Procédures modérées

Une greffe de cellules tumorales directement dans le pancréas ou dans la rate, opération de dix minutes, ouvre le protocole pour chacune des 880 souris utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent quatre semaines de traitement, à raison de deux injections intrapéritonéales par semaine, pour mesurer l'effet d'une chimiothérapie associée à un inhibiteur de la réparation de l'ADN sur des métastases hépatiques. L'efficacité de cette association a déjà été montrée in vitro et sur deux modèles murins de tumeurs sous-cutanées, ce qui n'empêche pas de recommencer en greffe orthotopique. Le porteur justifie l'effectif par une variabilité de prise de greffe qui impose des groupes de dix animaux, sans expliquer comment on passe de dix à 880.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. Pour augmenter les chances de survie des patients, de nouvelles thérapies plus ciblées sont en développement. C’est dans ce contexte que nous avons montré un très fort effet anti-cancéreux de l’association de médicaments existants avec ces nouvelles molécules ciblées. Il s’agit maintenant d’évaluer la thérapie in vivo.

Bénéfices attendus

Il a déjà été démontré in vitro l’efficacité de l’association d'un chimiothérapeutique avec un inhibiteur spécifique de la réparation des lésions de l'ADN, dans différents modèles de cancer du pancréas et ceci à de faible dose de drogue. Cette synergie a aussi été démontré dans 1 modèle de souris immuno-déprimé et 1 modèle de souris compétentes sur des tumeurs sous-cutanées. Il s'agit maintenant d'étudier à la fois l'efficacité du traitement sur le même modèle immunocompétent mais en greffe orthotopique, ainsi que sur les métastases hépatiques obtenus lors de greffe intrasplénique, et de mettre en évidence les mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse.

Procédures

Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale d'environ 10 minutes par animal. Les traitements se déroulent sur 4 semaines à raison de deux injections intrapéritonéales par semaine (d'une durée d'une trentaine de secondes environ).

Impact sur les animaux

Effets indésirables directs : - douleur associée à une injection intra péritonéale lors des traitements ou lors de l'implantation de cellules en intra-pancréatique. Effets indésirables indirects, conséquence des produits injectés : - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale. Concernant les traitements, de nombreuses études ayant déjà été élaborées, les doses administrées aux animaux sont maîtrisées et de ce fait aucun effet indésirable dû au traitement est attendu.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.

Remplacement

Il n’existe pas encore de vrai modèle in vitro reproduisant la complexité de la tumeur et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique d'un traitement. En revanche on assiste à une transition des modèles cellulaires en 2 dimensions vers des modèles cellulaires en 3 dimensions, les organoïdes, qui reproduisent un peu plus fidèlement l’environnement humain in vivo. L’utilisation d’organoïdes est encore très complexe et ne permet pas encore de se passer d'expérimentation in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’analyse statistique sera réalisée en collaboration avec une unité de biométrie. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel. D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur la plateforme, ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Le milieu est enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et dôme en plastique opaque. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Une grille de scoring ayant été établie, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.

Choix des espèces

L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6-7 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur pancréas, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour supprimer les cellules non-β de leurs îlots pancréatiques, elles reçoivent trois injections espacées de 48 heures, avant deux tests de tolérance au glucose de deux à six heures chacun : incision de la queue sous anesthésie, injection de glucose, sept à dix microprélèvements de sang, quatre prises de sang plus importantes, et pour certains lots un gavage lipidique. L'objectif est de mesurer ce que ces cellules apportent à la régulation de la glycémie, une question dont le porteur reconnaît qu'elle a été peu explorée. Il écrit travailler par ailleurs sur un simulateur de l'homéostasie glucidique que les données tirées de ces 400 souris viendront enrichir, "afin de réduire encore le recours à l'expérimentation animale".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur l’homéostasie nutritionnelle à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules. Les principales cellules des îlots sécrétant l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir inactiver les cellules ne produisant pas l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types de cellules. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.

Procédures

Pour induire le phénotype recherché, les animaux recevrons 3 injections (10 secondes par injection) espacées de 48h. Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 2 semaines d’écart (durée du test de 2 à 6h) : une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie, s’en suivra une injection (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 7 à 10 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 4 prélèvements (30 à 60 secondes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 30min à 1h). Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après l’injection de glucose).

