Procédures modérées
Recherche d’agents d’imagerie pour discriminer la Maladie d’Alzheimer et le Diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour fournir des tissus sur lesquels les sondes d'imagerie seront testées, les souris de ce projet ne reçoivent aucun agent d'imagerie de leur vivant. 210 souris vont être utilisées, 72 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, 90 en souffrance légère et 48 en souffrance modérée. Elles portent des modèles de maladie d'Alzheimer ou de diabète de type 2, sont génotypées par un punch à l'oreille, développent pour certaines une hyperglycémie dès deux mois avec perte de poids, et sont tuées à trois, six ou douze mois selon le stade de maladie étudié. Le bénéfice annoncé, un diagnostic capable de distinguer les deux maladies, reste au stade du projet, la sélection des sondes se faisant d'abord in vitro.
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) et la maladie d'Alzheimer (MA) mettent en jeu des fibres amyloïdes, agrégats de protéines spécifiques de chaque pathologie. La détection par imagerie de ces fibres est importante à la fois pour le diagnostic et pour la compréhension des mécanismes moléculaires de ces maladies. Malgré le grand nombre d'agents d'imagerie existants pour la détection des pathologies à amyloïdes, aucun n'a jusqu'à présent montré de sélectivité permettant de discriminer les agrégats du DT2 et de la MA. Comme de plus en plus de données suggèrent l’influence de chaque pathologie sur l'incidence de l’autre, leur discrimination sélective devient importante pour leur diagnostic et le développement de potentiel traitement. Avec ce projet, nous avons l'intention de contribuer à ce domaine émergent en développant des outils sélectifs (sondes spécifiques de chaque agrégats), qui pourront servir d’agent d’imagerie pour le diagnostic. Ces outils chimiquement produits sont testés au préalable sur des agrégats de chaque pathologie in vitro. Seuls ceux ayant une capacité de reconnaissance spécifique seront testées sur des tissus post-mortem de modèles animaux rongeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer à terme des outils d'imagerie sélectifs contre les agrégats qui sont intrinsèquement liés et impliqués dans la MA et le DT2. Avec les preuves émergentes d'une influence sur l’incidence d’apparition de la MA chez les diabétiques et inversement d’un diabète chez les patients MA, le développement d'outils de diagnostic pouvant sélectivement les différencier devient primordial pour engager des traitements appropriés et personnalisés.
Procédures
Certains animaux seront injectés sous anesthésie, 1 heure avant leur euthanasie (durée : 1 min). Au moment de l’euthanasie les souris seront analgésiées 30 minutes avant de procéder à l’anesthésie. Dans ce projet il n’y a pas d’injection in vivo d’agent d’imagerie. Les tissus sont prélevés post-mortem chez les animaux pour faire des tests ex vivo. Tous les animaux seront systématiquement génotypés à partir d’une biopsie à l’oreille (durée moins d’1 min)
Impact sur les animaux
Les modèles animaux rongeurs diabétiques développent une hyperglycémie à partir de 2 mois et peuvent perdre du poids. Identification des animaux par punch à l’oreille (douleur légère et de courte durée). Injection intraveineuse sous anesthesie (risque d’hématome au niveau de l’injection)
Devenir
Les modèles animaux utilisés dans l’étude seront tous euthanasiés pour collecter le sang à des fins de suivi de marqueurs des pathologies, des tissus pour tester le bon ciblage des agents d‘imagerie avec les agrégats présents dans chaque pathologie afin de s’assurer que le diagnostic est pertinent.
Remplacement
Le projet porte sur l’étude de pathologies chroniques et à évolution progressive. L’étude de l’influence de la maladie d’Alzheimer sur le développement du diabète, et inversement, est abordée en première instance in vitro, mais il est ensuite important, pour vérifier nos données, de passer sur des modèles animaux rongeurs des 2 pathologies pour valider le potentiel discriminant de ces sondes in situ.
Réduction
Dans ce projet, plusieurs temps d'étude sont considérés pour prendre en compte l'évolution des pathologies. Afin d’obtenir des résultats statistiquement robustes, chaque groupe de souris (pathologique ou non) comporte 10 individus hébergés de façon mixte pathologique et non-pathologique. L’évolution des 2 pathologies et de leur incidence chez les hommes et les femmes étant différentes, l’étude considère les 2 sexes. Pour l’étude sur la MA, 3 temps au cours de la pathologie seront étudiés (3, 6 et 12 mois), ce qui engage 60 mâles et 60 femelles. Pour l’étude sur le DT2, 2 temps au cours de la pathologie seront étudiés (2 et 4 mois), ce qui engage 40 mâles et 40 femelles. ..
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi: petites maisons en plastique, matériel de nidification et buchettes à ronger. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par les zootechniciens et les personnes intervenant dans ce projet (état général) tout au long de l’étude, avant leur euthanasie, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les modifications de comportement et l’état général des animaux seront surveillés quotidiennement, les points limites seront estimés à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être animal spécifique au projet. Un arbre décisionnel est mis en place permettant d’intervenir en cas de douleur, par administration d’un analgésique par période de 6/8h et sur au moins 48h afin d’atténuer la douleur, voire d’euthanasier l’animal, mettant un arrêt à son expérimentation. Dans ce cas les tissus seront prélevés pour être analysés après une analgésie et une anesthésie.
Choix des espèces
L’objectif du projet est d’étudier l’influence de la maladie d’Alzheimer sur le développement du diabète de type 2 et inversement. Les modèles animaux rongeurs de chacune de ces pathologies utilisés dans ce projet reproduisent respectivement ces 2 maladies. Ils sont appropriés car ils expriment des facteurs humains qui reproduisent certains caractères de chaque maladie au cours du vieillissement. Les stades étudiés au cours du projet correspondent 1/avant le développement ou au début de la pathologie et 2/ à un stade où la maladie est installée.
Etude des effets d’un traitement sur le développement tumoral et sur le microbiote dans un modèle murin de cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Transgéniques, les souris de ce projet développent spontanément un carcinome hépatocellulaire, détectable au scanner vers vingt semaines. 40 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec une injection dans la veine caudale, sept injections intra-abdominales sur deux semaines et demie, un isolement jusqu'à dix minutes dans une cage vide pour récupérer une crotte, et un scanner hebdomadaire sous anesthésie. Le porteur écarte le rat traité par un cancérogène chimique au motif que ce traitement serait plus douloureux et brouillerait les mesures de microbiote. Toutes sont tuées à la fin du traitement pour que leur tumeur soit prélevée.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95% des cancers du foie. Il est le sixième cancer le plus fréquent dans le monde (nombre de nouveaux cas par an) et le troisième plus mortel. De plus, le nombre de cas est en augmentation constante. Le CHC apparaît à la suite d’infection chronique par le virus de l’hépatite B ou C, ou de maladies hépatiques chroniques non virales, dues à la consommation d’alcool, à l’obésité ou au diabète. Il est trois fois plus fréquent chez l’homme que chez la femme. Pendant 15 ans, un seul médicament était préconisé pour les patients dont le CHC était non opérable. Il ralentissait l’évolution de la maladie, mais permettait rarement la guérison complète. Récemment, l’utilisation de l’immunothérapie a permis d’augmenter considérablement la survie des patients, mais pour un tiers d’entre eux seulement. Il est donc très important d’identifier d’autres traitements qui pourraient bénéficier à la majorité des patients atteints de CHC et de tester leur efficacité. Les altérations de protéines impliquées dans la régulation épigénétique (qui permet de définir comment les gènes vont être utilisés par une cellule) au cours du développement des cancers ont été rapportées dans de nombreux types de cancer dont le CHC. Il a été montré, à l’aide de culture de cellules en laboratoire, que l’inhibition de ces protéines entraîne la mort des cellules cancéreuses. D’autre part, un nombre croissant d’études montre que la composition du microbiote intestinal a une influence sur la réponse des patients au traitement anti-cancéreux. Il est à noter que notre laboratoire a mis en évidence des différences dans les altérations des régulateurs épigénétiques et dans la composition du microbiote entre mâles et femelles, chez des souris transgéniques développant un CHC. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité d’inhibiteurs de protéines impliquées dans la régulation épigénétique sur la croissance d’un CHC chez les souris mâles et femelles. Nous suivrons la taille de la tumeur au cours du traitement par imagerie scanner et nous analyserons les modifications de la composition du microbiote au cours du traitement.
Bénéfices attendus
La mortalité importante et précoce des patients atteints de CHC à un stade avancé oblige à intensifier la recherche de nouveaux traitements. Le ciblage de régulateurs épigénétiques est une option qui a montré son efficacité dans des modèles murins d’autres types de cancer et qui est actuellement en développement clinique. Nous pensons que l’administration d’un inhibiteur de ces régulateurs épigénétiques entraînera une réduction de la croissance tumorale dans notre modèle murin de CHC. En outre, nous pourrons déterminer si le sexe est un composant de cette réponse. En parallèle, nous caractériserons les modifications du microbiote au cours du traitement. Notre étude devrait nous permettre de tester l’efficacité de ce type de médicaments dans le CHC, ainsi que l’influence du sexe et de la composition du microbiote sur cette efficacité. Nos résultats contribueront à déterminer si un tel traitement peut être envisagé dans le traitement du CHC chez l’Homme.
Procédures
Pour pouvoir étudier le microbiote fécal, chaque souris sera isolée deux fois dans sa vie dans une cage vide jusqu’à obtention d’une crotte (10 minutes au maximum). Concernant le traitement, elles recevront une injection intraveineuse dans la veine de la queue (durée maximum trois minutes, comprenant le temps de contention et de préparation de la veine) et sept injections intra-abdominales (durée maximum 30 secondes par injection), à raison de trois injections par semaine. La croissance de la tumeur sera suivie par imagerie une fois par semaine, ce qui nécessitera une anesthésie gazeuse d’une durée de 7 à 10 minutes.
