Procédures modérées

Tuées à l'issue pour prélever leur sang et leur foie, 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent l'injection d'une molécule choisie pour sa toxicité hépatique, qui peut provoquer des douleurs abdominales. Quatre cents d'entre elles subissent en plus l'ablation des ovaires, dont la moitié avec la pose d'une capsule hormonale sous la peau, pour modéliser la ménopause et les traitements hormonaux. Le porteur reconnaît que le type de douleur induite par ces molécules n'a jamais été formellement caractérisé, et affirme dans le même temps qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement".

Objectifs

De nombreuses études ont montré que la toxicité de nombreux médicaments dépends des rythmes circadiens c'est-à-dire que leur toxicité est dépendante de l'heure de la journée. Cette approche de la pharmocologie, appellée chronothérapie, permet de diminuer la toxicité et/ou augmenter l'efficacité des médicaments. Cependant, l'effet du sexe sur différentes chronothérapies n'a été étudié que très brièvement dans la littérature alors qu'on sait que de nombreux paramètres pharmacologiques (absorption, métabolisation, excrétion) sont régulés de manière sexe-dépendante et circadienne. L'objectif de ce projet est donc de tester la chronotoxicité de 5 molécules utilisées en clinique et connues pour présenter une pharmacocinétique circadienne et dont nous avons identifié que les voies de métabolisation hépatique dépendent du sexe et du statut oestrogénique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer et comparer la chronotoxicité de ces 5 molécules entre les femelles et les mâles ainsi qu'entre des femelles intactes modélisant des femmes en période reproductive et des femelles ovariectomisées modélisant des femmes ménopausées. Ces résultats seront déterminants pour optimiser la chronothérapie de ces 5 molécules chez les femmes en période reproductive, les femmes ménopausées et les hommes sachant que ces molécules sont fréquement utilisées en clinique.

Procédures

Certains animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales dont une de classe légère (pose de capsule à libération prolongée sous la peau mimant les traitements hormonaux de la femme) et une de classe modérée (ablation des ovaires mimant la ménopause). Ces deux procédures durent entre 10-20min sous anesthésie générale. Au total, 200 animaux seront soumis à une chirurgie de classe modérée (ovariectomie) et 200 animaux seront soumis aux deux chirurgie de classe légère (pose de pellet sous-cutanné) et modérée (ovariectomie). Tous les animaux de ce projet (800 animaux au total) seront soumis à l'injection de molécule induisant une toxicité hépatique pouvant induire des douleurs abdominales et est donc considérée comme une procédure de classe modérée.

Impact sur les animaux

L'étude de la toxicité hépatique nécessite par définition d'utiliser des doses toxiques des différents composés testés pouvant induire des douleurs (douleurs abdominales). Si le type de douleur induite par ces molécules n'a jamais été formellement caractérisée, la toxicité hépatique aigue est généralement considérée comme une procédure de classe légère ou modérée. Ce protocole peut donc engendrer chez les animaux des douleurs abdominales et un stress lié à la manipulation.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélevements (sang, foie) et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Les effets de sexe et circadiens font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du sexe et des rythmes circadiens sur la métabolisation et la toxicité hépatique. De même, l'étude de la toxicité hépatique ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet. Cependant, une veille bibliographique régulière sera réalisée afin d’identifier de nouvelles méthodes alternatives pertinentes pour remplacer ce protocole.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages. L'étude de l’horloge biologique nécessite également de raffiner les conditions d'hébergement des animaux afin de respecter leur propre horloge car les souris sont des animaux nocturnes. Ainsi, les animaux utilisés dans ce projet seront manipulés dans la phase de nuit. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie et d’analgésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce s'est orienté vers la souris car c'est le modèle utilisé dans les études précedentes qui ont généré les résultats préliminaires aboutissant à ce projet. De plus, afin de pouvoir appliquer les conclusions de ce projet à l'humain, le modèle murin est le modèle expérimental qui permet de modéliser au mieux la pharmacocinétique des molécules testées. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.

Injectées de toxines bactériennes qui font chuter leur pression artérielle puis les plongent dans le coma, 810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi une IRM de trente minutes sous anesthésie générale. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre la fuite capillaire du choc septique, à partir de protéines repérées chez dix-neuf patients. Le porteur présente le coma comme une limitation de l'inconfort, tout en indiquant que les doses plus importantes retenues ici peuvent engendrer des douleurs physiques et psychologiques avant qu'il ne survienne.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (EU1). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute) (EU1). Les animaux subiront une IRM d'une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale (EU2). Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). L'imagerie IRM sera réalisée sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.

Impact sur les animaux

L’induction d’un syndrôme de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection toxines bactériennes. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer ce syndrôme L’injection entraine une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Ce modèle a déjà été testé et mis au point précédemment au laboratoire. Les examens d'imagerie réalisés, quant à eux, sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique.

Devenir

Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.

Raffinement

À la dose utilisée, le choc septique induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort. Enfin, le transport entre sites sera assuré par un prestataire agréé et durera environ 30 minutes. Les animaux auront accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages seront ventilées et enrichies avec du coton. Un délai entre le transport et l'imagerie sur site sera mis en place pour diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car le protocole précis de syndrome de réponse inflammatoire systémique induit par des sucres mimant des toxines bactériennes est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de cette protéine d'intérêt dans ce modèle de sepsis. Ce projet permettra de visualiser les effets protecteurs de cette protéine sur la fuite capillaire associée au choc septique. Ces expériences permettront de définir si cette protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du syndrome de réponse inflammatoire systémique chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.

