Procédures modérées

Génétiquement modifiées pour ne plus répondre aux corticostéroïdes, 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une compression du nerf sciatique de vingt minutes sous anesthésie, pratiquée sur les deux pattes arrière, l'une comprimée et l'autre opérée à blanc, puis trois tests moteurs mesurant la force, la coordination et l'équilibre. Le porteur qualifie la douleur induite de légère et affirme que la patte témoin ne gêne pas l'animal, tout en prévoyant une quantification quotidienne de cette douleur et des points limites. Toutes seront tuées à deux ou six mois pour prélever leurs nerfs sciatiques.

Objectifs

Le but de cette étude est d'utiliser un modèle de compression du nerf sciatique chez la souris pour mieux comprendre l'effet d'hormones sur la régénération du nerfs périphérique en utilisant des animaux ayant une réponse modifiée à ces hormones dans le nerfs.

Bénéfices attendus

Bien que très efficaces, les traitements hormonaux peuvent être accompagnés d'effets secondaires sévères. Des hormones sont impliquées dans la réponse au stress, l'immunité, l'inflamation, les rythmes biologiques, la mémoire et le métabolisme. De façon étonnante, leur rôle dans la biologie des nerfs a été peu étudié à ce jour. Mieux comprendre les rôles des hormones dans leur régénération pourrait avoir des applications dans le traitement des maladies des nerfs liés au diabéte, ou dans les atteintes nerveuses auto-immunes comme le syndrôme de Guillain-Barré.

Procédures

Pour étudier la réparation de la gaine de myéline les animaux subiront une compression du nerf sciatique pour induire une altération de la gaine de myéline et ensuite sa régénération. La procédure ne dure que 20 minutes et sera effectuée sous anesthésie générale après traitement analgésique pour limiter la douleur liée à l'opération. Après l'opération, nous suivrons au cours des semaines suivantes la récupération des fonctions du nerf sciatique en utilsant trois tests moteurs mesurant la force, la coordination et l'équilibre. Chacun des tests ne dure que quelques secondes par animal et sera répéter un autre jour, le premier test servant à habituer l'animal.

Impact sur les animaux

Chez la souris, la compression du nerf sciatique altère légèrement la locomotion et peut entraîner une douleur que nous avons caractérisée comme légère. Nous quantifierons les jours suivants cette douleur chez les souris en utilisant des critères spécifique d'évaluation de la douleur que nous avons mis en place afin de prendre en charge par un analgésique si nécessaire les nuisances induites par cette procédures. Les tests comportementaux peuvent aussi induire une légère douleur localisée. De base, l'état des animaux insensibles aux hormones n'est pas dommageable : on observe une baisse de performance sur des tests moteurs spécifiques mais sans gène au déplacement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les tests moteurs permettant de mesurer la régénération du nerf, qui aura lieu à 2 mois (jeunes adultes) ou à 6 mois (adultes matures) afin de prélever les nerfs sciatiques pour étudier la cinétique moléculaire et cellulaire de la remyélination.

Remplacement

La remyélinisation est un processus complexe qui nécessite l’intervention de multiples acteurs cellulaires qui ne peuvent être modélisés in vitro. La qualité de la mise en place de la gaine de myéline et de son maintien a des conséquences fonctionnelles qui nécessitent l’analyse de composantes sensori-motrices propres aux animaux vivants.

Réduction

Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation du système sensori-moteur. Nous soumettrons les données aux tests satistiques adaptés et comparerons les groupes de 10 animaux deux à deux (contrôles vs réponse aux corticostéroïdes inactivée / lésés vs non lésés). De plus, l’analyse de cohorte d'un autre projet du laboratoire et l’optimisation du protocole de compression du nerf sciatique nous permet de réduire par deux le nombre d’animaux opérés en s’affranchissant du groupe contrôle. Vue l’innocuité du geste chirurgical sur les tissus environnants le nerf et l’atteinte locomotrice très limitée, nous avons décidé d’opérer les animaux au niveau des deux pattes arrières (une subit la compression, l’autre seulement le geste chirurgical à blanc). Aucune gène n’a été constatée du côté de la patte contrôle et cela ne compromet pas la capacité de l’animal à se nourrir ou se déplacer, ni n’affecte significativement son bien-être.