Impact sur les animaux
- A 20 semaines, les animaux inclus dans l’expérience recevront une injection unique dans la veine caudale (environ trois minutes, comprenant la contention et la préparation de la queue), ce qui engendrera du stress et une douleur au point d’injection. - Lorsqu’ils entreront dans la procédure et à la fin de celle-ci, le prélèvement d’une crotte nécessitera de les isoler dans une cage vide (de 30 secondes à 10 minutes maximum), ce qui les stressera. - Lorsqu’ils entreront dans le protocole de traitement, les animaux recevront 3 injections intrapéritonéales par semaine, pendant deux semaines et demi (7 au total), 30 secondes par injection. Toutes les injections se feront sur souris vigiles, ce qui engendrera du stress et une douleur au point d’injection. - Les animaux seront pesés avant chaque injection (30 secondes), engendrant là aussi un stress. - Les animaux seront surveillés pour détecter des signes liés à une gêne ou une douleur générée par la présence de tumeurs hépatiques ou par l’injection du médicament.
Devenir
A la fin du traitement, les souris seront mises à mort, pour prélever leur tumeur et étudier l’effet du traitement.
Remplacement
L’efficacité du traitement que nous voulons appliquer aux souris a été démontrée sur des cellules cancéreuses en culture par de nombreux laboratoires, dont le nôtre. Mais cette approche ne permet pas d’étudier l’effet du traitement sur le cancer lorsqu’il se développe au sein d’un organe, ni les modifications et le rôle potentiel du microbiote au cours du traitement. C’est pour cette raison que nous devons tester notre traitement sur des souris qui développent un cancer du foie.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique qui a permis de déterminer qu'il fallait au minimum 9 mâles et 9 femelles par groupe (un groupe recevant le traitement et un groupe contrôle), soit 36 animaux, pour que les résultats soient statistiquement significatifs. Comme nous utilisons le nombre minimum, nous conserverons deux mâles et deux femelles supplémentaires, au cas où une des souris entrées dans l’expérience décèderait. D’autre part, grâce au suivi par imagerie, nous pourrons homogénéiser les groupes en terme de taille de tumeur au début du traitement et être sûrs de ne traiter que des souris ayant développé un CHC, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables en utilisant un nombre minimum de souris.
Raffinement
A partir de 18 semaines, soit deux semaines avant l’apparition supposée de la tumeur, l’observation minutieuse de l’état général des animaux sera effectuée 2 fois par semaine, pour détecter tout signe de souffrance lié au développement de la tumeur, en particulier un gonflement abdominal. Pendant la durée de l’expérience, un traitement de la douleur sera mis en place si des signes de souffrance légère apparaissent et des points limites ont été définis en cas de signes de souffrance plus importants. A partir de 20 semaines, le suivi du développement tumoral par imagerie permettra d’éviter aux animaux une souffrance due à une taille de tumeur importante.
Choix des espèces
Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose pour se rapprocher au mieux du développement du cancer chez le patient. Dans le cas du CHC, il est possible d’utiliser des rats traités avec un cancérogène chimique, mais le traitement chimique est plus douloureux. De plus, il risque d’avoir des effets sur le microbiote qui masqueraient ceux dus au développement de la tumeur. Comme nous souhaitons suivre l’effet du traitement lorsqu’une tumeur est présente, nous utiliserons des souris à partir de 20 semaines (âge auquel une tumeur est détectable par scanner). Nous utiliserons des animaux des deux sexes, pour étudier les différences éventuelles dans la composition du microbiote et la réponse au traitement entre mâles et femelles.
Étude d’efficacité d’un ARN messager dans un modèle d’athérosclérose précoce chez le singe cynomolgus
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Trente et un prélèvements sanguins, neuf administrations sur chaise de contention d'environ quarante minutes, douze mois de régime riche en gras et en cholestérol : 16 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour que leurs artères soient prélevées. Il s'agit de tester si un candidat médicament réduit la plaque d'athérome. Une étude préliminaire du même établissement avait provoqué des fèces liquides abondantes et une insuffisance rénale aiguë chez trois animaux soumis au régime athérogène, ce qui a conduit à en changer la composition. Le porteur justifie le choix de l'espèce par sa proximité phylogénétique avec l'humain et par le fait que ce sont des "animaux facilement manipulables".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer la capacité d’un candidat médicament à réduire la taille des plaques d’athérome dans un modèle physiopathologique d’athérosclérose précoce induit par l’alimentation chez le primate non humain
Bénéfices attendus
Les traitements actuels de l’athérosclérose sont capables de réduire efficacement le taux de cholestérol pour atteindre les niveaux recommandés par les lignes directrices. Cependant, ces traitements ne semblent pas efficaces pour diminuer la plaque d’athérome et des événements cardiovasculaires indésirables majeurs surviennent encore fréquemment. L’objectif de la molécule d’intérêt est de réduire rapidement et considérablement la plaque d'athérome dans les artères et donc de diminuer les événements cardiovasculaires chez l’homme.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux suivront un régime riche en gras et en cholestérol pendant 12 mois leur permettant de développer des plaques d’athéromes similaires à celles observées chez l’homme. L’évolution de la taille des plaques sera suivie par imagerie par résonnance magnétique chez des animaux anesthésiés. Deux sessions d'imagerie d'environ 1h seront réalisées. Pour cela le animaux seront mis à jeun la veille sur une durée n'exédant pas 16h. Tous les animaux recevront ensuite, à neuf reprises, un candidat médicament ou le contrôle. Les animaux seront vigiles lors des administrations. sessions d'imageries L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Trente-un prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Les animaux seront vigiles mais une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des récoltes d’urine individuelles seront réalisées à intervalles de temps définis (1 fois tous les 2 mois pendant les 18 premiers mois puis 4 fois par semaine pendant les 8 dernières semaines). Ces collectes seront réalisées dans les modules d’isolement de manière non invasive. Durant toute la durée de la récolte (environ 4h), l’animal sera physiquement isolé de son groupe mais gardera un contact olfactif, visuel et sonore avec ses congénères. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les publications concernant l’induction du modèle d’athérosclérose chez le singe par l’alimentation riche en gras et en cholestérol ne montrent pas d’effet néfastes sur les animaux après plusieurs mois. En revanche, un régime hyperlipidique et riche en cholestérol est susceptible dans de très rare cas d’augmenter le risque d’infarctus. Bien que non décrit par le fournisseur, ce nouveau régime pourrait également créer un inconfort intestinal au cours des premières semaines ainsi que l’apparition de diarrhées. Les IRM seront réalisées chez les animaux anesthésiés. Pour cela une mise à jeun de moins de 16h sera effectuée la veille ou le jour des manipulations, et pourra engendrer un stress et un inconfort. La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. La collecte d’urine pourra induire un stress et un inconfort car les animaux seront isolés dans le module pendant le temps de la récolte (environ 4 heures). Le contact visuel et olfactif avec les congénères sera gardé. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes d’intérêt (artères) et de confirmer l’absence de toxicité du traitement sur les autres organes.
Remplacement
La formation des plaques d’athérome est un processus complexe impliquant de nombreux phénomènes physiologiques. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.
Réduction
Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 16 primates. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables et interprétables. Afin de pouvoir répondre à l’objectif du projet, le nombre minimum d’animaux par groupe a été évalué à 7 par groupe (issues d’étude préliminaires sur d’autres modèles - données non publiées). Cette évaluation prend en compte la variabilité qu’il existe lors de l’induction des plaques d’athérome ainsi que la variabilité de réponse au traitement. Afin de pouvoir différentier les bénéfices liés au traitement des bénéficies liés à l’arrêt de l’alimentation riche en gras et cholestérol, un groupe contrôle de même taille sera nécessaire. Aussi, la mise en place du modèle d’athérosclérose précoce est longue et il existe un risque de perdre un ou deux animaux en cours d’étude (blessures sévères, pathologies sévères…), c’est pourquoi 2 animaux ont été ajoutés.
Raffinement
Bien que les animaux soient déjà acclimatés à l’environnement et aux manipulateurs plusieurs mois avant l’étude, une période d'habituation spécifique au projet, associée à du renforcement positif, sera mise en place avant le début de l’étude afin d’habituer les animaux aux manipulations et gestes techniques de l’étude (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Afin de faciliter le changement d’alimentation, l’alimentation riche en gras et en cholestérol sera introduite progressivement pendant 2 semaines afin que les animaux s’adaptent au nouveau régime. Afin de faciliter leur appétit et de maintenir l’intérêt des animaux pour la nourriture, la formulation de l’aliment riche en gras inclut un arome cacahuète. Cet arome pourra être changé au besoin. Une étude préliminaire réalisée au sein de l’établissement utilisateur avait mis en évidence la présence de fèces liquides abondantes ainsi qu’une insuffisance rénale aigüe chez trois animaux ayant suivi le régime athérogène. Afin de ne pas reproduire ces évènements, le fournisseur et la composition de l’aliment ont été changés et un travail sur la qualité de l’aliment a été réalisé : l’aliment fourni pour ce projet sera plus riche en fibre avec des fibres d’origine plus variées (incluant de l’inuline, fibre soluble fermentée par les bactéries présentes au sein du microbiote intestinal). Il sera également composé de moins de sucre et moins de cholestérol. Aucun évènement indésirable n’a été observé par le fournisseur avec ce type d’alimentation. Des points limites précoces ont été définis afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.