Une partie des souris est génétiquement prédisposée à développer des tumeurs du côlon, l'autre privée du gène de la tétraspanine 8. 1 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont marquées par section d'une phalange, gavées avec des bactéries choisies pour leur rôle pro-cancéreux, puis saignées par ponction derrière l'œil sous anesthésie, la progression tumorale étant suivie deux fois par semaine par l'aspect du pelage, celui de l'anus et la présence de sang dans les selles. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure pour prélèvements, sauf celles retenues pour entretenir la lignée.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle de la tétraspanine 8 (Tspan8) dans le côlon en termes physiologique et physiopathologique. Cette protéine est majoritairement localisée dans la membrane des épithéliums notamment dans le tube digestif et est connue pour être associée à des processus métastatiques dans le cancer colorectal. Pour ce projet, nous utiliserons des souris invalidées pour Tspan8 et des souris prédisposées à dévolopper un cancer colorectal. L’objectif principal sera de générer un modèle d'étude prédisposé à développer un cancer colorectal et invalidé pour la Tspan8 afin d’établir l’implication éventuelle de cette protéine sur la carcinogénèse colique. Le second objectif consistera à définir l’importance de cette dernière dans la perméabilité intestinale et son rôle sur le microbiote intestinal dans les deux contextes. En effet, ce dernier est un acteur majeur des (dis-) fonctions intestinales et il a été montré que les tétraspanines peuvent interagir avec des souches bactériennes. De ce fait, nous évaluerons également si TSPAN8 peut être partenaire pour des bactéries commensales ayant acquis des facteurs de virulence et connues pour jouer un rôle procarcinogène dans le cancer du côlon (Escherichia coli productrice de colibactine). Enfin, nous testerons la même hypothèse avec une entérobactérie murine Citrobacter Rodentium mimant une infection par entérobactérie chez homme.

Bénéfices attendus

Cette étude est partie intégrante d’un projet plus large visant à caractériser l’effet du microbiote intestinal sur la survenue de cancers colorectaux. En effet, l’étude des modifications de la structure de la barrière intestinale et de la colonisation bactérienne, en contexte sain ou pathologique sur des souris invalidées pour le gène de la TSPAN8, nous permettra de définir le rôle pro tumoral de cette protéine et de débuter les études mécanistiques visant à établir le lien entre cette protéine et les bactéries intestinales. A terme, ces études permettraient de définir une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer colorectal.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage intragastrique (douleur légère, faible durée quelques secondes) et des prélèvements de sang par technique rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse en pré-mortem (douleur légère, faible durée quelques secondes).

Impact sur les animaux

Pour les souris ne produisant pas la protéine d'intérêt TSPAN8, il n’est pas attendu de phénotype dommageable au vu des précédentes observations. Pour les souris prédisposées à développer un cancer colorectal, la croissance tumorale sera appréhendée par une observation bi-hebdomadaire des souris. Une fiche de score sera réalisée pour chaque souris et permettra de déterminer si l’animal est en souffrance. Les animaux seront génotypés/marqués par phallangectomie. Cette technique entraîne une douleur légère et de faible durée. Plusieurs paramètres généraux, comportementaux et d’autres liés au modèle seront observés : suivi du poids, aspect du pelage et de l’orifice anal, consistance et présence de sang dans les selles, locomotion, comportement innée et induit. Un suivi renforcé (quotidien) sera également mis en place dès l’apparition des premiers signes de douleur (noté sur la fiche de score) afin d’intervenir la plus rapidement. Les animaux pourront également subir un gavage intragastrique (douleur légère, très courte durée) ou un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital en prémortum sous anesthésie gazeuse (douleur légère, très courte durée).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour des prélèvements post-mortem sauf ceux nécessaires à l'entretient de la lignée.

Remplacement

La caractérisation des propriétés de la Tspan8 sur l’architecture de l’épithélium intestinal en contexte sain sera complétée par des études in vitro sur cellules coliques polarisées. Cependant, l’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il est impossible d’étudier le rôle de la Tspan8 lors d’une infection chronique en modèle in vitro. De même, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'étudier la perméabilité intestinale à l'échelle systémique en présence de microbiote intestinal sain ou pathologique. Enfin, l'étude du rôle de la TSPAN8 sur la modulation du microbiote intestinal en contexte sain ou pathologique doit obligatoirement être réalisé sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire sur modèle sain (Tspan-/-) ou pathologique (APCmin/+) ont mis en évidence une forte variabilité des modèles (variabilité inter individuel), de la colonisation bactérienne post gavage, de son maintien au cours du temps, de la progression tumorale en fonction du temps et de l'étude de le perméabilité intestinale. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance des modèles et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Lors de la création de la lignée le nombre d'animaux est également réduit à son minimum afin d'obtenir à terme un minimum de 7 souris femelles et mâles présentant le génotype d'intérêt pour l'étude du bien être animal.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un suivi qui permettra de détecter toute apparition de souffrance ou de mal-être quel que soit le modèle (sain ou pathologique). Le cas échéant, l’animal sera isolé et traité à l’aide d’antidouleurs de manière graduelle à la souffrance observée. Les animaux seront hébergés avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre). L’eau et l’alimentation seront fournis à volonté et disposé dans le fond de cage pour faciliter son accès. La litière sera changée en fonction des besoins de chaque cage. Durant la phase de création de la lignée, les animaux bénéficieront du même raffinement.