Raffinement

Les manipulations se font dans une pièce dédiée au comportement dans la zone expérimentale de l'animalerie. Les animaux issus d'une même portée sont hébergés dans les mêmes cages contenant du matériel de nidification. L'enrichissement est renforcé des dômes et des batonnets à ronger. Au minimum 4 heures s'écoulent entre chaque test de nature différente, et au maximum 2 tests seront effectués dans la même journée. La compression des nerfs s'effectue sous anesthésie et analgésie. Des analgésiques sont également administrés après l'opération. Si des animaux se déplacent avec difficulté, du gel alimentaire sera mis à disposition. La compression du nerfs ne provoque pas de dommage majeur pour l'animal et la récupération s'effectue rapidement, mais par précaution des points limites ont été définis pouvant aller jusqu'à l'arrêt de l'expérimentation.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères suffisamment proche de l’Homme pour servir à l’évaluation de l’implication des voies de signalisation des corticostéroïdes sur le développement et le maintien de la gaine de myéline périphérique. Par ailleurs, la génération de modèles de souris transgéniques est une stratégie largement utilisée dans ce domaine de recherche. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ces voies ont été principalement développés pour la souris. Les animaux seront utilisés au stade 2 mois, jeune adulte, et 6 mois, adulte mature pour voir si l'âge influe sur la capacité de régénération de la gaine de myéline lorsque la réponse aux glucocorticoïdes est inactivée.

Un fragment de nageoire coupé sous anesthésie, puis un prélèvement de sperme pour les mâles : 1 050 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet crée une lignée mutante pour un gène exprimé dans l'intestin, absent chez la souris, afin d'observer les effets de son inactivation sur le microbiote. Le porteur indique que 48 poissons seulement seront analysés après leur mise à mort, répartis entre individus mutants et non modifiés. Il ne dit rien du sort des mille autres, au-delà du fait qu'il faut selon lui "un grand nombre d'œufs" pour obtenir la mutation recherchée.

Objectifs

Un nouveau type de cellules a récemment été découvert dans l’intestin chez plusieurs espèces dont l’humain et le poisson-zèbre. Ces cellules pourraient jouer un rôle important dans le fonctionnement de l’intestin en régulant la composition du mucus, le pH et la production de substances antimicrobiennes. Elles pourraient donc avoir un impact sur le microbiote, qui est essentiel à la digestion et à la santé. Cependant, la fonction exacte de ces cellules reste inconnue, car elles ne sont pas présentes chez la souris, un modèle couramment utilisé en recherche. Pour mieux comprendre leur rôle, ce projet vise à étudier le rôle d’un gène (BEST4) spécifiquement exprimé par ces cellules chez le poisson-zèbre. Après modification génétique, l’intestin des poissons sera analysé afin d’observer les éventuels changements dans sa structure et son fonctionnement, ainsi que sur le microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Aucun modèle animal n’a encore été développé pour étudier l’inactivation de ce gène. Ce projet permettra donc de mieux comprendre le rôle de ces cellules récemment découvertes dans l’intestin de nombreuses espèces. Ces nouvelles connaissances sur le fonctionnement de l'intestin pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter certaines maladies digestives, tant chez l’humain que chez l’animal.

Procédures

Les animaux sont des animaux mutants qui seront prélevés pour organes post-mortem. Il s'agit donc de créér une lignée génétiquement modifiée dont les animaux subiront un génotypage et prélèvement de sperme pour les mâles concernés.

Impact sur les animaux

Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système digestif, car ce gène est surtout exprimé dans l’intestin. Des modifications pourraient affecter la sécrétion d’ions, l’hydratation du mucus, la régulation du pH et la production de substances antimicrobiennes, ce qui pourrait influencer l’équilibre du microbiote intestinal et, par conséquent, la santé intestinale. Cependant, comme ce gène n’est pas fonctionnel chez la souris sans provoquer de troubles majeurs, il est probable que l’intestin du poisson-zèbre puisse s’adapter en compensant l’absence de ces cellules. Le genotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction de l'activité de nage. La récolte de gamètes est bien maîtrisée et ne génère pas d’inconfort ou de nuisance pour les animaux.

Devenir

Ce projet vise à étudier le fonctionnement de l’intestin après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes.

Remplacement

Les cellules intestinales peuvent être étudiées à l’aide de modèles in vitro. Toutefois, ces modèles ne reproduisent pas encore toute la complexité de l’intestin, notamment la présence d’un microbiote diversifié. Il n’existe donc pas d’alternative aux études sur l’animal pour comprendre le rôle de ces cellules dans l'intestin.

Réduction

Au total, 48 poissons seront étudiés après euthanasie, répartis équitablement entre deux groupes : des individus mutants et des individus non modifiés. Pour obtenir ces poissons, un grand nombre d'œufs doit être produit, car seuls quelques-uns porteront la mutation recherchée. Le nombre strictement nécessaire de poisson sera produit afin de garantir l'obtention des 48 poissons nécessaires aux analyses.

Raffinement

Les poissons seront élevés dans des conditions optimales, adaptées à leur espèce, en veillant à la température, à l’éclairage, à la qualité de l’eau et à la densité des aquariums (30 individus maximum par bac dans un volume de 9.5 litres). Des plantes seront ajoutées pour enrichir leur environnement. Toutes les manipulations, comme la mise en ponte ou l’anesthésie, seront effectuées rapidement afin de minimiser le stress. Les animaux seront observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. En cas d’apparition de symptômes, qu’ils soient liés ou non à la modification génétique, le poisson sera pris en charge par le vétérinaire du laboratoire, qui décidera des mesures à adopter pour préserver son bien-être.

