dans ce projet, un âge auquel les grandes fonctions physiologiques sont arrivées à maturité.

Une ablation partielle du quadriceps, une injection de toxine qui détruit les fibres musculaires, des électrostimulations sous anesthésie pendant 45 minutes : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur reconnaît que l'ablation du quadriceps et la mesure de force in situ sont sources de douleur, et note que la mobilité revient deux heures après la chirurgie. L'objectif déclaré est de mettre au point des greffes de cellules souches musculaires pour réparer des pertes de muscle massives, l'expérimentation sur les souris servant à valider des données obtenues sur cellules humaines. Le choix de l'espèce, tel qu'il l'expose, tient à la disponibilité de lignées immunodéprimées et à une gestation courte, compatible avec la durée des expériences.

Objectifs

Le muscle squelettique adulte contient des cellules souches appelées Cellules Satellites (CS), qui lui permettent de se réparer après une blessure. Cependant, dans certaines conditions pathologiques (maladies musculaires) ou post-traumatiques (accidents, chirurgie), cette capacité de réparation est altérée, et le muscle ne peut plus fonctionner normalement. Nous utilisons les CS pour développer des traitements pour aider le muscle à se réparer après une lésion traumatique. Nos travaux s’articulent selon 3 projets de recherche : 1) L’optimisation des méthodes de purification des CS : nous améliorons les méthodes de purification des CS humaines pour augmenter la quantité de cellules obtenues et leur qualité pour la clinique, mais également des CS de souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche (Réduction). 2) Le développement de méthodes permettant de produire un nombre élevé de CS humaines in vitro tout en préservant leur pouvoir réparateur (capacité à réparer un muscle endommagé et à reconstituer un pool de CS appelé auto-renouvellement). 3) Le développement de stratégies de médecine régénérative pour réparer les lésions musculaires massives post-opératoires ou post-traumatiques, pour lesquelles il n’existe pas de traitement à ce jour. Nous étudions le potentiel thérapeutique de nouveaux matériaux associés à différentes sources de cellules ayant un pouvoir de réparation du muscle (les CS et les cellules souches pluripotentes induites [iPSC] humaines).

Bénéfices attendus

Projet 1 : Court terme : Améliorer le rendement de purification des CS de rongeurs permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés la recherche pré-clinique sur les CS. Long terme : Améliorer le rendement de purification des CS humaines permettra de franchir une étape vers leur utilisation clinique en thérapie cellulaire. Projet 2 : Court terme : Nos expériences permettront de mieux comprendre la façon dont les CS humaines fonctionnent et ainsi d’élaborer une méthode pour préserver leurs pouvoir réparateur in vitro. Long terme : Préserver le pouvoir réparateur des CS humaines permettra d’élaborer des traitements pour les lésions musculaires localisées (ex : l’insuffisance urinaire et certaines pathologies musculaires). Projet 3 : Court terme : Notre projet permettra de mieux comprendre les évènements intervenant lors d’une lésion massive des muscles (ou VML), et de développer des approches de médecine régénérative pour remplacer le muscle lésé. Long terme : Nos approches de médecine régénérative conduiront vers le développement clinique de stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de lésions musculaires massives.

Procédures

4 injections intrapéritonéales (IP) sur animal vigile : 2 min (1 fois/jour) ; 1 injection intramusculaire (IM) sous anesthésie générale : 10 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesure force musculaire : 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie et électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesures extension du genou sous électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min (3 fois/souris).

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales peuvent générer un inconfort passager pendant l’injection. Aucune perte de mobilité n’a été constatée. L’injection intramusculaire d’une toxine induisant une destruction des fibres musculaires est source de douleur. Les animaux retrouvent leur mobilité 10 à 15 min maximum après l’injection. L’ablation partielle du quadriceps est source de douleur pour l’animal. Les animaux retrouvent leur mobilité totale 2h après la chirurgie. La mesure de force musculaire in situ est source de douleur. Les électro-stimulations réalisées sur les muscles d’animaux anesthésiés sont de faible intensité mais peuvent être source d’inconfort. Aucune perte de mobilité n’est constatée. Pour toutes les procédures, des points limites adaptés ont été déterminés et seront appliqués.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures.

