Procédures modérées

Les souris de ce projet portent une mutation qui les rend profondément sourdes et leur donne un trouble vestibulaire : elles tournent en rond et présentent une activité motrice anormalement élevée. 956 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés. Sous anesthésie, elles reçoivent des électrodes sous la peau pour trente minutes d'enregistrement auditif, une incision fine pour l'injection d'un virus dans la cochlée, et une biopsie de quelques secondes. Le raffinement annoncé tient en trois mesures, anesthésie pour les tests auditifs, tatouage des phalanges et nourriture posée dans la litière, quand les bénéfices avancés s'ouvrent sur le milliard et demi de personnes touchées par un déficit auditif dans le monde.

Objectifs

Les cellules sensorielles auditives sont surmontées d’une touffe ciliaire constituée de stéréocils dans lesquels se produit la transmission du signal sonore. Le dysfonctionnement de cette transmission du signal sonore cause une perte auditive sévère. Certains composants responsables de cette transmission ont déjà été identifié. Toutefois, la régulation du fonctionnement de ces composants n’est toujours pas investie. Le projet porte sur une protéine qui fait partie de ce complexe. L’absence de cette protéine cause une surdité profonde d’origine congénitale et héréditaire. La protéine d’intérêt est très particulière dans sa fonction du fait qu’elle est la seule à interagir avec tous les composants de la machinerie de transmission du signal. Il a récemment été montré, que cette protéine pourrait subir une modification dont les conséquences restent encore inconnues. D’ailleurs, dans d'autres systèmes biologiques cette même modification pourrait jouer un rôle important dans la régulation des propriétés des complexes protéiques et dans leur transport au sein de la cellule. Les différents modèles de souris qui miment les mutations chez l’homme, reproduisent le phénotype humain et causent la surdité. Ainsi, nous envisageons par thérapie génique de restituer l’audition chez les souris mutantes pour la protéine d’intérêt. Également nous allons essayer de comprendre l'impact de cette modification sur son transport au sein de l'organisme et dans la régulation de son activité au sein du complexe de transmission du son. Nous souhaitons aussi identifier les protéines qui catalysent cette modification.

Bénéfices attendus

Les surdités sont un problème majeur de santé publique. On estime que 1,5 milliard de personnes dans le monde présentent des déficits auditifs et que ce chiffre devrait atteindre 2,5 milliards d'ici 2050. 1- Proposer une opportunité pour soigner une forme héréditaire de surdité par thérapie génique. 2- Comprendre le rôle d’une modification dans la régulation du complexe de transmission du son. 3- Déchiffrer le code protéique qui régule cette modification. Cette modification pourrait être une cible thérapeutique pour restaurer ou corriger une perte des seuils auditifs.

Procédures

Disposition d’élétrode en sous-cutanée sur animal anésthésié pour un enregistrement qui dure 30 minutes. Une incision cutanée très fine lors de l’injection au niveau de la cochlée sur animal anésthésié. Acte de Biopsie: geste qui dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les souris manifestent un trouble vestibulaire en plus de la surdité. Ils ont donc une activité motrice plus élevée que la normale. Les souris tournent en rond assez souvent. Afin d’injecter les virus, nous allons réaliser une incision très fine. Cette procédure peut provoquer une douleur légère malgré que les souriceaux soient endormis. Aussi, cette procédure et malgré la désinfection cutanée, pourrait causer une infection locale. Également, suite à l’acte de Biopsie, on pourrait avoir une infection locale. Les infections sont des risques rares aussi bien dans la pratique de la biopsie que l'incision lors de l'injection du virus.

Devenir

Pour effectuer le prélèvement des organes et réaliser les expériences, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Pour réaliser cette étude il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale car on ne sait pas mettre en culture les systèmes auditifs. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

- Les 2 oreilles de chaque souris seront utilisées systématiquement afin de ne pas doubler le nombre d’animaux. - Le sexe n’est pas pris en compte dans cette étude car il n’intervient pas jusqu’à preuve du contraire dans l’audition. Nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles dans notre étude.

Raffinement

Réduction de la douleur, souffrance & l’angoisse (raffinement) - Pour les tests auditifs, les animaux seront anesthésiés. - Les animaux seront marqués par tatouage au niveau des phalanges. - Les animaux présentent un trouble vestibulaire de ce fait on leur propose la nourriture dans leur litière.

Choix des espèces

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficit auditif chez la souris et l’architecture de la cochlée du rongeur est similaire à celle de l’homme ce qui permet d’étudier chez ces animaux le mécanisme de l’audition humaine. Pour restaurer l’audition de ces souris et comprendre l’impact des mutations étudiées, nous devons connaître la localisation exacte de la protéine d’intérêt dans son état sauvage et une fois mutée dans l’oreille interne à différents stades (embryonnaire, au cours du développement et adultes). Nous devons mesurer les courants produits par la transmission du son pour se rendre compte de la fonctionnalité des cellules de l’oreille interne.

Les deux nerfs optiques de 1 127 souris sont écrasés par pincement, trois minutes par œil, ce qui les rend aveugles. 2 975 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à trois injections dans le péritoine et deux injections d'un vecteur viral dans chaque œil par animal. Le porteur écrit n'observer aucune nuisance ni effet indésirable sur la capacité de ces souris aveugles à explorer leur environnement, à se nourrir, à boire ou à sociabiliser. Toutes sont tuées, 1 681 d'entre elles par une thoracotomie suivie d'une perfusion intracardiaque, pour analyser la repousse des axones dans la rétine, le nerf optique et le cerveau.

Objectifs

Chez les mammifères adultes, les neurones du système nerveux central (SNC) n’ont pas la capacité de repousser spontanément lorsqu’ils sont endommagés, ce qui conduit à des pertes irréversibles et permanentes des fonctions neuronales. Pour promouvoir la repousse des neurones du SNC, il est essentiel d’élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires de régénération. L’objectif global du projet est de comprendre comment les neurones du système nerveux central (SNC) peuvent être réparés après une lésion. Pour cela, nous nous concentrons sur les mécanismes cellulaires et moléculaires au sein des neurones eux-mêmes. Le projet étudiera comment les neurones régulent l'expression des gènes en réponse à une lésion, puis identifiera des facteurs-clefs de cette régulation nécessaires à la régénération. Enfin, nous chercherons des moyens de promouvoir la régénération des neurones en manipulant certains de ces facteurs-clefs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront d’identifier des mécanismes qui permettent à un neurone lésé de repousser et de se reconnecter après une lésion. Ils ouvriront des opportunités de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la réparation du système nerveux central. Ils permettront d'identifier de nouvelles cibles moléculaires pour déclencher la régénération des neurones de manière efficace et reproductible, et par la suite une reconnexion fonctionnelle. Ces résultats concerneront les patients atteints de maladies de l'œil (telles que le glaucome), mais aussi les patients ayant subi une lésion traumatique du cerveau ou de la moelle épinière (accident de la route, accident du sport, agression) et les patients atteints de maladies neurodégénératives (par exemple la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer qui affectent certains neurones dans le cerveau).