Choix des espèces

Les études sur la physiologie digestive utilisant des techniques de modification génétique sont souvent réalisées chez la souris. Cependant, ce modèle n’est pas adapté ici, car les cellules spécifiquement étudiées sont absentes dans son intestin. Le poisson-zèbre a été choisi car ces cellules sont bien présentes dans son intestin et partagent des caractéristiques similaires avec celles des mammifères. De plus, cette espèce est idéale pour la recherche génétique en raison de sa reproduction très efficace (plus de 200 œufs par femelle), du développement rapide des embryons, et du fait qu’un individu atteint sa maturité en seulement trois mois. Enfin, le poisson-zèbre est déjà largement utilisé pour mieux comprendre le fonctionnement de l’intestin des mammifères. Dans ce projet, les analyses seront réalisées sur des animaux adultes, afin d’étudier l’intestin à un stade de développement mature.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées puis nécropsiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent douze semaines de régime enrichi en lipides, subissent deux gavages, trois à onze injections et quatre séries de huit à neuf prélèvements de sang à la queue, certaines une chirurgie sous anesthésie générale. Le projet teste si la surexpression d'une adipokine dans le tissu adipeux retarde la résistance à l'insuline liée à l'obésité. Le porteur écrit que le modèle in vivo est "indispensable" pour étudier ces dialogues entre cellules, après avoir précisé que son équipe cultive couramment des adipocytes humains et murins.

Objectifs

L’obésité est caractérisée par un excès de tissu adipeux et s’accompagne de complications métaboliques. L’excès de tissu adipeux est corrélé au degré d’insulino-résistance qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit au développement d’un diabète de type 2. Le tissu adipeux est un organe central du métabolisme par sa fonction de stockage des lipides. Il produit également de nombreux facteurs, dont des adipokines bénéfiques ou délétères vis-à-vis de l’action de l’insuline ; ces adipokines peuvent agir au sein même du tissu ou à distance dans l’organisme. Une meilleure connaissance des adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l’obésité. Nous avons mis en évidence chez l’Homme une nouvelle adipokine dont le niveau d’expression dans le tissu adipeux est faible chez des personnes atteintes de syndrome métabolique ou de diabète de type 2. Son taux sanguin est un déterminant négatif de la résistance à l’action de l’insuline. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de cette adipokine par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une insulino-résistance. Nous voulons tester si sa surexpression dans le tissu adipeux peut permettre de retarder, voire d’empêcher, le développement d’une résistance à l’action de l’insuline induite par l’obésité. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’apport de nouvelles connaissances sur les acteurs de la sensibilité à l’insuline, dans un contexte de prise de poids et de dégradation de la signalisation insulinique. La compréhension du rôle de certaines adipokines dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline au cours de l’obésité, permettra de cibler de nouveaux mécanismes cellulaires. L’apport de l’expérimentation animale est majeur dans l’étude de la dérégulation de ces voies, en offrant un point de vue à corps entier de la physiopathologie de l’obésité et du diabète.

Procédures

Dans l’EU1, les animaux auront une alimentation enrichie en lipides durant 12 semaines et un hébergement à thermoneutralité. Tous les animaux seront soumis à 2 gavages, 3 à 11 injections et 4 séries de 8 à 9 prélèvements de sang à la queue au cours de leur vie ; chaque acte sur animaux vigiles n’excédant pas 15 secondes consécutives. Tous les animaux pourront subir une intervention chirurgicale (de 10 à 15 minutes maximum) sous anesthésie générale avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire. Dans l’EU2, les animaux seront soumis à 1 gavage, 1 série de 5 prélèvements de sang à la queue n’excédant pas 15 secondes consécutives, puis nécropsiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourraient survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min), lors des 12 semaines de régime enrichi en lipides, lors des gavages (environ 15 sec) ou encore lors des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 5 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors de prises de sang ou encore lors d’injections. Dans l’éventualité où l’option chirurgicale serait retenue pour induire la surexpression de l'adipokine étudiée, les souris pourraient ressentir une douleur légère pendant 1 à 2 jours malgré l’utilisation d’antalgique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et nécropsiés en vue de l'analyse de leur sang et de plusieurs organes.

Remplacement

Les modèles in vitro d’adipocytes humains et murins existent et l’équipe en cultive couramment. Cependant, en raison de la capacité de prolifération quasi-inexistante des adipocytes, ces lignées sont cultivées sous forme de préadipocytes puis différenciées en adipocytes matures grâce à un milieu de culture spécifique. Ces conditions de culture rendent les cellules artificiellement résistantes à l’action de l’insuline et il est impossible d’étudier l’effet de certaines molécules sur la sensibilité à l’insuline. De plus, les tissus adipeux sont constitués d’une grande diversité de cellules, outre les adipocytes, qui participent à la dysrégulation de la sensibilité à l’insuline. C’est le cas des cellules immunitaires qui, selon leurs sécrétions de cytokines et chimiokines, influencent le signal insulinique à l’échelle du tissu. Ainsi, le modèle in vivo sur l’animal, utilisé à des fins expérimentales, est indispensable à l’étude de ces dialogues intercellulaires au niveau du tissu, puis à l’étude des dialogues inter-organes au niveau systémique.