Remplacement

Pour l’ensemble de nos projets, les expériences seront réalisées en priorité sur des CS humaines quand cela sera possible. L’expérimentation sur les animaux ne sera utilisée que pour valider nos données in vitro et in silico (Evaluation du potentiel de greffes des hCS préamplifiées in vitro), ou lorsque les processus biologiques doivent être étudiés au niveau de l'organisme entier (Approches d’ingénierie tissulaire pour la réparation des lésions VML). Ces projets pré-cliniques ont un fort potentiel translationnel pour le traitement des lésions musculaires focales et des lésions musculaires massives (VML), et doivent donc être validés in vivo sur l’animal avant d'envisager un transfert vers la clinique.

Réduction

Afin de respecter le principe de Réduction dans nos projets, nous avons calculé le nombre d’animaux minimum (strictement nécessaire) par des analyses statistiques (test de puissance). Pour les différents axes, le nombre d’animaux a été calculé indépendamment, en tenant compte des résultats déjà obtenus, de la variabilité inhérente aux différentes procédures expérimentales, et des résultats déjà disponibles dans la littérature scientifique. De plus, toutes les expériences seront conçues et programmées de manière à recueillir le maximum de données par animal. Par exemple, un même muscle sera utilisé pour la mesure de force et plusieurs autres analyses.

Raffinement

Le concepteur et l’applicateur du protocole prendront les dispositions appropriées pour éviter toute souffrance, douleur, angoisse ou inconfort aux animaux. Les expérimentations seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté. Le milieu sera enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, abris en carton, carré de coton compacté et billes de bois. Les protocoles d’analgésie pré- et post-opératoires seront adaptés en fonction de la procédure expérimentale. Ils pourront également être adaptés pendant la réalisation des procédures de façon à limiter au maximum la douleur pouvant être ressentie par l’animal. Les procédures nécessitant l’anesthésie des animaux sont étudiées pour assurer une profondeur suffisante de l’anesthésie et pour limiter les difficultés de récupération pendant la phase de réveil des animaux. Pour prévenir tout risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur une plate-forme chauffante pendant l’intervention et la phase de réveil , et ne sont remis en stabulation qu’une fois actifs. Les animaux seront à nouveau contrôlés 2 heures après le réveil et de la nourriture humidifiée et de l’hydrogel seront placés dans la cage pour en faciliter l’accès, pendant les premières 24h suivant l’intervention, les potentiels signes de souffrance seront surveillés. Si l’un des point limites énumérés dans le projet était atteint, l’animal concerné serait immédiatement mis à mort (directive européenne 63/UE/2010).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour 2 principales raisons : (1) La disponibilité des modèles transgéniques reporteurs et immunodéprimés nécessaires à nos expériences de greffe, (2) La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Les expériences de greffe et de réparation post-lésionnelle ne peuvent être réalisées que sur des souris adultes en raison de la taille des souris. De plus, le processus d’auto-renouvellement des cellules souches (retour à l’état quiescent) ne peut être étudié que sur le muscle adulte.

Vérifier que les solvants fournis par des clients ne font pas souffrir les animaux avant de lancer les études payantes : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin du protocole. Chacune reçoit jusqu'à deux administrations par jour pendant quatorze jours, dans le péritoine, sous la peau, dans une veine ou par gavage. Le porteur indique que ces injections répétées peuvent réduire la mobilité, courber le dos, faire plisser les yeux, et provoquer irritation locale, inflammation du péritoine, douleur musculaire ou diarrhées. L'amendement au projet ajoute 120 animaux pour tester aussi la molécule elle-même, et le porteur range l'ensemble sous les principes de raffinement et de réduction.