Impact sur les animaux

Des souris de ce type sont actuellement en élevage dans un autre laboratoire. En dehors d’une diminution de poids légère et transitoire (1-2 semaines maximum) après la suppression des cellules des îlots qui ne sécrètent pas l’insuline, aucun effet délétère n’a été recensé chez ces animaux. Dans de très rares cas, il peut arriver, malgré les soins post-expérimentaux que la queue cicatrise mal après les prélèvements de sang. Il peut aussi arriver extrêmement rarement, lors de l’injection de toucher un organe entrainant la mort de l’animal.

Devenir

A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.

Remplacement

Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non-β des îlots pancréatiques au travers du modèle que nous proposons d’étudier dans ce projet. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Une pré-étude a été réalisée antérieurement dans un autre laboratoire sur ces animaux montrant sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courant largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, le choix des animaux contrôles (témoins) produits permettra de diviser par 2 le nombre total d’animaux à produire. Nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore de 90 notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs îlots pancréatiques pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 400 animaux maximum (au lieu de 900 si les mesures précédentes n’étaient pas appliquées) seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisé assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).

Raffinement

Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 2-3 fois par semaine et tous les jours durant la semaine suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Dans les 24h suivant les expérimentations, si une perte de poids >10% est constatée, une alimentation enrichie sera mis à disposition des animaux concernés. Cette alimentation enrichie sera maintenue jusqu’à ce que ces animaux aient recouvré leur poids d’avant injection, expérimentation. Si ce n’était pas le cas après 48h, ce qui n’est encore jamais arrivé lors des précédentes études avec le même type d’induction de phénotype, les mesures graduées et points limites habituels associées de l’animalerie seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris adulte est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme adulte, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non sécrétrices d’insuline dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte mâle, de 12 à 22 semaines. Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes de micro-organes in-vitro sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’équilibre nutritionnel des mammifères impliquant de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, reins…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère adulte vivant.

Valider une formation réglementaire obligatoire pour qui veut expérimenter sur des animaux non-humains : c'est à cela que servent ces séances, où 36 stagiaires et 6 formateurs par an manipulent des souris éveillées. 420 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin des travaux pratiques. Chaque animal subit jusqu'à six préhensions et six contentions de moins de trente secondes par des personnes débutantes, plus une injection de sérum physiologique, sur une séance de deux heures. Le porteur précise que ces souris sont des reproductrices âgées ou des individus dont les caractéristiques génétiques empêchent l'adoption, et présente le fait de les faire manipuler par des novices comme un bénéfice à moyen terme pour les animaux non-humains utilisés en recherche.

Objectifs

Pour tout concepteur de projet et tout expérimentateur utilisant des animaux à des fins scientifiques, l'utilisation d'animaux est conditionnée, par la réglementation européenne en vigueur, à la validation d'une formation spécifique. Dans cette formation plusieurs items sont imposés dont un item portant sur les éléments théoriques et pratiques des interventions dites faiblement invasives, comme par exemple une injection d'un médicament ou une prise de sang. Nous prévoyons d'aborder la partie pratique de cet item à travers le visionnage de vidéos, l'utilisation de mannequins et l'observation et la manipulation (préhension, contention) de souris vigiles. La formation s'adresse à un public qui n'est pas familiarisé avec la manipulation d'animaux et qui sera amené à en manipuler dans le cadre de stages d'études et/ou de programmes de recherche biomédicale. Notre objectif est de donner l'opportunité aux stagiaires d'approcher l'animal vigile, d'observer les réactions de l'animal au contact de personnes non familières, d'appréhender ses propres réactions lors de la manipulation d'animaux vigiles, et d'acquérir les bonnes pratiques de manipulation dans le cadre des 2 gestes, préhension et contention, qui sont réalisés au préalable de toute intervention sur l'animal.

Bénéfices attendus

Les stagiaires seront les bénéficiaires de cette formation à court terme ; il s'agit de doctorants et de personnels (chercheurs et personnels techniques) de laboratoires de recherche oeuvrant dans le domaine biomédical et d'étudiants en master 2 qui se préparent à faire un stage de fin d'études ou à travailler dans la recherche fondamentale en biologie animale ou appliquée à la santé humaine ou animale. Le contact de l'animal vigile dans un cadre sécurisant pour les stagiaires et l'apprentissage des bonnes pratiques de préhension et de contention contribuent à la bientraitance animale lors de l'utilisation des animaux en science. Ainsi, à moyen terme, il y a également un bénéfice attendu pour les animaux utilisés dans les programmes de recherche.