Réduction

Grâce à nos études préliminaires, nous savons qu’un minimum de 10 animaux nourris avec un régime enrichi en graisses par condition testée est nécessaire pour observer un effet sur la sensibilité à l’insuline. Ces travaux n’avaient cependant été réalisés que sur des mâles de fond génétique sauvage. A cause d’une hétérogénéité interindividuelle significative dans les paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront dans ce projet d’utiliser 15 animaux contrôles par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard) et 15 animaux génétiquement déficient pour une adipokine par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard), pour chaque condition expérimentale et température d’hébergement. Ce nombre minimal permettra d’obtenir des résultats robustes et basés sur une puissance statistique suffisante, en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Nous estimons que pour établir une différence éventuelle entre les groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus par groupe : soit 15 mâles non déficients, 15 mâles déficients, 15 femelles non déficientes et 15 femelles déficientes par condition expérimentale et température d’hébergement. L'utilisation de 3 cohortes au maximum, manipulées à des temps « indépendants », est justifiée par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Pour le bien-être animal, les souris seront en groupes sociaux de 4 à 5 individus constitués dès le sevrage de fratries, dans la majorité des cas. Les souris ne seront jamais isolées lors des protocoles. Un contrôle quotidien de l'alimentation, la boisson et l'état physique des animaux sera effectué. Des enrichissements (feuille d’essuie-tout, bâtonnet de bois, papier kraft « sizzle-nest ») seront placés dans les cages et remplacés lors du change hebdomadaire ou en cas de souillure excessive. Si les animaux montrent des signes d’agitation/nervosité lors des manipulations, des abris seront ajoutés aux cages (igloos, tubes…) afin de satisfaire leur besoin naturel de se cacher. Selon le développement technique et la disponibilité commerciale de certains produits à administrer, ces options moins invasives seront privilégiées à la chirurgie. Dans le cas contraire, les injections ou chirurgies se feront sous anesthésie avec antalgique et tapis chauffants. Dès l’apparition d’un comportement normal de réveil (étirements, ébrouement, toilettage…), il sera replacé avec ses congénères. Dans les jours suivants, la litière de copeaux de bois standard sera remplacée par une litière de cellulose ne produisant pas de poussière, évitant l’irritation des plaies chirurgicales. La cicatrisation de l’abdomen et l’absence de signes de douleurs (évaluée par la grille de scoring) sera un point essentiel de la surveillance quotidienne. Après mise sous régime riche en graisses, un suivi du poids hebdomadaire sera réalisé. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris) est le modèle animal expérimental le plus étudié notamment pour les études physiologiques et métaboliques. La lignée animale déficitaire pour le gène d’une adipokine a été développée chez la Souris et est utilisée par plusieurs équipes de recherche, ce qui permet une comparaison avec les données de la littérature. La transposition du modèle à l’Homme est améliorée par l’humanisation du modèle murin, par l’utilisation de vecteurs viraux permettant l’expression du gène humain de notre adipokine dans le tissu adipeux des animaux. Les animaux utilisés seront adultes et âgés de 8 semaines au début du protocole, 22 semaines à la fin du protocole.

50 souris âgées de 12 à 18 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde après un prélèvement de sang ou d'organes. Selon leur groupe, elles reçoivent une injection d'antibiotique puis un gavage de Clostridioides difficile, ou des solutions témoins, et pendant 21 jours un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution, avec neuf prises de sang et neuf prélèvements de selles. Le projet vise à réduire, grâce à la seconde bactérie, la mortalité d'une colite provoquée chez la souris par la première, première cause mondiale de diarrhée contractée à l'hôpital. Parmi les effets attendus, le porteur ne cite pourtant que des réactions au point d'injection, des changements temporaires d'appétit ou de comportement et des effets de l'infection "potentiellement réversibles avec des soins appropriés".

Objectifs

La colite à Clostridioides difficile est la première cause de diarrhée nosocomiale dans le Monde avec une mortalité élevée. Nous avons, au cours de précédents travaux in vitro, observé une capacité inhibitrice de certaines souches de Clostrdidium butyricum sur la croissance de souches toxinogènes de Clostridioides difficile. Le projet consisiterait en l’évaluation de l’efficacité et de la tolérance de l’administration de Clostridium butyricum par voie orale afin de réduire la mortalité sur un modèle murin de colite à Clostridioides difficile.

Bénéfices attendus

- Identification de C. butyricum comme probiotique potentiel pour prévenir ou traiter les infections à C. difficile. - Contribuer à la recherche sur les mécanismes d'action des probiotiques dans le microbiote intestinal. - Fournir des informations sur l'interaction entre les bactéries bénéfiques et pathogènes dans l'intestin.