Choix des espèces
Le singe développe spontanément des lésions d’athérosclérose aortiques et coronaires sur plusieurs années, voire plusieurs décennies et est sensible aux régimes athérogènes. Le macaque cynomolgus présente des lésions d’athérosclérose comparables à l’homme au niveau anatomo-pathologique. De plus, le candidat médicament étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les PNH partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme et notamment une homologie de séquence de la cible thérapeutique permettant d’évaluer le candidat médicament. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis d'un candidat médicament. Par ailleurs, l’espèce macaca fascicularis a été choisis car ce sont des animaux facilement manipulables. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. Dans la mesure du possible, les mâles les plus matures disponibles seront utilisés car plusieurs études montrent que les animaux juvéniles seraient plus résistants aux régimes athérogènes. Aussi, dans ce modèle la morbidité semble augmenter avec l’âge des individus et donc il est nécessaire de ne pas prendre des animaux trop âgés.
Identification de facteurs du tissu adipeux impliqués dans l’émergence de l’insulino-résistance programmée par un retard de croissance intra-utérin dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Les souriceaux étudiés naissent avec un retard de croissance provoqué, leur mère ayant reçu un régime pauvre en protéines pendant une semaine de gestation. 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, avec pour une partie d'entre elles huit semaines de régime gras et sucré, des jeûnes de cinq à quinze heures et six prélèvements sanguins en deux heures. Le porteur indique que le transfert des nouveau-nés vers des femelles adoptantes peut provoquer un rejet, ou dans de rares cas un cannibalisme maternel. Les femelles qui ont produit ces portées sont tuées à la fin de leur période de reproduction, sans qu'aucun prélèvement soit effectué sur elles.
Objectifs
L’environnement nutritionnel fœtal peut programmer des maladies cardio-métaboliques à l’âge adulte comme la résistance à l’insuline, notamment suite à une exposition à un régime faible en protéines. Des données de la littérature suggèrent que cette programmation passerait en majorité par les hormones du stress, les glucocorticoïdes. En outre, des données récentes suggèrent que les cellules du tissu adipeux pourraient avoir un rôle important dans l’initiation et le développement de la résistance à l’insuline, aboutissant au final à l’émergence d’un diabète. Ce projet a pour objectif de i) valider cette hypothèse et ii) d’étudier les mécanismes et les molécules impliqués.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de révéler de nouveaux mécanismes associés au développement de maladies métaboliques suite à une malnutrition fœtale. De plus, cette étude pourrait mettre en évidence de nouveaux marqueurs qui pourraient être utilisés à terme pour diagnostiquer précocement des personnes fragiles ou comme des cibles thérapeutiques pertinentes pour contrer la survenue de maladies métaboliques chez l’Homme.
Procédures
Les souris femelles servant à générer les souriceaux nés avec un retard de croissance intra-utérin (qui sont l’objet de l’étude) seront exposées à un régime hypo-protéique/iso-calorique durant une semaine au cours de la gestation. Une partie des animaux sera ensuite soumise à un régime riche en graisse et en fructose pendant 8 semaines. Les animaux seront impliqués dans deux mesures de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 2 minutes. Les souris seront soumises soit à un test pour évaluer la tolérance au glucose soit un test pour évaluer la tolérance à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun (entre 5h et 15h selon le test), les souris seront injectées en intrapéritonéal ou gavés et 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 fois par animal). Enfin, une partie des animaux subira une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses. Une seconde partie des animaux sera anesthésiée et analgésiée pour réaliser un prélèvement sanguin (2-3 minutes) ou une chirurgie (8-10 minutes) immédiatement suivie de l’euthanasie en vue des prélèvements, sans réveil des animaux.
Impact sur les animaux
Le retard de croissance intra-utérin est induit par un régime faible en protéines chez la femelle en gestation. Le changement de régime pourrait induire une néophobie et une malnutrition. Afin de garantir un accès au lait similaire pour tous les souriceaux, les femelles seront hébergées de manière individualisée 5 jours avant la mise bas. Cela pourrait induire un léger stress social. Enfin, la manipulation des nouveau-nés pourrait induire un stress chez les petits ainsi que chez les femelles adoptantes pouvant induire un rejet ou dans de rares cas un cannibalisme maternel. A l’âge adulte, une partie des souris sera exposée à un régime riche en graisse et en sucre afin d’induire une altération du métabolisme lipidique et une insulino-résistance. Les animaux seront soumis à des mesures de la composition corporelle qui pourrait induire un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention durant la mesure. Les animaux seront inclus dans plusieurs tests de phénotypages métaboliques. Ces tests impliquent une mise à jeun comprise entre 5h et 15h selon les actes. Cela pourrait induire une sensation de faim au cours de ces périodes. Les challenges métaboliques pourront entrainer un stress et une douleur de courte durée liée à la contention, l’administration par gavage et/ou injection, et les prélèvements sanguin de faible volume, ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Enfin, une partie des animaux subira une unique injection au niveau de l’abdomen pouvant induire un léger stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d’introduction de l’aiguille. Les animaux seront ensuite euthanasiés après quelques minutes par une méthode réglementaire. Une autre partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés pour réaliser un prélèvement sanguin ou une chirurgie immédiatement suivie de l’euthanasie en vue des prélèvements, sans réveil des animaux.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproduction sans prélèvement. Les souris produites dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des analyses in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Ce projet est focalisé sur l’initiation de l’insulino-résistance par l’alimentation périnatale au niveau du tissu adipeux et sa propagation vers les autres tissus. Un organisme vivant est donc nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeux. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu (adipocytes, macrophages résidents, hépatocytes, cellules musculaires) avec les différentes fenêtres temporelles impliquées (périodes périnatale et adulte).
Réduction
Le projet impliquera un total de 660 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un effectif de 12 souris par groupe sera nécessaire pour les approches in vivo dynamiques telles que les tests sensibilité insuline et de tolérance orale au glucose. Les approches associées à des mesures moléculaires, et d’histologie nécessiteront un effectif plus faible du fait de la réduction de la variabilité attendue. Pour ces approches, un effectif de 8-6 souris par groupe sera nécessaire, respectivement. Concernant les approches nécessitant un tri de cellules, et vue le développement du tissu adipeux sous régime riche en graisse, un effectif de 8 souris par groupe sera nécessaire pour celui-ci et un effectif de 16 souris par groupe sera nécessaire pour celles sous régime standard. En effet, un pool de deux tissus sera obligatoire pour obtenir le nombre de cellules requises pour les analyses ultérieurs. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. La principale contrainte concerne les modifications de régime durant la période de gestation et la manipulation des nouveau-nés lors des adoptions requises dans le cadre de ce projet. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible : les petits seront roulés dans la litière souillée et mouillée de la femelle adoptante, puis séchés dans du coton issu du nid afin de faciliter la prise en charge par la femelle adoptante. Le régime riche en graisse sera placé en faible quantité afin de garantir une qualité optimale de l’aliment et son appétence. Les différentes explorations métaboliques mise en œuvre seront effectuées par du personnel formé au geste et selon des protocoles maitrisés et les mises à jeun seront réduite au maximum pour réduire la contrainte sans compromettre l’obtention des résultats scientifiques. De plus, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Le projet a pour but d’identifier le rôle du tissu adipeux dans l’initiation de l’insulino-résistance et les mécanismes impliqués dans sa propagation aux autres organes. Cette résistance à l’insuline, qui conduit au diabète, peut être programmée durant la période fœtale si la mère est exposée à une malnutrition pendant sa grossesse. Ceci pourrait impliquer les hormones du stress. De plus, la propagation de la résistance à l’insuline pourrait nécessiter une communication entre divers cellules et organes. Ainsi, nous avons besoin pour atteindre les objectifs de ce projet, d’un organisme mammifère qui présente des régulations physiologiques avec une communication inter-organes à long terme, répondant à une modification nutritionnelle durant la période fœtale et pas trop éloigner de l’Humain. La souris est le modèle le plus adapté pour ce projet. Justification des stades de développement : Au stade jeune adulte (8 semaines), une fois que la croissance terminée et que la maturité des divers organes est atteinte, la sensibilité des souris à développer une résistance à l’insuline et une obésité en réponse à un régime riche en graisse et en sucre sera étudiée.
Biomarqueurs et mécanismes de la fibrose rénale induite par obstruction urétérale unilatérale (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ligature chirurgicale de l'uretère qui bloque l'écoulement de l'urine et provoque une fibrose du rein, puis une prise de sang et une injection de colorant sous contention. Le projet cherche des marqueurs précoces de cette fibrose dans l'urine et le plasma, prélevés après la mort avec les reins. Le porteur justifie le choix de la souris en écrivant qu'elle est l'espèce "la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse" dans les conditions de la procédure.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle qui peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale si elle n’est pas correctement prise en charge. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. L’IRC est très fréquemment associé à une fibrose du rein. Alors que la fibrose est une cause majeure de l’altération de la fonction rénale, sa détection précoce et les mécanismes de sa mise en place restent encore mal connus. L’obstruction urétérale unilatérale (UUO) chirurgicale chez la souris consiste en une ligature du canal d'excrétion de l'urine du rein à la vessie. C'est un modèle classique d’induction de la fibrose rénale. L’obstruction de l’uretère bloque l’écoulement de l’urine vers la vessie, entrainant une accumulation d’urine dans le pelvis induisant une fibrose des tubules rénaux et une perte de la fonction rénale. Ce projet a pour but de rechercher les biomarqueurs urinaires et plasmatiques précoces associés à la fibrose rénale induite par une UUO chirurgicale chez la souris. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’identification de biomarqueurs et une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l'IRC liée à une obstruction urétérale.