Procédures

Tous les gestes se feront sur des animaux vigiles : au maximum chaque animal sera soumis à 6 préhensions, d'une durée de moins de 30 secondes chaque, à 6 contentions, d'une duréee de moins de 30 secondes chaque, et à 1 injection de sérum physiologique d'une durée de moins de 15 secondes.

Impact sur les animaux

Douleur légère et temporaire (10 secondes) lors de l'injection. Stress léger à modéré sur la durée (2 heures) de la séance de travaux pratiques du fait de la présence des stagiaires et de la manipulation (préhension et contention) par des personnes débutantes.

Devenir

Les souris utilisées sont des animaux de réforme (reproducteurs âgés) ou sont issues d'élevage d'animaux génétiquement modifiés avec des caractéristiques génétiques qui limitent leur réutilisation dans des projets de recherche ou empêchent leur adoption pour éviter tout croisement avec des animaux de la faune sauvage. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin des travaux pratiques.

Remplacement

Les travaux pratiques seront précédés d'une séance de présentation théorique des interventions, de visionnage de vidéos récupérées sur des sites internet dédiés à l'utilisation des animaux en science et d'utilisation de mannequins. L'objectif de ce projet est de permettre aux stagiaires d'appréhender le concret de la manipulation des animaux, de se rendre compte des réactions de l'animal vigile manipulé et des sensations de la personne qui manipule, ce qui ne peut pas être actuellement simulé en réalité virtuelle.

Réduction

Nous prévoyons d'utiliser 1 à 2 animaux par stagiaire et par formateur ; le deuxième animal sera utilisé si le premier montre des signes de stress d'intensité modérée. Une seule session de formation sera réalisée par an et accueillera au maximum 36 stagiaires encadrés par 6 formateurs. La formation sera proposée 5 ans d'affilée. Il y aura donc besoin au maximum de 2 souris pour 42 personnes par an soit 84 souris par an et 420 sur la durée de la formation. Les animaux utilisés seront des animauxde réforme ou destinés à être mis à mort à court terme du fait de caractéristiques génétiques non adaptées aux programmes de recherche.

Raffinement

En amont des travaux pratiques, les stagiaires auront acquis des connaissances sur la biologie des souris, leur comportement et les signes de stress ou de souffrance. Le calme sera exigé sur toute la durée de la séance de travaux pratiques. La séance de travaux pratiques se fera par une approche progressive : mettre sa main dans la cage pour permettre aux souris de s'habituer aux stagiaires puis des gestes de plus en plus complexes seront proposés allant de la préhension à la contention de l'animal. Les formateurs montreront les gestes et proposeront aux stagiaires de les faire sous la surveillance du formateur ; les gestes seront validés par le formateur avant de passer au geste plus complexe si le formateur juge que le stagiaire est en état (stress limité) de le faire. Ainsi, pour limiter le stress de l'animal, la progression de l'apprentissage sera adaptée à chaque stagiaire. Des points limites gradés ont été définis ; leur atteinte conduira à une réaction sans délai des formateurs.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé actuellement en recherche fondamentale en biologie animale et en recherche appliquée à la santé, 2 des domaines majeurs auxquels se destinent les stagiaires en master 2 ou dans lesquels les doctorants et les personnels de laboratoire travaillent. Les animaux seront utilisés après sevrage, après avoir dépassé un poids de 20 g, de façon à avoir une taille bien adaptée à la préhension et à la contention par des personnes débutantes.

Mesurer si les truites arc-en-ciel retrouvent après la ponte la proportion de filet, la couleur et la texture attendues du produit vendu. 1 000 truites vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour des prélèvements musculaires. Chacune est anesthésiée, sortie de l'eau une minute, marquée par un pit-tag et amputée d'un morceau de nageoire pelvienne d'environ 5 mm2, 500 d'entre elles étant ensuite pêchées à l'épuisette chaque mois, et les femelles prêtes à pondre restant à jeun cinq jours. Le porteur précise que les poissons atteindront 2 à 2,5 kg au point final, ce qui correspond au poids du produit commercialisé sous forme de filets de truite fumés.