Objectifs

Dans le cadre de l'amélioration continue de nos méthodes de travail, notre objectif est de valider les produits utilisés pour diluer les molécules d'intérêt fournies par nos clients, lorsque ces véhicules n'ont pas encore été testés au préalable. Cette validation est cruciale lors de l'arrivée de nouveaux projets afin de garantir que le produit choisi n'entraîne pas de douleur aiguë ou chronique chez les animaux. L'objectif principal de cette étude est de confirmer les produits injectés aux animaux sont innofensifs. En assurant l'absence de douleur ou de détresse liée à l'administration du produit, nous serons en mesure de procéder aux études de traitement répétées en toute confiance, sans compromettre le bien-être animal et en garantissant l'exactitude des résultats expérimentaux, s'incluant dans le principe de raffinement. Cela nous permet également d'éviter de lancer des accouplements et de créer des cohortes avant d'être entièrement sûrs du protocole de l'étude, s'incluant dans le principe de réduction.Nous avons estimé, sur la base des projets réalisés à l'institut au cours des deux dernières années, que cette étude préliminaire pourrait être nécessaire au maximum six fois par an, en fonction des nouveaux projets nécessitant l'utilisation de produits non encore testés. Amendement 1 : Afin d’assurer une évaluation complète des conditions d’administration, cette étude inclura non seulement la validation des véhicules utilisés pour diluer les molécules d’intérêt, mais aussi l’injection de la molécule elle-même lorsque cela est pertinent (par exemple lorsque seul une concentration inferieur à déjà été testé in vivo, ou lorsque la molécule seule pourrait avoir un risque de toxicite) nécessitant une modification du projet initial avec ajout de 120 animaux. Cette approche permettra de vérifier l’innocuité de l’ensemble de la formulation administrée, garantissant ainsi que ni le véhicule ni la molécule d’intérêt n’entraînent de douleur aiguë ou chronique chez les animaux, tout en maintenant la rigueur scientifique et le bien-être animal.

Bénéfices attendus

- Évaluation de la sécurité du produit : Assurer que l'administration du produit ne provoque ni douleur aiguë ni douleur chronique chez les animaux. Cela est crucial pour garantir que nos essais ne compromettent pas le bien-être animal. - Fiabilité des études : En validant la non toxicité du produit, nous serons en mesure de mener des études de traitement répété en toute confiance, ce qui nous permettra de fournir des résultats fiables et précis sur les effets des molécules testées.

Procédures

Chaque animal sera soumis à 1 administration d'un produit contrôle au maximum 2 fois par jour pendant 14 jours par voie intrapéritonéale, sous cutanéee, intraveineuse ou par gavage. Ces gestes durent environ 1 minute et n'affectent pas le bien-être des animaux plus d'une heure.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des injections répétés pouvant conduire de manière aigue à une diminution de la mobilité de l'animal ou a des anomalies posturales (dos vouté, yeux plissés). En chronique les injections peuvent induire une irritation locale ( injection sous-cutanée), une inflammation du péritoine (injection intra-péritonéale), une douleur musculaire (injection intramusculaire) ou des diahrées (gavage oral).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole et les organes seront collectés si un effet négatif du traitement est visualisé.

Remplacement

Tester le produit à injecter avant la réalisation de l'étude expérimentale est une étape essentielle qui contribue à la sécurité, à l'efficacité et à la rigueur scientifique de la recherche. Cette phase permet de garantir que les résultats obtenus sont fiables et que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile, répondant ainsi aux exigences éthiques et scientifiques des études expérimentales. Ceci va permettre d'identifier des potentielles réactions indésirables de l'injection ou du composé en lui même mais egalement d'optimiser sa formulation ci necessaire

Réduction

Une étude pilote de 8 animaux sera réalisée pour les études necessitant une administration répétée d'un composé lorsque le client ne l'aura jamais testé par lui même aupréalable (exemple: véhicule repris de la littérature). Tester le véhicule en amont permet d'anticiper et de corriger d'éventuels problèmes avant qu'ils n'affectent l'étude principale, évitant ainsi des répétitioins d'une étude et donc l'utilisation de plus d'animaux. Cela nous permettra également d'éviter de lancer des accouplements et de créer des cohortes avant d'être entièrement sûrs du protocole de l'étude. Suite à nos retours sur les projets précédents et en concordance avec les études statistiques nous avons opté pour 8 animaux par groupe. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 8 animaux constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Amendement 1 : Cette étude inclura non seulement la validation des véhicules utilisés pour diluer les molécules d’intérêt, mais aussi l’injection de la molécule elle-même lorsque cela est pertinent.