Procédures
- Chirurgie (obstruction urétérale unilatérale): x1 (environ 10 minutes) - prélèvement de sang: x1 (environ 2 minutes) - injection d'un colorant sous contention: x1 (maximum 5 minutes). Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2. Les procédures non-terminales seront réalisées dans l’EU1. Les procédures terminales seront réalisées soit à l’EU1, soit à l’EU2 selon la disponibilité des salles et du matériel nécessaires.
Impact sur les animaux
Effet indésirable lié à l'UUO dans les 10 jours avant la mise à mort. - Chirurgie : peut provoquer de la douleur et du stress et des complications sont possibles (saignement, cicatrice mal refermée ou infectée). - Mesure de la permeabilité vasculaire rénale : légère douleur liée à l’injection dans la veine caudale sous contention - Prise de sang : risque de saignement.
Devenir
Tous les animaux sont mise à mort en vue de l'analyse de leurs reins, de leur plasma et de leur urine en post-mortem.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’IRC. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.
Réduction
La chirurgie UUO est bien maitrisée par les expérimentateurs impliqués. Cela limite les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre expérience du modèle, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 240 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique. La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autre test statistique.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les expériences réalisées au laboratoire. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec libre accès à l'eau et à la nouriture. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie définissant précisemment les points limites à ne pas dépasser. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport. Le transport est assuré seulement par les personnes formées à l’expérimentation animale. Les cages sont transportées dans des sacs isothermes (2 cages maximum par sac) de façon à limiter au maximum le stress lié aux variations de température ou aux bruits excessifs. Le trajet du transport se fait selon un plan défini selon la pièce de destination à l’EU2/2. La durée du transport peut varier entre 5 et 8 minutes selon la pièce de destination.
Choix des espèces
L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Définition des mécanismes qui contrôlent la latence d’HSV-1
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées du virus de l'herpès à la lèvre sous anesthésie, gardées un mois le temps que l'infection devienne latente, puis exposées jusqu'à sept fois à une chaleur de 43 °C pendant douze minutes pour simuler une fièvre, 1 488 souris vont être utilisées dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère. Environ 30 % d'entre elles développent une agitation permanente, une prostration, des troubles de la marche et des vocalisations spontanées ou déclenchées par le toucher, signes d'une évolution mortelle. Des lésions vésiculo-croûteuses et des lésions oculaires apparaissent au fil de l'infection. Toutes sont tuées pour prélever les ganglions trigéminés où le virus s'installe.
Objectifs
Le HSV-1, un virus entraînant des problèmes oculaires graves, peut se réactiver après une première infection et causer des lésions aux yeux. Actuellement, aucun vaccin ne peut l'empêcher de se réactiver complètement. Notre recherche vise à comprendre comment le système immunitaire peut bloquer cette réactivation du virus pour éviter ces dommages oculaires. Nous utilisons des modèles animaux pour explorer les moyens d'empêcher le virus de redevenir actif et ainsi prévenir ces problèmes de santé graves. Objectif 1 : Découvrir comment le système de défense du corps empêche la maladie grave et limite la réapparition du virus. Objectif 2 : Comprendre les détails biologiques d'une méthode qui protège contre la maladie grave et empêche le virus de se réactiver.
Bénéfices attendus
Compréhension accrue du virus HSV-1 : Il pourrait aider à mieux comprendre comment le système immunitaire contrôle ce virus spécifique, le HSV-1, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de traitement. Développement de nouvelles stratégies de prévention : En comprenant les mécanismes qui empêchent la réactivation du virus, il pourrait permettre le développement de nouvelles méthodes pour prévenir les récidives et les dommages oculaires associés. Potentielles avancées dans la recherche de vaccins : Les connaissances acquises pourraient également contribuer à la recherche de vaccins plus efficaces contre le HSV-1, qui pourrait à terme réduire les cas de maladies oculaires graves associées à ce virus. Amélioration des soins de santé : En réduisant les réactivations du HSV-1 et les complications oculaires qui en découlent, cela pourrait améliorer la qualité de vie des personnes touchées et potentiellement réduire les coûts des soins de santé liés à ces complications.
Procédures
Aucun prélèvement n’est effectué sur des animaux conscients et aucune intervention chirurgicale n’est effectuée. Infection labiale : Les animaux seront soumis à une procédure d'inoculation virale , sous anesthésie générale de courte durée (20-30 min). Ils seront surveillés quotidiennement pour l'apparition de signes de maladie et traités avec un analgésique jusqu'à la fin de l'infection virale aiguë. Certaines souris recevront un vaccin avant l'infection, et d'autres recevront une injection d'anticorps pour inhiber des réponses immunitaires spécifiques avant l'infection, durée 30 secondes par injection. Les animaux seront hébergés pendant un mois pour permettre à la phase latente de l'infection de s'établir. Simulation de fièvre : Pour induire une réactivation du HSV-1, les souris seront exposées à une chaleur de 43°C pendant 12min afin de simuler une fièvre de manière non invasive. Elles seront ensuite surveillées, séchées et ramenées à une température normale pendant 30 minutes après la simulation de fièvre. Cette procédure sera répétée jusqu’à induction d’une réactivation des réservoirs HSV-1 (7 fois au maximum).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui peuvent parfois se développer: aspect ébouriffé du pelage, perte de poids, augmentation de la fréquence respiratoire, lésions vésiculo-croûteuses au site d'injection, lésions herpétique oculaires ). Chez environ 30 % des animaux, des signes d’évolution vers une maladie plus sévère (agitation permanente, prostration et/ou troubles de la mobilité gênant la marche, et perte de poids, vocalisation spontanée ou déclenchée par le toucher) peuvent se développer indiquer une évolution fatale de la maladie. Si les mesures visant à éviter l’hypothermie après une hyperthermie ne sont pas suivies, un décès par hypothermie pourrait survenir.
Devenir
Les souris seront euthanasiées pour prélèvement des ganglions trigémineaux où prend place l’infection latente et pour évaluer la capacité de réactivation du virus.
Remplacement
Cette étude se concentre spécifiquement sur les interactions entre HSV-1 et le système immunitaire de l'hôte aux sites spécifiques de d'infection (ganglion trigéminés). Les modèles animaux sont essentiels pour ces expériences, en raison des interactions immunitaires entre le virus et l'hôte qui ne peuvent pas être modélisées in vitro de façon satisfaisante. Cependant, lorsque cela est possible, nous utilisons des tests in vitro ou ex vivo pour remplacer les animaux. Par exemple, les tests de réactivation virale sont effectués lorsque cela est possible pour remplacer les expériences in vivo.
Réduction
Nous tirons parti de notre connaissance approfondie du modèle, et des calculs statistiques (de puissance) qui permettent de définir le nombre minimal d'animaux requis pour obtenir des résultats significatifs, et ainsi réduire au minimum le nombre total d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront gardés en observation entre 3 et 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie, afin de leur permettre de s'acclimater à l'environnement. Au cours des expérimentations, un suivi clinique détaillé est effectué quotidiennement pendant la phase aiguë lorsque la maladie survient, afin de détecter tout signe de maladie et de souffrance, et avec un accès illimité à la nourriture et aux boissons. Si un point limite apparaît, les animaux seront euthanasiés dans les plus brefs délais. De plus, les manipulations sont limitées au strict nécessaire, avec des techniques réalisées sous anesthésie générale et analgésie pour la prise en charge des symptômes liés à l'infection.
Choix des espèces
Les humains sont les seuls hôtes naturels du virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1, virus de l'herpès). Cependant, certaines souris peuvent également montrer des signes de rétablissement suite à une infection aiguë au HSV-1, tout en développant une infection latente à long terme, similaire à ce qui se produit lors d'une infection chez l'homme (présence de génomes viraux et absence de production de particules virales, mais avec la capacité de se réactiver à l'avenir). De plus, la réponse immunitaire est comparable à celle observée chez l'homme. Comme les souris sont aussi de petits mammifères, elles constituent un modèle idéal pour étudier les interactions entre le système immunitaire des mammifères et le virus HSV-1 sur l'histoire naturelle de l’infection. L'âge des souris dans notre modèle est une variable importante que nous pouvons contrôler, nous infectons à 6 semaines d'âge, car après 6 semaines, les souris commencent à développer une résistance naturelle.
Etudes des effets toxiques de xénobiotiques (médicament) chez le primate non humain
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Macaques à longue queue : 1120
Les études de toxicité de ce projet, jusqu'à 80 en cinq ans, sont menées pour le compte de laboratoires qui développent des médicaments, avant tout essai chez l'humain et en vue d'une autorisation de mise sur le marché. 2 240 primates, 1 120 ouistitis et 1 120 macaques à longue queue, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, et la plupart sont tués pour l'analyse pathologique. Éveillés, ils subissent des prises de sang dans des systèmes de contention, boîte pour les macaques, tube pour les ouistitis, et peuvent subir sous anesthésie profonde des ponctions de liquide céphalorachidien jusqu'à une fois par semaine ou des biopsies d'organes, tandis que les administrations dans le crâne ou le canal rachidien comportent un risque de lésions neurologiques et de paralysie partielle. Le porteur écrit que les lignes directrices imposent de "recourir à des modèles in vivo". Deux primates par étude, qui ne reçoivent pas le produit, peuvent rester en vie et passer dans d'autres études, et l'établissement indique travailler avec des associations pour en replacer en parc zoologique.