Procédures

Les souris recevront une injection intrapéritonéale d'anesthésiant et de myorelaxant, suivie d'une injection dans l'œil d'un vecteur viral. Cette procédure dure au maximum 1 min par œil. Une partie des souris recevra une lésion des nerfs optiques par pincement. Cette procédure dure 3 min par œil. Les souris subiront une thoracotomie dans le cadre de leur euthanasie par perfusion intra-cardiaque. Cette procédure dure 5 min et est réalisée une seule fois car elle conduit à la mort de l'animal. Nombre d’animaux concernés par l’injection intrapéritonéale : 2975, dont 1294 1 fois, 554 2 fois, 1127 3 fois. Nombre d’animaux concernés par l’injection intravitréale : 2975, dont 1848 1 fois chaque œil, et 1127 2 fois chaque œil. Nombre d’animaux concernés par la lésion du nerf optique : 1127, 1 fois chaque œil. Nombre d’animaux concernés par la perfusion intra-cardiaque : 1681.

Impact sur les animaux

L’injection par voie intrapéritonéale entraîne probablement un stress des animaux au moment de leur contention et de l’introduction de l’aiguille. Cependant, au regard de la durée extrêmement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits par l'introduction de l’aiguille sont très limités dans le temps. Les éventuelles douleurs ressenties pendant l'injection dans l'œil ou pendant l'incision de la membrane conjonctive sont prises en charge en pré- et post-opératoire par l'administration d'anesthésiant local et d'analgésique. La lésion des deux nerfs optiques entraîne la cécité des souris. Cependant, nous n’observons aucune nuisance ou aucun effet indésirable sur la capacité des souris à explorer leur environnement, à se nourrir, à s’abreuver ou à sociabiliser.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort soit pour prélèvement des tissus rétiniens et leur mise en culture ; soit pour analyse histologique de la régénération dans la rétine, le nerf optique et le cerveau.

Remplacement

L’étude de processus cellulaires et moléculaires complexes impliqués dans la régénération du SNC mammifére adulte nécessite l’utilisation d’animaux et ne nous permet pas de recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in vitro. En effet, à l'heure actuelle, il n'existe aucun modèle de culture de neurones de rétine adulte ni de système d’organoide qui pourrait être utilisé en remplacement du système visuel de la souris.

Réduction

La très grande reproducibilité du modèle expérimental permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans l'analyse de la régénération. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats scientifiques statistiquement valables nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Les procédures décrites sont maîtrisées depuis plusieurs années au sein de l’équipe par les expérimentateurs responsables du projet. Nos approches peu invasives et peu incapacitantes, ainsi que la parfaite maîtrise des procédures chirurgicales réduisent la variabilité et les pertes post-expérimentation. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permet de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement valables.

Raffinement

Dans l'équipe, les expérimentateurs maîtrisent parfaitement les chirurgies d'injection intravitréale et de lésion du nerf optique. La maîtrise des procédures ainsi que leur courte durée contribuent à limiter l’inconfort des souris. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes s'assurent quotidiennement du bien-être des animaux. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Les souris seront hébergées dans une zone dédiée aux périodes post-expérimentation. Des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des procédures. Une grille de score servira de repère pour vérifier l’état de l’animal pendant la période post-opératoire, permettant l'idenditification des critères d'arrêt des souffrances et la décision à prendre. Les stratégies d’optimisation ainsi qu'une médication adaptée en pré- et post-expérimentation sont mises en place dans le but de réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse chez les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont appropriées pour ce projet car le système visuel de la souris est similaire à celui de l’humain et permet d'étudier tous les aspects de la repousse axonale et de la reconnexion (aux niveaux moléculaire, cellulaire et des circuits). En tant qu'organisme mammifère, les souris partagent de nombreuses caractéristiques avec les humains, notamment l'échec de la régénération du SNC adulte. Dans le domaine de la régénération axonale, l'avantage d'utiliser des souris est de dépasser la compréhension in vitro des systèmes moléculaires et d'avoir une vue d'ensemble dans le cadre d'un organisme entier. Cela est crucial si nous voulons que les résultats soient éventuellement traduits en une approche thérapeutique pour les lésions du SNC adulte chez l'humain. Dans le projet, nous utiliserons des souris à l'âge adulte (au moins 4 semaines d'âge).

230 poulets de deux lignées de pondeuses vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sept jours après l'inoculation. Chacun reçoit par gavage soit le parasite Eimeria tenella, soit une suspension de microbiote prélevée sur une lignée résistante, et subit un prélèvement de duvet sous contention. La mise à mort sert à récupérer les parasites multipliés dans l'intestin et à caractériser la réponse immunitaire, l'enjeu affiché étant les pertes économiques que la coccidiose cause aux élevages. Le porteur écrit que la dose inoculée ne provoque ni morbidité ni signes proches du point limite, alors que le projet repose sur la comparaison de lésions intestinales plus ou moins sévères entre lignées.

Objectifs

La coccidiose aviaire conduit à de fortes pertes économiques. Cette maladie est causée par des parasites intestinaux. L’espèce la plus pathogène conduit à des lésions plus ou moins sévères au niveau caecal. Au laboratoire, nous avons mis en évidence l’importance de la présence du microbiote sur le développement du parasite. De plus, nous avons montré qu’à charge équivalente, la pathologie est plus sévère avec notamment des lésions caecales, une réponse inflammatoire et une perte d’intégrité intestinale plus fortes chez les animaux avec microbiote par rapport à des animaux sans microbiote. Ces données suggèrent que le microbiote joue un rôle dans la physiopathologie de l’infection. Suivant la génétique de l’animal, la sévérité de la pathologie est variable, certains poulets étant plus résistants à la pathologie liée à cette infection en comparaison à d’autres lignées. Chez la poule, les travaux actuels ont montré que la composition du microbiote peut être variable en termes de composition et abondances selon la lignée génétique, pour des animaux élevés dans les mêmes conditions. La composition du microbiote des poulets résistants n’a jamais été explorée. Nous émettons l’hypothèse que ces animaux pourraient présenter une composition en microbiote très différente des autres lignées élevées dans le même environnement, ceci pouvant être relié à la pression génétique de l’animal. Cette lignée résistante présente une génétique et des phénotypes très distincts de ceux des lignées de poule exploitées en production, et l’hypothèse que son microbiote intestinal diffère également est vraisemblable, dans la mesure où génétique et microbiote influent conjointement l’expression des phénotypes de l’hôte considéré comme holobionte. Les microbes présents dans cette lignée plus résistante, sous l’influence de sa génétique bien spécifique, pourraient jouer un rôle protecteur sur la physiopathologie de cette infection. Moduler le microbiote pourrait alors constituer un levier intéressant pour prévenir le développement de pathologies trop sévères associées à une morbidité et mortalité élevées.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que les animaux recevant le microbiote des Fayoumi résistent mieux à l’infection et présentent par conséquent moins de pertes zootechniques, moins de lésions, moins d’inflammation, moins développement parasitaire.