Raffinement

La phase de test du produit contribue au raffinement des méthodes expérimentales en minimisant la douleur et la détresse, et en maximisant la qualité des données obtenues. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation ainsi que le poids chaque jour pendant les 14 jours de la procédure. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est un mammifère permettant une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux pourront être utilisés à partir de l'âge de 1 mois jusqu'à 1 an, en fonction des exigences spécifiques de l'étude principale. Cette flexibilité d'âge nous permet d'adapter les animaux au modèle expérimental en phase avec les problématiques physiologiques pertinentes pour chaque étude.

Jusqu'à seize anesthésies générales d'une heure trente par animal sur six mois, et jusqu'à huit injections d'agent de contraste : 576 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever des tissus. Le syndrome de Takotsubo leur est provoqué par une injection d'hormone de stress dans le péritoine, qui déclenche selon le porteur un stress important pendant environ une heure et peut évoluer vers une insuffisance cardiaque, une perte de poids et un affaiblissement. L'imagerie doit servir à évaluer un médicament candidat contre cette atteinte cardiaque, faute de traitement validé chez les patients. Le rat Wistar a été retenu parce que les appareils d'imagerie sont adaptés à sa taille et pour comparer les résultats aux études de scintigraphie déjà publiées.

Objectifs

Le syndrome de Takotsubo est une pathologie cardiaque causée par un stress physique ou émotionnel, qui déforme temporairement le ventricule gauche. Bien que les symptômes ressemblent à ceux des infarctus du myocarde, il n'y a pas d'obstruction des artères du coeur, et les signes cliniques sont réversibles. À long terme, cependant, ce syndrome évolue vers de l'insuffisance cardiaque et présente un taux de mortalité comparable à celui d'un infarctus. Les mécanismes et traitements de cette pathologie sont encore mal connus, et il n'existe pas de consensus sur le traitement thérapeutique. Cette étude vise à évaluer à l'aide de techniques d'imagerie médicale non invasives les effets d'un nouveau médicament pour traiter le Takotsubo dans un modèle de rat.

Bénéfices attendus

À l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement spécifique validé pour le syndrome de Takotsubo, mis à part les soins de support, malgré une mortalité non négligeable. La recherche de nouvelles options thérapeutiques pourrait combler cette lacune, offrir des solutions plus ciblées, et améliorer la qualité de vie des patients souffrant des suites de ce syndrome.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale sous anesthésie (

Impact sur les animaux

Tous les rats de cette étude seront soumis à une injection intrapéritonéale d'hormone de stress pour induire le modèle ce qui provoque une douleur faible de courte durée au point d'injection. L'hormone de stress provoque un stress important durant environ une heure. Par la suite, à plus long terme, une insuffisance cardiaque peut être induite et entrainer des effets indésirables comme par exemple une perte de poids et un affaiblissement de l’animal. Au cours des injections intraveineuses et intrapéritonéales, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation (nuisance courte et de faible intensité) et une douleur faible et de courte durée lors de l’injection. Un stress léger et de courte durée peut également être généré lors des examens d'imagerie, qui nécessitent manipulation et anesthésie.