Objectifs
L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie indispensables à l’évaluation clinique de xénobiotiques pour le compte de laboratoires les développant. Ce projet vise à d’évaluer la sécurité et la toxicité de xénobiotiques avant l’administration à l’humain, selon les lignes directrices OECD/ICH/EMA, chez deux espèces de primates non humains : le macaque Macaca fascicularis et le oustiti Callithrix jacchus. Dans le cadre d’une utilisation de primates non humain, ces xénobiotiques sont uniquement des médicaments en cours de développement. Leur évaluation est effectuée conformément aux exigences des autorités réglementaires (ICH, EMA). Elle constitue la phase « pré-clinique » du développement de médicaments, qui est un pré-requis aux essais cliniques de phase I, II et III chez l’humain et nécessaires pour l’obtention d’une AMM. Pour chaque xénobiotique, afin de caractériser ses potentiels effets toxiques, d’identifier ses organes cibles et de définir ses marges de sécurité, plusieurs études complémentaires et séquentielles sont nécessaires : - Des études préliminaires de détermination du range de doses (DRF, dose range finding) ou de la dose maximale tolérée (MTD - Maximal tolerable dose) qui constituent la première étape des évaluations toxicologiques. Elles permettent d’identifier la dose appropriée pour les études réglementaires ultérieures, notamment la toxicité à dose unique et à doses répétées. Elles aident également à déterminer les effets pharmacologiques et toxiques afin de confirmer les études règlementaires et de garantir le succès du dépôt d'une demande d'autorisation de mise sur le marché. - Des études de toxicologie réglementaires BPL (bonnes pratiques de laboratoire) qui ont pour objectif de déterminer le niveau exempt d'effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé (NOAEL) en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, de collecter des données sur la sécurité, l’efficacité et/ou la toxicité, de candidats médicament avant administration chez l’humain ou chez l’animal. Par ailleurs, le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R. Les procédures sont optimisées pour limiter le nombre d’animaux requis, agir en étapes progressive pour raffiner le choix des doses et réduire la douleur et la contrainte, notamment par l’utilisation de techniques moins invasives et la validation d’approches alternatives.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie (préliminaires et règlementaires) ont pour objectif de déterminer le niveau de dose exempt d'effets toxiques ou sans effet indésirable observé (NOAEL), en fonction de la durée du traitement, de sa voie d’administration et de l’espèce animale utilisée. Ces études permettent de collecter des données de toxicologie et pharmacocinétique de candidats médicament avant administration chez l’humain. Ces données sont des prérequis règlementaires avant le passage aux essais cliniques chez l’humain ainsi que pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM). Le projet favorisera l’application des principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), en optimisant les protocoles d’étude pour limiter l’impact sur le bien-être animal, ce qui renforcera la qualité scientifique des résultats et la conformité aux normes éthiques et réglementaires. On estime jusqu’à 4 études de toxicologie réglementaire par espèce et par an sur 5 ans (40 études règlementaires maximum) et jusqu’à 4 études préliminaires par espèce et par an sur 5 ans (40 études préliminaires maximum) pourront être réalisées.
Procédures
Les animaux sont soumis dans ce projet : - des prélèvements de sang réguliers réalisés dans le cadre de recommandations vétérinaires, vigiles (sauf en cas d'anesthésie prévus pour d'autres prélèvements, cf ci-dessous), dans un système de contention adaptée à l’espèce. Chaque prélèvement dure quelques minutes, le nombre total est établi en fonction des caractéristiques du produit testé et limité en suivant les recommandations vétérinaires internationales. -des prélèvements d'urine, de manière passif (isolement jusqu’à diurèse ou bien de 4h maximum), ou échoguidé sous sédations (quelques minutes). Généralement, un prélèvement au début et un prélèvement en fin d’étude sont suffisants. - prélèvement d’autres fluides biologiques (liquide céphalorachidien, liquide synovial) : jusqu’à une fois par semaine, sous anesthésie profonde d’une quinzaine de minutes environs - des biopsies d’organes par ponction échoguidée (mini invasive), sous anesthésie profonde (10 minutes environ) - des contention manuelle, notamment dans le cadre d'examen clinique pour détecter des effets toxiques, d’environ 10 minutes. Afin d’éviter la répétition d’actes anesthésiques, les prélèvements peuvent être réalisés au cours d’une même anesthésie, permettant, en 10 à 15 minutes, de recueillir plusieurs échantillons de tissus et liquides biologiques. A chaque étude, tous ces prélèvements ne sont pas effectués, à l’exception des prélèvements de sang et d’urine qui sont systématiques. Ils sont choisis selon la nature du produit testé et les données préliminaires déjà connues (in vivo ou in vitro).
Impact sur les animaux
Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des primates. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress chez ces espèces non domestiques - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de tissus biologiques (principalement de sang) et l’administration répétée du xénobiotique peut provoquer des lésions et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque de lésions ou d’infection lors d’administration intrathécale, intracraniale (lésions neurologiques, paralysie partielle) ou intra-articulaire (boiterie, arthrite). Enfin, les animaux sont placés en cage individuelle pendant la phase d’évaluation de la diurèse (prélèvement d’urine, durée limitée à 4 heures maximum). - Liées à une toxicité du xénobiotique testé : les études de toxicologie visent à évaluer la toxicité d’une molécule. Ce type de nuisances est difficilement estimable, mais selon le mécanisme d’action du xénobiotique (anticorps, anticancéreux, neurologique, etc), la voie d’administration, ou encore sa biodistribution, des effets toxiques sont possibles (neurologique, immunologiques, inflammation, métabolique, etc).
Devenir
Les études de toxicologie nécessitent une analyse pathologie et donc la mise à mort des animaux d'après les recommandations des instances pharmaceutiques et médicales internationales. Néanmoins, pour chaque étude, 2 animaux peuvent être inclus dans la phase de préparation uniquement sans recevoir le produit testé et donc maintenus en vie en fin d'étude et inclus après validation vétérinaire dans d'autres études dans le cadre d'une même procédure (utilisation continue). Sans produits administrés, ou bien dans le cas où une mise à mort n'est pas utile d'un point de vu scientifique,ils peuvent être réutilisés dans d'autres procédures, ou bien placés. L'établissement travaille avec des associations pour replacer ces animaux en parc zoologique.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ces études. Selon les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques, il est nécessaire de recourir à des modèles in vivo.
Réduction
Concernant les études de toxicologie règlementaire, le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues d’après les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Afin de le réduire, des animaux peuvent faire plusieurs études préliminaires après une période de repos (wash-out) et une validation vétérinaire entre chaque étude, dans le cadre d’une utilisation continue. De plus, chez les primates, selon la nature du produit, les études préliminaires peuvent être restreintes à une étude de détermination du range de doses (DRF - dose range finding), pour limiter le nombre d’animaux utilisés. Enfin, la réutilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ est possible pour les procédures de gravité réelle "modérée" tant que ces animaux n’ont pas reçu de xénobiotique en cours de test. Cela permet de réduire le nombre global d’animaux utilisé au sein de l’établissement et d’utilisés des animaux bien habitués aux manipulations liées aux études. Cette réutilisation est validée par un vétérinaire et la SBEA.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 15-21 jours est respectée à réception des animaux, suivie de 1- 2 semaines de training. Les animaux bénéficient d’un programme de training par renforcement positif pour réduire le stress/favoriser la coopération (habituation aux systèmes de contention -boîtes taxi, chaises, gilets- et manipulations progressives reproduisant les gestes techniques de l’étude). Un programme d’enrichissements validé par la SBEA est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi SBEA. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles pour réduire le stress/le risque de blessures liés à un réallotement. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase d’administration du principe actif. L’examen clinique complet est effectué par un personnel formé pour évaluer les fonctions motrices, nerveuses, cardiaques, respiratoires, la température et l’état général des animaux. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. L’établissement développe des techniques les moins invasives possibles. Ex : des gilets de télémétrie pour les marmousets, permettant d’analyser les fonctions cardiaques, respiratoires et l’activité sans contrainte physique ou pose d’implant. Des systèmes de contention adaptés sont développés pour limiter les manipulations directes et la contention manuelle des primates vigiles (chaise à contention pour perfusions intraveineus, boîte taxi pour macaques, tube à contention pour marmousets). Les volumes prélevés/administrés respectent les guidelines des bonnes pratiques de prélèvements/administration élaborés par des vétérinaires et des chercheurs.
Choix des espèces
Ces animaux sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de xénobiotiques destinés à devenir des médicaments humain. Les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques requièrent généralement deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Les primates non humains sont utilisés comme espèce non rongeur lorsque les études ne peuvent pas utiliser d’autres espèces. Les principales raisons justifiant ce choix sont : - Le caractère immunogène du xénobiotique à tester susceptible d’induire une réaction de rejet ou la formation d’anticorps chez d’autres espèces, - La cible du xénobiotique est présente uniquement chez les primates non humains, - Le métabolisme du xénobiotique est plus proche de celui de l’humain chez le primate non humain que chez les autres espèces. Selon ces lignes directrices, il convient d’utiliser de jeunes animaux sains ; les macaques sont utilisés à partir de 2 ans, les marmousets à partir d’un an.
Développement de cellules neuronales et gliales d’origine humaine dans le cerveau de souris dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des souris gestantes subissent une chirurgie abdominale d'environ une heure pour que des cellules humaines soient greffées à leurs embryons, et d'autres souris reçoivent ces cellules à la naissance, dans chaque hémisphère du cerveau, ou adultes, par une injection dans le cerveau d'une heure sous anesthésie. 1 010 souris, dont des souris immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les mécanismes de la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme que ces processus ne peuvent être étudiés que sur des animaux non-humains vivants "présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants et démontrés", alors qu'aucun test de mémoire ou de comportement ne figure parmi les procédures et que les analyses sont prévues "exclusivement ex-vivo". Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, et le cerveau de certaines, opérées puis cicatrisées, est prélevé pour apprendre à réaliser des coupes de tissu.
