Procédures modérées

Cinq sondages du rumen, cinq prises de sang, cinq prélèvements de fèces et une biopsie de cartilage dans l'oreille : chacun des 56 veaux utilisés passe par là, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué dans le cadre du projet, tous rejoignent ensuite leur parcours d'animaux d'élevage. L'objet est de tester si une solution d'huiles essentielles donnée au jeune âge réduit durablement les émissions de méthane, un additif dont le porteur signale qu'il coûte cher à distribuer chaque jour aux vaches adultes. Les veaux sont suivis de 21 jours à 17 mois, précisément parce que le porteur veut savoir si l'effet obtenu tôt persiste un an plus tard.

Objectifs

Au sein des gaz à effet de serre, le méthane entérique, lorsqu’il est exprimé en équivalent carbone, représente 16 % de la production française. Ce gaz provient d’abord du secteur agricole, plus particulièrement des ruminants, qui en produisent naturellement via les éructations. Une grande partie des stratégies efficaces contre ce gaz mettent en place des leviers alimentaires permettant de moduler les microbes du rumen. En effet, le méthane produit par les ruminants est d’origine microbienne, des essais précédents ont tenté de modifier la population microbienne dans l’estomac des vaches pour diminuer la production de méthane. Néanmoins, ces effets ne sont pas systématiquement observés. Dans ce projet, nous proposons d'examiner le changement de population microbienne chez le veau pourrait induire un impact à long terme favorable sur les émissions de méthane ainsi que si ce changement aurait un impact la digestion et la santé de l’animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices associés sont situés à plusieurs échelles et domaines. Au sein du projet, l’acquisition de références françaises sur les veaux d’origine laitière permettra de définir leur niveau d’émission de méthane entérique et ainsi ajuster les valeurs actuellement utilisées pour calculer les émissions totales au niveau national au sein de simulations diverses. En élevage, le complément alimentaire proposé a prouvé son efficacité pour diminuer les émissions de méthane et optimiser la productivité laitière. Cependant, son application nécessite une supplémentation quotidienne de 1 g par vache, ce qui impose des contraintes financières et logistiques pour l'éleveur. Avec cette expérimentation, nous cherchons à mettre en évidence l’effet d’une persistance de cette action ciblée dans le jeune âge au-delà de la période d’administration. Enfin, sur le plan de la recherche fondamentale, ce projet permettra d’explorer le dialogue subtil entre le microbiote digestif et l’animal hôte pendant des périodes charnières de la vie. Le suivi du jus de rumen, de fèces et de sang, prélevées aux mêmes temps de vie, permet de mettre en évidence les mécanismes dynamiques qui lient le microbiote et le métabolisme de l’hôte. Il est attendu que les données collectées fournissent des enseignements majeurs pour la conception de nouveaux additifs alimentaires à la fois efficaces sur les émissions de méthane et sur les performances animales.

Procédures

56 animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Prélèvement de fèces : 5 fois, cette intervention durera environ 2 minutes maximum par animal - Prélèvement de cartilage par biopsie auriculaire : une seule fois, cette intervention durera moins de 5 secondes par animal - Prélèvement de jus de rumen : 5 fois, environ 3 minutes maximum par animal – Prise de sang : 5 fois, environ 2 minutes maximum par animal

Impact sur les animaux

Les effets indésirables dus aux interventions sont : - Le stress lié à la contention / manipulation, prélèvement de fèces, de cartilage par biopsie auriculaire et de jus de rumen - Un risque de blessure et de douleur légère liés à la manipulation, le prélèvement de cartilage par biopsie auriculaire, le prélèvement de jus de rumen et la prise de sang.

Devenir

Les animaux poursuivront ensuite leur parcours d’animaux d’élevage.

Remplacement

A ce jour, les méthodes d’évaluation indirectes des émissions de méthane entérique sont prometteuses, mais insuffisamment précises et génériques pour se passer du modèle animal. De ce fait, avoir recours aux veaux (animal cible) est obligatoire pour répondre à la problématique de cet essai.

Réduction

L’utilisation de données provenant d’un essai passé sur le microbiote ruminal de veaux prélevés au jeune âge et les méthodes statistiques ont permis de définir que 14 veaux par modalité étaient requis pour observer des résultats répondant à notre objectif.

Raffinement

Les diverses mesures envisagées ont été réduites au minimum sur le type de mesure ou leur nombre par animal afin de collecter suffisamment de données utiles pour répondre aux bénéfices attendus du projet (3.3.2.3.). Les prélèvements de fèces et de sang, voire de cartilage pour le génotypage (1 prélèvement unique) seront associés lors d’une même pesée des veaux, afin de limiter les manipulations, donc le stress et les risques de blessures pour les animaux. Afin de réduire le nombre de prélèvements fécaux sur animaux, les fèces collectées seront divisées en 2 sous-échantillons : l’un destiné à la mesure infrarouge, l’autre à l’évaluation du microbiote fécal.

Choix des espèces

Le méthane entérique, un puissant gaz à effet de serre avec un effet délétère sur le climat, est majoritairement émis par les bovins en France. En absence d’outils ou de variables substitue proxys fiables actuellement pour quantifier ces émissions, l’utilisation de bovins est essentielle pour collecter ces données et chercher des solutions de réduction du méthane entérique à l’échelle française. Le choix des veaux âgés de 21 jours à 17 mois de vie (0j à 16 mois d’essai) comme sujet d’étude résulte d’un des objectifs de l’essai concernant la programmation du microbiote ruminal des gros bovins par la consommation d’un complément alimentaire durant le jeune âge. Cela permet donc d’étudier : 1) l’effet du complément alimentaire durant le jeune âge (moins de 4 mois d’âge) ; 2) l’effet de la distribution du complément alimentaire dans le jeune âge sur les émissions des mêmes bovins après 1 année environ.