Procédures

Les souris seront soumises aux prélèvements suivants : neuf prélèvements sanguins seront effectués aux jours J-6, J-1, puis les jours J1 à J3 après le gavage de Clostridioides difficile, et ensuite aux jours J6, J8, J10 et J14. En parallèle, neuf prélèvements de fèces seront effectués aux mêmes dates. Chaque prélèvement prendra moins de 5 minutes. Par ailleurs, les souris recevront un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution (groupe témoin) depuis J-6 jusqu'à J14, d'une durée maximale de 5 minutes par gavage. Un gavage unique de Clostridioides difficile ou de solution de dilution sera administré au jour J0, également pendant 5 minutes maximum. De plus, les souris recevront une injection d'antibiotique (ou de tampon de dilution pour le groupe témoin) au jour J-1. A la fin de la procédure, pour l’acte d’euthanasie, l’animal sera en contention pour une durée de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

- Réactions au site d'injection. - Changements temporaires dans l'appétit ou le comportement. - Effets liés à l'infection, potentiellement réversibles avec des soins appropriés.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.

Remplacement

Il s'agirait ici d'une étude préclinique pour confirmer l'effet probiotique de certaines souches de C. butirycum sur l'infection à C. difficile. Nous avons choisi le modèle murin pour la colite à C. difficile comme décrit dans la littérature. Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie.

Réduction

L'outil statistique approprié, utilisé pour notre étude, suggère qu'il faudrait 50 souris au total pour ce projet comprenant 2 procédures. Une étude pilote sera réalisée en première intention sur 10 souris afin de réduire le nombre d'animaux dans l'ensemble de ce projet.

Raffinement

Lors de nos différentes procédures d’infection, les souris seront immobilisées pour une durée de moins de 5 min. A la fin de nos procédures ou en cas d’atteinte d’un point limite, les souris seront anesthésiées avant euthanasie. Un test de réflexe (pincement extrémité patte) sera effectué afin de valider l’anesthésie. En cas de survenue de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplé à ce projet, la température corporelle sera prise et un analgésique pourra être administré. Une surveillance appropriée sera mise en place par du personnel habilité.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie. Nous utiliserons des souris adultes (12 à 18 mois), car elles sont représentatives des conditions humaines en matière de réponse immunitaire et d'infection, ce qui est essentiel pour notre étude sur l'inhibition de C. difficile.

Injectées sous anesthésie de cellules tumorales humaines dans la glande mammaire, gavées une fois par jour pendant quatre jours d'une molécule qui active les récepteurs aux œstrogènes, des souris femelles immunodéprimées passent aux neuvième et onzième jours deux examens d'imagerie TEP sous anesthésie, le second après une nuit de jeûne et une prise de sang. 30 souris vont être utilisées sur deux établissements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour vérifier si un traceur radioactif qui imite les œstrogènes peut repérer sans biopsie des mutations rendant inefficaces les traitements hormonaux du cancer du sein. Le porteur cite la douleur de l'injection mammaire et du développement tumoral, une irritation de l'œsophage, une hypoglycémie liée au jeûne et une vulnérabilité accrue aux infections. Toutes sont tuées après les examens, pour l'analyse de leurs tumeurs.

Objectifs

Ce projet, réalisé dans 2 établissements utilisateurs, cherche à savoir si un traceur radioactif utilisé en imagerie médicale peut aider à repérer certaines mutations génétiques dans les cancers du sein. Ce produit imite une hormone féminine, appelée œstrogène, et se fixe normalement sur des récepteurs spécifiques dans les cellules cancéreuses. Or, certaines mutations peuvent empêcher ces récepteurs de fonctionner correctement, rendant les traitements hormonaux inefficaces. L'idée est donc de vérifier si ce traceur peut détecter ces mutations sans avoir besoin de faire un prélèvement et ainsi prédire si un traitement hormonal sera efficace ou non pour chaque patiente.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices majeurs, notamment : 1- Mieux prédire l'efficacité des traitements hormonaux : Certaines patientes atteintes d'un cancer du sein reçoivent un traitement hormonal, mais si leur tumeur présente certaines mutations, ce traitement peut être inefficace. Ce projet pourrait aider à adapter le traitement. 2- Éviter des prélèvements invasifs : actuellement, pour analyser les récepteurs aux hormones féminines et détecter d'éventuelles mutations, il faut prélever un échantillon de la tumeur, ce qui peut être douloureux et risqué.