Objectifs

Chez la truite, la reproduction affecte fortement la croissance. C’est particulièrement impactant chez la femelle qui produit une quantité d’œufs correspondant à 10 à 15 % de son poids. Au moment de la reproduction, la croissance s’arrête et elle reprend après la ponte. Cela affecte également la qualité des produits, en particulier la proportion de filets du poisson, et la couleur et la texture des filets, qui sont dégradés au moment de la ponte. Ces qualités sont ensuite restaurées. L'objectif du projet est d’évaluer si le changement de rythme de croissance, au moment de la ponte et après la ponte, affecte le nombre et l’activité des cellules souches musculaires (cellules satellites), qui vont permettre la croissance musculaire. Ce projet a également comme objectif d’évaluer la possibilité d’effectuer un sexage par échographie (méthode non invasive) des truites dès le printemps qui précède leur maturation sexuelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser l’impact de la maturation sexuelle et de la ponte sur la plasticité des cellules satellites. Nous espérons ainsi montrer que ces cellules sont la clé de la reprise de croissance et de la restauration des qualités après la ponte. Ce type de connaissance peut permettre, dans des travaux futurs, d’identifier des souches de truites ou des pratiques d’élevage favorisant cette aptitude à la récupération post-ponte des poissons. Ce projet sera également l’occasion de tester, en parallèle du sexage moléculaire sur prélèvement de nageoire, un sexage par échographie. Si cette technique non invasive s’avère fiable, elle permettra, à l’avenir, d’éviter de prélever un échantillon biologique, pratique dommageable pour les poissons.

Procédures

En début de procédure, 1000 poissons anesthésiés seront soumis une première fois à une émersion d’une 1 minute maximum, puis à l’insertion d’un pit-tag et à un prélèvement concomitant d’un échantillon de nageoire pelvienne pour sexage moléculaire. Ils seront également soumis à une mesure échographique non invasive dans l’eau qui durera 1 minute maximum. Une seconde mesure échographique sera réalisée 2 mois plus tard, lors d’une biométrie, sur les poissons anesthésiés, après l’obtention des résultats du sexage moléculaire, pour valider la fiabilité de l’identification du sexe par échographie. Puis 500 d’entre eux seront ensuite soumis une fois par mois à une pêche avec une épuisette, une anesthésie, une émersion de 30 sec pour la lecture du numéro de pit-tag, la mesure du poids et de la longueur. Enfin, ils seront également soumis à des transferts pour constituer les lots post ovulation.

Impact sur les animaux

Les poissons seront mis à jeun 72 heures avant les manipulations liées au contrôle de la maturité sexuelle, et les femelles prêtes à pondre seront mises à jeun pendant 5 jours, le temps nécessaire à la réalisation des mesures et des prélèvements avant d’être remises en élevage. La nuisance attendue de ces mises à jeun est d’intensité légère. Une nuisance d’intensité modérée sera générée par un prélèvement invasif de tissu au niveau de la nageoire pelvienne (de l’ordre de 5 mm2) pour réaliser l'analyse génétique du sexe des poissons. Pour l’observation des organes reproducteurs par échographie, le temps nécessaire est estimé à moins d’1 min par poisson. La nuisance attendue est d’intensité légère. Cette observation sera réalisée deux fois : une 1ère fois au moment du prélèvement de nageoire, et une 2nde fois lors de la biométrie où les males seront écartés. Les poissons subiront également un stress d’intensité légère engendré par la pêche, l’anesthésie et un temps d'émersion, au moment du prélèvement de nageoire, d’une durée maximale de 1 minute. La somme des nuisances attendues lors de cette procédure est classée modérée.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de projet afin de réaliser des prélèvements musculaires.

Remplacement

L'objectif du projet est de déterminer l'impact des rythmes de croissance du poisson, au moment de la ponte et après la ponte, sur la plasticité des cellules souches, en lien avec la qualité des produits. La croissance est une fonction physiologique qui impacte l’ensemble des tissus et organes de l’animal. Cette fonction interagit biologiquement avec une autre fonction essentielle qu’est la reproduction. Pour répondre à l’objectif du projet, nous devons réaliser des mesures sur des animaux en croissance, donc vivants.