Toutes mises à mort pour des analyses moléculaires et histologiques, 746 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une greffe de cellules sous la peau, puis passe sous le pied à coulisse tous les deux jours pendant quatre semaines, endormie à chaque fois, soit une quinzaine d'anesthésies par animal. La tumeur peut entraîner une perte de poids et des ulcérations cutanées. Le porteur indique avoir déjà obtenu des résultats sur cultures cellulaires en trois dimensions, et conclut qu'il est "nécessaire" de passer à la souris parce que les cultures ne reproduisent pas les échanges entre la tumeur et le reste du corps.

Objectifs

Notre équipe modélise des altérations géniques identifiées dans des cancers et étudie les conséquences moléculaires et cellulaires de ces altérations et leur contribution à l’oncogenèse. Ainsi, dans le contexte des sarcomes, nous avons identifié des altérations génomiques conférant des propriétés oncogéniques in vitro telles que des capacités de prolifération, de clonogénicité et de formation de sphères en trois dimensions accrues. Nous devons valider maintenant nos modèles cellulaires sur un minimum d’animaux pour tenir compte du contexte physiologique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’étudier le rôle de remaniements génomiques dans l’initiation et/ou la progression tumorale de certains sarcomes L’utilisation du modèle in vivo est une étape primordiale dans la compréhension et la détermination de l’implication de ces changements génomiques dans le développement sarcomateux avec la participation du micro-environnement. Ce serait une avancée majeure sur l’étude du développement de ces cancers et, l’identification des voies dérégulées permettrait de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques afin de mieux prendre en charge ses patients. Les traitements actuels n’étant que peu efficaces sur ce type de pathologie.

Procédures

Les animaux vont subir une greffe sous-cutanée de cellules sous anesthésie, cette greffe nécessite une procédure implantatoire de moins de 5 min, le nombre d'animaux concernés est de 746. La croissance tumorale sera suivie par mesure externe au pied à coulisse (tous les 2 jours pendant 4 semaines) chez l’ensemble des animaux anesthésiés, intervention qui durera environ 5 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de stress dû à la contention/préhension des animaux. 2/ un risque mineur d’infection pour les injections sous cutanés. 3/ un risque de stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boîte à induction lors de l’injection et des mesures) et de réveil. 4/ la croissance tumorale peut également induire une perte de poids, des ulcérations et dans de rares cas des douleurs.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de réaliser des analyses moléculaires et histologiques ultérieures nécessaires à la conclusion du projet. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Les premiers tests ont montré que les modifications du génome jouent un rôle clé dans les sarcomes. Cependant, les cultures de cellules en laboratoire ne sont pas un modèle parfait, car elles ne reproduisent pas les interactions entre la tumeur et le reste du corps. Cela limite leur utilité pour des applications cliniques. De plus, lorsqu’on cultive les cellules en 3dimensions leur capacité tumorale devient encore plus marquée, ce qui montre l’importance de la structuration tridimensionnelle des cellules. Pour confirmer ces premières observations, il est nécessaire de passer à un modèle plus complet : les souris. Les souris avec un système immunitaire incomplet, permettent d'implanter des cellules humaines et d’étudier la formation de tumeurs de manière plus réaliste. Les souris avec un système immunitaire fonctionnel, quant à elles, sont utilisées pour étudier la réponse immunitaire et la croissance des tumeurs dans un système immunitaire fonctionnel. Ces modèles animaux nous aideront à mieux comprendre le rôle des modifications génétiques impliquées dans le développement des sarcomes.

Réduction

La croissance des tumeurs sera suivie de manière régulière pendant toute l’expérience, en mesurant les tumeurs de façon non invasive avec un pied à coulisse tous les 2 jours. Pour analyser les résultats, nous utiliserons un test statistique qui est couramment utilisé dans ce type d'étude. En utilisant un logiciel de calcul statistique, nous avons aussi déterminé qu'il nous faudrait un certain nombre de souris pour que les résultats soient fiables. Nous utiliserons donc des groupes de 8 souris, et répéterons les expériences jusqu'à trois fois si nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre de souris utilisé dans l'étude sera donc le maximum prévu, et pourra être réduit en fonction des résultats obtenus. L’utilisation de certaines lignées cellulaires permettra aussi de diminuer le nombre de souris nécessaires en utilisant les mêmes groupes témoins.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l’enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de mesures compensatoires et de critères d’arrêt). La croissance tumorale sera suivie par mesure au pied à coulisse ce qui permettra de suivre la croissance des cellules tumorales et d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge rapide. Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou postopératoire afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris ayant un système immunitaire incomplet, pour pouvoir greffer des cellules humaines mais aussi des souris avec un système immunitaire intact qui nous aideront à étudier comment ce système interagit avec les tumeurs. Nous choisirons des souris de 8 semaines, car elles permettent une meilleure croissance des tumeurs. De plus, en choisissant de jeunes souris, on évite les problèmes liés à l'affaiblissement des animaux plus âgés.

Une injection de cellules tumorales humaines dans la mamelle, quatre gavages quotidiens, deux séances d'imagerie TEP sous anesthésie et une nuit de jeûne : 30 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de savoir si un traceur radioactif imitant les œstrogènes permet de repérer, sans biopsie, les mutations qui rendent les traitements hormonaux inefficaces. Ces souris sont immunodéprimées pour que la tumeur humaine prenne, ce que le porteur qualifie d'"indispensable" tout en reconnaissant que cet état, qui les expose aux infections, "est considéré comme dommageable". Toutes sont tuées après les examens pour que les tumeurs soient analysées.

Objectifs

Ce projet, réalisé dans 2 établissements utilisateurs, cherche à savoir si un traceur radioactif utilisé en imagerie médicale peut aider à repérer certaines mutations génétiques dans les cancers du sein. Ce produit imite une hormone féminine, appelée œstrogène, et se fixe normalement sur des récepteurs spécifiques dans les cellules cancéreuses. Or, certaines mutations peuvent empêcher ces récepteurs de fonctionner correctement, rendant les traitements hormonaux inefficaces. L'idée est donc de vérifier si ce traceur peut détecter ces mutations sans avoir besoin de faire un prélèvement et ainsi prédire si un traitement hormonal sera efficace ou non pour chaque patiente.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices majeurs, notamment : 1- Mieux prédire l'efficacité des traitements hormonaux : Certaines patientes atteintes d'un cancer du sein reçoivent un traitement hormonal, mais si leur tumeur présente certaines mutations, ce traitement peut être inefficace. Ce projet pourrait aider à adapter le traitement. 2- Éviter des prélèvements invasifs : actuellement, pour analyser les récepteurs aux hormones féminines et détecter d'éventuelles mutations, il faut prélever un échantillon de la tumeur, ce qui peut être douloureux et risqué.

