Procédures modérées

Deux des six macaques rhésus de ce projet viennent d'un projet antérieur reposant sur la même approche, ce qui leur épargne la pose d'un implant crânien. Les quatre autres subissent une chirurgie de quatre heures pour fixer une pièce de contention sur le crâne, suivie de plusieurs semaines de convalescence, puis d'un conditionnement comportemental sous restriction hydrique. Tous passent une dizaine de périodes d'enregistrement en IRM fonctionnelle vigile, d'une à deux semaines chacune et de nouveau sous restriction hydrique, plus six sessions sous sédation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué à l'issue, quatre étant réutilisés dans des projets de même nature et deux retournant à l'animalerie après désimplantation, ce que le porteur qualifie d'approche "très économe en termes d'individus impliqués".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à caractériser les réseaux corticaux qui sous-tendent cognition spatiale et cognition sociale chez le singe macaque. L'objectif est double: (1) comprendre comment ces réseaux s'articulent chez le singe et (2) estimer leur degré d'homologie avec les réseaux supportant les mêmes fonctions cognitives chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Les connaissances que ce projet dégageront doivent permettre de mieux comprendre comment cognition spatiale et cognition sociale sont implémentées chez le primate, et en quoi cette implémentation diffère entre l’Homme et le singe macaque. Il s'agit de connaissances fondamentales dont il est difficile de prévoir, par essence, la façon dont elles contribueront à améliorer la santé humaine et/ou animale. Cependant, les troubles touchant la cognition sociale et/ou spatiale chez l'Homme sont suffisament nombreux et invalidants pour justifier de faire progresser nos connaissances fondamentales dans ces domaines.

Procédures

Les 6 macaques rhesus qui participent à ce projet seront impliqués dans une unique procédure qui comporte 4 phases. Deux des animaux seront ré-utilisés d'un projet antérieur (si avis vétérinaire conforme) qui s'appuyait sur la même approche expérimentale, ils n'auront donc pas à repasser les 2 premières des 4 phases décrites ci-après: (A) Pose de la pièce de fixation de tête (n=4): implique une chirurgie d'environ 4 heures sous anesthésie et dans des conditions aseptiques, puis un suivi post-opératoire et une période de convalescence de plusieurs semaines. (B) Conditionnement comportemental (n=4): implique des manipulations quotidiennes d'acclimation à la manipulation, puis un conditionnement comportemental à une tâche de fixation s'accompagnant d'une restriction hydrique contrôlée (quelques semaines à plusiers mois selon les individus). (C) Sessions d’enregistrements IRMf vigile (n=6): implique pour chaque individus une dizaine de périodes d'enregistrement en IRMf, chacune durant entre 1 à 2 semaines. Ces périodes d'enregistrement s'accompagne d'une restriction hydrique et elles sont donc espacées d'au moins un mois pour chaque individus. (D) Sessions d’enregistrements IRMf anesthésié (n=6): implique pour chaque individus 6 sessions d'enregitrement de 45 minutes environ, sous légère sédation et hors périodes de restriction hydriques.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables potentiels sur les animaux impliqués dans ce projet sont: (1) le stress que peut générer la phase d'habituation à la manipulation, à la chaise à primate et à l'immobilisation de tête, (2) les conséquences de l'anesthésie (déshydratation, dépression respiratoire ou dépression du rythme cardiaque), (3) les complications post-opératoires (douleur potentielle, risques d'infection) (4) le stress et la perte de poids associés à la restriction hydrique.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure de ce projet, il n'est prévu aucune mise à mort. Les animaux seront replacés ou réutilisés dans des projets scientifiques de même nature, selon leur âge, leur état de santé, conformément à l'avis vétérinaire qui sera émis le cas échéant.

Remplacement

Les capacités cognitives spatiales et sociales que nous cherchons à comprendre s'expriment, par essence, dans des organismes entiers en interaction avec leur environnement. Comprendre comment ces capacités se sont développées chez les primates pour culminer chez l'homme nécessite une approche comparative homme/singe seule à même de nous apprendre comment fonctionnent les réseaux cérébraux sous-jacents. L'objectif est double (1) identifier les spécificités humaines, (2) caractériser les domaines de pertinence du modèle animal pour l'étude de la cognition spatiale et de la cognition sociale. Ces objectifs scientifiques ne peuvent être atteint qu'en étudiant l'organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau chez des singes macaques et des humains placés dans des conditions expérimentales similaires.