Réduction

Le lot bisexué de 1000 truites incluses dans ce projet correspond à l’effectif minimum pour répondre à l’objectif fixé. En effet, il nous faut inclure 1000 truites pour disposer des 500 femelles nécessaires à la réalisation du projet. Le projet nécessite d’avoir des truites témoins immatures pour chaque point de mesure post-ponte, soit 4 points de mesure à 0, 1, 2 et 4 mois post-ponte. Le nombre requis, par point de mesure, est de 10 à 15 poissons, soit un nombre de 40 à 60 poissons immatures au total. Pour avoir ce nombre de femelles immatures, il nous faut partir d’un lot de 500 femelles, puisque seulement environ 10% (environ 50 poissons) vont rester immatures à 2 ans, tandis que les autres (450 animaux, 90%) vont maturer sexuellement et produire des œufs. Ce nombre de poissons prévus est donc l’effectif minimal pour les analyses prévues. Il permettra d’évaluer d’une part l’impact de la maturation sexuelle et de la ponte sur le nombre et l’activité des cellules satellites, en lien avec la qualité des produits et la taille des fibres musculaires, en comparant les poissons ayant pondus avec les témoins immatures à chaque point de mesure. Il permettra également d’évaluer l’effet du temps post-ponte, pour les poissons ayant pondu et les témoins immatures, en comparant les données obtenues aux différents temps de mesures, à 0, 1, 2, et 4 mois post-ponte.

Raffinement

Les prélèvements d’échantillons de nageoire, ainsi que toutes les manipulations seront réalisés sous anesthésie. Un tissu humide sera utilisé pour manipuler les poissons pour éviter la déperdition de mucus. Un prélèvement d'un petit bout de nageoire sera réalisé pour l'analyse génétique du sexe des poissons. Une surveillance des poissons sera réalisée à l'issue de ce prélèvement et dans les jours qui suivent. Des tables de suivi des soins seront mises en place et utilisées tout au long du projet. L’observation des gonades par échographie sera réalisée sur chaque poisson directement dans le bac d’anesthésie à l’occasion de biométrie.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. C’est de plus une espèce d'intérêt agronomique qui représente 95 % de la production piscicole française et l’une des espèces les plus élevées en Europe. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance qui a démontré sa capacité de reprise de croissance après la ponte. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Les poissons feront environ 600 g (16 mois post-fécondation) au début de l’expérimentation. C’est à ce stade qu’ils seront soumis à la procédure expérimentale décrite dans la présente saisine. Ils seront ensuite élevés dans les conditions standard jusqu’à l’atteinte de leur maturité sexuelle, qui débouche sur la ponte de leurs œufs, à 2 ans (1,5 - 2kg), puis lors de la phase de récupération post-ponte jusqu’à 2 ans et 4 mois pour le point final, où les poissons feront 2 - 2,5 kg. Ce poids final correspond au produit commercialisé, en condition de production, sous forme de filets de truite fumés.

Un sérum toxique pour le rein, obtenu en immunisant des moutons contre des composants du glomérule de souris, est injecté sous anesthésie à toutes les souris du projet. 760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec selon les protocoles un gavage ou une injection quotidienne pendant dix à quatorze jours et un recueil d'urine deux fois par semaine. Il s'agit de tester si l'inhibition d'une protéine de stress freine la formation des croissants cellulaires qui détruisent le filtre du rein. Le porteur décrit une prise de poids par ascite et par œdèmes après l'injection du sérum, puis conclut que les protocoles sont "relativement courts" et qu'il ne devrait pas observer de complications trop sévères.

