Procédures modérées

Chaque souris subit jusqu'à trois injections de produits de transfection puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins avant d'être tuée. 2 070 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement d'organes et analyses histologiques. La finalité est commerciale, le porteur voulant valider avant vente des agents censés délivrer de l'ADN ou de l'ARN dans l'organisme, cette deuxième modification du projet ajoutant des animaux pour tester d'autres formulations lipidiques. Il annonce vérifier "l'absence de toxicité" des produits tout en listant les risques attendus, thrombose, réactions inflammatoires et troubles de la démarche.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés. Une 2è modification du projet initial est nécessaire pour tester d'autres formulations lipidiques, avec ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.

Procédures

Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un ou plusieurs prélèvements sanguins (maximum 4) (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des injections (sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou intranasale). De plus ils subiront un ou plusieurs prélèvements sanguins. Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).

Raffinement

Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Les systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.

6 354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou plusieurs injections, certaines sous anesthésie générale, pour installer dans leurs poumons une bactérie ou du lactate et provoquer une pneumonie. Le porteur indique une perte de poids transitoire de deux à trois jours après l'infection et prévoit des injections de morphinique selon le score clinique atteint. Les retombées annoncées pour les patients en réanimation restent au conditionnel, et il conclut que les modèles animaux sont "indispensables" à la compréhension des interactions entre microbiote respiratoire et immunité pulmonaire.

Objectifs

Les infections pulmonaires contractées à l’hôpital sont les plus fréquentes parmi les infections liées aux soins médicaux et représentent une des principales raisons de l’utilisation d’antibiotiques. Cependant, la résistance croissante des bactéries aux antibiotiques complique leur traitement, avec des échecs thérapeutiques observés dans environ 30 % des cas. Cette situation souligne l’urgence de développer de nouveaux traitements pour prévenir ou soigner ces infections. Des recherches récentes suggèrent que certaines bactéries naturellement présentes dans les poumons, pourraient jouer un rôle protecteur contre ces infections pulmonaires. Cependant, les interactions entre ces bactéries bénéfiques et celles responsables des infections sont encore peu connues, et leur influence sur les défenses immunitaires des poumons reste à approfondir. Notre projet de recherche explore, à l’aide d’un modèle animal, comment le lactate – une substance produite par une bactérie naturellement présente dans les poumons – agit sur la muqueuse pulmonaire et les cellules immunitaires, ainsi que son impact sur la réponse à une pneumonie.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à identifier les substances produites par les bactéries naturellement présentes dans les poumons qui aident à maintenir leur bon fonctionnement. Cela permettra de combler un manque de connaissances essentiel pour développer des traitements basés sur le microbiome pulmonaire. Ce travail pourrait avoir un impact majeur pour les patients souffrant de pneumonie. En effet, des études récentes montrent que l'administration de probiotiques, comme les bactéries lactiques, à des patients en réanimation pourrait réduire le risque de pneumopathie. Cependant, les preuves actuelles sont encore insuffisantes pour justifier des recommandations médicales.

Procédures

Tous les animaux recevront une ou plusieurs injections. Certaines injections seront réalisées sous anesthésie générale et ne dureront au maximum qu’1 minute, avec un réveil presque instantané. Les autres injections seront réalisées sur animaux vigiles et ne dureront que quelques secondes. En fonction de l’état général des animaux (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections de morphinique pourraient être réalisées.

Impact sur les animaux

Modèles d’infection : Les modèles d’inflammation respiratoires aigües sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les animaux reprennent une courbe de poids normale. Pour les autres parties du projet, suite à la colonisation bactérienne, les animaux pourraient présenter, au cours des 24 premières heures du protocole, une légère perte de poids. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendrent pas de douleurs résiduelles ainsi que de stress supplémentaire. Suite à l’injection de bactérie ou de molécules en fonction des voies d’administration choisies et dans le cas d’injections multiples sur une durée maximum de 14 jours, les animaux pourraient ressentir un stress et une gêne.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre le microbiote respiratoire et le système immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=8) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Pour les tests pour lesquels une analyse statistique n’est pas prévue ainsi que pour certains groupes témoins, le nombre d’animaux sera réduit à 3 ou 5 animaux par groupe. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnelle aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections d’analgésiques seront réalisées. Afin de limiter la gêne potentielle consécutive à certaines administrations, la zone d’injection sera anesthésiée localement.

Choix des espèces

Le modèle murin de pneumonie est un modèle bien caractérisé, reproductible, et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature.