Réduction

Le nombre d'animaux impliqués dans ce projet (n=6) est suffisant pour appliquer des tests statistiques classiques et extraire des connaissances robustes et généralisables sur les réseaux corticaux supportant cognition spatiale et cognition sociale chez le singe macaque. Du fait de la nature faiblement invasive des approches déployées ici, les mêmes animaux participeront à tous les protocoles d’imagerie fonctionnelle et structurelle, permettant de réduire le nombre d'individus à implanter. Il est a noté que 2 des 6 animaux inclus dans ce projet sont réutilisés suite à leur implication dans un projet antérieur reposant sur des méthodes similaires à celles proposées ici. De même, aucun animal ne sera sacrifié en fin de projet. Ils seront réutilisés dans des projets de même nature si leur âge et leur état de santé le permet, ou seront désimplantés et continueront à être hébergés dans notre animalerie. Cette approche est ainsi très économe en termes d'individus impliqués.

Raffinement

Tout stress ou souffrance des animaux ayant un effet négatif sur les processus cognitifs étudiés, il convient de veiller à les diminuer au maximum. Dans le cadre de ce projet, cela passe notamment par une pose d'implant de tête sous anesthésie générale, l'utilisation d'analgésie en post-opératoire, une surveillance continue des animaux pour détecter tout signe de détresse et un conditionnement comportemental très graduel. Chacune de ses étapes est associée à un ensemble de points limites stricts qui, s'ils sont dépassés, justifieront l'arrêt temporaire ou définitif de la procédure en cours. Par ailleurs, une grande attention est portée à l'environnement de nos animaux, avec des enclos de 4 individus permettant les interactions sociales dans un milieu spacieux et enrichis (perchoirs, lianes, jouets, etc). Des bassines sont aussi présentes dans les enclos quand les animaux en restriction hydrique n'y sont pas. Tout sera mis en oeuvre pour minimiser les nuisances sur les animaux impliqués dans ce projet. Notre recul de 10 ans dans l'emploi de ces approches expérimentales nous permet d'affirmer que leur impact négatif sur la santé des animaux est généralement minime et réversible. Le stress potentiel engendré par la manipulation des animaux et leur contention est réduit au maximum par une acclimatation lente et progressive à ces manipulations. Le stress hydrique potentiel durant les phases de conditionnement ou d'enregistrement est contrôlé de façon fine (évolution du poids, de la prise alimentaire, screening comportemental, complémentation hydrique éventuelle pour assurer les besoins journaliers). Enfin, si la pose d'une pièce de fixation est généralement très bien tolérée par les animaux, nous veillons à prévenir toute infection éventuelle autour de cette pièce par des nettoyages fréquents (une fois par semaine en général et plus si nécessaire).

Choix des espèces

Le singe macaque est un modèle central en Neurosciences Intégratives de par ses similitudes comportementales et cérébrales avec l'Homme et sa facilité de conditionnement sur des tâches cognitives complexes. Beaucoup de nos connaissances sur le cerveau proviennent d'études invasives menées sur ce primate. Avec l'avènement des techniques d'imagerie fonctionnelle chez l'Homme, puis leur implémentation chez le singe, il est devenu possible d'adresser la question des homologies interspécifiques de façon directe et ainsi de baser le transfert de connaissances sur des bases plus solides. Ces 2 espèces de primate ayant divergées il y a environ 25 millions d'années, le modèle singe offre de plus l'opportunité d'interroger d'un point de vue évolutif les substrats corticaux qui ont rendu possible l'émergence de certaines spécificités humaines liées à la cognition spatiale et/ou sociale (manipulation d'outils, hypersocialité, langage, etc.). Les animaux utilisés doivent avoir atteint l'âge adulte pour éviter des problèmes potentiels quand l'implant de tête est posé alors que le crâne n'a pas fini sa croissance. Ils ne doivent pas être trop vieux pour minimiser les risques liés à l'anesthésie et éviter la variabilité potentielle d'un déclin cognitif lié à l'âge.

Pour tester une irradiation par rayons X fins comme alternative à la chirurgie de l'épilepsie, 94 souris sont rendues épileptiques par injection d'une molécule dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de quinze minutes, des IRM et une irradiation pouvant durer une heure, une seconde chirurgie de trente minutes pour implanter des électrodes, puis des enregistrements de trois heures toutes les deux semaines pendant huit mois. Le cycle reproducteur des femelles est évalué seize jours de suite, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress répété. Toutes sont tuées pour prélever les cerveaux, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant l'apport d'un gel hypercalorique.