Procédures

Inoculation orale par gavage de l'inoculum ou suspension de microbiote par animal (1 fois et environ 5 min contention comprise). Prélèvement du duvet par poussin (1 fois et environ 2 min contention comprise).

Impact sur les animaux

L’administration orale est un acte désagréable pour l’animal et peut également engendrer du stress. La contention peut également engendrer un stress. Ces deux actes sont de courte durée (1-2 minutes maximum). L’infection peut créer des signes cliniques. Cependant, la dose inoculée ne cause pas de morbidité et n’induit pas de signes cliniques proche du point limite. Si toutefois, il y avait des effets indésirables, ce serait en fin d’expérimentation.

Devenir

Tous les poulets inoculés seront mis à mort 7 jours après l’inoculation pour récupérer les parasites qui se sont multipliés dans la lumière intestinale afin vérifier la protection du microbiote contre l'infection à E. tenella et la caractérisation de la réponse immunitaire induite.

Remplacement

L’étude de l’influence du microbiote sur la physiopathologie de l’infection par ce parasite nécessitent des expérimentations in vivo pour lesquelles des analyses des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, et du microbiote intestinal seront réalisées. De plus, le parasite ne fait pas un cycle complet in vitro.

Réduction

Les effectifs sont basés sur les études du laboratoire et de la littérature portant sur les scores lésionnels lors d’essais d’alternatives naturelles aux anticoccidiens et pour lesquelles il faut en moyenne 20 animaux / groupe avec trois groupes pour avoir une différence significative pour un test statistique non paramétrique. Ces effectifs sont suffisants pour les analyses microbiotes prévues.

Raffinement

Hébergement : Les animaux seront placés en groupe social sur une litière dans laquelle les poules pourront picorer. Les poulets disposeront d’un enrichissement social et comportemental. Dans les box, du bolduc sera suspendu pour permettre aux animaux de piquer dedans. Les animaux se perchant spontanément, des perchoirs seront installés. Ils constituent un enrichissement qui fait partie du comportement naturel. Limitation des nuisances sur le bien-être animal : Evaluation de l’état de santé des animaux deux fois par jour par le personnel de la plateforme expérimentale afin de surveiller l’apparition des premiers symptômes liés à la maladie : plumes ébouriffées, prostration. Si atteinte du point limite : euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient ces parasites. Deux lignées de poules pondeuses seront utilisés dans l’étude pour être dans les conditions les plus proches de celles des élevages industriels, et auront un statut sanitaire propre.

Prélevés un par un à l'épuisette dans leur bassin d'élevage, endormis, ouverts pour recevoir une marque acoustique dans la cavité abdominale, 110 jeunes esturgeons européens de moins d'un an subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération dure moins de cinq minutes sous anesthésie générale, l'animal couché sur le dos dans une gouttière humidifiée, avant cinq jours de récupération dans son bassin d'origine puis le lâcher dans l'un des deux fleuves étudiés. Tous sont gardés vivants et relâchés, les marques comportant un capteur qui signale l'ingestion du poisson par un prédateur. Le porteur retient 55 individus par fleuve en s'appuyant sur un taux de prédation qui pourrait atteindre 80 %, ce qui ne laisserait que douze juvéniles par fleuve pour décrire le comportement de dévalaison.

Objectifs

Il s’agit de renseigner la dynamique de dévalaison et le risque de prédation de juvéniles d’esturgeon européen dans le cadre du programme de repeuplement de l’espèce. Cette étude se déroulera dans 2 fleuves en parallèle et portera sur des juvéniles âgés de moins d’un an. Il s’agit de renseigner grâce à des suivis individuels par télémétrie la durée passée en eau douce, dans les zones sans et avec l’influence de la marée pour chaque fleuve et le moment de l’entrée dans l’estuaire salé. Les juvéniles seront équipés de marques acoustiques dotées d’un capteur spécifique permettant d’identifier l’ingestion par un prédateur afin de quantifier le risque de prédation au cours du trajet. Dans le cadre du programme de repeuplement, ces informations sont essentielles. Elles permettront de comparer les comportements et les risques entre les deux fleuves et d’adapter, si nécessaire, les stratégies de repeuplement. Le comportement de dévalaison pourra être comparé à des données acquises antérieurement avec des individus un peu plus grands et enrichis des informations sur la prédation. En effet, depuis ces quinze dernières années, les populations d’un prédateur potentiel, le silure glane, ont explosé dans les bassins versants concernés et plus largement en Europe de l’ouest, impactant plusieurs espèces ce qui pose la question de l’impact potentiel sur la survie des esturgeons relâchés. Par ailleurs, les juvéniles impliqués dans le projet actuel sont nés de parents nés en captivité alors que les études précédentes, datant de plus d’une dizaine d’années, avaient été menées avec des juvéniles nés en captivité mais issus de parents d’origine sauvage. Il est donc également possible que les comportements qu’ils développent en milieu naturel après lâcher soient influencés par leur origine.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances sur le comportement de dévalaison d’une espèce en danger critique d’extinction et faisant l’objet d’un programme de repeuplement. La comparaison des comportements entre les fleuves n’a jamais été réalisée et on peut s’attendre à des différences liées aux caractéristiques des habitats au sens large (physique et physico-chimique) et au peuplement biologique (présence de prédateurs). Cette expérience permettra d’apporter des éléments qualitatifs et quantitatifs sur la durée de séjour dans les fleuves, la localisation des juvéniles, leur rythme jour/nuit, le taux de juvéniles qui atteignent l’estuaire salé et le taux de prédation piscivore dans les différents secteurs des fleuves. En fonction des résultats les pratiques de repeuplement pourront ainsi être adaptées.

Procédures

Les poissons (110 au total) prélevés dans leur bassin d’élevage, à l’épuisette et individuellement, seront placés dans un bac d’anesthésie qui sera rapidement transféré vers la salle chirurgicale à proximité. Pour chaque juvénile, nous procèderons ensuite à l’implantation d’une marque acoustique dans la cavité abdominale. Cette opération chirurgicale, qui dure moins de 5 min, sera réalisée sous anesthésie générale. Après avoir placé l’animal anesthésié sur le dos dans une gouttière de contention, une sédation (anesthésie plus légère) sera maintenue ainsi que l’humidification du corps pendant toute la durée de la chirurgie. Le réveil de l’animal en eau claire sera surveillé avant qu’il ne soit remis dans son bassin d’élevage d’origine afin qu’il récupère dans un environnement connu durant 5 jours avant le lâcher en fleuve.