Choisi parce qu'il est "couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années", le rat est l'espèce retenue pour ces deux modèles de migraine. 600 rats, mâles et femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leur cerveau. Ils reçoivent une injection de neuropeptide directement dans un ganglion nerveux sous anesthésie, puis leur sensibilité cutanée est mesurée pendant quatre heures, par application de filaments fins et jet d'air toutes les trente minutes. Le porteur annonce des points limites fixés par une grille de scores sans dire lesquels, tout en identifiant la douleur comme la principale nuisance du protocole.

Objectifs

Dans notre étude, nous utilisons deux modèles de migraine chez le rat en injectant deux neuropeptides qui jouent un rôle dans les migraines mais agissent différemment. L'un est déjà une cible pour des traitements car il provoque l'élargissement des vaisseaux et augmente la sensibilité aux douleurs dans la tête. Le second, lui, agit autrement et pourrait aider les patients qui ne répondent pas aux traitements ciblant le premier. En comparant ces deux substances, nous cherchons à mieux comprendre leurs effets dans les migraines, et à voir comment elles influencent différemment les mâles et les femelles. Cela pourrait mener à des traitements plus adaptés aux besoins individuels.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet va nous permettre de développer un modèle animal de migraine plus proche de la réalité clinique. Cela nous aidera à mieux comprendre les mécanismes de la migraine, à identifier des différences entre mâles et femelles, et à découvrir de nouvelles options de traitement. La migraine touche plus souvent les femmes, mais la plupart des études ont été faites sur des mâles, alors qu’on sait que le sexe et les hormones influencent la façon dont la migraine se manifeste. À moyen terme, comprendre ces différences et le rôle de différentes zones du cerveau dans ce modèle nous permettra d’approfondir nos connaissances sur la migraine. Par ailleurs, bien que les triptans soient les médicaments spécifiques de la migraine, ils ne fonctionnent que pour environ 60 % des personnes, ce qui laisse penser qu'il existe d'autres mécanismes en jeu.

Procédures

Mesure de la sensibilité cutanée : le jour de l'injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en intra-ganglionnaire (chaque application dure 3 secondes).

Impact sur les animaux

Les injections de neuropeptides induisent une douleur modérée. Une gêne est observée après injection, sans entraver les mouvements. Les injections intra-ganglionnaires provoquent un stress et une inflammation locale modérés. L’anesthésie constitue une nuisance légère, avec un risque de perturbations respiratoires ou cardiovasculaires. Les stimulations mécaniques (filaments de Von Frey, AirPuff) entraînent une douleur modérée. Les manipulations répétées induisent un stress modéré.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des études transcriptomiques, protéiques et immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est fixé à un maximum de 10 pour assurer une étude fiable, en tenant compte des étapes clés comme l’habituation, les injections, les observations comportementales, les prélèvements et la préparation des échantillons. Les études comportementales étant un facteur limitant, nous prévoyons suffisamment d'animaux pour garantir des résultats solides pour ce modèle de migraine. Enfin, pour prendre en compte les différences entre mâles et femelles dues aux hormones, l’étude inclura les deux sexes.

Raffinement

Avant les études comportementales, les animaux sont placés dans des cages enrichies (tunnels et contacts sociaux) pendant une semaine, puis habitués au nouvel environnement pendant 4 jours pour réduire leur stress. Avant les injections, les rats sont anesthésiés, vérifié par l'absence de réflexe de retrait. La douleur est la principale nuisance identifiée, et pour les stimulations mécaniques, nous suivons les recommandations internationales pour limiter leur durée et intensité. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores.

Choix des espèces

Le rat est couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature. Etant donné que les réponses neurobiologiques aux migraines peuvent différer entre les sexes, mâles et femelles seront inclus dans cette étude.

6 300 poissons sauvages de dix espèces vont être capturés, anesthésiés et incisés sur le ventre pour recevoir une puce électronique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu reste entre trente secondes et une minute hors de l'eau, le temps des mesures et de l'implantation du transpondeur. Tous sont ensuite remis à l'eau vivants, l'étude cherchant à savoir quelles espèces et quelles tailles franchissent un siphon de 190 mètres qui coupe une zone humide en deux. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de réaliser ce suivi pour "justifier de la nécessité" d'actions de restauration à proximité de l'ouvrage.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer la franchissabilité par les poissons d’un siphon (tuyau de 190 m de long) présent dans une annexe alluviale d’un grand fleuve, et qui scinde cette vaste zone humide en deux. Cette annexe fait l’objet d’un projet global de restauration hydrologique au regard de son fort enjeu pour la biodiversité aquatique. Des observations locales tendent à montrer que ce siphon est ponctuellement franchissable par certains poissons mais de nombreuses questions concernent la diversité des espèces et des classes de taille capables de franchir cet aménagement, et les conditions de débit requises. Pour répondre à ces interrogations, et justifier les futurs programme de restauration écologique, une étude par marquage est envisagée. La méthodologie proposée implique l’implantation de puces électroniques, ci-après nommées « PIT tags », dans 10 espèces de poissons sauvage, regroupées en 4 groupes selon leur écologie. Des dispositifs de détection des puces seront installés à l’entrée et à la sortie du siphon. L’étude impliquera la réalisation de 3 campagnes de marquages pour un suivi qui s’étalera au maximum sur 5 ans, pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales. Si le quota d’animaux marqué dans chaque groupe d’espèces n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière l’effet bloquant du siphon au passage de certaines espèces / classes de tailles de poissons. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour justifier de la nécessité de mettre en œuvre des actions de restauration à proximité de ce siphon.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 6300 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici siphon) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 5 ans, avec captures et marquages les trois premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des tendances comportementales, et évaluer la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du milieu (annexe hydraulique d’un grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur PIT tag dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser le PIT tag lors de la fraie. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, durée moyenne de franchissement).