Devenir

A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle alternatif pour évaluer des thérapies pour le syndrome de Takotsubo. Cette pathologie cardiaque liée au stress est un processus physiologique global faisant interagir différents organes et différents types cellulaires au sein des organes. De plus, les méthodes de diagnostique et suivi thérapeutique testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel d'aide à l'expérimentation animale, proposant un outil de calcul statistique. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisants pour aboutir à des conclusions statistiquement significatives. Le nombre d'animaux obtenu est cohérent avec nos expériences précédentes de protocoles d'imagerie lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) avec une surveillance accrue post induction du Takotsubo. La mise en place de points limites adaptés permettra d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection d’antalgiques dans la mesure du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, dans le cas d’atteinte de plusieurs points limites. Les méthodes d'imagerie que nous utiliserons dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à deux par cage, dans la limite réglementaire) avec un enrichissement du milieu.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est le rat qui est le modèle le plus utilisé pour les études de cardiomyopathies. Les intruments d’imagerie sont adaptées pour la taille des rats. De plus le modèle rat est le modèle le plus répandu pour étudier ce syndrome d’après la littérature. Le rat Wistar a été choisi pour la comparaison avec les études en scintigraphie de la littérature. Adultes de 12 semaines car c’est l’âge adulte auquel les animaux auront atteint la maturité, nous permettant ainsi de s’affranchir des problèmes liés à l’âge. De plus, cet âge est retrouvé dans la littérature, ce qui nous permettra de confronter nos résultats.

88 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pesée quinze ou seize fois, mesurée à cinq reprises dans un tube de contention de trois minutes et laissée quarante-huit heures seule en cage de mesure de la dépense énergétique. Elles reçoivent quinze semaines de régime gras et sucré, deux ou trois gavages, une injection d'insuline dans le péritoine, une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, des jeûnes de quatre à quinze heures et des prélèvements de sang répétés par une entaille d'un demi-millimètre au bout de la queue. La moitié de l'effectif est transportée vers un second établissement, y reste quarante-huit heures, jeûne quatre heures et meurt par dislocation cervicale sous anesthésie générale. Le bénéfice avancé se réduit à une hypothèse, le récepteur CD36 intestinal "pourrait constituer une cible thérapeutique" contre l'obésité.