Objectifs
Le projet à caractère scientifique a pour objectif de décrypter les mécanismes conduisant aux pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer (MA), et impliquant certains récepteurs cellulaires. Le rôle important de ces récepteurs dans la mémoire et les processus cognitifs, progressivement altérés lors de l’évolution de la MA est démontré. L’avantage d’un modèle de greffe de cellules humaines ou selon l’appellation de « souris humanisée » est de fournir un contexte permettant de mieux appréhender les mécanismes de la dégénérescence neuronale évolutive, à des phases bien plus précoces que celles utilisées pour le diagnostic de la maladie, c’est-à-dire ceux de l’apparition des premiers symptômes chez les patients. Les nouvelles approches d’analyses sur cellule unique permettront de mieux caractériser et comparer les mécanismes moléculaires impliqués dans les formes familiale et sporadique de la MA, qui à ce jour sont suspectés différents mais encore non clairement identifiés dans les deux cas.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la pathogénèse des deux formes sporadique et familiale de la maladie d’Alzheimer (MA). A court terme, le projet devrait permettre de démontrer le potentiel des méthodes in-vivo utilisées pour décrypter ces mécanismes. Enfin, un transfert des compétences acquises et extension de l’étude sur cellules issues de patients devraient aussi permettre d’autres avancées. A plus long terme, le projet devrait pouvoir s’orienter vers l’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour la MA et offrir la possibilité de collaborer avec des start-ups déjà identifiées pour tester des molécules candidates pour traiter la MA.
Procédures
-Injections sur l’ensemble des animaux des 4 procédures (temps d’injection / animal : 15 secondes). -Chirurgie abdominale chez la souris gestante. Chaque chirurgie dure environ 60 min, en excluant les temps de préparation de l’animal et les temps post-opératoires. -Greffe de cellules chez l’embryon de souris au dernier tiers de gestation : injection 30 secondes au total. -Greffe de cellules chez la souris nouveau-né au dernier tiers de gestation : injection 45 secondes au total par hémisphère. -Greffe de cellules et/ ou de vecteur chez la souris adulte par injection dans le cerveau : injection 60 min /souris.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables chez les souris nouveau-nés comprennent le stress d’une courte séparation de leur mère (et réciproquement pour la mère par rapport à la portée), et une douleur modérée à l’injection difficile à évaluer à ce stade néonatal, mais bien anticipée par des antalgiques. Pour les souris adultes subissant une chirurgie pour injection stéréotaxique sous anesthésie, les effets indésirables sont une douleur post-opératoire modérée contrôlée et gérée par des antalgiques. Pour les souris devant subir une chirurgie abdominale, les nuisances sont une douleur modérée post-opératoire du fait de la chirurgie abdominale contrôlée, anticipée et contrôlée par des antalgiques.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans l’étude seront mis à mort à la fin de chaque procédure du fait des analyses prévues exclusivement ex-vivo. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Certains animaux ayant subi une chirururgie et totalement cicatrisés peuvent être utilisées pour prélèvements de cerveaux (apprentissage de coupes tissulaires).
Remplacement
L’évaluation des processus associés à la maladie d’Alzheimer (MA) ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants et démontrés pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages, atlas des régions cérébrales pour le repérage des structures en chirurgie), et de la manipulation plus aisée. Le modèle souris est un modèle de choix permettant de travailler sur des animaux manipulés génétiquement et est de ce fait celui retenu. Ce projet représente actuellement le seul modèle « humanisé » pour la MA permettant à terme une avancée thérapeutique ciblant les cellules humaines in-vivo et principaux acteurs en interaction constante dans l’évolution de la maladie.
Réduction
Puisqu’il s’agit d’un renouvellement de projet, les nombres d’animaux ont été optimisés par les études antérieures et sont réduits à leur minimum. Aucune étude pilote est nécessaire. Tous les protocoles d’injection sont largement maitrisés et chaque souris utilisée conduira à des résultats interprétables. Selon les résultats et leur interprétation, il est possible que la méthodologie soit à terme simplifiée sur un mode de chirurgie unique sans impact sur les objectifs scientifiques. Les analyses prévues sur cellule unique se feront selon un protocole déjà mis au point. Elles permettent d’obtenir une masse de données à partir de peu d’échantillons de tissus cérébraux. Les tissus non utilisés seront conservés à -80°C. Pour les greffes des souris dans l’utérus, les portées sont très larges, permettant de réduite à son strict minimum le nombre de souris gestantes. Le stade de greffe retenu a été optimisé lors de précédentes études, permettant une très bonne survie des nouveau-nés. Mâles et femelles seront utilisés en pourcentages les plus équivalents possibles et identifiés. Les animaux greffés seront mis à mort en fin d’expérience et non réutilisables. Le projet met en œuvre une collaboration avec un bio-informaticien possédant l’expertise des modes d’analyses transcriptomiques sur cellule unique et des tests statistiques associées. Pour les études relevant des analyses anatomiques/morphologiques, nous nous baserons sur nos études publiées selon des protocoles similaires.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance accrue, de soins pré- et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. Pour les souris immunodéficientes, des conditions maximales d’asepsie seront appliquées. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton. Durant les chirurgies, nous assurerons l’absence d’autres manipulations d’animaux dans la pièce de chirurgie et la préparation de tout le matériel sera réalisée en amont pour réduire les temps de manipulation. Deux expérimentateurs seront présents pour réduire les temps d’action. Tous les points limites seront contrôlés pour chaque procédure et anticipés par traitements analgésiques injectables. En absence d’effet, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). Les animaux seront utilisés à trois stades de développement distincts : embryonnaire, néonatal et adulte. Pour la gestation, des femelles de 8-10 semaines seront utilisées. Les souris greffées seront sevrées à 4 semaines après naissance, en séparant mâles et femelles. Tous les animaux sevrés et injectés avec des vecteurs, seront utilisés à partir de 8 semaines et testés en groupe d’âge et protocoles indépendants jusqu’à 9 mois (3, 4, 5, 7 et 9 mois). Une condition de greffe de cellules sans vecteur sera initiés dès 1 mois. Le projet vise à étudier le développement de cellules humaines dans un contexte in-vivo, se rapprochant de conditions physiologiques et pathophysiologiques et mimant au mieux ce qui se passe dans la pathogénèse de la maladie d’Alzheimer chez les patients avant l’apparition des signes cliniques et également avant celle des premiers évènements cellulaires. Mieux comprendre les interactions entre les cellules greffées et celles de l’hôte présentant des stades de maturation différents, représente également un enjeu important pour le futur et les approches de médecine régénérative à venir.
Développement des nouvelles techniques d’imagerie et optogénétique pour l’étude de la connectivité inter-hémisphérique dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
700 souris vont être utilisées sur cinq ans, chacune opérée une heure à une heure trente pour recevoir un implant optique fixé sur le crâne, puis observée sous microscope jusqu'à dix fois pendant une à deux heures. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes sont tuées, le cerveau prélevé. Une partie d'entre elles est maintenue éveillée sur un tapis roulant pendant ces séances, et le porteur signale après l'opération une douleur, une perte de poids, un risque d'inflammation et la perte possible de la barre de tête. Les retombées médicales annoncées, un meilleur ciblage des thérapies géniques en cas de maladie visuelle, restent une perspective, l'objet immédiat étant de mettre au point de nouveaux microscopes.
Objectifs
Ce projet vise à mettre au point des nouvelles technologies d’optique permettant simultanément de contrôler l’activité des neurones avec des protéines sensibles à la lumière et de les imager dans des régions du cerveau en profondeur en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques pour détecter l’activité des neurones. Nous concevons et construisons de nouveaux microscopes combinant imagerie et activation des neurones du cerveau avec la lumière en combinaison avec des fibres optiques et des microlentilles. Ces outils constituent des techniques sans précédent pour l’étude du cerveau, permettant de contrôler l’activation de cellules choisies dans des circuits neuronaux, selon des schémas mimant des processus physiologiques. Le projet nous permettra d’obtenir la cartographie des connexions interhémisphériques des circuits visuels en profondeur dans le cerveau et de pouvoir démontrer le lien entre circuits neuronaux impliqués dans la vision ainsi que dans les comportements moteurs et sensoriels.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de développer de nouvelles techniques d’optiques pour la manipulation des neurones avec la lumière et l’imagerie en simultanée à travers de microlentilles. Les circuits neuronaux moteurs et visuels en profondeur pourront être étudiés avec ces nouvelles techniques, plus précises par rapport aux méthodes actuellement utilisées. Cette étude nous permettra aussi de comprendre la structure et l’intégration de circuits et connexions interhémisphériques responsable de la perception, navigation et de la vision, afin de cibler au mieux les thérapies géniques en cas de pathologie (par exemple visuelle).
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et sous analgésie consistant à injecter des molécules d'intérêt et à poser un système optique pour étudier l'activité neuronale. (durée de la chirurgie : 1h-1h30). Une partie des animaux observés en microscopie sera éveillée, les animaux seront observés sous un microscope et sur un tapis roulant (durée : 1-2h, maximum 10 fois). Une partie des animaux observés au microscope sera injectée sous anesthésie avec un fluorophore. Une partie des animaux observés en microscopie sera libre de bouger (durée : 1-2h, maximum 10 fois). Ces animaux subiront une anesthésie pour la mise en place du support de la fibre (5 minutes).