Objectifs

Les maladies rénales affectent dix pour cent de la population mondiale avec une incidence croissante et elles représentent de nos jours un véritable enjeu de santé publique. Si ces maladies ne sont pas prises en charge, elles peuvent aboutir à une insuffisance rénale terminale (IRCT). L'IRCT est associée à une importante mortalité cardiovasculaire et à un coût élevé pour la société (environ 4 milliards d'euros par an en France). L'une des causes les plus sévère d'IRCT sont les glomérulonéphrites extracapillaires (GEC). Les GEC sont associées à une prolifération anormale de cellules rénales : les cellules épithéliales pariétales formant un "croissant" cellulaire dans le glomérule, unité de filtration du rein. Des données suggèrent l'implication des protéines de stress dans le développement de ces croissants. Il a été démontré que l'une de ces protéines de stress aurait un rôle délétère dans la GEC faisant de cette protéine une cible thérapeutique potentielle. Le principal modèle murin de GEC est caractérisé par l'injection d'un sérum toxique pour les reins (sérum obtenu après immunisation de mouton contre des composants du glomérule de la souris). Dans ce modèle, les animaux développent une atteinte rénale rapide dès le dixième jour, caractérisée par des lésions de croissants (reproduisant les caractéristiques histologiques et fonctionnelles des GEC humaines). Pour préciser le rôle in vivo de cette protéine de stress et l'intérêt thérapeutique éventuel de son inhibition, nous nous sommes fixés plusieurs objectifs : 1/ Etude de l'expression de la protéine de stress au cours du développement de la GEC expérimentale pour affiner le rôle in vivo de cette dernière 2/ Inhibition pharmacologique de la protéine à visée thérapeutique 3/Inhibition génétique de la protéine de stress dans plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées pour déterminer quelles cellules rénales sont impliquées dans la signalisation de cette protéine.

Bénéfices attendus

Les maladies glomérulaires représentent la première cause d'insuffisance rénale terminale. Le développement de thérapies ciblées agissant spécifiquement sur les cellules épithéliales glomérulaires (cellules locales) est donc essentiel afin de contrôler ces maladies glomérulaires. Ces travaux pourraient permettre de proposer la protéine de stress (étant déjà la cible de différents traitements) comme une cible thérapeutique prometteuse dans diverses maladies glomérulaires rénales. Comme nos premiers résultats l'indiquent, cette protéine pourrait être impliquée dans le développement de pathLaologies dévastatrices comme la glomérulonéphrite extracapillaire (GEC) aboutissant dans la majorité des cas à l'apparition d'une Insuffisance Rénale Chronique (IRC). De nos jours, l'insuffisance rénale chronique à des conséquences socio-économiques majeures. Son traitement représente l'un des couts les plus importants du budget de la santé pour une petite fraction de la population : il est urgent de disposer de davantage de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques. De plus, actuellement, le traitement de la GEC repose principalement sur une thérapie qui a des effets nefastes importants pour les patients concernés. Ce projet a l'ambition de proposer des stratégies thérapeutiques inhibant les mécanismes physiopathologiques clés impliqués dans le développement des croissants.

Procédures

(1) Tous les animaux recevront une injection de sérum sous anesthésie environ 3 minutes par souris sur un plateau thermostaté à 37degrés. (2) Pour les protocoles, certains animaux recevront un gavage par jour sur les périodes de traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minutes par souris. (3) Pour un autre protocole, certains animaux recevront une injection d'un traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minute par souris. (4) L'ensemble des souris auront un recueil des urines pendant le protocole deux fois par semaines environ 1 minute par souris. (5) Prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (1 minute environ/souris).

Impact sur les animaux

Le stress et la douleur peuvent être générés par : 1.les différentes injections des medicaments. Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent developper une inflammation et un stress lors de la contention pour la bonne administration. 2. Les manipulations quotidiennes en particulier pour les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent developper un stress lors de la contention pour le recueil d'urines quand elle est nécéssaire. 3. Les complications associées au modèle murin. Suite à l'injection du sérum toxique pour le rein, les animaux peuvent prendre du poids en raison de l'ascite et des oedemes développés lors de la mise en place des lésions rénales. 4. Complications liées à l'anesthésie au moment de l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Les protocoles mis en place dans le projet sont relativement cours, nous ne devrions pas observer de complications trop sévères pour les reins (perte de poids, baisse de la température corporelle).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique de créatinine et d'urée.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans nos deux modèles d'insuffisance rénale aigue. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 760 souris. De plus, nous utiliserons des tests statitiques adaptés.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront réduites au maximum grâce à l’application de mesures de raffinement appropriées. Avant le début de la procédure, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine afin de les préparer à leur environnement. Leur bien-être sera assuré par un enrichissement optimal de leur environnement, comprenant une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes. Cette litière, initialement compacte, sera décompactée par les animaux eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose seront fournis dans chaque cage, offrant aux animaux des éléments pour explorer et se cacher, contribuant ainsi à leur confort. La gestion de la douleur sera une priorité, avec l’utilisation de méthodes d’analgésie et d’anesthésie adaptées pour minimiser toute souffrance. Des points limites ont été définis pour assurer une surveillance stricte du bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Afin de garantir leur état de santé optimal, une surveillance quotidienne de leur aspect physique et du poids des animaux sera effectuée par le personnel qualifié de l'animalerie ou les responsables du projet. Les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur. Chaque cage contiendra un maximum de cinq animaux, et l’animalerie respectera des conditions de température, d’humidité et de renouvellement de l’air rigoureuses conformément à la réglementation en vigueur.Enfin, pour la mesure de certains paramètres, des efforts seront faits pour réduire au maximum le stress lié à la contention, garantissant ainsi le bien-être des animaux tout au long de la procédure