Impact sur les animaux

Les individus peuvent subir un stress dû à la manipulation : transfert du bassin d’élevage au bassin d’anesthésie. La procédure de marquage étant réalisée sous anesthésie en respectant les bonnes pratiques, nous nous attendons à un stress et une douleur limités. De même, pendant le transport et la phase d’acclimatation au site de lâcher, les individus peuvent subir un stress dû à un changement d’environnement.

Devenir

Les juvéniles marqués seront relâchés en milieu naturel, le but étant de caractériser leur comportement de dévalaison et le risque de prédation.

Remplacement

Aucun remplacement ne peut être envisagé car l’expérience porte sur l’espèce considérée. Ces lâchers expérimentaux avec suivis par télémétrie dans le milieu doivent permettre de renseigner précisément la dynamique de dévalaison et le risque potentiel de prédation de ces juvéniles dans le cadre du programme de repeuplement de l’espèce.

Réduction

Nous avons estimé le nombre nécessaire de juvéniles pour l’expérimentation à 55 par fleuve soit 110 au total. A ce jour, aucune étude de ce type n’a été réalisée pour étudier le taux de prédation de juvéniles d’esturgeons dans le cadre de leur dévalaison. Si on se base sur des taux de prédation évalués dans le même bassin versant pour une autre espèce en phase de montaison (aucune étude sur des juvéniles en dévalaison) au printemps (lamproie marine), les taux de prédation étaient très élevés et estimés à 80%. Le taux de prédation correspond à un résultat mais il est d’important également d’avoir des informations sur le comportement de dévalaison de juvéniles non prédatés. Si on observe un taux de prédation aussi élevé, il resterait 12 juvéniles par fleuve pour étudier le comportement de dévalaison. C’est relativement peu mais cela permettra de savoir si les comportements sont similaires ou très variables. Une étude précédente dans un fleuve a permis de renseigner le comportement de dévalaion de juvéniles d’esturgeons européens plus grands (180g et 30cm en moyenne) que ceux ciblés par la présente étude. Environ 75% des juvéniles avaient atteint l’estuaire salé ce qui nous semblait un résultat satisfaisant dans le cadre des pratiques de repeuplements qui débutaient. Mais le risque de prédation il y a plus de 15 ans était beaucoup plus faible et nous ne disposons pas de données actualisées dans les deux fleuves ce qui nous amène à proposer le projet actuel. De plus, une de nos études précédentes, ciblée sur le comportement de dévalaison à l’automne de plus jeunes stades (10g et 14cm en moyenne) que la présente étude visait à comparer les comportements et les taux de détection en milieu naturel d’individus issus de modalités d’élevage différentes (environnement enrichi ou non). Les résultats ont mis en évidence un effet positif de l’enrichissement en captivité incitant à une amélioration des pratiques de repeuplement ; le taux moyen de poissons détectés en milieu naturel étant de 69% toutes conditions confondues (min. 50%, max. 90% selon les modalités d’élevage) avec 61 juvéniles lâchés initialement. Au vu des effectifs de ces deux précédentes études dont les résultats ont permis de répondre aux questions posées, la proposition ici d’un effectif similaire de 55 juvéniles par fleuve nous paraît pertinente.

Raffinement

Pendant l’élevage, les juvéniles disposent de conditions enrichies afin d’améliorer leur bien-être et les préparer à un lâcher en milieu naturel. Ainsi, dans leur bassin, il y a du courant, leur permettant un entrainement à la nage, des blocs disposés sur le fond du bassin, afin d’imiter de manière simplifiée la variabilité des fonds en milieu naturel et les bassins sont placés à l’extérieur afin de bénéficier d’une photopériode naturelle. Lors des opérations de chirurgie destinées à la pose des marques dans leur abdomen, les poissons seront anesthésiés profondément et surveillés jusqu’à leur réveil (surveillance des différentes étapes de l’endormissement, des battements operculaires, du comportement de nage au réveil). Tout au long de l’opération, ils seront placés sur le dos dans une gouttière en V humidifiée, une dose sédative d’anesthésique sera diffusée au travers des branchies et leur corps sera maintenu humide. Les manipulations seront effectuées par du personnel qui est habitué à travailler avec l’espèce et qui dispose des formations adaptées en matière d’expérimentation animale et de chirurgie sur poissons. Après l’intervention, les individus seront replacés dans leur bassin d’origine afin de leur laisser 5 jours de récupération avant leur lâcher dans les fleuves.

Choix des espèces

L’étude porte sur des esturgeons européens afin d’améliorer les connaissances sur leur écologie et de raffiner les pratiques de repeuplement actuelles de cette espèce. Les poissons impliqués sont des juvéniles de moins d’un an pesant au minimum 85g. A ce stade, les juvéniles sont en phase de dévalaison de l’eau douce vers l’estuaire salé. Ce projet vise à étudier ce comportement, ainsi que le taux de prédation encouru sur ce trajet. Le poids de chaque poisson correspond au poids à partir duquel l’implantation des marques choisies n’a aucun impact délétère notable sur les poissons d’après la littérature et notre expérience.

290 rats et 290 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sédatés par inhalation puis piqués à répétition. Chaque animal reçoit une injection sous la peau, une dans le péritoine, une dans une veine de la queue couplée à un prélèvement de sang, et un gavage, tous de sérum physiologique. Ces gestes ne produisent aucune connaissance, ils alimentent une séance de travaux pratiques de quatre heures offerte chaque année à 96 étudiants de première année de BUT et à dix personnes extérieures. Aucun animal n'est tué ici, les rats partant ensuite vers des protocoles sans réveil ou des travaux pratiques hors procédure, et les souris vers des procédures légères à modérées. Le porteur écrit que le recours à l'animal vivant est "indispensable", tout en indiquant que les participants s'exercent d'abord sur des mannequins.