Choix des espèces

L’étude des processus de progression tumorale ne peut s’effectuer que dans un organisme vivant proche de l’homme, en l’occurrence, le modèle souris. Celui-ci est aussi particulièrement adapté aux expériences d’infection bactérienne et d’étude de la perméabilité intestinale. Dans le modèle prédisposé à développer un cancer colorectal et invalidé pour la Tspan8, nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois correspondant respectivement à la période d’apparition des premières lésions et d’un stade avancé de développement tumoral. Pour le modèle uniquement invalidé pour la synthèse de la Tspan8, nous regarderons aux temps 2,3 et 4 mois les modifications de perméabilité de l’épithélium intestinal. La colonisation bactérienne sera suivi en temps réel 1fois/semaine.

Toutes tuées pour prélever leur cœur, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut passer jusqu'à dix-huit échographies cardiaques mensuelles, de trente minutes chacune sous anesthésie gazeuse, alors que le porteur reconnaît que le risque de mort sous anesthésie augmente chez des animaux au cœur défaillant. Les souris dont le gène est supprimé peuvent développer une insuffisance cardiaque avec œdèmes pulmonaires, difficultés respiratoires, troubles du rythme et morts subites, pour éclairer un syndrome génétique rare. Le porteur conclut que les stratégies de remplacement ne reproduisent pas l'"organisme entier" et que l'expérimentation sur souris est "indispensable".

Objectifs

Le syndrome de Carney, est un syndrome génétique rare conduisant à des atteintes cardiaques incluant des tumeurs cardiaques et une altération de la fonction cardiaque. Notre projet a pour objectif d’identifier le rôle d’un gène particulier dans la mise en place de ces atteintes cardiaques.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’augmenter nos connaissances sur le rôle joué par notre gène d'intéret dans les cellules résiduelles des crêtes neurales cardiaques chez l’adulte et ainsi d’identifier les mécanismes physiopathologiques responsables de la mise en place des atteintes cardiaque liées au syndrome de Carney.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections (moins de 2 minutes chacune), d'une échocardiographie (évaluation de la fonction cardiaque par échographie) mensuelle soit 18 maximum, réalisée sous anesthésie générale gazeuse (30 minutes au total).

Impact sur les animaux

Les animaux délétés pourront développer au cours du temps une pathologie cardiaque altérant la contraction cardiaque qui conduira in fine à une insuffisance cardiaque. Si les souris développent des symptômes proches de ceux identifiés chez l’Homme, elles pourraient développer une insuffisance cardiaque (avec des œdèmes dont des œdèmes pulmonaires associés à des difficultés respiratoires, une fatigabilité et des difficultés à se déplacer), des troubles du rythme et des morts subites. Au cours du projet, certains animaux recevront une injection unique. La principale nuisance attendue est le stress de l'animal lié à la contention. Les échocardiographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse post mortem du tissu cardiaque.

Remplacement

Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux. Malgré les stratégies de remplacement développées, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris contrôles et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physio-pathologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Afin de limiter ou d’éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. L’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiquescouplée à notre expérience (nos investigations passées montrent que certains effets varient selon les mesures de 30 à 70 %) permettent d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Ainsi, le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence des anomalies de la fonction cardiaque. De plus, cette étude de type longitudinale permet de suivre les animaux au cours du temps ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse chez l’animal : - Modifications apportées à l'élevage afin d'améliorer le bien-être des animaux : enrichissement des cages. - L'anhestésie gazeuse est mise en place pour limiter l'angoisse de l'animal. - Établir des points limites les plus précoces possibles en fonction de l'objectif de l'expérimentation. - Afin de prévenir toute souffrance, les animaux seront examinés quotidiennement. Une grille d'évaluation des scores sera mise en place et permettra selon des critères précis, le déploiement d’actions spécifiques permettant de soulager la souffrance. - Une attention toute particulière sera portée au site d'injection afin de prévenir toute infection. - Une attention particulière sera portée auxanomalies respiratoires.

Choix des espèces

Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du cœur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation de souris génétiquement modifiées représente le modèle le plus pertinent en ce qui concerne la compréhension des maladies humaines. Pour cette étude les animaux adultes âgés de plus de 8 semaines seront utilisés. Les stades adultes se justifient par la volonté d’analyser le rôle du gène dans des cellules résiduelles dans le cœur adulte.

Toute souris qui perd plus de quinze pour cent de son poids, ou qui cumule trois signes cliniques, est mise à mort. 4 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des régimes déficients en tryptophane, trois injections déclenchant des crises de migraine, l'implantation d'électrodes crâniennes ou d'une caméra endoscopique fixée sur le crâne, et des enregistrements de quarante minutes de la rétine et du cortex visuel, répétés trois fois. Le porteur reconnaît que l'exposition à la lumière bleue est aversive et que l'endoscope pèse sur la tête de l'animal, et présente 4 320 comme un maximum susceptible d'être revu à la baisse, sans détailler la répartition par groupe.