Objectifs

Une grande partie des patients épileptiques souffrent d’un type de la maladie qui est résistante aux médicaments. Cette forme d’épilepsie est caractérisée par des crises et est souvent associée à plusieurs troubles de la mémoire et de l’apprentissage. La chirurgie permet d'enlever la partie du cerveau malade qui génère les crises, mais c’est une opération qui présente certains risques et peut générer des effets secondaires. Nous étudions différentes formes de rayons X afin de développer une thérapie alternative sans avoir besoin d’ouvrir la boîte crânienne. Nous proposons d’utiliser un appareil qui permet d’appliquer des rayons X semblables à ceux actuellement utilisés en clinique humaine, mais aussi avec des faisceaux plus fins et moins nocifs, afin d'évaluer l’effet des différentes formes de rayons X. Ces expériences sont cruciales pour transférer la technologie des rayons X en faisceaux plus fins dans la pratique clinique. En démontrant sa faisabilité et son efficacité en tant que traitement non invasif de l'épilepsie pharmacorésistante, nous avons pour ambition de fournir une preuve de concept préclinique pour une application thérapeutique à l’horizon de 2030.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, les patients souffrant de certains types d’épilepsie répondent mal aux traitements pharmacologiques classiquement prescrits. Le meilleur traitement reste la chirurgie de retrait de la zone du cerveau malade après ouverture de la boîte crânienne. Malgré un taux d'efficacité de 60%, cette technique présente de nombreux risques, tels que des infections et des troubles de la mémoire et de l’apprentissage. De plus en plus de patients sont réticents à cette méthode. Il est donc nécessaire de trouver des traitements alternatifs efficaces et non invasifs. Notre étude par irradiation avec des rayons X plus fins que ceux utilisés actuellement permettrait de développer une nouvelle méthode de traitement, plus efficace que la chirurgie, non invasive, avec moins d’effets secondaires et une durée d’hospitalisation moindre.

Procédures

Les souris subiront dans un premier temps une chirurgie d’environ 15 min visant à les rendre épileptiques, par injection d’une molécule dans une région précise du cerveau. Des IRM seront effectuées pendant une durée n’excédant pas 60 minutes. L’irradiation dure moins de 60 minutes. Afin de mesurer les effets de l’irradiation sur les crises, des électrodes intra-cérébrales seront positionnées (chirurgie d’environ 30 min). Les souris seront ensuite soumises à un enregistrement de leurs crises pendant 3 heures toutes les deux semaines pendant 8 mois après irradiation afin de vérifier l’efficacité et la stabilité du traitement. De plus, des tests évaluant le comportement des animaux seront effectués 4 et 8 mois après l’irradiation. Le cycle menstruel des souris femelles sera également évalué de manière répétée pendant 16 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Cette étude se déroule sur plusieurs mois et peut comporter certains effets indésirables pour les animaux. La première étant l’épilepsie. Les animaux font essentiellement des crises partielles qui ne présentent pas de signes de douleurs apparentes lors de leur déclenchement, et qui sont indolores chez l’homme. Certaines souris peuvent présenter des crises convulsives occasionnellement, qui peuvent entraîner un stress et des douleurs musculaires. Après les chirurgies, les souris peuvent ressentir des douleurs et potentiellement des problèmes pour se nourrir et s’hydrater pendant les premières 24 heures. Les souris épileptiques sont plus réactives et doivent être hébergées séparément pour éviter tout conflit entre individus et/ou une altération possible de l’électrode. Il est possible que les souris subissent un léger stress lors des déplacements vers les salles expérimentales. Après irradiation, il est possible que les souris présentent des effets indésirables comme une perte de poids et une perte de poil au niveau de la zone irradiée. Le cycle menstruel des souris femelles sera également évalué de manière répétée pendant 16 jours consécutifs, ce qui peut induire un stress répété.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et d’observer au niveau structural et cellulaire les effets de la radiothérapie.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle alternatif ne permet de remplacer l'utilisation d'animaux pour étudier ce type d’épilepsie. Il n’existe aucun modèle in vitro ou sur ordinateur qui permette de mettre en évidence ce type d’épilepsie dans le cerveau, ni de le traiter par irradiation. Le modèle de souris choisi pour cette étude est reconnu dans la littérature pour reproduire la pathologie chez l’homme : crises spontanées, perte des neurones, inflammation du tissu nerveux, modification de l'architecture neuronale du cerveau, résistance aux traitements antiépileptiques, autres symptômes de la maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire est calculé en fonction de notre connaissance de ces procédures et des analyses statistiques des résultats qui seront utilisées. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

Toutes les procédures (chirurgie pour l’épilepsie, IRM, chirurgie d’implantation de l’électrode, irradiation) sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pour minimiser la douleur et le stress de l’animal. Pendant les premières 48h post-chirurgies et irradiation, des croquettes seront placées directement dans la cage, et un suivi journalier du poids et de l’état général de l’animal sera effectué. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet, pendant et entre les procédures, et une échelle de douleur nous permettra d’intervenir rapidement par l’administration d’analgésique ou la mise à mort de l’animal. Du gel hypercalorique et appétent sera donné en cas de perte de poids constatée (plus de 20%). De plus, la manipulation des animaux sera faite de manière douce pour éviter un stress supplémentaire. Des sessions d’habituation (aux expérimentateurs, salles de comportement) seront également effectuées.