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans cette étude est bien maîtrisé par le personnel du laboratoire, qui possède une grande expérience avec cette espèce. De plus, de nombreuses données relatives à ce modèle sont déjà disponibles dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix particulièrement pertinent, surtout en comparaison avec d'autres espèces. Cette étude bénéficie également de la possibilité de tester l'implication de voies de signalisation spécifiques à certaines cellules, grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ligature de l'uretère sous anesthésie, une opération d'environ dix minutes qui bloque l'écoulement de l'urine et provoque en dix jours une fibrose du rein, avec un risque de saignement, de cicatrice mal refermée ou infectée. Une partie des souris est ensuite transportée entre deux établissements utilisateurs, dans des sacs isothermes, pour un trajet de cinq à huit minutes, avant les prélèvements terminaux de reins, de plasma et d'urine. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"indispensable" pour comprendre l'insuffisance rénale chronique et indique tenir une veille bibliographique sur d'éventuelles méthodes alternatives.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle qui peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale si elle n’est pas correctement prise en charge. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. L’IRC est très fréquemment associé à une fibrose du rein. Alors que la fibrose est une cause majeure de l’altération de la fonction rénale, sa détection précoce et les mécanismes de sa mise en place restent encore mal connus. L’obstruction urétérale unilatérale (UUO) chirurgicale chez la souris consiste en une ligature du canal d'excrétion de l'urine du rein à la vessie. C'est un modèle classique d’induction de la fibrose rénale. L’obstruction de l’uretère bloque l’écoulement de l’urine vers la vessie, entrainant une accumulation d’urine dans le pelvis induisant une fibrose des tubules rénaux et une perte de la fonction rénale. Ce projet a pour but de rechercher les biomarqueurs urinaires et plasmatiques précoces associés à la fibrose rénale induite par une UUO chirurgicale chez la souris. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont l’identification de biomarqueurs et une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l'IRC liée à une obstruction urétérale.

Procédures

- Chirurgie (obstruction urétérale unilatérale): x1 (environ 10 minutes) - prélèvement de sang: x1 (environ 2 minutes) - injection d'un colorant sous contention: x1 (maximum 5 minutes). Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2. Les procédures non-terminales seront réalisées dans l’EU1. Les procédures terminales seront réalisées soit à l’EU1, soit à l’EU2 selon la disponibilité des salles et du matériel nécessaires.

Impact sur les animaux

Effet indésirable lié à l'UUO dans les 10 jours avant la mise à mort. - Chirurgie : peut provoquer de la douleur et du stress et des complications sont possibles (saignement, cicatrice mal refermée ou infectée). - Mesure de la permeabilité vasculaire rénale : légère douleur liée à l’injection dans la veine caudale sous contention - Prise de sang : risque de saignement

Devenir

Tous les animaux sont mise à mort en vue de l'analyse de leurs reins, de leur plasma et de leur urine en post-mortem.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’IRC. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.

Réduction

La chirurgie UUO est bien maitrisée par les expérimentateurs impliqués. Cela limite les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre expérience du modèle, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 240 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique. La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autre test statistique.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature et les expériences réalisées au laboratoire. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec libre accès à l'eau et à la nouriture. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie définissant précisemment les points limites à ne pas dépasser. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport. Le transport est assuré seulement par les personnes formées à l’expérimentation animale. Les cages sont transportées dans des sacs isothermes (2 cages maximum par sac) de façon à limiter au maximum le stress lié aux variations de température ou aux bruits excessifs. Le trajet du transport se fait selon un plan défini selon la pièce de destination à l’EU2/2. La durée du transport peut varier entre 5 et 8 minutes selon la pièce de destination.

Choix des espèces

L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.