Objectifs

La migraine, 6ème cause de handicap dans le monde, est associée à une allodynie cutanée et une photophobie qui rendent difficile le traitement. Elle est influencée par les aliments. Dans ce contexte nous nous intéressons plus particulièrement au tryptophane, un acide aminé essentiel dont la réduction de son ingestion augmente l’intensité des nausées, de la douleur et de la photophobie pendant la crise migraineuse. Les dérivés du tryptophane agissent sur un récepteur qui participe au contrôle de la neuroinflammation et la neurotoxicité. L'activation de ce récepteur a des effets protecteurs et antiinflammatoires. Au laboratoire nous avons mis en évidence chez la souris qu’une déficience en tryptophane conduit à des altérations au niveau cérébrale associées à une persistance de la diminution du seuil de sensibilité à la douleur et de la photophobie. Le 1er objectif est d’étudier le rôle du tryptophane dans le déclenchement et/ou la chronicisation de la migraine et les troubles sensoriels/affectifs associés. De plus, durant la crise migraineuse le message nociceptif (signal de douleur) issu des méninges et le message lumineux issu de la rétine convergent au niveau du thalamus (structure centrale du cerveau) avant d’être transmis vers les régions corticales suggérant un rôle de la rétine et du thalamus dans le mécanisme de photophobie. Le deuxième objectif de notre projet est donc d’étudier comment le message nociceptif/lumineux est traité au niveau thalamique et cortical durant et entre les crises de migraine. Enfin, récemment, il a été montré que la lumière peut avoir des effets bénéfiques sur la sensibilité à la douleur, en fonction de sa couleur avec des effets antinociceptifs de la lumière verte et pronociceptif de la lumière bleue dans des modèles animaux de nociception et de douleurs neuropathiques. Notre troisième objectif est donc d’étudier l’impact de la lumière en fonction de sa couleur sur la sensibilité à la douleur dans un contexte de migraine.

Bénéfices attendus

Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau de la rétine, des noyaux thalamiques et du cortex. Une déficience en tryptophane favoriserait ces dysfonctionnements via la modulation d'un récepteur. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence le rôle du tryptophane dans l’initiation et la chronicisation de la migraine ainsi que la vulnérabilité du circuit thalamo-corticale à la neuroinflammation, permettant de trouver des nouvelles cibles thérapeutiques adaptés au patient et centrées sur une approche alimentaire et probiotique et/ou photothérapeutique.

Procédures

injections intrapéritonéales - 3 injections par animal espacées de minimum 9h- quelques secondes par injection injection anesthésique - quelques secondes par injection procédures chirurgicales (implantation électrodes craniennes)- entre 20 et 30 minutes enregistrements électrorétinographiques, 40 minutes maximum, 3 enregistrements par souris à 10 min, 24h et 7 jours enregistrements potentiels évoqués visuel, 40 minutes maximum, 3 enregistrements par souris à 10 min, 24h et 7 jours procédures chirurgicales (microendoscopie)- entre 20 et 30 minutes

Impact sur les animaux

hypersensibilité sensorielle hypersensbilité à la douleur la pose de l'électrode sur la cornée peut entrainer des irritations post-enregistrement (très rarement observé par expérience car l'éectrode est légèrement posée sur la cornée sans déplacement) inconfort lié à la présence de l'endoscope sur la tête de l'animal qui génère un léger surpoids inconfort lors de l'exposiiton à la luière bleue qui est plutôt aversive Normalement l'ISDN n'induit pas de stress et d'anxiété mais certaine souris peuvent avoir une réaction différente à la généralité. Douleur légère (piqûre) lors des injections Léger inconfort lié à la présence de la caméra endoscopique sur la tête de l’animal

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car ayant reçu des régimes particuliers et/ou des traiements ou des chirurrgies, ils ne pourront pas etre réutilisé sans prendre le risque de compromettre les autres expérimentations. De plus certains animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (procédure 3)

Remplacement

Aucune méthode alternative actuelle ne permet de remplacer l’expérimentation sur animal dans le cadre de ce projet qui prend en compte les interactions complexes entre la rétine (la lumière), le cerveau et le microbiote (alimentation) impliquées dans la migraine et ses symptômes associés. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal afin d’avoir une vision générale du système et de pouvoir étudier les mécanismes de régulation et d’intégration de la douleur migraineuse.

Réduction

Notre expertise dans les domaines techniques utilisés dans ce projet nous permet d’établir le nombre d’animaux par groupe de manière fiable pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre indiqué dans les différentes procédures correspond au maximum d’animaux mais nous procédons par série de manière à ce que si tout se passe de manière optimale nous puissions réduire le nombre d’animaux par groupe. Quelle que soit la procédure à réaliser, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin de tirer des conclusions statistiquement fiables et pertinentes.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux, les souris seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, sauf pendant la récupération de la chirurgie, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier) avec accès libre à la nourriture et l’eau. Leur état physique et comportement seront évalués régulièrement de la réception à la mise à mort. Dans le cas où l’animal montre au moins un des signes cliniques (tels que manque de toilettage, piloérection, déplacement anormal, posture anormale, mutilation, hypoactivité, agressivité, vocalisation spontanée, lésions, perte de poids, fuite anormale) soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contre la douleur, désinfection des blessures, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à sa mise à mort. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques ou s’il perd plus de 15% de son poids initial, nous procèderons à sa mise à mort.

Choix des espèces

Ce projet est la suite d'une étude précédente. Nous continuons donc à utiliser le même modèle animal. Nous avons pu mettre en évidence une similarité des symptômes migraineux chez la souris et l’homme dont allodynie faciale et photophobie. De plus nous envisageons par la suite de travailler sur des souris génétiquement modifiés, knockouts pour des gènes spécifiques afin d’affiner notre étude sur les mécanismes impliqués dans la migraine. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes (6 -12 semaines d’âge)

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection par jour pendant quatre semaines sur animal vigile, avec un risque de péritonite et d'infection aux points de piqûre que le porteur reconnaît, puis passent deux tests d'agrippement forcé et deux prélèvements sanguins sous anesthésie. La dernière étape est une chirurgie de mesure de la force musculaire, sous anesthésie profonde, immédiatement suivie de la mise à mort. Deux composés ont déjà montré leur effet sur des cellules de patients, le porteur affirmant que le passage in vivo reste une étape "indispensable" avant tout essai chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif global du projet est d'évaluer l'efficacité de molécules pharmacologiques pour la ré-expression de protéines, dans des modèles murins bien caractérisés de maladies neuromusculaires rares. Il n’existe pas, à l’heure actuelle, de traitement pour ces maladies. Des études sont en cours afin de moduler les déficits secondaires liés aux mutations mais il est pertinent de développer une approche permettant de cibler le défaut primaire (l’absence de protéine en raison de la mutation génétique) en permettant la ré-expression de la protéine déficitaire. Les molécules dont nous voulons évaluer l'efficacité in vivo ont déjà démontré, in vitro dans des systèmes rapporteurs et des lignées cellulaires issues de patients, leur efficacité. Des résultats préliminaires de pharmacocinétique ont aussi été obtenus dans des souris contrôles permettant d’affiner le déroulement de ce projet.