Procédures

Site 1: Les souris recevront une injection de cellules tumorales humaines pour induire un cancer du sein, ce qui prendra environ 10 minutes par souris, sous anesthésie générale. Elles seront gavées 1x par jours pendant 4 jours avec une molécule permettant l'activation des récépteurs aux oestrogènes dans la tumeur, ce qui prends 1 minutes par souris. Elles seront suivies pendant 11 jours et auront 2 examens d’imagerie médicale à J9 et J11, toujours sous anesthésie générale. Site 2: Le premier examen, d’une durée de 25 minutes, servira à détecter la présence du récepteur aux hormones féminines, grâce à une hormone féminine radioactive. Site 2: Après une nuit de jeun, le second examen d’une durée de 25 minutes, permettra d’observer l'activité métabolique de la tumeur, grâce au glucose radioactif. Cette durée de 25-30 minutes comprend l'injection du produit radioactif (5 minutes), l'anesthésie (2 à 3 minutes), l'examen (11 minutes et 20 secondes) et le réveil de l'animal. Site 2: Avant l'examen de l'activité métabolique de la tumeur, un prélèvement sanguin pour mesurer la glycémie sera effectué sur chaque souris, ce qui prendra au maximum 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sont les suivants : • Douleur liée à l’injection mammaire des cellules tumorales. • Irritation des muqueuses de l'oesophage • Hypoglycémie potentielle due à un jeûne d’environ 12 heures avant l’examen. • Hypothermie potentielle causée par l’anesthésie générale. • Douleur liée au développement tumoral. • Le modèle de souris immunodéprimées est indispensable pour permettre l’implantation de tumeur humaines sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour garantir la validité des résultats dans un contexte préclinique visant à reproduire au mieux lce qui est observé chez l’humain. L’état immunodéprimé des souris peut entraîner une vulnérabilité accrue aux infections. Bien que les animaux soient maintenus dans des environnements strictement contrôlés, cette condition est considérée comme dommageable. Cette nuisance est compensée par une surveillance quotidienne rigoureuse et des conditions d’hébergement adaptées, visant à minimiser les impacts sur le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie.

Remplacement

Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé en fonction d’analyses statistiques basées sur des résultats préalablement obtenus, et des données bibliographiques, afin de minimiser les effectifs nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. De plus, les techniques d'imagerie choisies permettent de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, un enrichissement (comme des tunnels et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite afin que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près : on surveillera la taille de la tumeur pour s’assurer qu’elle ne grossisse pas trop, et on vérifiera aussi régulièrement leur poids. À partir du 5ème jour, elles seront gavées avec la molécule qui induit l'expression des récepteurs aux œstrogènes. Ce produit peut induire une déshydratation des souris lorsqu'il est donné dans l'eau de boisson, le gavage permet donc d'éviter cet effet indésirable. Pour les examens d’imagerie, les souris seront anesthésiées afin qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant pour ne pas avoir froid, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Une fois l’examen terminé, elles resteront sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Certains examens demandent aux souris d’être à jeun pendant une nuit. Comme cela peut baisser leur taux de sucre, on vérifiera leur glycémie en prélevant une goutte de sang avant de commencer. Pendant toute la durée de cette étude, nous appliquerons les points limites que nous nous sommes fixés afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Des souris femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le cancer du sein, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser des femelles. De plus, des femelles âgées de 9 semaines ont une glande mammaire suffisamment développée pour garantir une injection correctement localisée.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trente-cinq gavages quotidiens sur cinq semaines et une prise de sang à la queue, avant d'être anesthésiée puis tuée par dislocation cervicale, son tube digestif étant prélevé pour un dosage d'ocytocine. Les composés testés appartiennent à un client du laboratoire, et le porteur reconnaît une "phase très précoce" de développement dont l'aboutissement commercial reste au conditionnel. Il indique avoir mené une première série d'essais sur cultures cellulaires, mais conclut qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité des composés dans un "organisme entier".

Objectifs

Le microbiome intestinal a été montré comme ayant un impact sur un très grand nombre de fonctions physiologiques. En effet, un nombre croissant de données indique que de nombreuses pathologies s'accompagnent d'un déséquilibre du microbiote et que la restauration de ce microbiote s'accompagne souvent d'une amélioration, voire d'une disparition des symptômes. Ainsi, certaines bactéries réduisent l'inflammation intestinale, freinent la perte osseuse, ou encore favorisent la cicatrisation des plaies cutanées. Or il a été montré que l'intestin possède des cellules capables de secréter de l'ocytocine et que cette dernière joue un rôle majeur dans l'équilibre de certaines population bactériennes et en particulier dans les effets bénéfiques. Ainsi, d'intense recherche visent aujourd'hui au développement de thérapies induisant une augmentation de la sécrétion intestinale d'ocytocine. L'objectif du présent projet est de tester la capacité d'une série de composés en développement (Composés X, Y et Z), développé par notre client, a induire une augmentation de la sécrétion d'ocytocine chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à traiter certaines pathologies inflammatoires de l'intestin ainsi que l'ostéoporose via une production accrue d'ocytocine. Bien que le projet soit une phase très précoce du développement, si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché de nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (10 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration quotidienne de placébo ou d'un candidat médicament par voie orale (35 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) à un prélèvements sanguins pratiqués à la veine de la queue (1 prélèvement; durée: 5 minute/prélèvement).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des pesées régulières ainsi qu'à des administrations de traitements par gavage pendant 5 semaines (1 semaines d'habituation et 4 semaines de traitement). Deux prélèvements sanguins seront pratiqués : l'un via la veine de la queue a D0 et l'autre par ponction cardiaque après euthanasie à D28. Enfin, au dernier jour de l'étude, les animaux seront anesthésiés par un mélange kétamine/xylazine avant dislocation cervicale immédiatement suivie d'une ponction cardiaque et du prélèvement du tube digestif. En termes de nuisances, les animaux seront soumis à du stress du fait des manipulation lors des pesées régulières de poids corporel ou des administrations de substances (traitements et anesthésie). Par ailleurs les animaux seront soumis à des douleur légère et transitoire qui ne nécessite pas de médication lors des administrations par gavage, et des prélèvements sanguins à D0.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le tyube digestif et de réaliser un dosage d'Ocytocine tissulaire.