Procédures

Site 1: Les souris recevront une injection de cellules tumorales humaines pour induire un cancer du sein, ce qui prendra environ 10 minutes par souris, sous anesthésie générale. Elles seront gavées 1x par jours pendant 4 jours avec une molécule permettant l'activation des récépteurs aux oestrogènes dans la tumeur, ce qui prends 1 minutes par souris. Elles seront suivies pendant 11 jours et auront 2 examens d’imagerie médicale à J9 et J11, toujours sous anesthésie générale. Site 2: Le premier examen, d’une durée de 25 minutes, servira à détecter la présence du récepteur aux hormones féminines, grâce à une hormone féminine radioactive. Site 2: Après une nuit de jeun, le second examen d’une durée de 25 minutes, permettra d’observer l'activité métabolique de la tumeur, grâce au glucose radioactif. Cette durée de 25-30 minutes comprend l'injection du produit radioactif (5 minutes), l'anesthésie (2 à 3 minutes), l'examen (11 minutes et 20 secondes) et le réveil de l'animal. Site 2: Avant l'examen de l'activité métabolique de la tumeur, un prélèvement sanguin pour mesurer la glycémie sera effectué sur chaque souris, ce qui prendra au maximum 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sont les suivants : • Douleur liée à l’injection mammaire des cellules tumorales. • Irritation des muqueuses de l'oesophage • Hypoglycémie potentielle due à un jeûne d’environ 12 heures avant l’examen. • Hypothermie potentielle causée par l’anesthésie générale. • Douleur liée au développement tumoral. • Le modèle de souris immunodéprimées est indispensable pour permettre l’implantation de tumeur humaines sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour garantir la validité des résultats dans un contexte préclinique visant à reproduire au mieux lce qui est observé chez l’humain. L’état immunodéprimé des souris peut entraîner une vulnérabilité accrue aux infections. Bien que les animaux soient maintenus dans des environnements strictement contrôlés, cette condition est considérée comme dommageable. Cette nuisance est compensée par une surveillance quotidienne rigoureuse et des conditions d’hébergement adaptées, visant à minimiser les impacts sur le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie.

Remplacement

Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé en fonction d’analyses statistiques basées sur des résultats préalablement obtenus, et des données bibliographiques, afin de minimiser les effectifs nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. De plus, les techniques d'imagerie choisies permettent de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, un enrichissement (comme des tunnels et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite afin que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près : on surveillera la taille de la tumeur pour s’assurer qu’elle ne grossisse pas trop, et on vérifiera aussi régulièrement leur poids. À partir du 5ème jour, elles seront gavées avec la molécule qui induit l'expression des récepteurs aux œstrogènes. Ce produit peut induire une déshydratation des souris lorsqu'il est donné dans l'eau de boisson, le gavage permet donc d'éviter cet effet indésirable. Pour les examens d’imagerie, les souris seront anesthésiées afin qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant pour ne pas avoir froid, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Une fois l’examen terminé, elles resteront sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Certains examens demandent aux souris d’être à jeun pendant une nuit. Comme cela peut baisser leur taux de sucre, on vérifiera leur glycémie en prélevant une goutte de sang avant de commencer. Pendant toute la durée de cette étude, nous appliquerons les points limites que nous nous sommes fixés afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Des souris femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le cancer du sein, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser des femelles. De plus, des femelles âgées de 9 semaines ont une glande mammaire suffisamment développée pour garantir une injection correctement localisée.

Greffées sous anesthésie de cellules cancéreuses humaines dans un premier établissement, des souris nude immunodéprimées sont transportées au bout d'une vingtaine de jours dans un second, où ont lieu les irradiations et les injections des anticorps couplés à des médicaments testés. 674 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après une ponction du cœur sous anesthésie. Les injections se font dans une veine, une fois par semaine pendant deux à six semaines selon la progression des tumeurs, et les effets de l'irradiation ne figurent pas parmi les nuisances listées. Sur le remplacement, le porteur affirme que ses résultats in vitro lui permettent "d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique", et juge les xénogreffes requises pour "prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats".

Objectifs

La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des ptahologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules senecentes dans les tumeurs. Il s'agit d'un projet multisite.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules senescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules senescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la radiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.

Procédures

Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs. En fin de protocole, les souris seront anesthésiées afin de permettre une ponction intracardiaque puis euthanasiées. L'EU1 sera en charge des xénogreffes sur les animaux ( environs 20 jours de charge) avant leur transfert vers l'UE2 qui prendra en charge les irradiations ainsi ques les injections d'AEDC (30 jours environs).

Impact sur les animaux

Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales et lors des injections intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.

Remplacement

Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etand donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. Lors du transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2, nous utiliserons des boîtes de transport de type Novopac opaque (1 seule fenêtre permettant de contröler les souris ) contenant différents éléments d'enrichissement brique de bois, sciure et nourriture humidifiée (gel diet).

Choix des espèces

La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.