Objectifs

Les laboratoires de recherche privés ou académiques emploient de nombreux techniciens intervenant directement dans la mise en oeuvre de projets scientifiques utilisant des animaux vivants. Ces projets ont pour but d'améliorer à la fois nos connaissances mais aussi la santé humaine ou animale. L'objectif de ce projet est d'assurer les compétences des agents appliquant des procédures expérimentales sur rongeurs conformément à la directive 2010/63/UE et le décret du 1er février 2013 sur l'utilisation des animaux vivants en expérimentation animale. Dans le cadre du module de spécialisation rat-souris, 1 séance de travaux pratiques (4h) sera réalisée chez le rat et la souris vigile. La séance consistera à former les participants aux principales techniques faiblement invasives de préhension manuelle en vue d'administrations de sérum physiologique en mode sous cutané, intraperitonéal, intramusculaire, intraveineux, gavage et de prélèvement sanguin intraveineux (au niveau de la queue) . La règle des 3 R sera respectée sachant que des méthodes alternatives ne sont pas disponibles en remplacement des procédures faiblement invasives dont l'apprentissage sur animal est un requis fondamental dans ce type de formation. De plus le nombre d'animaux (1 rat et 1 souris par participant) a été reduit au minimum nécessaire et suffisant pour assurer un apprentissage de qualité et les compétences demandées. Afin de limiter les contraintes lors des manipulations les animaux seront préalablement sédatés facilitant ainsi les procédures. Ce projet concerne la formation chaque année de 96 étudiants du parcours BMB 1ère année du BUT Génie biologique nécessaire aux manipulations lors des TP inclus dans le programme national de la formation. Il concerne aussi la formation (pour applicateurs) de personnels extérieurs à l'IUT que l'établissement délivre chaque année (1 session) pour 10 participants.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre aux futurs applicateurs de procédures de maitriser (dans le cadre des 3Rs) les techniques d'administrations et prélévements peu invasifs sur rat ou souris vivantes.

Procédures

Les animaux subiront chacun une sédation qui pourra être suivie d'une injection intrapéritonéale de serum physiologique , d' une injection sous cutanée de serum physiologique, d'une injection intraveineuse de serum physiologique couplée à un prélèvement sanguin (veine de la queue). Ils recevront également une administration per os (gavage) de serum physiologique. Tous ces actes sont de tres courtes durées (quelques secondes à 1 minute maximum).

Impact sur les animaux

Chaque animal subira : - une sédation par inhalation gazeuse entrainant un stress léger de courte durée. - 1 piqure d'aiguille pour l'injection intrapéritonéale, entrainant une douleur légère de courte durée. - 1 piqure pour l'injection sous cutanée entrainant une douleur légère de courte durée. - 1 piqure pour l'injection/prélévement intraveineuse entrainant une douleur légère de courte durée. - 1 administration orale entrainant un stress léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront maintenus en vie à la fin de la procedure, et réutilisés , apres avis du vétérinaire référent, dans d'autres procedures d'autres projets dans le but de Réduire le nombre d'animaux des dits projets. Les animaux seront utilisés soit pour des experiences hors procedures ( mise à mort dans le but de prélevee des organes ou tissus) ou bien dans des projets avec procedures sans reveil pour les rats , et dans projets à procedures légéres à modérées pour les souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est ici adaptée. En effet, afin de former les personnels aux gestes techniques et expérimentation in vivo, le recours à l’animal vivant est indispensable. Les personnels impliqués directement dans l’expérimentation animale in vivo doivent, sinon être opérationnels, maitriser les techniques pratiques de base de l’expérimentation animale in vivo. Ce projet fait partie intégrante de la formation de niveau applicateur agréée que nous délivrons et qui est requise par la directive européenne 2010/63/UE. Il est à noter que préalablement à la procédure d'administration/prélèvements sur animaux vivants, les participants seront formés aux gestes sur des mannequins (rat souris).

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum ( 1 rat + 1 souris par participant) tout en restant dans des limites pédagogiques efficaces pour la formation et l’acquisition des compétences dans le cadre de la formation spécifique des personnels appliquant les procedures expérimentales sur animaux vivants. De plus ces animaux seront réutilisés ce qui contribue à une réduction a posteriori du nombre d'animaux dans d'autres projets (du BUT). En effet Les rats seront re-utilisés plus tard pour une utilisation dans les travaux pratiques hors procédures (mise à mort en vue de prelever organe), ou dans des procedures sans reveil d'autre projets. Les souris pourront être re-utilisées dans des travaux pratiques ultérieurs avec procedures légères à modérées d'un projet autorisé pour le parcours de 2eme année BUT.

Raffinement

Afin de favoriser au maximum le bien être de l'animal ( limiter les nuisances , la douleur, le stress,...) pour les animaux mais également pour assurer l'apprentissage des gestes des participants, différentes actions sont mises en place. Pour ce faire, une periode d'habituation de quelques heures à la salle /poste de manipulations pour les animaux est sytématiquement respectée. Les animaux sont préalablament sédatés (inhalation de courte durée de gaz anesthésiant) avant la pratique des différentes administrations. De plus les participants ont pu simuler sur mannequins les différentes opérations ce qui optimise leur apprentissage sur animaux vivants. Les caractéristiques du matériel (aiguilles sondes) sont adaptées à l'espece rat ou souris afin de garantir la résussite de l'acte en limitant la douleur ( considérée comme légère pour une administration) ou le risque physiologique (volume d'injection ou de prélévement et intervalles de temps suffisant entre chaque administration). La substance injectée (serum physiologique) est à pH controlé (selon les règles d'utilisations des médicaments). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard (cage enrichies ) mais beneficient en plus d'une game room en dehors des manipulations. Cette game est un espace de jeu pour les rat ou souris qui leur permet ,en groupe , d'interagir avec différents objets ( tunnels, boites à trous, grelots hamacs ...), en dehors de leurs cages, et ce pendant 1h par jour (2 à 3 fois par semaine). La methode d'administration volontaire par le rat ou la souris via micropipette (solution appétante) est utilisée en vue d'une substition à la methode de gavage.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les animaux modèles les plus utilisés dans l’expérimentation in vivo pour les études en pharmacologie ou en physiologie Animaux adultes pour faciliter les manipulations.

Soumises à une ou deux injections d'une substance qui déclenche une réaction inflammatoire, puis à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie, 1 720 souris vont toutes être tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La substance peut entraîner une perte de poids, une baisse de la pression sanguine et des dysfonctionnements rénaux et hépatiques, le geste d'injection pouvant lui-même provoquer ulcération, induration et crampes abdominales. L'objet déclaré est de montrer que des candidats médicaments développés au laboratoire bloquent le récepteur TLR4, en vue de traiter des maladies inflammatoires chroniques comme celles de l'intestin ou de la peau. Le porteur indique que ces candidats ont été testés au préalable sur des cellules pour s'assurer de leur non-toxicité, puis reconnaît ne pas pouvoir exclure une toxicité chez la souris, ces travaux étant les premiers menés sur des animaux.