Remplacement

Une première série d'étude a été conduite in vitro afin de vérifier l'impact des composé testés sur un modèle de cultures cellulaires ensemencées à l'aide de la bactérie L. reuteri. Néanmoins, la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de vérifier l'efficacité des composés dans un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3-4 animaux par cage) afin de satisfaire leurs besoins sociaux et auront accés à de l'eau et de la nourriture ad libitum. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

La souris, comme tout modèle animal, est un modèle qui présente des différences dans la composition exacte du microbiote comparativement à l'humain. Néanmoins, on observe une bonne conservation des grands types bactériens entre humain et souris. Par ailleurs, l'interaction microbiote/ocytocine est conservé chez les deux espèces. La souris reste donc un modèle d'intérêt sur le plan préclinique. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

Une partie des souris utilisées est génétiquement modifiée pour que leurs macrophages soient privés des deux molécules étudiées. 1 104 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chacune reçoit une plaie chirurgicale sur le dos entre les omoplates, puis est rendormie deux fois par semaine pendant trois semaines pour l'observation de la cicatrisation et le changement de pansement. Elles sont mises à mort à la fin du suivi, leurs tissus servant aux analyses post mortem qui closent le projet.

Objectifs

Une meilleure compréhension des mécanismes permettant la réparation de la peau est un enjeu de santé publique. L'avancée de nos connaissances dans ce domaine pourrait permettre l’amélioration du traitement d’épisodes cliniques aiguës (brûlure, choc mécanique, …) et chroniques (eczéma, psoriasis…) qui touchent une grande partie de la population. Malgré l’importance de ces processus, les mécanismes moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire sont encore mal connus. Des données de la littérature montrent que certaines cellules de l’immunité synthétisent des molécules bénéfiques pour la cicatrisation, en particulier des cellules appelées macrophages . En utilisant un modèle in vitro, nous avons identifié deux molécules, des facteurs de transcription, qui régulent la production par les macrophages d’une partie des molécules bénéfiques pour la cicatrisation. Les facteurs de transcription sont des molécules qui contrôlent généralement l'expression d'un grand nombre de gènes. Nous faisons donc l'hypothèse qu'à travers une étude plus poussée de ces deux facteurs de transcription dans les macrophages lors de la réparation cutanée, nous pourrons identifier de nouvelles molécules impliquées et ainsi faire progresser significativement notre compréhension globale des mécanismes de la réparation tissulaire. Le projet comporte deux objectifs : 1- déterminer si les résultats obtenus in vitro sont valides dans une situation de réparation tissulaire physiologique à l’échelle d’un organisme entier, 2- identifier de nouveaux acteurs moléculaires de la cicatrisation qui interagissent dans les macrophages avec les facteurs de transcription déjà identifiés. Pour atteindre ces objectifs, il est nécessaire d’utiliser un modèle murin de cicatrisation cutanée. Ce modèle reproduit les étapes de cicatrisation tissulaire observée chez l’homme, et nous permet d'étudier le rôle de nos molécules d'intérêt dans un environnement complexe plus représentatif d’une situation physiologique. Nous comparerons des souris normales et des souris qui ne possèdent pas ces molécules dans les macrophages. Ce projet permettra d’identifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de réparation tissulaire.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous pourrons faire avancer de manière conséquente notre connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent la réparation des tissus après une lésion. En particulier, ces résultats permettront d’identifier de nouvelles molécules contrôlant la fonction des macrophages au cours de la réparation tissulaire. Ces nouvelles molécules pourront être étudiées plus en détails dans de futurs projets, contribuant à l’avancée des connaissances scientifiques. De plus, il est établi que les macrophages jouent un rôle central dans les pathologies inflammatoires quand leur fonction de réparation est altérée, par exemple dans les ulcères, les plaies chroniques des patients diabétiques, et les fibroses (accumulation de tissu fibreux pathologique). De plus, cette fonction de réparation est également diminuée chez les sujets âgés, sans que l’on en comprenne les mécanismes. Mieux connaître les acteurs moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire dans les macrophages permettra ainsi de formuler de nouvelles hypothèses sur les causes du dysfonctionnement des macrophages dans des conditions pathologiques. Les nouvelles molécules identifiées dans ce projet pourront ainsi représenter de nouveaux candidats pour des approches thérapeutiques afin d’améliorer la régénération tissulaire et d’empêcher la fibrose dans les pathologies inflammatoires chroniques.

Procédures

Dans notre modèle, nous créons une petite blessure sur la peau des souris, et nous observons ensuite la cicatrisation au cours du temps, en prenant soin de protéger la plaie par des pansements. Pour cela, chaque animal sera anesthésié le temps de la procédure (environ 10 min), puis sera anesthésié à nouveau afin d'observer la cicatrisation et de changer le pansement (environ 3 min à chaque fois, 2 fois par semaine, pour une durée maximale de 3 semaines) .

Impact sur les animaux

Les animaux, sous anesthésie, subiront une chirurgie légère afin de créer une petite blessure sur la peau au niveau du dos entre les omoplates. Les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie (légère et rapide), risque d'hypothermie (modérée et rapide) et douleur liée à une blessure cutanée (modérée et de courte durée). Dans de rares cas, il est également possible que la plaie puisse s'infecter. Les nuisances attendues dans ce cas sont : douleurs liées à une infection (modérée et de courte durée).