Leur accès à l'eau est contrôlé pour qu'ils restent motivés par les tâches à accomplir. Six macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun ne devant être tué : trois seront replacés et trois réutilisés dans d'autres projets. Chacun subit deux interventions chirurgicales de quatre à cinq heures, onze examens d'imagerie cérébrale sous anesthésie générale dont six avec injection directe dans le cerveau, et des séances comportementales quotidiennes d'une heure trente à deux heures pendant quatre à cinq mois. Le projet vise à cartographier les circuits sous-corticaux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, le porteur retenant le macaque comme l'espèce "la plus près de l'être humain".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

Placés jusqu'à vingt-quatre heures dans des chambres en plexiglas après administration d'une substance, 500 souris, 3 000 rats et 2 000 cobayes subissent un enregistrement de leur fonction respiratoire, certains après une heure de chirurgie de cathétérisme. Les 5 500 animaux sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ramène les effets à un "léger stress" lié à la contention et à l'isolement, tout en énumérant bronchospasmes, bronchoconstrictions, toux, hyperventilation et douleurs après l'opération. Quatre cents cobayes seront réutilisés, les 5 100 autres tués, ces tests servant à établir le profil de sécurité de candidats médicaments avant leur passage chez l'humain, conformément aux exigences réglementaires européennes, américaines et japonaises.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer les effets de substances en cours de développement sur la fonction respiratoire et de collecter des données précises pour répondre à des questions essentielles liées à la sécurité, l'efficacité, et le mécanisme d'action de la substance. Ces tests permettent de vérifier si une substance améliore la fonction respiratoire dans des maladies comme l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive,... et permettent également de déterminer si une substance est en mesure de réduire les symptômes respiratoires tels que la dyspnée ou la toux. Les substances, même non destinées à traiter directement les maladies pulmonaires, peuvent avoir des effets sur le système respiratoire (bronchospasmes, hypoxie, etc.). Tester leur impact est donc crucial pour garantir la sécurité du patient et établir le profil de sécurité du candidat médicament avant son passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (ICH S7A guideline, 2001).

Bénéfices attendus

Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus chez les patients traités pour des affections respiratoires. Ils entrent également comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. La mesure des paramètres ventilatoires (fréquence respiratoire, volume courant, minute volume, temps d’inspiration, d’expiration et de relaxation, débits aux pics d’inspiration et d’expiration) ou dynamiques (résistance ou pause augmentée) permet de différencier les substances affectant le contrôle de la respiration de celles agissant sur la dynamique du poumon (obstruction ou dilatation des voies aériennes, resistance pulmonaire).

Procédures

Les animaux sont placés dans des chambres en plexiglas pour une période de 30 min à 3 h de stabilisation jusqu’à 24h après l’administration selon le modèle pour évaluer la fonction respiratoire. Le traitement unique avec les candidats médicaments se fait par différentes voies (administration quelques secondes) ou par aérosols (administration pendant quelques minutes). Pour certaines administrations, les animaux subissent une chirurgie de courte durée (1 heure) quelques jours avant le test. A la fin de la procédure, ces animaux seront soumis à des prélèvements de sang (quelques secondes), d’organes ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. La phase d’enregistrement peut engendrer un stress léger chez l’animal dû fait de l'isolement. Certaines conditions d’enregistrement et/ou substances de références peuvent entrainer du bronchospasme, de la bronchoconstriction, de la bronchodilatation, de la toux, de l’hyperventilation. La phase de chirurgie par cathétérisme peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, s’il y a un prélèvement, les animaux sont tous euthanasiés. S’il n’y a pas de prélèvement, les animaux ayant reçu des substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont euthanasiés. Les animaux n’ayant pas reçu de substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont remis en stock.

Remplacement

Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la fonction respiratoire des animaux vigiles. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif, et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Si cela est pertinent et afin de réduire le nombre d’animaux, tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront réalisées à la fin des évaluations pharmacologiques (et non sur des animaux surnuméraires satellites).

Raffinement

Un soin particulier dans le raffinement des méthodes est assuré et garantit l’utilisation systématique du modèle apportant le maximum de réponses scientifiques et le minimum de souffrance pour l’animal. La pléthysmographie corps entier permet de suivre les paramètres respiratoires sur l’animal vigile en leur laissant une liberté de mouvements. Dans le cas de mesures sur plusieurs heures ou jours, les animaux sont regroupés dans leur cage d'hébergement suite aux premières mesures et seront remis dans les chambres de pléthysmographie pour effectuer la mesure. De l'eau de boisson est à disposition et une poche de complément alimentaire est mis à disposition pour des mesures dépassant 12h. Les animaux peuvent se voir d’une chambre à l’autre. Dès la fin de l’expérience, les animaux sont regroupés ou immédiatement euthanasiés. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, des yeux, la posture, les réactions de l'animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l'appétit, l'état d'hydratation, les tremblements ou convulsions), afin d’assurer d’une part, un bon suivi des animaux et d’autre part, une fin sans souffrance ou angoisse lorsque nécessaire. De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints (détresse respiratoire). Par ailleurs et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement litiére, objets de nidification et à ronger, présence de congénéres. Losque nécéssaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. le progarme d'anesthésie et d'analgésie est défini par un vétériniare afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit). Les méthodes d’euthanasie choisies, le cas échéant, sont sélectionnées pour supprimer toute forme d’angoisse, de stress ou de douleur).