Choix des espèces

Le modèle d’épilepsie chez la souris que nous utilisons est actuellement un modèle de référence, parmi les plus proches des conditions observées chez l’homme. Des animaux adultes âgés de 8 semaines seront utilisés dans ce projet. Le modèle a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long des procédures.

Anesthésiées pour une échocardiographie de vingt minutes puis pour une imagerie des vaisseaux lymphatiques d'une heure trente, 3 684 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une biopsie d'oreille au sevrage, cinq administrations orales, une injection et des prélèvements de sang, avant la mise à mort de tous les animaux pour analyse des tissus. Le projet cherche à préciser le rôle des vaisseaux lymphatiques dans l'athérosclérose, les nouvelles stratégies thérapeutiques annoncées étant renvoyées au long terme. Les effets déclarés se limitent à des douleurs légères et à un stress de courte durée, sans un mot sur ce que représente pour ces souris le développement de l'athérosclérose elle-même.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont une cause de morbidité et de mortalité importante dans le monde. En particulier, l’athérosclérose est connue pour ses conséquences : principalement l'infarctus du myocarde, mais aussi les accidents vasculaires cérébraux et l’anévrisme aortique. Certains lipides jouent un rôle bénéfique dans l’athérosclérose, tandis que les vaisseaux lymphatiques aident à limiter la progression de la maladie en facilitant le transport du cholestérol vers le foie. L’objectif de ce projet est de mieux caractériser le rôle des vaisseaux lymphatiques dans des modèles expérimentaux d’athérosclérose chez la souris. Cette étude permettra de développer, à terme, de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de prévenir la progression de l’athérosclérose chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de mieux comprendre l’impact potentiel de certains lipide sur les vaisseaux lymphatiques dans la physiopathologie de l’athérosclérose. Cette étude estimera le potentiel bénéfice thérapeutique d’un médicament ciblant les vaisseaux lymphatiques afin de prévenir la progression de l’athérosclérose.

Procédures

Le prélèvement pour identification de la modification génétique sera fait au moment du sevrage de l’animal, elle pourra occasionner une douleur légère et ne prendra que quelques secondes. Le prélèvement de sang (1 à 2 prélèvements/souris) sera fait sur animal anesthésié. Le prélèvement prend moins de 30 secondes par animal. Les administrations par voie orale (5/souris) seront faites sur animaux vigiles et prennent moins de 15 secondes par animal. Les injections seront faites sur animaux vigiles (1 injection/souris). Une injection prend moins de 10 secondes. L’échocardiographie (2/souris) sera faite sur animal anesthésié et prendra environ de 20 minutes par animal. L'imagerie des vaisseaux et des ganglions lymphatiques (1/souris) sera faite sur animal anesthésié et prendra 1 heure et 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Le prélèvement pour identification peut occasionner une douleur légère et un stress de courte durée. Les injections peuvent causer un stress et une douleur légère de courte durée. Les administrations orales peuvent causer une douleur légère et un stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyses des tissus.

Remplacement

Les modèles de souris sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l'athérosclérose. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes en culture cellulaire qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’athérosclérose. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.

Réduction

Les effectifs sont déterminés à partir des données de la littérature et avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment par l'utilisation d'analgésique lors de certaines étapes ainsi que l'utilisation d’anesthésie adaptée durant les procédures. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra pas être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

L’utilisation des animaux est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de modèles d’athérosclérose en culture cellulaire permettant de reproduire la physiopathologie de la maladie. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre la souris et l’humain, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation des résultats. Ces animaux permettront d’analyser finement le rôle spécifique de certains lipides. Seules des souris adultes de plus de 8 semaines seront utilisées pour ces études pour rester cohérents avec les conditions cliniques, l’athérosclérose étant une maladie touchant les adultes chez l’humain.

1 776 cochons génétiquement modifiés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir douze injections d'immunogènes et subir vingt prélèvements sanguins, jusqu'à 10 % de son volume sanguin par prise, avec fièvre, inflammation au point d'injection et malaise général parmi les effets décrits. La mise à mort se fait par exsanguination sous anesthésie profonde, pour récupérer le maximum de sérum, le projet visant 70 kilos d'anticorps purifiés destinés à des essais cliniques. Le porteur écrit avoir cherché des méthodes sans animaux et conclut que les techniques in vitro ne sont "pas encore suffisamment développées".