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Des données de la littérature montrent que les macrophages, chez l’Homme comme chez la souris, produisent des molécules bénéfiques pour la réparation tissulaire. Nos données obtenues in vitro dans des modèles de culture cellulaire montrent que nos molécules d'intérêt régulent l’expression d’une partie de ces molécules bénéfiques. Nous souhaitons donc maintenant confirmer nos résultats dans un modèle in vivo. Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. La peau est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un équilibre. La dynamique du tissu cutané, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Enfin, certaines populations cellulaires du système immunitaire se spécialisent particulièrement en fonction de leur localisation, en particulier les macrophages. Ainsi, les macrophages de la peau ont certainement des propriétés différentes de celles de tout autre organe. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro à ce jour malgré l’existence de modèles de peau ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de comprendre les interactions cellulaires nécessaires pour la cicatrisation cutanée. Des expériences in vivo sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues in vitro. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d’outils statistiques, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le nombre de souris par condition est de 12 (4 animaux par expérience, expériences répétées 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Dans notre expérience préalable de ce modèle de cicatrisation, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans la cicatrisation de la peau.

Raffinement

Dans le cadre de ce modèle de blessure cutanée, un analgésique est administré aux animaux lors de la chirurgie. Les animaux sont surveillés tous les jours pour l’état général, afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des soins post-opératoires spécifiques seront mis en place si nécessaire (par exemple en cas de douleur ou d'infection de la plaie). Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés (telles que des souris transgéniques déficientes pour notre molécule d’intérêt ou des techniques d’analyse d’expression de gènes), ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique du composé, puis jusqu'à six prélèvements sanguins en une semaine, sous anesthésie gazeuse. L'objectif est de mesurer comment un candidat médicament se répartit dans l'organisme, pour choisir la molécule et la dose qui passeront ensuite en clinique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour ce type d'étude et que les modélisations in silico ne sont "pas encore abouties".

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés afin de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la pharmaceutique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme pharmaceitique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).

Procédures

Les administrations sront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la voie utilisée. Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique si besoin et sous anesthésie. 6 prélèvements maximum sont réalisés par animal sur une semaine (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Dans tous les cas l'inconfort ou le stress, si observé, sera de très courte durée, inférieur à 1 min. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets indésirables suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration. Si ces signes devaient néanmoins survenir ils seront de courte durée, inférieur à 1h.

Devenir

Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.

Remplacement

L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin de calculer un minimum de statistiques descriptives (moyenne, écart-type et coefficient de variation) sur les données obtenues, un minimum de 3 animaux par conditions (molécule, voie d’administration, dose, formulation, temps de prélèvement) est nécessaire. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux

Raffinement

Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des souris est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les souris à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.

Choix des espèces

Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix de la souris dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiques de cette tranche d'âge permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches en limitant le biais expérimental lié à l’âge.

Les souris de ce projet sont immunodéprimées, pour accepter la greffe de cellules pancréatiques humaines sans les rejeter. Elles sont 872, toutes tuées deux à six mois après la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après destruction de leurs propres cellules bêta, elles subissent une chirurgie de greffe, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, des prises de sang deux fois par semaine pendant vingt-quatre semaines et des tests de tolérance au glucose de deux heures et demie, avec pour effets attendus des hypoglycémies et une réaction du greffon contre l'hôte pouvant leur faire perdre plus de 20 % de leur poids. Le porteur annonce un modèle plus proche de la clinique humaine et une accélération du développement de thérapies, bénéfices renvoyés au long terme.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui présente deux formes : type 1 (T1D), caractérisée par une absence de sécrétion d’insuline causée par la perte de cellules béta pancréatiques; et type 2 (T2D), caractérisée par une résistance à l’insuline. En 2021, le T1D affectait 9 millions de personnes dans le monde et le T2D plus de 537 millions de personnes (OMS). Le traitement des deux formes de diabète est un enjeu de santé publique majeur, or il n’existe aujourd’hui aucune thérapie curative. Les seuls palliatifs chroniques sont, pour le T1D, l’injection quotidienne d’insuline et, pour le T2D, les approches thérapeutiques diminuant la résistance à l’insuline ou augmentant la sécrétion d’insuline tout en améliorant le profil métabolique. Néanmoins, les traitements actuels restent inefficaces pour soigner durablement les patients. De plus, la qualité de vie des patients reste très impactée (injections quotidiennes, complications, charge mentale) et associée à des risques importants, notamment des épisodes d’hypoglycémie dont certains peuvent être fatals (à une fréquence moyenne de 0.5 à 1 événement par an chez les patients T1D traités). Il est donc indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques comme la modulation de la réponse auto-immune dirigée contre les cellules béta, l’optimisation de la sécrétion d’insuline et l’amplification de la masse de cellules béta endogènes. Le projet présenté vise ainsi à répondre à ces besoins thérapeutiques par le développement d’un modèle animal humanisé translationnel, plus proche de la réalité clinique humaine. L’objectif du modèle est d’accélérer le développement de nouvelles thérapies et de limiter les échecs cliniques. Les objectifs du projet sont : 1) implémentation d’un modèle humanisé avec la greffe de cellules béta pancréatiques humaines productrices d’insuline dans la souris. 2) validation physiopathologique et pharmacologique du modèle : (a) dans le cadre du diabète auto-immun (T1D) : - Etude de la réaction auto-immune contre les cellules béta humaines du modèle, par des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques ou des cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC) humains, - protection par des cellules immunitaires régulatrices humaines, - et étude d’efficacité de composés pharmacologiques visant à renouveler les cellules bêta endogènes, (b) dans le cadre du T2D : - étude d’efficacité de composés pharmacologiques visant à optimiser la capacité sécrétrice d’insuline de cellules béta humaines.