Bénéfices attendus

Les maladies neuromusculaires sont des maladies héréditaires rares, cliniquement et génétiquement hétérogènes. La dystrophie musculaire de Duchenne est la maladie musculaire la plus commune chez l’enfant (prévalence estimée à 1-9 / 100 000) et les dystrophies liées au déficit en collagène VI sont la seconde forme de dystrophies musculaires congénitales en Europe dont la prévalence exacte est inconnue. Environ 10 pourcent des patients portent des mutations non-sens entraînant entraînant des codons de terminaison de la traduction prématurés (PTC pour premature termination codon), et une absence de synthèse protéique. A ce jour il n’existe aucun traitement curatif pour ces maladies très invalidantes. Le besoin de développer des stratégies ciblées est donc très fort. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer le bénéfice thérapeutique de nouvelles molécules contrecarrant spécifiquement les mutations non-sens, en forçant la synthèse protéique. A long terme, ces molécules pourraient bénéficier à des patients atteints d’autres maladies génétiques causées par des mutations non-sens. Des modèles murins portant des mutations non-sens dans les gènes impliqués dans ces maladies reproduisent de nombreux défauts moléculaires et fonctionnels, et sont donc des modèles parfaitement adaptés pour l’évaluation de cette approche thérapeutique. Le bénéfice attendu est la ré-expression de la protéine ciblée qui sera détectée sur tissus prélevés en post-mortem, et qui devrait améliorer la fonction musculaire.

Procédures

Les animaux feront l'objet d'injections quotidienne (sur animal vigil car procédure très rapide), sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend moins de 2 min par souris. Deux prélèvements sanguins sont prévus, un en tout début de procédure effectué sous anesthésie (durée de l'acte moins de 5min), un autre juste avant l'euthanasie, sous anesthésie (durée de l'acte moins de 5min). Des mesures de la force musculaire seront réalisées la 1ère semaine du traitement et lors de la 3ème semaine, grâce à un test d'agrippement qui consiste simplement à faire agripper une grille par la souris au niveau de ses membres antérieurs ou postérieurs (ou les deux) en appliquant une légère traction pour mesurer la force d’agrippement. Ce test comporte 3 mesures avec une minute de repos (soit une durée de 3-4 minutes environ). Enfin, les animaux feront l'objet d'une procédure de mesure de force de muscles spécifiques des membres postérieurs, nécessitant une intervention chirurgicale sous analgésique et anesthésie profonde et qui sera immédiatement suivie par l'euthanasie des animaux avant leur réveil. La durée de l'acte chirurgical est d'environ 30min par animal.

Impact sur les animaux

Certains animaux de cette étude présentent un phénotype dommageable, qui se traduit par une atteinte musculaire lorsqu'elles sont âgées qui n’altère cependant pas la survie des animaux, ni leur mobilité ou fertilité. Elles sont viables, fertiles, et possèdent une longévité normale. Les souris feront l’objet de procédures consistant essentiellement en des étapes d’injections, puis d’un protocole d’évaluation non invasive de la force musculaire (grip strength), et enfin d’un protocole d’évaluation de la fonction musculaire. Les souris pourraient donc ressentir une légère douleur de courte durée au point d’injection/prélèvement et un stress léger lors des manipulations quotidiennes, la pesée hebdomadaire ou les périodes d’adaptation aux différentes techniques. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite et les sites d’injections peuvent s’infecter. Les tests de force musculaire peuvent générer un stress et une fatigue transitoire. Des prélèvements sanguins sont aussi prévus (en vigile ou sous anesthésie) et peuvent induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Par ailleurs, les anesthésies, effectuées dans le cadre de certains actes, peuvent induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Tous les animaux qui entreront dans ce projet seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des tissus cibles. Dans le cas des modèles que nous allons utiliser, nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles squelettiques, à la fois d’un point de vue de la force musculaire mais aussi grâce à des marqueurs moléculaires et à la réexpression de la protéine d’intérêt. Ces études d'efficacité seront complétées par l'analyse d’un marqueur sanguin couramment utilisé pour vérifier l’état des cellules musculaires.

Remplacement

Dans un objectif de remplacement, une sélection in vitro des composés thérapeutiques dans des modèles cellulaires de la maladie est effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Les molécules dont nous voulons évaluer l'efficacité in vivo ont déjà démontré leur potentiel dans des conditions in vitro. Cependant les modèles in vitro restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas la complexité tissulaire contenant plusieurs types cellulaires qui communiquent entre eux et avec leur microenvironnement. L’évaluation in vivo de l’efficacité des différents composés thérapeutiques nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation d’intérêt et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. Ainsi, sur la base des tests in vitro nous avons sélectionné 2 composés montrant une efficacité sans cytotoxicité.