Objectifs

Le projet vise à générer des anticorps porcins glyco-humanisés dirigés contre des cellules tumorales humaines (utilisation en oncologie) ou des cellules immunitaires (utilisation en transplantation pour palier au rejet de greffes). Le projet utilise des porcs génétiquement modifiés par l'inactivation de deux gènes intervenant dans la chaîne de glycosylation des protéines. Les anticorps produits par les animaux présentent des glycosylations similaires aux glycosylations humaines et donc moins immunogènes pour l’homme. L’administration répétée des pools d’antigènes tumoraux ou lymphocytaires (cellules du système immunitaire) induit une réponse immunitaire robuste chez les porcs, produisant des sérums riches en anticorps spécifiques ciblant les cellules tumorales ou les cellules du système immunitaire (lymphocytes). Ces anticorps pourraient constituer de nouveaux candidats médicamenteux pour répondre à des besoins médicaux non satisfaits en transplantation et en cancérologie. Avec les animaux prévus au projet, environ 70 kg d’anticorps specifiques purifiés seront produits pour être évalués au cours d’études cliniques.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer des anticorps polyclonaux antitumoraux en utilisant des porcs DKO (double knock-out) hyperimmunisés avec des cellules tumorales, ce qui pourrait représenter une avancée significative en thérapie oncologique. Les porcs DKO, modifiés génétiquement pour améliorer la compatibilité immunitaire, permettent la production d'anticorps moins immunogènes et donc plus efficaces contre une variété de cellules cancéreuses. En utilisant ces modèles animaux, nous espérons générer des anticorps polyclonaux qui peuvent cibler plusieurs épitopes des cellules tumorales, augmentant ainsi les chances de neutraliser les cellules cancéreuses et réduisant le risque d'échappement tumoral. Ces anticorps pourraient offrir des alternatives ou des compléments aux thérapies actuelles, comme les monoclonaux, avec une meilleure réponse immunitaire et une réduction des effets secondaires. Le bénéfice attendu est donc une amélioration notable des options thérapeutiques pour les patients atteints de cancer, ouvrant la voie à des traitements plus personnalisés et potentiellement plus efficaces.

Procédures

Au cours des programmes d’immunisation, les animaux sont soumis à l’injection de pools d’immunogènes et à des prélèvements sanguins. Un animal inclus dans un programme peut subir au maximum 12 injections de pools d’immunogènes (1 injection toutes les 2 semaines) et 20 prélèvements sanguins (1 prélèvement par semaine ou toutes les 2 semaines). Les interventions sont réalisées sur des animaux vigiles ou sur des animaux anesthésiés en fonction de leur poids et du type d’intervention. Pour les animaux pesants entre 70 et 120 kg, les prélèvements sanguins sont réalisés sous analgésie. Le temps d’intervention est d'environ 15 minutes par porc. Pour les animaux de 120 à 200 kg, les prélèvements sanguins et les vaccinations seront réalisés sous analgésie et anesthésie. L’anesthésiant est administré par injection intramusculaire et par la mise en place d’un masque pour l’anesthésie gazeuse. Le temps d’intervention est d'environ 35 minutes par porc incluant le temps pour le réveil de l’animal. Lors des anesthésies les animaux sont isolés dans une salle thermorégulée où la température est augmentée afin d’éviter l’hypothermie des porcs.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins peuvent être fréquents, ne dépassant pas les 10% du volume sanguin total de l'animal. Ces prélèvements peuvent provoquer des effets cliniques modérés et nécessitent une période sans prélèvements pour reconstitution du volume sanguin (selon le volume prélevé ex : une semaine de récupération pour 7.5% du sang total prélevé). Les vaccinations sont également fréquentes, impliquant l'injection de cellules tumorales avec adjuvant. Les animaux peuvent présenter des réactions cliniques modérées à la suite de ces injections. L'animal peut éprouver du stress dû à la manipulation et à l'injection répétée de substances. Une attention particulière sera portée à l'utilisation de techniques minimisant la douleur et le stress (utilisation de sédatifs ou d'anesthésiques locaux). Les symptômes cliniques modérés peuvent inclure de la fièvre, une inflammation au site d'injection, et un malaise général. Les animaux seront surveillés de près pour détecter toute réaction indésirable.