Objectifs

L’inflammation est une réponse de l’organisme face à une menace d’origine exterieure ou intérieure. Il s’agit d’une réaction transitoire mais peut dans certains cas, durer des mois ou des années et donner lieu à une inflammation dit chronique. Dans le cas des maladies inflammatoires dites chroniques, la balance entre l’inflammation et la reconstitution d’une équilibre immunologique est perturbée et peut conduire à des réactions disproportionées de l’organisme. Les traitements actuels sont insuffisants ou inexistants dans certains cas, ce qui rend difficile la prise en charge des patients et impacte leur qualité de vie. De nouvelles cibles sont en cours d’étude pour agir sur la réponse inflammatoire exagérée liée à l’activation de l’inflammation via les facteurs microbiens ou endogènes. Il a été montré que le récépteur TLR4 est impliqué dans le déclenchement de la réponse inflammatoire et au développement de ces maladies inflammatoires chroniques. Les études menées dans le cadre de ce projet s’appuyent sur le ciblage et l’interaction de ce récepteur avec les candidats médicaments développés dans notre laboratoire pour leur effet anti-inflammatoire. Ce projet repose sur deux objectifs. Le premier objectif est de reproduire chez l’animal un contexte inflammatoire similaire à ce qu’il se passe chez l’homme. L’inflammation est induite chez la souris par l’administration d’un produit qui va agir spécifiquement sur ce récepteur TLR4 et déclencher ainsi une réponse inflammatoire. Le second objectif est de démontrer les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments administrés chez ce même animal pour lequel l’inflammation a été provoquée. Les candidats médicaments vont reconnaitre spécifiquement le récepteur comme cible sur laquelle agir. L’interaction entre le candidat et la cible permettra de bloquer la réponse inflammatoire et inhiber ainsi les symptômes qui y sont liés. La finalité de ce projet est de démontrer l’efficacité de candidats médicaments ayant une action anti-inflammatoire afin de proposer un nouveau traitement et améliorer la prise en charge des patients atteints de ces maladies inflammatoires chroniques telles que Crohn, Alzheimer, maladies inflammatoires de la peau. Les modifications dans les voies d'administration et de prélèvement nécessitent une modification du projet initial sans ajout d’animaux.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels permettent de soulager les symptômes mais ne permettent pas de traiter l’origine de la maladie. Démontrer l’efficacité de ces candidats médicaments nous permettrait de proposer un traitement de fond avec une nouvelle stratégie qui se focalise davantage sur les mécanismes qui favorisent l’inflammation que sur les symptômes uniquement. Ce nouveau médicament pourrait être envisagé seul ou en combinaison avec d’autres traitement existants pour améliorer le potentiel thérapeutique et assurer une meilleur prise en charge et qualité de vie des patients sur le long terme. De plus l’utilisation de ce médicament pourrait être envisagée dans différentes applications cliniques car le mécanisme ciblé dans ce projet provoquant le développement de la réponse inflammatoire, se retrouve dans beaucoup de maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections de substance espacées d'une minute à minima. Les animaux resteront vigiles ou seront anesthésiés selon le mode d’administration (modification) utilisé. Un prélèvement de sang terminal (modification) est prévu chez tous les animaux et sera effectué sur animal anesthésié. Cette intervention durera cinq minutes.

Impact sur les animaux

Les candidats médicaments ont été testés au préalable sur des cellules pour s’assurer de la non toxicité de ces produits et de leur efficacité pour bloquer la réponse inflammatoire. Cependant il s’agit de premières études menées chez les animaux et nous ne pouvons exclure le fait que ces candidats puissent entraîner une toxicité chez l’animal au moment de l’injection se traduisant par les symptômes cutanés suivants : irritation, démangeaison, gonflement ou rougeur passagère. Des nuisances dues au geste technique au moment de l’injection sont également à prendre en compte : ulcération, induration, crampes abdominales. La substance inflammatoire peut entraîner une perte de poids, une baisse de la pression sanguine ainsi que des dysfonctionnements rénaux et hépatiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses post-mortem.

Remplacement

Des premiers tests ont été réalisés au préalable sur des cellules avant de lancer des études chez l’animal pour vérifier la non toxicité et les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments. Néanmoins, aucune méthode de remplacement ne permet de reproduire la réponse inflammatoire à l’échelle de l’organisme. La réponse inflammatoire entraîne la libération de molécules qui vont diffuser à travers la circulation jusqu’à atteindre différents organes et provoquer des lésions notamment au niveau du foie, reins, thymus, rate, poumons. Ces interactions ne peuvent pas être modélisées par une méthode alternative et nécessitent de réaliser des études chez l’animal sur lequel on a reproduit la réaction inflammatoire afin d’obtenir des symptômes similaires.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour collecter suffisamment de données qui seront analysées à l’aide d’outils statistiques permettant de répondre aux hypothèses et objectifs scientifiques définis dans ce projet. Cette estimation a été déterminée à partir d’études décrites dans la littérature scientifique ayant déjà utilisées ce modèle d’étude. Néanmoins les paramètres expérimentaux utilisés pour mettre en place le modèle sont variables d’une étude à l’autre. Nous avons donc envisagé une étude pilote pour déterminer les conditions expérimentales optimales afin d’obtenir un modèle d’étude stable sur lequel s’appuyer pour évaluer les propriétés anti-inflammatoires de nos candidats médicaments. Dans cette étude, nous étudierons la réponse inflammatoire au cours du temps et selon la dose de substance inflammatoire injectée. Le nombre d’animaux est défini selon deux critères : la dose et le temps. 4 doses et cinq points de temps ont été déterminés à partir de données issues de la littérature. Suite à cette étude pilote, le modèle sera reproduit pour évaluer le potentiel thérapeutique anti-inflammatoire des candidats médicaments. Le nombre d'animaux a été estimé selon les groupes nécessaires à la réalisation de l’étude. Ces groupes sont définis selon le type de candidats et la dose à laquelle ils seront administrés. Les candidats seront évalués selon 4 doses chacun. Les résultats attendus à l’issue de ces études sont une atténuation de la réponse inflammatoire et une amélioration des symptômes chez l’animal. Ce projet prévoit une répartition équivalente de mâles et de femelles dans chaque groupe pour vérifier un effet sexe potentiel sur la réponse inflammatoire.

Raffinement

L’environnement des animaux sera enrichi de coton, d'abris et d’objet afin de subvenir au bien-être animal. Une période d’acclimatation de deux semaines est prévue à l’arrivée des animaux incluant une phase d’habituation à la contention pour limiter le stress de l’animal avant une injection. Le recours à une anesthésie préalable pourra être réalisée selon le mode d'administration utilisé. Un suivi quotidien sera effectué pour évaluer l’état de l’animal et l’apparition d’effets indésirables. Une grille d’évaluation basée sur ces observations permettra si nécessaire l’arrêt de la procédure en cours pour éviter toute douleur ou souffrance à l’animal.