Réduction

Afin de réduire et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés tout en tenant compte des connaissances sur les lignées utilisées pour optimiser nos chances de détecter un bénéfice thérapeutique. Des résultats préliminaires de pharmacocinétique ont aussi été obtenus dans des souris contrôles permettant d’affiner le déroulement de ce projet, et de choisir 3 doses pertinentes. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, biologie moléculaire, histologie et ce, sur plusieurs tissus. Nos études précédentes ainsi que la veille scientifique réalisées sur la littérature scientifique rapportant des études similaires nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des analyses statistiques seront réalisées pour une interprétation fiable des résultats. Au maximum 124 animaux seront utilisés pour ce projet.

Raffinement

Dans le but de raffiner le protocole, toutes les précautions seront prises afin de réduire au mieux le stress et la souffrance animale. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Pour la lignée avec phénotype dommageable, des croquettes de nourriture seront laissées sur la litière. Pour les animaux très jeunes, de la nourriture hydratée sera laissée sur la litière des cages. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Des mesures de raffinement adaptées aux différentes procédures et corrélées avec les nuisances ou effets indésirables attendus seront mises en place afin de limiter la douleur et le stress : Lors de l’anesthésie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter une chute de la température corporelle. Les sites d’injection seront examinés chaque jour afin de détecter tout signe d’inflammation ou d’infection, ce qui serait alors discuté avec la cellule du bien-être animal et le vétérinaire. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis.

Choix des espèces

Des modèles murins, drosophile et/ou poisson-zèbres ont été décrits pour la dystrophie musculaire de Duchenne et d'autres myopathies. L’approche thérapeutique testée cible un type particulier de mutation qui ne sont reproduites que dans des modèles murins. Le premier modèle utilisé présente un phénotype musculaire adapté pour l’évaluation d’approches thérapeutiques car permettant une meilleure évaluation des bénéfices fonctionnels. Ce modèle présente un phénotype dommageable. Le second modèle est le seul modèle disponible présentant une mutation essentielle pour le projet. Ce second modèle ne présente pas de phénotype dommageable. L’utilisation de ces modèles permettra de valider l’approche thérapeutique dans les tissus affectés. Les animaux sont utilisés à 4-6 semaines, stade auquel la croissance musculaire est bien avancée et afin de réaliser sans problème les injections.

1 000 souris vont être utilisées et tuées pour mettre au point une injection censée remplacer la castration chirurgicale, chacune ne subissant qu'une seule injection, un micro-tatouage et au plus deux prélèvements de sang. Les procédures sont classées en gravité modérée, le porteur mentionnant des prélèvements derrière l'œil, une possible inflammation locale après injection intramusculaire et des réactions d'hypersensibilité par voie intraveineuse. Le bénéfice avancé tient à l'évitement d'une chirurgie qualifiée de traumatisante pour les chiens, chats et cochons, et au contrôle des populations d'animaux errants. Épargner ces opérations passe donc par la mise à mort de mille souris, étape que le porteur présente comme obligatoire pour obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

L’objectif du projet vise à développer une solution alternative à la castration chirurgicale des mammifères. Il vise à remplacer une chirurgie douloureuse, stressante, source d’angoisse et génératrice d’effets secondaires graves par un médicament injectable, biologique et indolore. Le concept a été validé avec des experts scientifiques et vétérinaires. Après des optimisations et des évaluations réalisées in vitro, la procédure de ce projet sera réalisée chez la souris. Les études réalisées chez la souris serviront à définir la dose efficace et sécurisée qui sera utilisée chez d’autres mammifères au cours des essais cliniques qui seront ensuite conduits. L’ensemble de ces expériences sont nécessaires pour obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un futur médicament.

Bénéfices attendus

- Le bénéfice attendu est de trouver une alternative à la castration chirurgicale qui est traumatisante pour les animaux et engendre de plus des maladies chroniques chez les animaux de compagnie (cancer par exemple). - Créer un outil de contrôle plus simple des populations d'animaux errants.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins sous anesthésie d'un nombre maximum de 2 de leur vivant pour une durée n'excédant pas 1 minute. Chaque animal sera soumis à un micro-tatouage pendant une 20aine de secondes. Chaque animal sera soumis sous anesthésie à une unique injection, soit sous cutanée, soit intra-musculaire, soit intra-veineuse. Quelle que soit la procédure choisie, le temps n'excèdera pas les 30 secondes.

Impact sur les animaux

L'injection sous-cutanée et les prélèvements sanguins rétro-orbitaires peuvent générer de l'inconfort au réveil de l'animal. L'injection intra-musculaire peut provoquer une inflammation locale. L’injection intra-veineuse peut provoquer des réactions d’hypersensibilités dite « d’infusion », bénignes et transitoires. Il y a une possibilité d'effet indésirable éventuel des médicaments.