Devenir

À la fin du programme d'immunisation, l'euthanasie par exsanguination finale sous anesthésie profonde est justifiée par la nécessité de collecter une quantité maximale de sérum hyperimmun, essentiel pour la production de substances médicamenteuses. Cette procédure permet de garantir une qualité optimale du sérum sans compromettre le bien-être des animaux. L'euthanasie est également prévue en cas de non-réponse aux vaccinations ou une atteinte au bien-être de l'animal. Dans ces cas-là, elle est réalisée en utilisant un euthanasiant pour assurer une fin de vie des animaux de manière indolore et éthique.

Remplacement

Une recherche exhaustive a été menée pour identifier des méthodes alternatives sans utilisation d’animaux. Malheureusement, pour la production de sérum hyper-immunisé, les méthodes in vitro disponibles ne sont pas encore suffisamment développées pour remplacer complètement l'utilisation des animaux.

Réduction

Une planification statistique rigoureuse est utilisée pour déterminer le nombre minimum d'animaux nécessaires. Les essais préliminaires in vitro aident à affiner les protocoles expérimentaux et à réduire le nombre d’animaux requis. Les prélèvements sanguins sont planifiés de manière à maximiser la quantité de sérum collecté par animal, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaires. En outre, dans cette étude nous souhaitons optimiser le protocole d’immunisations des animaux. L’objectif de ce protocole est d’induire une meilleure réponse immune humorale par rapport aux protocoles précédemment utilisés, en améliorant l’utilisation des adjuvants, la quantité d’antigène injectée et les voies d’injection. Obtenir un protocole optimisé nous permettra d’obtenir une meilleure réponse humorale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de doses thérapeutiques d’anticorps. Les protocoles de collecte sont optimisés pour minimiser les interventions répétées.

Raffinement

Les porcs sont hébergés dans des environnements enrichis pour favoriser leur bien-être. Cela inclut des espaces suffisants pour se déplacer, des matériaux de fouissage et d’enrichissements (brosses pour les reproducteurs, chaines avec des balles, tasseaux de bois attachés des parois, objets en caoutchouc spécifiques pour le porc, arbustes en pot), et la possibilité d’interagir socialement avec d’autres porcs. L’élevage est également à température adaptée à chaque catégorie de porc (climatisation et chauffage). Les animaux sont surveillés quotidiennement et individuellement pour détecter et traiter rapidement tout signe de détresse ou de maladie. Des soins vétérinaires sont effectués sur tous les animaux qui le nécessitent. Les animaux sont manipulés avec précaution et respect. Des procédures d’analgésie et d’anesthésie ont été mises en place pour minimiser la douleur et le stress des animaux lors des injections et des prélèvements ainsi que les douleurs éventuelles post-procédures. Lors des anesthésies les animaux sont isolés dans une salle thermorégulée ou la température est augmentée afin d’éviter l’hypothermie. Les protocoles de collecte de sang ont été optimisés pour minimiser les interventions répétées. L’optimisation du protocole de vaccination permettra également d’améliorer les conditions d’injections chez les porcs (diminution du nombre et du volume d’injection). Pendant les procédures d'immunisation et prélèvement les animaux sont surveillés quotidiennement et individuellement selon une grille d’évaluation qui définit des points limites selon un score (voir en annexe). Selon le score obtenu et l’arbre décisionnel (voir en annexe), les animaux sont maintenus ou sortis du programme et/ou traités avec des analgésiques si besoin.

Choix des espèces

Le choix du modèle porcin pour la production d'anticorps polyclonaux se révèle pertinent sur plusieurs plans scientifiques et éthiques. Les porcs, avec leur système immunitaire relativement similaire à celui des humains, offrent une source efficace pour la génération d'anticorps spécifiques et en quantités significatives. Leur taille et leur physiologie facilitent les procédures de collecte et le traitement du sang, rendant leur utilisation optimale pour la production à grande échelle. Le porc est un bon compromis pour obtenir des anticorps de haute qualité tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires et en optimisant les conditions de leur traitement. Les porcs seront utilisés à plusieurs stades de développement pour assurer l'efficacité et la sécurité de la procédure d'immunisation. Tout d'abord, les porcelets sont élevés jusqu'à ce qu'ils atteignent un poids minimum de 80 kg, ce qui correspond généralement à un âge d'au moins 5 mois. Cette période de croissance permet de s'assurer qu'ils ont atteint une maturité physique suffisante pour supporter les procédures d'immunisation sans risque accru de complications. Ensuite, les animaux sont immunisés à partir de cet âge, garantissant que leur système immunitaire est suffisamment développé pour répondre efficacement à la vaccination. Enfin, des sérums hyper-immuns sont prélevés sur les porcs 35 jours après la première vaccination par prises de sang répétées, conformément aux normes éthiques de volume et de fréquence de prélèvement. Cette approche permet de recueillir des échantillons de manière sûre et éthique tout en maximisant l'efficacité de la réponse immunitaire induite.