Bénéfices attendus

Le projet proposera un modèle physiologique et translationnel de souris humanisées en termes de cellules béta, insuline et glycémie humaine. Ce nouveau modèle humanisé permettra de modéliser l’attaque auto immune des CD8+ et PBMC et le rôle protecteur de cellules immunitaires régulatrices. Il permettra également d’évaluer dans un contexte physiologique, l’activité de molécules potentiatrices de la sécrétion d’insuline, en développement dans le traitement du diabète de type 2, ou inductrices du renouvellement des cellules béta humaines, en développement dans le cadre du diabète de type 1. De plus, ce modèle murin de xénogreffe de cellules béta humaines pourrait, à plus long terme, permettre de développer des modèles hautement pertinents de diabète de type 2 à travers par exemple des régimes de type High Fat Diet et ainsi d’évaluer les nouvelles approches de lutte contre l’insulino-résistance et l’amélioration du profil métabolique. A plus long terme, les bénéfices attendus sont une accélération du développement de nouvelles thérapies innovantes pour le T1D et T2D et une amélioration des résultats cliniques (diminution des échecs thérapeutiques) par un meilleur criblage thérapeutique lors des phases préclinique.

Procédures

Les animaux seront soumis aux procédures suivantes: - injection intra-péritonéale jusqu'à 1 fois par jour pendant 5 jours, durée 5 min par injection, - prélèvement sanguin, 2 fois par semaine, pendant jusqu'à 24 semaines, durée 5 min par prélèvement, - chirurgie pour greffe de cellules béta pancréatiques humaines, jusqu'à 1 fois par animal, durée 15 min, procédure réalisée sous anesthésie générale, - échographie, jusqu'à 2 fois par animal, durée 30 min, procédure réalisée sous anesthésie générale, - test de tolérance au glucose, incluant 1 injection intra-péritonéale et jusqu’à 10 prélèvements sanguins pour mesure de la glycémie, procédure effectuée jusqu'à 2 fois par animal, durée 2,5 heures par procédure, - administration intra-péritonéale ou intra-veineuses de cellules immunitaires humaines ou de molécules pharmacologiques, jusqu'à 2 fois par animal, durée 5 min par injection.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les souris pourront être soumises à : - une ablation des cellules béta endogènes, - une chirurgie pour implanter des cellules béta humaines, - une administration de cellules immunitaires humaines ou de molécules pharmacologiques. Plusieurs nuisances doivent être anticipées : A) liées à l’ablation des cellules béta endogènes pouvant générer des épisodes d’hypoglycémie. B) liées à la procédure de chirurgie : - Hypothermie liée à l’anesthésie, - Saignements, douleur et stress liés à la chirurgie. C) liées à la greffe de cellules béta : - pas de douleur attendue liée à la taille de la greffe, la taille attendue restant minime, - possible hypoglycémie due à une trop forte production d’insuline par les cellules greffées pouvant éventuellement générer un état de léthargie. D) liées au suivi de la greffe de cellules béta et à l’administration de cellules immunitaires - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des prélèvements de sang. - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections de cellules immunitaires. - Réaction immunitaire de la greffe contre l’hôte (GvHD). Les symptômes de la GvHD sont une perte de poids (>20%), une posture courbée, un pelage hérissé et une perte d’activité, - Hypoglycémie transitoire. E) liées au molécules pharmacologiques administrées - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections de molécules pharmacologiques. - Les molécules pharmacologiques qui seront utilisées sont des peptides et molécules connus et n’ont pas d’effet secondaire grave décrit chez la souris.

Devenir

Les animaux utilisés pour la mise en place du modèle diabétique seront euthanasiés 2 mois après la procédure, ce qui est le temps nécessaire pour confirmer le développement du diabète. Les animaux utilisés pour la greffe de cellules béta humaines puis pour l’évaluation de leur rejet et de leur protection seront euthanasiés au plus tard 6 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour obtenir les résultats sur la survie, le rejet et la protection des cellules béta humaines.

Remplacement

Les expériences prévues dans ce projet ne peuvent pas être transposées efficacement dans un système in vitro tout en garantissant d’apporter des informations physiologiques pour les raisons suivantes : - Le projet vise à développer un modèle complexe multicellulaire humain d’une maladie métabolique incluant notamment des régulations faisant intervenir plusieurs tissus ; - L’objectif est d’évaluer l’impact de cellules immunitaires et de molécules effectrices sur la fonction de cellules béta humaines et sur leur capacité à maintenir une glycémie normale dans un environnement métabolique complet (foie, muscle, système digestif).

Réduction

Le principe de réduction du nombre d’animaux a été appliqué en premier lieu en se basant sur des résultats d’études similaires précédentes afin d’estimer statistiquement les nombres d’animaux nécessaires. Par ailleurs, pour les expériences de mise au point de protocoles, les nombres d’animaux nécessaires ont été estimés en se basant sur notre expérience de ce type d’approches. Le nombre de conditions expérimentales à comparer a également été calculé afin d’obtenir les résultats avec le nombre le plus faible possible d’animaux. Enfin, nous procéderons par étapes et conclusions intermédiaires afin, à nouveau, d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Un second aspect de la réduction du nombre d’animaux est que les personnes qui effectueront les expérimentations seront précisément formées et habituées à chaque procédure afin de réduire au maximum le risque d’échecs mais aussi de nuisance pour les animaux et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderont dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une reproductibilité optimale de nos résultats et, en conséquence, une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

La démarche de raffinement de ce projet implique : - personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, - surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Des échelles de scoring seront utilisées pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Différentes actions seront menées : - Afin de réduire le stress, les animaux seront reçus et acclimatés pendant au moins 5 jours avant une procédure. - Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. - Pour la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un analgésique. Puis une anesthésie par isoflurane. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage en isolation dans un environnement chauffé et monitoré pour sa température corporelle, hydratation, absence de douleur, et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, une analgésie sera administrée en préventif pendant 3 jours, le jour de la chirurgie inclus, 2 fois par jour espacé de 12h. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées (10 jours après la chirurgie). Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classique A2 et surveillé tous les jours. L’apparition des points limites sera surveillée avec observation des signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie. Si un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée. Nos procédures impactant la glycémie, des mesures, 2 fois par semaine, seront réalisées afin d’anticiper d’éventuels effets indésirables et les actions pour en minimiser les effets appliquées. Notamment dans le cas d’hypoglycémie (insulinome, mort des cellules béta), du sucrose sera fourni dans l’eau. Si un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal, et l’euthanasie appliquée s’il n’est pas possible de soulager l'animal.