Devenir

L'ensemble des animaux concernés par cette demande de projet sont impliqués dans une unique procédure, ils seront tous mis à mort au terme de celle-ci.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytiques et/ou moléculaires de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments biologiques mis en œuvre.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum nécessaire par lot a été déterminé par une analyse statistique préalable. Les molécules candidates sont soigneusement sélectionnées par des tests In-Vitro au préalable de manière à ne pas générer de cohortes d'animaux superflues.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées en conditions stériles et suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés en fratries. Les conditions d’hébergements sont adaptées à ces animaux (maintien du statut sanitaire) : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de laine végétale. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont référencés et régulièrement ré-évalués par la Structure de Bien-Etre Animal. Les procédures prévue dans ce projets seront réalisées sous anesthésie et tout sera mis en place pour éviter la douleur des animaux sans provoquer d'interaction les traitements testés. Les mesures concervatoires et points limites adaptés et spécifiques au projets sont défini pour limiter au maximum toute souffrance animale. Les procédures prévue dans ce projets seront réalisées sous anesthésie.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytiques et/ou moléculaires de notre objet d'étude. Après des optimisations et des évaluations réalisées in vitro, la procédure de ce projet sera réalisée chez la souris. Les études réalisées chez la souris serviront à définir la dose efficace et sécurisée qui sera utilisée chez d’autres mammifères au cours des essais cliniques qui seront ensuite conduits. L’évaluation des biothérapies exprimant nos anticorps chez la souris, espèces représentatives des espèces cibles, est une étape préliminaire pour définir la dose efficace (dose stérilisante) et tolérée des animaux de plus grande taille (porc, chien et chat). Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines , âge pour lequel elles sont reconnues comme pubères et fertiles et dont on pourra confirmer l’induction d’une stérilisation biologique et après 2 semaines d’acclimatation.

Une phalange est coupée sur chaque souriceau entre son septième et son dixième jour de vie, pour l'identifier. Les mêmes souris développent à partir de quatre mois un cancer de la glande surrénale avec métastases pulmonaires, et reçoivent alors deux à trois injections par semaine pendant deux mois, seules ou combinées à une chimiothérapie. 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à six mois, au stade où la dissémination métastatique est jugée évidente. Le porteur ne mentionne comme nuisances que le stress de la contention et une douleur de faible intensité liée aux piqûres, sans un mot sur ce que représente pour l'animal un cancer métastatique laissé évoluer deux mois.

Objectifs

Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif avec un pronostic très défavorable, en grande partie à cause de l’absence de thérapies efficaces pour les patients atteints de carcinome cortico-surrénalien métastatique ou récurrent. En effet, le traitement standard actuel pour ces patients – la combinaison du mitotane avec la tri-chimiothérapie EDP (Etoposide, Doxorubicine et Platine) ne donne qu’une survie globale de 15 mois, soulignant la nécessité de développer de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer le potentiel thérapeutique de l’élimination des cellules sénescentes avec des sénolytiques seuls ou en co-thérapie avec l’étoposide dans un modèle métastatique de carcinome cortico-surrénalien cliniquement pertinent. Ceci devrait permettre d’améliorer le pronostic du corticosurrénalome, qui reste aujourd’hui défavorable.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Identification par phalangectomie : une phalange distale des souris nouveaux-nées sera coupée entre les premiers 7 et 10 jours de vie afin de permettre l’identification et le génotypage des individus. Le geste sera realisé une seule fois au cours de la vie de l’animal et ne durera que quelques secondes. - Injections intrapéritoneales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 128 souris (mâles et femelles confondus, âgées de 4 mois), seront injectées deux ou trois jours par semaine pendant 2 mois avec des sénolytiques seuls on en combinaison avec la chimiothérapie étoposide. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Échographie : realisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, 128 souris de 4 mois d’âge, mâles et femelles confondus, seront rasées sur les flancs et la taille de la tumeur sera mesurée à l’aide d’un échographe. Ce geste sera réalisé 3 fois par souris : une fois au début du traitement, une fois après un mois de traitement, et puis entre 72 et 48h avant la mise à mort de la souris, et ne durera que 30 minutes à chaque fois.

Impact sur les animaux

Bien que de courte durée (quelques secondes), la contention et les injections intrapéritoneales peuvent induire un stress et une douleur de faible intensité.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses ciblant le rôle des sénolytiques comme nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés ayant un potentiel comme agent antitumoral. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour faire des analyses moléculaires et l’autre pour des analyses histologiques.. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux injectés avec le sénolytique seul ou en combinaison avec l’étoposide seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, jusqu’à leur euthanasie. Les points limites de nos expériences sont déterminés en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Ainsi, les expériences seront arrêtées suite à la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Pour tous les signes indicateurs de douleurs (activité réduite, perte de poids, automutilation…) nous suivrons une échelle de points limites stricte et des analgésiques seront administrés si besoin.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La lignée utilisée permet l’inactivation de ces deux gènes dans le cortex de la glande surrénale. À partir de 4 mois, ces souris développent des corticosurrénalomes agressifs qui se manifestent par l’apparition de métastases pulmonaires. Afin d’évaluer le rôle antitumoral des sénolytiques sur des corticosurrénalomes à des stades avancés associés à une dissémination métastatique, les souris seront traitées avec le sénolytique seul ou en combinaison avec l’étoposide au moment où les premiers signes de malignité ont été détectés (4 mois) et jusqu’au moment où la dissémination métastatique est évidente (6 mois).

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant huit semaines, six jours sur sept, elles reçoivent un composé par la bouche, à la pipette ou par sonde de gavage enfoncée jusqu'à l'estomac quand elles se montrent réfractaires. Trois batteries de tests mesurent leur motricité et leur sensibilité : cinq minutes forcées à marcher sur une roue tournante, analyse de la démarche, et pressions croissantes d'un filament sur la paume de la patte. Le porteur estime l'ensemble des nuisances "à caractère léger", le seul gavage relevant selon lui du modéré, alors que les 240 souris sont déclarées en gravité modérée.