58 souris porteuses d'une mutation qui affaiblit leurs muscles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent 37 gavages, quatorze pesées et deux mesures de force musculaire sous anesthésie, avant le prélèvement des muscles des pattes, du cœur et du diaphragme. Le porteur reconnaît que ce modèle ne reproduit qu'une forme atténuée de la maladie humaine, sans réduction d'espérance de vie ni baisse d'activité spontanée, et en conclut que le phénotype "n'est ainsi pas dommageable". L'étude est menée pour un client dont le composé doit franchir l'étape in vivo, que le porteur qualifie d'"incontournable" pour un dossier d'essai clinique.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une maladie d'origine génétique induisant une dégénérescence progressive de l’ensemble des muscles de l’organisme. Elle est liée à une anomalie responsable de la production d’une protéine impliquée dans le soutien de la fibre musculaire. Chez les patients atteints de cette maladie, qui sont à 99,5% des hommes, les fibres qui constituent les muscles squelettiques et cardiaque se détériorent à chaque contraction et finissent par se détruire. Des cellules souches musculaires tentent de régénérer le tissu musculaire lésé, mais ce processus est vite débordé et la dégénérescence finit par l’emporter. Les patients atteints de la maladie de Duchenne présentent ainsi une espérance de vie très réduite, de l'ordre de 25 ans, du fait notamment de complications cardiaques et respiratoires. La recherche est ainsi très active concernant cette maladie et plusieurs pistes visant à mise au point d’un traitement curatif sont actuellement à l’étude. Néanmoins, à aujourd'hui, il n'existe aucun traitement curatif sur le marché. Néanmoins, les patients sont le plus souvent traités par des molécules anti-inflammatoires Le présent projet vise à étudier les effets d'un composé X en développement sur les symptômes musculaires liés à la myopathie de Duchenne. Le modèle employé est un modèle de mutation génétique spontanée qui présente des symptômes proches de la maladie de Duchenne chez l'humain, bien que les symptômes soient beaucoup moins prononcés. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament (Composé X) sur les capacités musculaires du modèle de maladie de Duchenne.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter les conséquences musculaires de la maladie de Duchenne chez l'humain. Alors que plusieurs molécules ont été testées ces vingt dernières années, il n'existe toujours aucun médicament curatif de la maladie de Duchenne. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la maladie de Duchenne.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (14 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Administration de traitements par gavage (37 administrations; durée : 1 minute); 4) Mesures in vivo de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et les administrations de traitement par voie orale pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, bien que considéré comme un modèle de maladie de Duchenne d'intérêt, le modèle de souris utilisé présente un phénotype bien plus léger que l'humain. Ainsi, bien que présentant une moindre force musculaire que les souris non génétiquement modifiées, notre modèle génétique ne présente pas de réduction de l'espérance de vie, ni de différence dans l'activité spontanée, à la différence de l'humain. En effet, les défauts musculaires n'apparaissent que lors de tests impliquant un effort assez soutenu. Le phénotype de notre modèle n'est ainsi pas dommageable.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les muscles des pattes, le coeur et le diaphragme pour des analyses fonctionnelles (mesures de force musculaire ex-vivo), et histologiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de tester, suite à une première série d'études menées in vitro, le composé sur organisme entier afin de vérifier que les effets observés sur système in vitro se traduisent effectivement en un bénéfice dans le cadre de la pathologie. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre de 12 animaux par groupes utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés et en tenant compte de l'hétérogénéité du modèle. Le groupe contrôle du modèle, constitué de souris non génétiquement modifiées, a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu que la maladie de Duchenne touche à 99,5% des garçons, l'étude sera limitée au genre mâle.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par gavage oral par des expérimentateurs parfaitement formés et rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2/3 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les procédures de mesure de la force des muscles de la patte arrière seront réalisée chez la souris anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée .

Choix des espèces

Le modèle de souris choisi est classiquement utilisé pour étudier la dystrophie de Duchenne et pour tester des candidats médicaments au stade préclinique visant à traiter cette pathologie. Le modèle récapitule de nombreux symptômes de la pathologie de Duchenne, bien qu'il n'exhibe qu'une forme légère de la maladie comparativement à l'humain. Les souris seront reçues à 5 semaines d'âge. Cet âge a été déterminé en fonction de la cinétique des défaut musculaires observés chez le modèle employé. En effet, à partir de 12 semaines, ces souris commencent à présenter une hypertrophie musculaire. Bien que leur force musculaire reste inférieure à tout âge à celle des souris non génétiquement modifiées à tout âge, et compte tenu de la durée du traitement, nous souhaitons que les souris ne présentent pas une hypertrophie musculaire trop marquée en fin d'étude.