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies, comme les implants permanents, puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire (1 à 3 jours après l’opération). Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie. Les enregistrements sous le microscope pourront causer un léger stress des animaux. Des rares effets pourront se produire pendant les chirurgies : mauvaise réaction à l’anesthésie ou saignements. Des rares effets pourront se produire après les chirurgies : perte de la barre de tête en post-opératoire ou inflammation. La contention légère de l'animal pour les injections et pour les expériences d’imagerie peut entrainer un léger stress des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin du projet. Les cerveaux seront prélevés afin d'obtenir des données anatomiques supplémentaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Une partie des expériences avec les nouvelles protéines sensibles à la lumière et les indicateurs d’activité neuronale seront faites d’abord dans des modèles cellulaires in vitro, pour identifier les plus efficaces avec les systèmes optiques développés. Des simulations par ordinateur, préalables aux expériences, sont utilisées pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des protéines sensibles à la lumière…). À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux activés par la stimulation sensorielle et motrice ne sont pas observables in vitro. L’utilisation de l’animal est donc scientifiquement indispensable à notre étude.
Réduction
Dans cette étude, le nombre total d'animaux impliqués a été rigoureusement déterminé afin de répondre aux objectifs expérimentaux. La taille des effectifs a été établie en se basant sur un calcul de puissance statistique, garantissant ainsi que l'échantillon est suffisamment représentatif pour détecter un effet significatif avec des tests statistiques tout en minimisant l'utilisation d'animaux conformément aux principes éthiques. Au total, et sur 5 ans, nous utiliserons 700 animaux.
Raffinement
Dans cette expérience, les animaux seront logés par groupes de 5 dans des cages spécialement ventilées pour garantir une bonne circulation de l'air. Ils seront examinés chaque jour par des scientifiques et des professionnels qualifiés, et bénéficieront de conditions de vie optimales : ils auront un environnement enrichi pour jouer et se dépenser, ainsi que de la nourriture et de l'eau en continu. Pour les animaux en cours d’expérimentation, un marquage spécial sera utilisé afin de les surveiller de près. Chaque test est encadré par des règles spécifiques visant à s’assurer du bien-être des animaux, et des critères clairs ont été définis pour interrompre l'expérience si nécessaire. À chaque étape, les conditions sont adaptées pour minimiser le stress des animaux. Par exemple, après une intervention chirurgicale, un gel nutritif sera mis à disposition si un animal perd du poids. Selon les procédures, des traitements d’analgésie et anesthésie seront mis en place. Afin de détecter le moindre signe de souffrance le plus tôt possible, une grille d’évaluation sera utilisée, ce qui permettra de prendre des mesures rapides et, si nécessaire, de pratiquer une euthanasie dans les cas où la douleur ne peut être contrôlée. Enfin, avant certaines observations spécifiques (comme l’observation au microscope), les animaux seront progressivement habitués à cet environnement pour réduire leur stress et faciliter le déroulement des expériences.
Choix des espèces
Notre modèle animal est la souris adulte car ce modèle, très utilisé par les laboratoires de recherche, permet d’étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques proches de l’Homme. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études sous microscope avec haute précision. Le modèle souris permet aussi de disposer d’animaux ayant des particularités génétiques pertinentes pour notre étude. Nous utiliserons des souris âgées entre 7 semaines et 1 an avec circuits neuronaux matures.
Traitement du diabète de type 1 chez la souris par administration intrapéritonéale d’anticorps ciblant le point de contrôle immunitaire PD-1 humain
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
La glycosurie sert de point limite : les souris qui déclarent un diabète sont mises à mort. 1 290 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Les femelles du modèle développent un diabète, perdent du poids et s'affaiblissent jusqu'au décès en trois semaines environ, tandis que les injections dans l'abdomen se répètent deux à trois fois par semaine pendant deux à dix semaines, avec une goutte de sang prélevée à la queue trois fois par semaine. Le porteur cherche la preuve de concept d'anticorps ciblant un point de contrôle immunitaire, et renvoie l'essai clinique chez l'adulte, puis chez l'enfant, à un éventuel succès.
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune résultant de la destruction des cellules bêta du pancréas, productrice d’insuline, par le système immunitaire. Son incidence est en constante augmentation et touche des enfants et adolescents de plus en plus jeunes. Actuellement, on ne guérit pas du diabète. Son traitement est uniquement palliatif, et implique des injections pluriquotidiennes d’insuline, impactant gravement la qualité de vie des patients et n’empêchant pas des complications à long terme. De nombreuses thérapies ont été testées dans le diabète de type 1, avec des succès souvent très mitigés, probablement dus à une intervention trop tardive, c’est-à dire chez des patients déjà diabétiques alors qu’une grande majorité des cellules bêta est détruite. Les efforts se concentrent maintenant sur la possibilité d’arrêter ou du moins freiner le développement de la maladie au stade « prédiabète ». Dans cet objectif, l'effet de nouvelles thérapies s'attaquant à la cause immunologique du diabète de type 1 sera évalué. Il s’agit en particulier de cibler des molécules appelées « points de contrôle immunitaires » présents au niveau de la membrane des cellules immunitaires permettant de contrôler/bloquer leurs fonctions. L’hypothèse est d’utiliser des anticorps qui vont augmenter l’efficacité de ces points de contrôle immunitaires et ainsi réduire l’activité du système immunitaire et la destruction des cellules bêta pancréatiques. Pour cela, un nouveau modèle de souris diabétique sera créé permettant de tester directement les mêmes anticorps développés actuellement en clinique dans d’autres maladies inflammatoires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter la preuve de concept des effets thérapeutiques de nouvelles molécules innovantes pour moduler les réponses immunitaires et prévenir le diabète de type 1 avant la destruction complète des cellules bêta pancréatiques. En cas de succès, ces recherches pourraient permettre d’envisager un premier essai clinique tout d’abord chez les patients adultes pour vérifier l’absence d’effets indésirables puis deuxièmement chez des enfants et adolescents, principales cibles des essais de prévention du diabète de type 1. Cette application clinique bénéficiera des résultats obtenus de différentes études chez l’homme testant actuellement les mêmes molécules dans différents contextes inflammatoires.
Procédures
- Injections intrapéritonéales pendant 10 secondes, effectuées 2 à 3 fois par semaine (1/jour) pendant 2 à 10 semaines. - Injection intraveineuse sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 1 seule fois. - Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectué 1 seule fois. - Prélèvement d’une goutte d’urine pour mesure de glycosurie sur souris vigile, 10 secondes, 1 fois/semaine. - Prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue pour mesure de glycémie sur souris vigile, 10 secondes, 3 fois/semaine sur 3 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris femelles développent un diabète (taux anormalement élevé de sucre dans le sang). Elles perdent alors du poids et s’affaiblissent jusqu’au décès en environ 3 semaines. Les souris peuvent également subir un léger stress lié à l’anesthésie et ressentir des douleurs modérées liées aux injections intrapéritonéales, intraveineuses et aux prélèvements sanguins.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
Des tests cellulaires appropriés seront utilisés pour répondre à des questions mécanistiques précises visant à analyser l’impact des anticorps choisis sur les réponses immunitaires. Cependant l’expérimentation animale est indispensable pour évaluer sur le vivant l’efficacité thérapeutique des stratégies proposées pour prévenir le diabète de type 1 et comprendre les mécanismes immunitaires responsables de la pathologie et de l’effet thérapeutique observé.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris traitée, plusieurs organes seront prélevés, incluant rate, ganglions et pancréas pour de multiples analyses afin d’obtenir le maximum d’informations biologiques et mécanistiques. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé, le protocole donnant le meilleur effet thérapeutique sera déterminé avant de lancer de nouvelles expériences pour comprendre les mécanismes responsables de l’effet thérapeutique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus (groupes sociaux) dans un environnement enrichi. Des points limites adaptés ont été établis (notamment la mesure du sucre dans les urines pour diagnostiquer un diabète) permettant de mettre à mort l’animal en cas de signes de souffrance ou de développement d’un diabète. Une anesthésie générale de courte durée est réalisée pour réduire la douleur de certains gestes.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix dans les études sur le diabète de type 1 étant donné la bibliographie existante sur le sujet et la caractérisation des réponses auto-immunes chez cette espèce, et leur similitude avec les observations chez l'homme. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes à partir de 6 semaines d’âge afin que les souris aient un système immunitaire mature mais suffisamment jeune pour impacter le développement du diabète.
Etudes exploratoires chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Macaques rhésus : 46
Contenus jusqu'à quatre heures pour des perfusions intraveineuses, parfois hébergés seuls pour éviter les contaminations, 302 macaques subissent des administrations quotidiennes ou hebdomadaires et des biopsies sous sédation. 256 macaques crabiers et 46 macaques rhésus sont concernés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente ces études exploratoires comme se faisant "avec peu d'animaux", au motif qu'elles sécurisent des études réglementaires plus lourdes. 70 d'entre eux pourront être gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, les 232 autres sont tués, en partie pour l'analyse histopathologique de leurs organes.
Objectifs
Ces études permettent d’établir ou de confirmer les homologies biologiques entre le primate non humain et l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce), en préparation ou en complément des études réglementaires. Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé pharmaceutique avec pour but d'assurer la santé des patients. Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans l'espèce primate non humain. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le primate non humain. Lorsqu'elles sont réalisées avant le démarrage d'études réglementaires avec des conditions particulières (voie d'administration ou investigations particulières), ces études préliminaires avec peu d'animaux permettent d'assurer le succès des études règlementaires qui nécessitent des nombres plus importants d'animaux, en évitant ainsi le risque de devoir les répéter.