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres respiratoires des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. La substance est généralement administrée à dose unique. Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les tests décrits dans l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisés de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mis en oeuvre au sein du laboratoire. Par ailleurs, la méthode de pléthysmographie peut également être un outil de choix pour l’étude de la fonction respiratoire sur des modèles animaux physiopathologiques tels que les souris transgéniques ou des modèles de bronchoconstriction ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique

Quarante-cinq minutes de chirurgie du cerveau, puis deux heures d'enregistrement de l'activité neuronale : 96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en huit groupes de douze, ils reçoivent d'une à quatre injections de kétamine avant l'enregistrement. L'objet déclaré est de comprendre comment la kétamine module l'activité du cortex préfrontal, dans l'espoir d'ouvrir des pistes contre la dépression résistante aux traitements. Le porteur retient le rat parce que son usage est "généralisé" en neurosciences et que les résultats pourront être comparés à la littérature existante.

Objectifs

La découverte des effets antidépresseurs rapides de la kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et éveillé l’espoir de nouveaux traitements à efficacité accélérée. En effet, alors que les antidépresseurs classiques mettent plusieurs semaines à agir et sont inefficaces chez plus de 30% des patients, l’injection d’une seule dose de kétamine provoque des effets antidépresseurs rapides et robustes chez les patients atteints de dépression pharmaco-résistante. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine du pouvoir antidépresseur de la kétamine est donc une étape clé pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles dépressifs majeurs. En effet, la kétamine pourrait soulager les symptômes de la dépression en modulant l'activité cérébrale contrôlant l’humeur. Les objectifs du projet sont donc de tester l'effet d'une dose unique ou de doses multiples de ketamine sur la modulation de l'activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Ces expérience permettront de mieux comprendre le rôle modulateur exercée par la kétamine sur l'activité du cerveau contrôlant l'humeur et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitements des troubles dépressifs.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie du cerveau qui dure 45 minutes. Deux groupes de 12 rats sont soumis à une injection du composé (5 min) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à deux injections du composé (5 min par injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à trois injections du composé (5 min par injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à quatre injections du composé (5 min per injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Tous les animaux sont hébergés en cage collective ée (2 rats par cage) pour une dureé maximum de 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à une chirurgie et traitements successifs dont le degré de gravité va de léger à modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie , en effet l'animal est anesthésié puis opéré. Bien que toutes les mesures soient prisent pour réduire douleur et risque d’infections, cette procédure représente la plus importante nuisance pour l'animal. Les autres types de nuisances envisagées sont l'euthanasie même si l'animal est sédaté au préalable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau et effectuer des analyses imunohistochimiques sur ce dernier.

Remplacement

La procédures décrite a recours exclusivement à des rats de laboratoire (Sprague Dawley) pour les raisons suivantes : 1. Il est interdit de mettre en œuvre chez l’homme des techniques neurobiologiques invasives telles que celles décrites ici et qui permettent d’établir des liens de causalité tels que ceux que nous cherchons à tester, 2. Il n ’existe pas encore de modélisation mathématique (pharmacologiques) des effets que nous cherchons à comprendre. Pour comprendre les mécanismes de la plasticité in vivo, nous devons utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones spécifiques avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Des outils statistiques sont utilisés pour calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires à la validation de l'expérience. Ce nombre s'élève à 12 animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Le confort de l’animal est pris en compte tout au long de sa vie au moyen d’une grille d’évaluation et la définition de points limites et critères d’arrêt de l'expérience. Un soin particulier est porté à la formation des expérimentateurs pour qu'ils sachent détecter tout signe de mal-être et ne soient pas eux-mêmes source de mal-être par une manipulation inadaptée. Les soignants qui s’occupent de nos animaux sont encadrés par ou sont eux-mêmes des personnels diplômés soigneurs animaliers. Les expériences se déroulent quand les animaux sont actifs et leur sommeil est ainsi respecté. Les animaux sont pris en main de façon appropriée [jamais par la queue, les pattes reposant sur un support (bras, main...) pour éviter la sensation du vide]. L’anesthésie pour les chirurgies et la douleur post -opératoire sont gérées avec des molécules adaptées comme des antidouleurs. Une pommade cicatrisante est appliquée sur les sutures. Pour prévenir l’hypothermie, les chirurgies sont pratiquées sur couverture chauffante puis l’animal est placé dans une chambre post-opératoire jusqu’à ce qu’il se redresse sur ses pattes. Les animaux sont hébergés collectivement tout au long de l'expérience. Pour enrichir l’environnement, des nids végétaux sont placés dans chaque cage et renouvelés systématiquement lors du change.

Choix des espèces

Cette espèce est un bon modèle pour les études pharmacoloqiques. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences. Nous utiliserons des rats jeunes adultes. Ce stade de développement a été choisi afin de correspondre aux données de la littérature afin de pouvoir comparer nos données.