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée régulièrement, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

10 espèces cibles de poissons, présentes dans le milieu naturel et caractéristiques du milieu étudié, seront réparties en 4 groupes ayant une écologie similaire: - Anguille : espèce considérée à part état donné son écologie et son statut de protection - Cyprinidés d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine, goujon - Cyprinidés d’eau calme : brèmes, gardon, carpes - Carnassiers : Brochet, silure. 2 stades de développement sont retenus : juvéniles et subadultes-adultes. Au total, les juvéniles représentent environ 18% de l’effectif marqué (1110 individus sur 6300), le reste étant des subadultes et adultes, qui sont les stades préférentiellement ciblés. Les plus petits individus seront relâchés sans être marqués.

Tester le composé anti-obésité d'un laboratoire client : 30 souris mâles rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent 36 jours seules en cage, subissent 22 gavages, neuf pesées et un jeûne de huit heures avant un test de tolérance au glucose. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance pour un animal social, et que l'obésité induite réduit leur capacité de mouvement. L'étude ne portera que sur des mâles, tester aussi les femelles imposant de doubler les effectifs, une seconde étude n'étant prévue qu'en cas d'efficacité observée chez le mâle.

Objectifs

Le présent projet sera mené pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client qui développe des thérapies de première classe pour traiter les causes sous-jacentes du dysfonctionnement organique chez les patients atteints de troubles métaboliques graves, notamment l'obésité et le diabète. Parmi ses thérapies en développement, notre client souhaite tester le composé X qui a été développé afin d'augmenter les dépenses énergétiques et diminuer l'appétit, de façon à améliorer la santé métabolique et cardiovasculaire des patients souffrant d'obésité et de troubles métaboliques associés. L'étude faisant l'objet de la présente demande visera a tester l'efficacité in vivo du composé X, à deux doses, chez un modèle de souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Compte tenu du mécanisme d'action du composé X qui conduit à une activation des dépenses énergétiques via la production de chaleur par le corps, les souris seront hébergées à une température de 28-30°C, de façon à limiter la production de chaleur par l'organisme.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mis sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (9 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de placébo ou du candidat médicament par voie orale (22 administrations; durée : 1 minute); 3) Analyse de la composition corporelle (1 mesure; durée : 2 minutes); 4) Un hébergement individuel en cage standard (36 jours pour tous les animaux).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements oraux (placébo, composé X et Glucose), ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 8h préalable a la réalisation du test de tolérance au glucose, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultérieures (imagerie, histologie, dosage de protéines impliquées dans les dépenses énergétiques...).