Choix des espèces

Le choix du modèle mus musculus est lié à la praticité du modèle (taille, accessibilité) et à la disponibilité d’animaux immuno-déprimés qui favorisent l’implantation de cellules humaines ainsi qu’aux données déjà publiées sur ce type d’approches. Plus spécifiquement, le choix du modèle mus musculus est lié à l’existence de modèles publiés de greffe des cellules EndoC-bH® ainsi que d’injection de lymphocytes T ou de PBMC pour induire le rejet de greffe de cellules béta humaines. Les souris qui seront utilisées seront âgées d’entre 6 et 9 semaines au moment de l’ablation des cellules bêta endogènes. Ceci afin que les implantations de cellules EndoC-bH®, prévues 1 à 4 semaines après, soit faites sur des souris âgées de 7 à 13 semaines soit un âge permettant que l’animal ne soit pas trop petit afin de faciliter la chirurgie, tout en garantissant que les animaux seront adultes sans être trop âgés en fin de protocole soit jusqu’à 6 mois après l’implantation initiale de cellules béta.

164 lapins reçoivent une greffe de tumeur, implantée par chirurgie dans le foie ou injectée sous la peau du dos, de l'oreille ou de la glande mammaire, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur peut provoquer un inconfort pendant 42 jours, et une détection tardive de métastases pulmonaires peut s'accompagner de douleurs. Le porteur déclare vouloir développer la culture cellulaire pour cesser de produire cette lignée tumorale sur l'animal, tout en programmant l'usage de ces lapins sur cinq ans. Tous sont tués pour prélever et exploiter les tumeurs.

Objectifs

En 2023, plus de 400000 nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués. Les thérapies combinant différentes traitements ainsi que le développement de nouvelles technologies et techniques associées à la chirurgie se sont largement développées aux cours des dernières années. Il y a donc une nécessité urgente à disposer de modèles précliniques adaptés afin de pouvoir valider ces nouveaux traitements avant de les proposer aux patients. Les modèles in vitro et in vivo (rongeurs) ont leurs limites et il est primordial de pouvoir disposer de modèles moyen / gros animaux, notamment pour les dispositifs médicaux humains ne pouvant être utilisés sur des petites espèces. Parmi les animaux de taille moyenne notamment compatible avec un geste chirurgical tel qu’effectué chez l’Homme, le lapin est le seul modèle animal pour lequel un modèle tumoral est disponible: le cancer de la peau. Globalement, ce modèle permet de réaliser des tests de traitements et sa caractérisation permettra d’améliorer les pratiques lors de son utilisation. L’objectif de ce projet est la caractérisation de ce cancer permettant une standardisation. Cela permettra d’une part, un raffinement du modèle ainsi qu’une réduction à terme du nombre d’animaux utilisé notamment grace à des techniques alternatives comme la culture cellulaire en 3D. D’autre part, une meilleure connaissance du modèle permettra d’étendre les applications de recherche à différents types de cancer/traitement.

Bénéfices attendus

Les connaissances qui découleront de ce projet permettront d’aider aux développements de traitements contre le cancer par la mise au point de modèles fiables.

Procédures

Pour l’anesthésie générale, les animaux subiront deux fois une injection. Un rasage sera appliqué sur les zones d’implantation des greffes une fois. Sous anesthésie générale et antidouleur, certains animaux subiront une chirurgie (incision d’environ 3 cm) qui durera environ 30 minutes. Cette opération permettra la mise en place d’un fragment tumoral ou une suspension cellulaire dans le foie. Chez d’autres animaux, le fragment ou la suspension cellulaire sera injectée dans le foie à travers la peau (5 minutes). Enfin, d’autres animaux recevront l’injection de fragment ou suspension de cellules au niveau du dos ou de l’oreille ou de la glande mammaire sous la peau. Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine sur six semaines maximums soit 18 fois maximum. Des mesures échographiques ou au pied à coulisse sur l’animal vigile sous contention seront réalisées au minimum une fois par semaine pour suivre l’évolution des tumeurs soit maximum 8 fois sur 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables sur l’animal sont principalement marqués par : - Une douleur modérée possible durant 1 à 2 jours après la chirurgie au niveau de la zone chirurgicale et au niveau des oreilles (pose de cathéter). - Un inconfort après la chirurgie (42 jours maximum) peut être généré par la présence de la tumeur sous la peau. - Dans l’éventualité d’une détection tardive de métastase, une douleur possible de l’animal peut avoir lieu sur quelques jours lors du développement de métastase (notamment pulmonaire). - Un stress de quelques minutes peut avoir lieu lors de la manipulation pour les anesthésies/injections/mesures des tumeurs et pesées.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort dans le but de prélever, étudier et exploiter les tumeurs.

Remplacement

Le lapin est le seul modèle moyen / gros animal présentant un modèle tumoral : le VX2 (carcinome épidermoïde) pouvant être compatible avec un geste chirurgical tel qu’effectué chez l’Homme ainsi que l’utilisation de dispositifs médicaux humains. Un des objectifs de ce projet est de développer la culture de cellules pour de ne plus à avoir utiliser l’animal pour produire la tumeur.