Bénéfices attendus
Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de choisir les doses dans les premières études règlementaires. Elles permettent également, lors de criblages, de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans l'espèce primate non humain. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée. Les études exploratoires peuvent également être conçues pour montrer l’efficacité d’un produit, s’il est possible de l’étudier dans un modèle animal sain. En amont des études règlementaires, ces études préliminaires, avec peu d'animaux, permettent souvent d'assurer le succès des études règlementaires qui nécessitent des nombres plus importants d'animaux, en évitant ainsi le risque de devoir les répéter.
Procédures
Les animaux sont traités par différentes voies (ex : orale, injection intramusculaire) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 4h maximum dans le cas de perfusion intraveineuse. Les prélèvements seront réalisés en respectant les recommandations éthiques en vigueur adaptées au type de prélèvement et en respectant une période de récupération adaptée pour l’animal entre deux prélèvements. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile sont peu invasifs (ex : sang, par les voies veineuses périphériques) et nécessitent une contention de courte durée (jusque 4h maximum pour des perfusions intraveineuses). Pour les prélèvements nécessitant une sédation et/ou une anesthésie (ex. biopsie), l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Pour certaines études (rares), un hébergement individuel peut être requis pour collecter des données individuelles ou éviter les contaminations d'un animal à l'autre.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement : -aux effets du produit administré -à l’inconfort généré par les procédures -aux prélèvements sur animaux vigiles : stress provoqué par la contention et/ou l’hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores… préservés), le cas échéant -à la sédation/anesthésie générale -aux prélèvements comme les biopsies - Stress lors de contraintes occasionnelles liées à la procédure d’administration (ex : administration répétée) et à l’hébergement, notamment lors d’hébergement individuel, et de contentions le cas échéant, pour la réalisation de certains examens (ex : ECG).
Devenir
Les études de toxicologie peuvent inclure une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Les animaux pour lesquels aucune analyse histopathologique n'est nécessaire, et pour lequels des effets limités du traitement ont été observés peuvent être gardés en vie, et possiblement être réutilisés dans un autre projet après une période de récupération et sous réserve d'accord du vétérinaire.
Remplacement
L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament et/ou d’un dispositif médical ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Dans certains cas, l'espèce primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques (similarités physiologiques ou métaboliques Homme-primate non humain), par exemple dans le cas de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins thérapeutiques anti-cancer...).
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les prélèvements et la sensibilité des méthodes analytiques sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux. En se basant sur des tests statistiques, comprenant à minima des tests de normalité, d’analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.
Raffinement
Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (ex : graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteur) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté dans le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les mesures sont prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation.
Choix des espèces
Le choix du primate non humain est justifié par : - les homologies avec l'homme - la disponibilité d'études préliminaires sur cette espèce, - les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie… Certains composés biologiques ciblant le système immunitaire [anticorps monoclonaux, protéines et vaccins thérapeutiques (anti-cancer, anti-Alzheimer…)] doivent être testés chez le primate non humain (espèce non-rongeur avec le système immunitaire le plus proche de l'Homme). Le choix de l’espèce de primate (Macaca fascicularis, Macaca mulatta) est le plus souvent déterminé par des études in-vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’homme. La pharmacocinétique du candidat médicament est également prise en compte, ainsi que les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique. Les macaques (crabiers ou rhésus) sont les seules espèces de primates utilisées dans les études de toxicologie réglementaire. Les animaux sont généralement âgés de 2 à 4 ans. Pour certains composés, des animaux mâtures (d'un point de vue maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés (par exemple nouveau produit contraceptif, des anticancéreux, des immunomodulateurs). Dans ce cas les femelles ont en général au-moins 4 ans, et les mâles au minimum 4 à 5 ans. Pour certaines indications, il sera indispensable de tester le candidat chez un animal un peu plus jeune (20 mois minimums).
Optimisation de combinaisons de traitements à base de Radiothérapie pour des modèles murins de cancer du sein.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à vingt et une injections, dix-huit séances de radiothérapie sous anesthésie et douze gavages pour un seul animal : 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un des modèles de cancer du sein employés provoque des métastases pulmonaires à partir de trente jours, avec une détresse respiratoire et la mort de l'animal. Le porteur affirme que les séances de radiothérapie n'entraînent aucune douleur et se dispense donc d'antidouleur, et qu'aucune toxicité n'est attendue aux doses employées. Le recours à des souris génétiquement homogènes est présenté comme permettant de travailler avec un nombre d'animaux "relativement réduit", ici 2 500.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer des combinaisons de Radiothérapie (RT) avec des médicaments anticancéreux. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association et les fractionnements (dose et nombre de séances de RT) afin de pouvoir développer des essais cliniques avec les schémas d’associations les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de RT guidée par l’image et dédié au petit animal, permettant de délivrer des traitements par RT similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce projet a été évalué et validé par le comité scientifique de notre établissement.
Bénéfices attendus
En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer l’efficacité des traitements en optimisant des combinaisons innovantes, à la fois par l’évaluation de nouvelles combinaisons à bases de RT mais aussi l’optimisation des schémas de combinaisons (médicaments administrés avant, durant ou après la RT, et optimiser les doses et fractionnement de la RT…). Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les combinaisons les plus prometteuses en termes d’efficacité (évaluée par la croissance des tumeurs) sans induire de toxicités. Celles-ci pourront être sélectionnées pour le développement d’essais cliniques.
Procédures
- Injections: Une seule injection de cellules tumorales durant 5 secondes avec anesthésie des animaux sera nécessaire. Les médicaments anticancéreux seront aussi administrés par injection (3 injections/semaine pendant 1 mois soit 12 injections maximum) durant 5 secondes sur des animaux non anesthésiés ou vigiles suivant le site d'injection. Il y aura également 4 séances d'imagerie maximum par IRM et bioluminescence pour une durée entre 5 et 45 minutes qui nécessitera l'anesthésie des animaux et une injection (durant 5 secondes) par séance soit 8 injections maximum. Chaque animal pourra donc recevoir jusqu'à 21 injections maximum durant une procédure. - Gavage: admnistration durant 30 secondes de médicaments anti-cancéreux par voie orale sur des animaux non anesthésiés (3 gavages/semaine pendant 1 mois soit 12 gavages maximum) - Radiothérapie: Les animaux seront traités sous anesthésie gazeuse. Les séances de radiothérapie (jusqu’à 18 au maximum) pourront durer entre 1 minute et 5 minutes selon la technique utilisée et la dose délivrée. - Des prélèvements de sang durant 30 secondes et au nombre de 4 maximum réparties sur 3 semaines pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
La pousse de la tumeur peut engendrer une douleur de faible intensité, des faibles pertes de poids et une légère gêne à la locomotion due à l’encombrement que la tumeur peut créer. Les séances de RT et les molécules thérapeutiques évaluées n’engendrent pas de nuisances aux animaux aux doses testées et à la durée des traitements réalisés. Les injections des médicaments seront réalisées à l’aide d’aiguille induisant une douleur légère de très courte durée. Un des modèles de cancer du sein testé peut entraîner le développement de métastases pulmonaires à partir de 30 jours après l’injection dans la glande mammaire des cellules tumorales pouvant provoquer une détresse respiratoire et donc entraîner une perte de poids et la mort de l’animal.
Devenir
Etant donné que les animaux auront reçu un traitement et une injection de cellules cancéreuses, ils ne pourront être utilisés pour une autre étude. Ainsi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’étude de l’efficacité des médicaments ou des nanoparticules, combinés à la RT, ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques (distribution, métabolisme, système immunitaire…) et donc d’étude sur animaux. De plus, l’étude de combinaisons avec des immunothérapies, nécessite de travailler sur des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la RT dépend du niveau d’oxygénation (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral (composé de différents types de cellules). Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études.
Réduction
Pour l’évaluation de l’efficacité d’une combinaison, il sera nécessaire de traiter 4 groupes d’animaux : 1) Contrôle ; 2) Molécule évaluée seule (chimiothérapie, thérapie ciblée, immunothérapie, nanoparticule…); 3) RT seule; 4) Combinaison molécule + RT. Nous prévoyons d’évaluer ces efficacités avec 10 souris par groupe. Ces effectifs tiennent compte de notre expérience sur la variabilité observée et permettent de pouvoir conclure à une potentielle supériorité des combinaisons en utilisant des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, l’état des souris sera observé quotidiennement. Les injections des cellules cancéreuses sont réalisées sous anesthésie gazeuse, afin de réduire le stress et la souffrance de l’animal. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur évolution. Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie afin de maintenir les animaux immobiles et de réduire leur niveau de stress. Les animaux seront réveillés sous lampe chauffante pour éviter toute hypothermie puis replacés dans leur cage après chaque séance de RT d’une durée maximale de 5 minutes. La température moyenne dans la cabine d’irradiation est d’environ 25°c. Les séances de RT n’entrainent pas de douleur chez l’animal, elles ne nécessiteront donc pas l’emploi d’anti douleur. Aucune toxicité n’est attendue suite à la RT délivrée et les doses utilisées des médicaments associés seront celles utilisées usuellement en préclinique, commue pour ne pas induire de toxicité. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. Le groupe s’occupant du bien-être animal de notre établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Si besoin, les animaux recevront de l’alimentation gélifiée (pour limiter la déshydrations et/ou perte de poids. Un placement sous lampe chauffante sera mis en place en cas de diminution de la température corporelle des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de souris est parfaitement approprié car les expérimentations sur cellules ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme complet, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeurs dans des souris de même type permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Les animaux seront utilisés à un âge minimum de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire fonctionnel et un poids corporel d’au moins 18-20 g afin d’avoir une efficacité homogène des médicaments.