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire, les dépenses énergétiques et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de première étude sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par gavage seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 17 semaines (24 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 11 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Les souris sont analysées au moment où elles atteignent leurs points limites, c'est-à-dire quand la leucémie s'est déclarée. 3 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie, jusqu'à une fois par mois pendant toute leur vie, une irradiation, puis une greffe de moelle ou de cellules leucémiques humaines suivie de chimiothérapie. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, développer "à long terme" de nouvelles thérapies contre le cancer pédiatrique le plus fréquent, quand les prélèvements répétés et la maladie induite, eux, courent sur toute la vie des animaux.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques B (LAL-B) touchent principalement les enfants, et constituent le cancer pédiatrique le plus fréquent. Les traitements actuels de ces leucémies sont efficaces pour induire une rémission à long terme. Cependant, les cellules souches leucémiques (CSLs) peuvent échapper au traitement et servir de réservoir pour les rechutes de la maladie, ces dernières étant de très mauvais pronostique clinique. Le projet que nous développons représente un challenge important en recherche translationnelle, et a pour objectif d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les fonctions aberrantes des CSLs. A cette fin, nous développons des modèles murins génétiquement modifiées pour exprimer des facteurs de transcription oncogéniques, et qui récapitulent efficacement le développement de la leucémie humaine. Nous développons également des modèles de xénogreffes de LAL-B humaines couplés a des traitements de chimiothérapie pour accéder aux cellules responsables des rechutes de la maladie. Par l’utilisation de ces modèles, nos travaux démontrent que les oncogènes sont capables de reprogrammer des propriétés fonctionnelles et moléculaires de cellules souches à une sous-population de progéniteurs lymphocytaires normaux, les convertissant en CSLs résistantes aux traitements, mimant ainsi les caractéristiques des cellules responsables des rechutes de la maladie chez le patient. Nos modèles permettent donc un accès reproductible et non restrictif aux CSLs qui représentent une population cellulaire de premier choix pour le développement de nouvelles thérapies ciblées. Dans ce contexte, nous proposons dans ce projet d’explorer, de caractériser et de cibler les CSLs.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir notre connaissance sur les cellules qui initient les leucémies aigues lymphoblastiques de l’enfant et de développer à long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Le prélèvement de moelle osseuse et/ou de sang ainsi que les transplantations de moelle osseuse dans des souris receveuses irradiées au préalable se feront sous anesthésie (animal surveillé jusqu'au réveil). Les prélèvements de moelle osseuse, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de deux minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont des procédures de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements médullaires, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de 2 minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont donc une procédure de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes. Les souris sont surveillées attentivement dans les heures qui suivent l’irradiation, et du gel hydratant est ajouté dans la cage durant la première semaine.

Devenir

A l’âge voulu, les souris seront euthanasiées pour prélèvement d'organes.

Remplacement

En complément à nos approches in vivo, notre travail consiste également à confirmer nos observations par des approches expérimentales in vitro sur les cellules de souris mais également sur les cellules humaines. Nous avons notamment validé au laboratoire par des approches in vitro, que les cellules initiatrices de la leucémie sont quiescentes et résistantes aux traitements de chimiothérapie, ce qui constitut une stratégie complémentaire à nos approches de transplantation in vivo. De plus nous utilisons massivement des outils d’analyse à large échelle des données de la littérature, ce qui nous permet d’avancer dans nos démarches scientifiques sans utiliser d’animal.

Réduction

Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et une analyse statistique adaptée aux petits échantillons, optimisant ainsi nos protocoles et réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés. Les travaux de la littérature nous aident à déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour garantir la valeur scientifique de l'expérience et éviter qu'elle ne doive être reproduite. De plus, les études longitudinales nous permettent de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental comprenant l'utilisation de cylindres de coton pour réduire le stress potentiel et la présence d'igloos rigides rouges dans toutes les cages pour offrir un abri sécurisé. En cas de comportement inhabituel tel que la prostration, un pelage terne et hirsute, ou des signes de blessures infligées par d'autres animaux, l'individu concerné est isolé et reçoit une attention renforcée. Une perte de poids soudaine dépassant 20% du poids initial de l’animal est également surveillée (selon une grille de scoring en annexe). Des soins appropriés sont alors prodigués, incluant la désinfection des plaies ou un accès facilité à la nourriture si nécessaire. Si aucune amélioration n'est constatée malgré ces mesures, des décisions seront prises pour mettre fin à la vie de l'animal de la manière la plus humaine possible afin de prévenir toute souffrance inutile, en accord avec les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Les souris immunodéficientes sont hébergées dans un environnement répondant aux normes pour prévenir l'apparition de phénotypes dommageables (manipulation PSM, isolateur). Les prélèvements médullaires (de degré de sévérité modérée) sont réalisés sous anesthésie et analgésie, avec l'animal placé sur une plaque chauffante et surveillé attentivement jusqu'à son réveil. Les personnes effectuant ces prélèvements sont formées à cette technique et possèdent les compétences nécessaires pour manipuler les souris et effectuer les gestes techniques dans le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

La communauté scientifique internationale privilégie l'utilisation de modèles murins pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans les pathologies hématologiques, en raison de la conservation des gènes et des voies de signalisation entre l'Homme et la souris. Ainsi, les résultats obtenus chez la souris en hématopoïèse sont souvent extrapolables à l'humain. Nous allons mener des études longitudinales tout au long de la vie des animaux, incluant des périodes à un jeune âge (1 et 3 mois) ainsi qu’au stade leucémique (analyse au moment du développement de la maladie lorsque les souris auront atteint leurs points limites). Ces différents stades miment le processus multi-étapes du développement de la maladie, de l’initiation à la transformation tumorale.