Réduction

Pour ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour permettre le maintien, la production et la caractérisation de tumeur VX2 au cours des 5 ans. Le nombre de 4 animaux par groupe va permettre d’obtenir des données suffisantes à l’avancée du projet (pertinence des techniques et sites d’implantation, du type de greffons). Les tests in vitro réalisés en amont et l’optimisation au fur et à mesure vont permettre une réduction d’une nombre de groupe. Toutes les conditions ne seront pas testées en memes temps ce qui permettra d’arrêter le projet dès qu’on obtient un bon développement de tumeur. D’autre part, il s’agit d’une étude descriptive visant à valider de nouvelles techniques sans nécessité de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes sociaux de 2 ou 4 lapins en concertation avec l’éleveur. Ils seront isolés sur la période post-chirurgie et seront remis ensemble lorsqu’il n’y aura aucun risque pour eux de s’abîmer la cicatrice. Les animaux sont habitués aux techniciens par des temps d’échanges et distribution de friandises. L’état des animaux est évalué par un scoring biquotidien en semaine et quotidien le week-end basé sur l’aspect de l’animal, le suivi de l’alimentation et de l’abreuvement.

Choix des espèces

Le lapin est le seul modèle animal non rongeur disposant d’un modèle tumoral fiable et reproductible. Des animaux au stade adulte (environ 12 semaines) seront utilisés. Ce stade permet d’avoir des animaux avec un système immunitaire peu mature (3-3,3kg) favorisant le développement d’une tumeur.

6 312 souris mâles génétiquement modifiées pour développer des lésions précancéreuses de la prostate vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant cinq injections en une semaine et jusqu'à trois prélèvements sanguins. Certaines sont suivies jusqu'à deux ans et voient leurs lésions évoluer vers des tumeurs volumineuses, avec douleur abdominale, posture voûtée et perte de poids parmi les signes attendus. Le point limite retenu est une prostate de la taille d'une bille à la palpation, qui déclenche la mise à mort. Toutes sont tuées pour prélever la prostate et d'autres organes, le bénéfice avancé se limitant à démontrer l'intérêt des neutrophiles comme marqueur diagnostique ou comme cible thérapeutique.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure caractérisation de la progression des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate développés au laboratoire sont basés sur l’expression de la recombinase chimérique Cre-ERT2 dont l'activité est induite par le tamoxifène dans l’épithélium prostatique, afin d'inactiver à l’âge adulte le gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines (Pten). Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme [4]. À noter que l'inactivation de Trp53 dans les cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN permet de lever la barrière de sénescence, accélère le développement d'adénocarcinomes et favorise l'apparition de tumeurs sarcomatoïdes métastatiques. De plus, la perte de l'expression du récepteur à la vitamine D (VDR) favorise le developpement de métastases et de tumeurs aggressives. De récentes études, dont les notres, suggèrent un rôle important des neutrophiles, des cellules myéloïdes du système immunitaire, dans la tumorigènese prostatique. Cependant, peu d'information sont disponible sur leur hétérogénité au cours de la tumorigénèse, ni sur l'efficacité de les cibler, voire de les utiliser comme biomarqueur. L'objectif de ce projet est de déterminer en utilisant des technologies innovantes si les neutrophiles contribuent à la progression des lésions précancéreuses de la prostate induites par injection de tamoxifène. Ce projet ce déroulera dans deux Etablissement Utilisateur.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate est un des cancers masculins les plus fréquents et meurtriers, notamment en raison de limite d’efficacité pour les traitements et les options diagnostiques. Ce projet vise à démontrer l’intérêt des neutrophiles comme nouvel outil diagnostique et comme cible thérapeutique pour ces cancers réfractaires.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) (EU1). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur des animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours (EU1). Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris (EU2). Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale, une injection suivi du sacrifice (EU1). (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse). Des cohortes independantes seront injectées avec le radiomarqueur et anesthésiées au maximum 3 fois (30 min max) (EU2). Des cohortes indépendantes seront traitées (10 secondes de contentions) 2 fois par jour pendant une semaine (EU2).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection, dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Lorsque les souris transgéniques développeront les lésions précancéreuses (PIN), à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. Dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris, dans ce cas une administration de solution saline sera réalisée. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. Des secheresses ophtalmiques peuvent apparaitre au cours de l'anesthésie, dans ce cas un gel ophtalmique sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. De plus, les études longitudinales chez l'homme ne sont pas ethique puisqu'elle nécessite des biopsies à répétition. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points de cinétique ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande des cohortes de 20 animaux par point de cinétique, ce qui justifie l’utilisation des test statistiques paramétriques. Afin d’obtenir des résultats significatifs, un nombre d’animaux utilisés par condition (d’un génotype donné à un âge donné) a été calculé en fonction de la différence attendue et de l'hétérogéneité observée. Dans ces conditions, on aura besoin de 20 animaux par groupe. La tomographie par émission de positrons (TEP) est un examen d'imagerie en médecine nucléaire qui est peu invasif, les quantités de produits injectées sont de l’ordre de 0,01 mg/Kg ce qui est extrêmement faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, des points limites stricts et spécifiques au projet seront utilisés. Les points limites de l’expérience seront un volume de prostate après palpation de la taille d'une bille et le poids de la souris. Si la prostate devient volumineuse, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est trop importante ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Lors de l'anesthésie, une secheresse occulaire et une diminution de la temperature corporelle peut apparaitre. Aucun effet secondaire n'a été rapporté pour les molécules utilisées dans cette étude. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Enfin, nous procéderons à une habituation à la contention pour les injections intraperitoneales (IP). Lors des examens d'imagerie, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter le dessèchement oculaire et une injection sous cutanée de NaCl à température corporelle est réalisée pour éviter la déshydratation. De même, la température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorées en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés à l'isoflurane (air ambiant). La durée d'analyse par imagerie est restreinte au maximum (3 semaines max par souris). Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des effets de la pathologie. Le transport se fera dans un vehicule adapté dans des cages de transcports adaptées et enichies afin d'assurer la sécurité des animaux (en terme de manipulations, d’équipements utilisés, moyens de transport, conditions de transport). De plus, ils seront manipulés en évitant tout effrayement.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans les gènes Pten, Trp53 et VDR le plus fréquemment impliqués dans les cancers de la prostate humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à la prostate qui est un organe qui termine son developpement post-puberté.