Pour désigner le vecteur viral le plus efficace avant des études réglementaires, deux macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous deux tués à l'issue pour prélever leurs organes. Ils reçoivent deux perfusions de rituximab de deux heures et une injection d'imlifidase, maintenus sur une chaise de contention pendant plus de deux heures à chaque fois, avant l'injection des vecteurs AAV. L'immunosuppression ainsi provoquée les rend plus vulnérables aux infections, et le porteur relève que ces mêmes produits peuvent déclencher chez l'humain des réactions anaphylactiques aiguës. Le nombre de deux animaux n'est adossé à aucun calcul, le porteur écrivant qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

Les vecteurs ou virus adéno-associés (AAV) sont des outils particulièrement efficaces et prometteurs pour le transfert de gènes, en partie parce que les AAV sont des virus non pathogènes capable de conduire à l'expression de gènes à long terme sans intégration de l'ADN du vecteur dans le génome de l'hôte. Cependant, la population est régulièrement exposée aux AAV. Elle peut ainsi développer une immunité dirigée contre ces AAV via la production d’anticorps neutralisants capable de détruire les produits construits avec des AAV et les empêchant d’être efficaces. L'objectif de cette étude est de sélectionner l’AAV le plus efficace après avoir inhibé temporairement la réponse immunitaire grace à des immunosupprésseurs. Pour cela le projet prévoit d'évaluer la capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique et à transduire dans le système nerveux central (SNC) de plusieurs capsides d’AAV. En cas de succès, le vecteur selectionné pourra être utilisé pour un certain nombre de maladies génétiques liées au SNC.

Bénéfices attendus

En cas de succès, le vecteur pourra être utilisé comme « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles et ainsi traiter des maladies génétiques qui affectent le système nerveux central.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à deux reprises un anticorps monoclonal (rituximab) et à une reprise l'imlifidase par voie intraveineuse. Les injections d'anticoprs dureront 2 heures et la contention sur chaise durera environ 2 heures et 10 minutes et l'injection d'imlifidase durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos de trois semaines entre les 2 administrations d'anticorps et 3 jours entre la dernière administration de l'anticorps et l'administration de l'imlifidase. Puis une semaine après l’administration de l’anticorps monoclonal les animaux recevront les AAV d’interêt. L’injection durera 15 minutes et la contention sur chaise durera environ 25 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les administrations par voie intraveineuse pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de d'injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant cette manipulation. Les études de toxicité du rituximab et de l'imlifidase aux doses precrites chez le singe cynomolgus n’ont révélé aucun autre effet que la diminution pharmacologique prévue du nombre des lymphocytes B. En revanche, chez l’humain l’administration de rituximab et de l'imilifidase peut engendrer dans les cas les plus graves des réactions inflammatoires ou anaphylactiques aigues. Après l’induction de l’immunosuppression, les animaux seront plus susceptibles de développer une infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la disctribution des AAV.

Remplacement

Les études de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique. Cette étude aura lieu chez le primate car cette espèce apporte les meilleures données transposables à l’homme concernant la traversée de la barrière hématoencéphalique mais également concernant la transduction avec les vecteurs AAV. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro et justifie le recours à des animaux.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 2 primates répartis en 1 lot. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Ces données préliminaires permettront de définir le nombre d’animaux nécessaires pour les études réglementaires. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation specifique au projet de 28 jours sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, chaise à contention). Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur. Les administrations seront réalisées sur animal vigile car l'anesthésie engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même ou peut constituer un biais pouvant interférer avec les résultats scientifiques de l'étude en modifiant les paramètres physiologiques des animaux. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin.

Choix des espèces

Les primates non humains (PNH) constituent un modèle animal privilégié pour l'optimisation des protocoles d'administration de gènes dans les système nerveux central (SNC) par les AAV avant les essais cliniques chez l’homme. En effet, il est admis que les primates non humains (PNH) présentent de nombreuses similitudes que l'on ne retrouve pas dans d'autres modèles animaux, par exemple une grande homologie de séquence d'ADN (93 % avec les macaques rhésus), des schémas d'expression génique similaires entre les cerveaux de macaques et les cerveaux humains contrairement aux cerveaux de souris. Aussi les primates et les humains ont en commun un néocortex considérablement élargi et une spécialisation des zones corticales par rapport aux souris. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses post mortem. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.