Choix des espèces

La souris utilisée dans le cadre de ce projet est une espèce particulièrement adaptée au développement du modèle inflammatoire aigu, notamment dans la phase précoce. Cette réponse inflammatoire se traduit par des phénomènes physiologiques similaires à ceux observés lors de la phase inflammatoire induite après une infection chez l’homme : taux élevé et précoce de cytokines pro-inflammatoires, baisse de la pression sanguine, modification de la fréquence cardiaque, et dysfonctionnements des organes périphériques. Les phénomènes physiologiques observés chez la souris sont autant d’indicateurs pour corréler les bénéfices obtenus chez l’animal à ceux que l’on pourrait obtenir chez l’homme. Cette espèce permet de développer un modèle efficace dans la phase précoce de l’inflammation et de le proposer comme un outil permettant d’évaluer les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments. Il s’agira de souris adulte afin d’inclure dans ce projet des animaux possédant un système immunitaire mature.

1 200 souris, dont des souris génétiquement modifiées pour ne plus produire la protéine CD44, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et chacune passe jusqu'à 32 semaines sous régime gras ou reçoit jusqu'à 16 injections intrapéritonéales d'un agent qui provoque une fibrose du foie. Sous régime riche en graisses, glucides et cholestérol, les premières sont mises à jeun quatre heures puis gavées à la sonde rigide, avec un risque de passage du liquide dans les poumons et de détresse respiratoire, et reçoivent jusqu'à trois injections intrapéritonéales et plusieurs prises de sang à la queue. Le porteur annonce la validation d'une protéine qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" dans les maladies du foie liées à l'obésité. Pour justifier le choix de la souris, il avance sa "natalité importante" et le fait qu'elle permet d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée".

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’à la fibrose/cirrhose puis au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, les traitements pharmacologiques restent très limités et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, et également à la surface des cellules stellaires hépatiques qui jouent un rôle clé dans la mise en place de la fibrose, en produisant de façon excessive du collagène. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de cette protéine est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n'exprimant pas cette protéine, et soumis à des régimes alimentaires ou des agents chimiques favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle d’une protéine à la surface des cellules qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans un contexte de maladie stéatosique du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

Dans la procédure 1 : Pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris seront mises à jeun pendant 4h puis recevront des solutions aqueuses par gavage à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge suivi de 2 prélèvements sanguins à la veine de la queue. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées et le sang sera alors prélevé au niveau de la veine de la queue. Enfin à la fin du régime, un dernier prélèvement sanguin sera effectué. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Un à deux prélèvements sanguins à la veine de la queue seront effectués (en milieu et en fin de traitement avec l’agent chimique).

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1 : pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris prendront du poids pouvant occasionner une gêne pour se déplacer. Lors des gavages des solutions aqueuses à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge, l’introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées. À la suite de ces injections une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pouvant entraîner une inflammation au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront réalisées 3 fois au maximum pour atteindre la significativité statistique.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) pour chacune nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter leur sévérité. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances lors des pesées et/ou injections bi-hebdomadaires nous permettront de repérer précocement l’apparition de points limites qui imposent une action pour soulager l’animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles et femelles), la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles et femelles), le traitement chimique induisant de la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

Le rat roussard, un rongeur diurne, vit en cage individuelle dès le sevrage, les mâles de cette espèce étant agressifs entre eux. 64 rats roussards et 64 souris, soit 128 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer l'effet de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme d'une espèce diurne et d'une espèce nocturne. Chacun subit une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie générale pour l'implantation d'un capteur de télémétrie, puis jusqu'à quatre semaines en cage individuelle, ce que le porteur décrit comme un "stress d'isolement social". Tous sont tués pour des analyses post-mortem, après un prélèvement de sang terminal que le porteur situe "après arrêt respiratoire de l'animal".

Objectifs

La lumière joue un rôle majeur sur la physiologie et la santé. Ce projet de recherche vise à étudier les effets de la lumière ambiante sur la prise alimentaire et le métabolisme au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne, la souris et chez un modèle animal diurne, le rat roussard. Dans ce projet de recherche, nous proposons de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise les comportements de prise alimentaire chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur le comportement. Nous proposons que les effets directs de la lumière favorisent la prise alimentaire de jour chez les espèces diurnes et inhibent la prise alimentaire de nuit chez les animaux nocturnes.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme pourrait permettre de participer à la prévention et le traitement des troubles liés à la prise de nourriture et des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et à un prélèvement sanguin terminal réalisé également sous anesthésie générale et après arrêt respiratoire de l'animal. Pour toutes les procédures les animaux devront être placés en cage inviduelle pour une durée maximal de 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement social d'une durée maximale de 4 semaines. La chirurgie d'implantation du capteur de télémétrie pourrait induire de l'inflammation, une perte de poids transitoire, une infection au site des sutures.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour analyse post-mortem.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme et la détection de la lumière impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles) et des relais nerveux et hormonaux, l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-organes.

Réduction

Pour les tests in vivo circadiens et métaboliques, le nombre d’animaux proposé (n=12 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales recueillies dans des études antérieures. Pour l'étude des réponses hormonales et neuronales à la lumière (post-mortem), le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire et par condition lumineuse) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures . Notre suivi systématiquement longitudinal des animaux réduit significativement le nombre d’individus utilisés.

Raffinement

Les souris issues d'un fournisseur agréé seront soumies à deux semaines d'acclimatation aux nouvelles conditions d'animalerie avant le début des procédures. Le rongeur diurne est quant à lui hébergé dès le sevrage en cage individuel car les mâles de cette espèce sont très territoriaux et donc agressifs entre eux. Les souris seront ensuite placées en cages individuelles pour la durée des procédures ce qui genèrera un stress d'isolement social que nous limiterons par ajout de frisure en plus de l'enrichissement classique des cages à savoir bâton à ronger et coton pour faire un nid. La frisure permettra de soutenir la thermorégulation de la souris individualisée notamment tout en apportant un enrihcissement supplémentaire pour la construction du nid. La procédure invasive de chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie adaptée et la température corporelle des animaux est maintenues grâce à un tapis thermostaté relié à une sonde rectale durant toute la procédure. Dès l'anestéhsie et ensuite jusqu'au réveil les animaux sont maintenus sous lampe chauffante. L'état de santé des animaux est évalué une fois par semaine avant la procédure de chirurgie puis au minimum quotidiennement à l'aide d'une grille de score adapatée après. Des points limites spécifiques ont été établis pour limiter la souffrance animal en arrêtant la procédure dès que nécessaire. En post-chirurgie pour aider la récupération de l'animal de la nourriture gélifiée sera ajoutée au fond de la cage pour faciliter la prise de nourriture et hydrique.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, notre projet repose sur l’analyse comparative des réponses comportementales, physiologiques et neuronales entre un modèle animal nocturne et un modèle animal diurne. La souris est une espèce nocturne devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable en recherche animale par l’existence de nombreuses lignées transgéniques (y compris celles porteuses de mutations, celles avec gènes invalidés, ou avec gènes-rapporteurs). Une fois ce projet achevé, nous envisageons de rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris transgéniques exposées aux mêmes procédures expérimentales. Le modèle rongeurs diurnes sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les différences de réponses entre espèces nocturnes et diurnes. C’est pourquoi les mêmes expériences seront faites en parallèle chez un rat diurne, et la souris nocturne. Jeunes adultes (2-4 mois) pour étudier un système circadien et un métabolisme matures et non-sénescents.