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un apport énergétique et une inflammation élevés. CD36 est un récepteur présent notamment au niveau des membranes des cellules intestinales qui contrôle la formation des lipoprotéines synthétisées par l’intestin au cours de la digestion. Ces lipoprotéines véhiculent les lipides alimentaires mais aussi des molécules pro-inflammatoires issues du microbiote intestinal. Le premier objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal sur la régulation de la dépense énergétique de souris rendues obèses par un régime de type occidental (riche en graisses et en sucres). Nos précédents travaux de recherche laissent envisager que le CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies telles que l’obésité. Pour ce faire nous utiliserons des souris déficientes en CD36 spécifiquement au niveau des cellules intestinales comparées à des souris contrôles. 32 souris contrôles et 32 souris déficientes en CD36 seront nourries soit avec un régime standard, soit avec un régime occidental durant 15 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Le deuxième objectif de ce projet consiste à évaluer les conséquences d’une sur-activation de CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité. De précédents travaux ont permis de montrer que des leurres lipidiques, c’est-à-dire des molécules mimant les lipides mais n’apportant pas de calorie, diminuaient la consommation de lipides chez la souris obèse, en activant CD36 au niveau des papilles gustatives. Dans ce projet, nous étudierons à présent l’effet d’un leurre lipidique au niveau intestinal sur la mise en place de l’obésité induite par une régime occidental chez la souris. Pour cela, 24 souris contrôles seront nourries avec ce régime durant 8 semaines (temps nécessaire pour observer des effets dans ce cas). 12 souris recevront chaque jour le leurre lipidique en complément de leur alimentation et seront comparées à 12 souris recevant un placebo. Au total, 88 souris seront utilisées dans ce projet, qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le CD36 intestinal modifie-t-il la dépense énergétique en régimes standard et de type Western Diet (riche en acides gras saturés et en sucres) ? 2. Le CD36 intestinal modifie-t-il les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et la perméabilité intestinale lors d’un régime riche en acides gras saturés ? 3. La suractivation de CD36 intestinal par des leurres lipidiques affecte t-elle la mise en place de l’obésité ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaires.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire pour la procédure 1 (15 pesées sur 15 semaines de régime) et bi-hebdomadaire pour la procédure 2 (16 pesées sur 8 semaines de régime), ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par une technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 0, 2, 4 , 9 ou 10, et 15 pour la procédure 1(5 mesures par souris au cours du régime), et en semaines 0, 2, 4, et 8 (4 mesures par souris au cours du régime) Dans la procédure 1, 2 gavages seront réalisés : en S12 avec de l’huile et une molécule fluorescente en solution aqueuse, et en S14 avec une solution aqueuse contenant la molécule fluorescente. Dans la procédure 2, 3 gavages seront réalisés (durée de moins de 10 secondes à chaque fois) : en S5 avec du glucose, en S7 avec une solution aqueuse contenant une molécule fluorescente et en S8 avec de l’huile. Dans la procédure 2 uniquement, une injection intrapéritonale sera réalisée en S4 avec de l’insuline. L’injection intrapéritonéale est un geste rapide (moins de 10 secondes) et effectué par du personnel formé et habitué à le réaliser. Une injection intraveineuse au sinus retro-orbital sous anesthésie générale sera réalisée avec une molécule bloquant temporairement l’action d’une enzyme (en S14 dans la procédure 1 et en S8 dans la procédure 2). Cette injection rapide (moins de 10 secondes) est effectuée sous anesthésie par du personnel formé. Des prélèvements sanguins au niveau caudal par simple pression après une légère incision du bout de la queue (0,5mm) et sous anesthésie locale seront également réalisés en semaines 11, 12, et 14 pour la procédure 1 et en semaines 5, 6, 7 et 8(environ 1min par souris par prélèvement). Dans la procédure 1, une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 9 ou 10. Cette mesure indolore et non invasive s’effectue dans des cages spécifiques. Elle nécessite 2 jours d’isolement dans cette cage. Dans la procédure 1, toutes les interventions se dérouleront dans l’EU1 jusqu’à la semaine 15. En semaine 16, la moitié de l’effectif (32 souris) sera transféré dans l’EU2 dans des boites de transports adaptées et y restera 48H. Les animaux seront alors soumis à un jeûne court de 4H avant mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale. La procédure 2 se déroulera exclusivement dans l’EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux en régime WD peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’est jamais observé après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris lors des mesures de dépense énergétique pendant 48h, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les tests de tolérance orale au glucose et à l’insuline, et l’étude de l’hypertriglycéridémie nécessitent des mises à jeun de 4 ou 15h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact. La mise à jeun nécessaire de 15h se fait sur la nuit lors de leur phase de nourriture nocturne et s’avère donc plus stressante pour les animaux qui auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Le test de tolérance orale au glucose et l’étude de l’hypertriglycéridémie nécessitent une préhension des animaux afin de les gaver ce qui peut être stressant pour les souris. Le test de tolérance à l’insuline nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale qui peut également être invasive. L’analyse de la composition corporelle nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène. L’injection de la molécule bloquant temporairement l’action d’une enzyme sera réalisée par voie intra-veineuse sous anesthésie à l’isoflurane par un personnel formé maitrisant ce geste.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, la moitié de l’effectif (32 souris) sera mis à mort dans l’EU1 sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem. L’autre moitié (32 souris) sera transféré dans l’EU2 puis mis à mort sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem. A l’issue de la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides.

Raffinement

Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale (application au bout de la queue pour les prélèvements sanguins à la queue), soit sous anesthésie générale (pour le prélèvement sanguin intracardiaque, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids, prise de poids pouvant gêner la locomotion). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet (mise à mort sous anesthésie générale). Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet. Le transport des animaux dans l’EU2 sera effectué au moyen de boites opaques spécifiquement prévues pour les rongeurs, dans lesquelles seront disposées de la nourriture et de l’eau gélifiée, ainsi qu’un enrichissement supplémentaire afin de limiter le stress lié au transport. De plus, les 2 EU étant très proches, le temps de transport sera très court (environ 15minutes).

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent bien, se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris non génétiquement modifiées. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.