Enregistrer une enzyme détoxifiante auprès des autorités suppose de montrer qu'elle réduit la mycotoxine dans les reins et le sérum des poissons : 260 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour caler la dose détectable avant l'étude proprement dite. Pendant soixante-dix jours, elles reçoivent un aliment additionné d'ochratoxine A, sont sorties de l'eau sept fois pour la pesée, puis subissent une prise de sang à la veine caudale suivie d'une mise à mort immédiate, le volume prélevé dépassant 10 % de leur volume sanguin. Le porteur indique que la mycotoxine peut provoquer une perte de poids, un refus de s'alimenter, un gonflement du ventre et une inflammation de l'anus. Il précise l'intérêt de l'opération, enregistrer l'enzyme chez les salmonidés en même temps que chez les espèces terrestres au moyen d'une seule étude au lieu de quatre.

Objectifs

Les aliments pour l’aquaculture ont évolué vers une réduction conséquente des protéines d’origine animale, compensée par l’utilisation de plus en plus importante de substituts d’origine végétale pouvant être potentiellement contaminés par les mycotoxines. Lorsqu’elles sont présentes en trop grande quantité dans l'alimentation des animaux, une fois ingérées par l’animal, elles peuvent s'avérer toxiques, notamment chez les poissons d’élevage et peuvent avoir des conséquences sur leur santé et leurs performances et affecter ainsi la rentabilité économique des élevages. Parmi les centaines de mycotoxines connues, l’ochratoxine A est l’une des plus préoccupante rencontrées en aquaculture car elle s’accumule principalement dans les reins et dans une moindre mesure dans le foie, les muscles et la graisse des poissons. Bien que l'ochratoxine A soit un contaminant connu dans les aliments pour poissons, son effet sur la santé des poissons reste plutôt inconnu avec des données limitées sur la cinétique de toxicité, les effets variant en fonction de la concentration et des espèces de poissons qui l’ingère. La prévention des risques induits par les mycotoxines inclut des stratégies pré et post récoltes souvent classées en physiques, chimiques et biologiques. Une des stratégies de prévention contre les mycotoxines est l’utilisation d’additifs fixateurs de toxines pouvant être ajoutés à l’aliment afin de réduire l’absorption intestinale des toxines en les liant ou en les transformant. Les enzymes constituent un fixateur de toxines permettant de transformer les mycotoxines en composés moins toxiques conduisant à une amélioration des performances des animaux. #Cependant l’ enregistrement d'une solution enzymatique pour la détoxification de la toxine, nécessitera de pouvoir détecter la toxine dans les reins et le sérum et de montrer une réduction de la toxine avec l’ajout de l’enzyme. Ce projet consiste à réaliser un pré-test pour déterminer la dose de toxine analytiquement détectable dans les reins et le sérum sanguin chez les salmonidés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de 1/ déterminer la plage de concentration dans laquelle les effets non létaux dus à l’exposition à la mycotoxine peuvent être détecté, 2/ d’identifier les matrices biologiques pertinentes permettant de quantifier les effets de la mycotoxine rajouté à l’aliment, #3/définir sur la base des résultats obtenus les conditions expérimentales adéquates pour développer une stratégie de détoxification de l’ochratoxine chez les poissons et enregistrer l’enzyme chez les salmonidés en même temps que chez les espèces terrestres au moyen d’une seule étude au lieu de quatre#.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 70 jours. Sorties hors de l’eau pour la pesée des poissons par groupe (7 fois en trois mois, moins de 30 secondes) Prises de sang unitaires au niveau de la veine caudale (durée 30 secondes). Un volume sanguin supérieur à 10% du volume sanguin circulant sera prélevé car les poissons seront immédiatement euthanasiés (durée 1 seconde).

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris avec un aliment standard répondant à leurs besoins nutritionnels et supplémenté en mycotoxine pendant 70 jours. La mycotoxine peut exercer une influence sur la santé et la qualité de vie des animaux caractérisés par une perte de poids, une diminution du facteur de condition corporel du poisson, un refus de s’alimenter, changements d’apparence (gonflements du ventre, inflammation de l’anus). Stress dus à la capture et à la sortie des bassins pour la pesée. Douleur transitoire à l’endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements biologiques.

Remplacement

Au moment de la délivrance de cette autorisation de projet, il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de reproduire les conditions du tube digestif et les différences entre les espèces animales et leur métabolisme pour démontrer pleinement l'efficacité dans des conditions pratiques. De plus, le développement d’un additif alimentaire correcteur implique de connaitre le mode d’action de la mycotoxine chez l’animal auquel il est destiné. La procédure est nécessaire pour déterminer la plage de concentration dans laquelle les effets non létaux dus à l’exposition à l’ochratoxine peuvent être détecté et identifier les matrices biologiques pertinentes permettant de quantifier les effets de la mycotoxine rajouté à l’aliment.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et répondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire l’angoisse et le stress des animaux. Avant toute manipulation, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins sont réduits par une manipulation délicate des animaux. Les conditions expérimentales sont également raffinées par un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’une mousse humide pour faire reposer l’animal sur un support de contention adapté, d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans une procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, en tant que modèle pour les poissons d’eau froide. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car il est taxonomiquement proche du saumon et de physiologie comparable. Les fonctionnalités nutritionnelles sont les mêmes ainsi que les besoins nutritionnels. Par conséquent, la réponse physiologique de la truite au cours de l'étude sera la même que celle des autres salmonidés, les résultats pourront donc être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée. Au début de l’étude les truites pèseront 110 g. Elles seront élevées pendant 12 semaines, pour atteindre un poids final supérieur à 400 g.

Aucun animal porteur du phénotype dommageable n'est gardé au-delà de vingt semaines, et tout individu atteignant un point limite est tué aussitôt. 2 880 souris vont être utilisées dans cet élevage de lignées à inflammation chronique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin. Le phénotype produit une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires, et les souris qui ne l'expriment pas rejoignent les groupes témoins. L'élevage alimente un projet sur le métabolisme des lipides dans le syndrome d'Aicardi-Goutières, et le porteur écrit que les animaux développeront une inflammation chronique vers vingt semaines tout en affirmant que les conditions d'élevage seront adaptées pour qu'ils ne développent pas de symptômes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.

Procédures

Les animaux développeront aux alentours de 20 semaines d'âge une inflammation chronique liée à leur phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.

Remplacement

L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.

Réduction

Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.

Choix des espèces

Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).