Objectifs

La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique. Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est dûe à des mutations dans le gène MFN2 . Au niveau cellulaire, ce gène muté entraine des défauts dans les interactions entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE) ainsi que dans la dynamique et le transport des mitochondries, dans les neurones moteurs des souris CMT2A. Nos travaux précédents ont montré qu’un des mécanismes sous-jacents à la pathologie était l’activation d’un stress cellulaire appelé stress du réticulum endoplasmique. Le composé pharmacologique utilisé au cours de ce projet est un inhibiteur de cette voie de stress. Il a déjà démontré des effets protecteurs dans d’autres formes de CMT ainsi que dans la maladie de Charcot chez des modèles souris et est en cours d’essai clinique pour cette dernière chez l’homme. Ce projet a pour but de tester une approche thérapeutique basée sur l'administration de ce composé pharmacologique dans un modèle murin modélisant de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ce traitement pharmacologique représente une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. Si un effet bénéfique est obtenu, cela pourrait dans le futur conduire à un essai clinique chez l’homme. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT liées à des défauts de stress du réticulum endoplasmique.

Procédures

Les animaux seront soumis à : une administration de traitement par voie orale en prise spontanée ou par gavage 6j/7 pendant 8 semaines (léger; quelques minutes); des tests de comportement permettant la masure de la locmotion et de la sensibilité des pattes . Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais et entre chaque test (au moins deux jours). A la fin de l'expérience, une chirurgie sans réveil sera réalisée.

Impact sur les animaux

Dans le cas de l’administration guidée par micropipette, les animaux subiront à l’âge adulte un traitement par voie orale de 6 jours par semaine pendant deux mois. Cela impliquera une légère contention de l'animal deux fois par jour au moyen d'une légère pression exercée par la paume de la main de l'expérimentateur. L'administration par micropipette ne créera pas d'inconfort, et le composé a déjà été testé et est bien toléré. Si les animaux deviennent réfractaires à la fin du traitement à l’administration par micropipette, le composé sera alors administré par gavage à l’aide d’une sonde droite de 26G. Dans ce cas les animaux subiront une contention afin d'immobiliser l'animal et l’incorporation d’une canule à bout rond pour délivrer directement dans l’estomac. Ces gavages répétés peuvent induire des irritations au niveau de l’œsophage et représentent ainsi une nuisance modérée. Le phénotype dommageable de ces souris est léger et n'entrainent pas d'inconfort dans leur vie quotidienne. Néanmoins, les animaux subiront trois tests comportementaux à trois temps (avant, pendant et à la fin du traitement). Au cours du test rotarod, les souris seront forcées à marcher sur une roue qui tourne pendant 5 min. Pour les souris transgéniques qui présentent des défauts locomoteurs sur ce test, cela pourra conduire à une fatigue musculaire légère. Nous n'anticipons pas de nuisance liée au test du gait. Le test VonFrey, qui a pour but d’analyser la réponse sensitive, entraîne par contre un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Les souris ressentiront ainsi une légère piqûre au niveau de leur paume qui entraine un léger inconfort. Nous estimons qu'au cours du projet l'ensemble des nuisances à caractère léger. Seul la mise en place du gavage entrainera une nuisance modérée.

Devenir

mise à mort et récupération des tissus

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique de ce composé sur un modèle in vitro de la maladie. Néanmoins le passage in vivo est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux, détaillé au point 3.4.10, a été limité au minimum nécessaire (= 16 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et au moyen de tests statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous privilégions une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies. Au total nous utiliserons 192 animaux répartis de la manière suivante: - Deux groupes d’âge : début du traitement (avant le début des symptomes ) et début du traitement (après le début des symptomes) – Deux groupes d'animaux : contrôles et modèles de la pathologie - Trois groupes thérapeutiques : non traités, traités avec une solution saline et lait, traités avec le composé pharmacologique. Il y aura donc au total 192 animaux dans l'étude.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe). Les souris seront stabulées par petits groupes dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de maisonnettes en carton. Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Le maintien de lignée est réalisé dans un établissement utilisateur agrée et les souris seront manipulées et suivies par du personnel compétent. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont controlés. Nous avons également choisi de privilégié un mode d’administration de notre composé pharmacologique via la méthodede prise spontanée par pipette plutôt que par gavage afin de réduire considérablement le stress des animaux et d’éventuels risques de blessures lors de l’injection. Des points limites ont été établis (voir fiche de score) pour prendre en charge au plus vite les atteintes au bien être de l’animal et l’arrêt des souffrances.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez ces patients telles qu'une dénervation musculaire, et des défauts locomoteurs tardifs. Pour les deux approches, les traitements seront réalisés à deux âges : avant (3 mois) et après le déclenchement de la maladie (5 mois) afin de déterminer si l'effet du traitement permettra d'empêcher le développement de la maladie et/ou de la ralentir une fois celle-ci déclarée. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement.

Cinquante molécules par an, deux cent cinquante sur la durée du projet, envoyées par des clients : 4 000 rongeurs, 2 500 souris et 1 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par gavage, injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse, subissent des prélèvements sanguins à la queue ou en submandibulaire, et une ponction de liquide céphalorachidien. Tous sont tués pour découper leur cerveau en tranches et y enregistrer l'activité électrique. Le porteur qualifie ce travail de projet scientifique mené sur sa plateforme, alors que les composés, leur toxicité évaluée en amont et le calendrier des tests relèvent de ses clients.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives liées au vieillissement ou à des troubles spécifiques, constituent un enjeu majeur de santé publique. Ce projet scientifique, réalisé sur notre plateforme d'électrophysiologie, vise à étudier l'efficacité de composés en développement sur l'activité neuronale, grâce à la technique d'électrophysiologie ex vivo sur coupes cérébrales de rongeurs sains. Ce projet servira de base pour le développement futur de stratégies thérapeutiques, dans les modèles pathologiques spécifiques associés et qui seront décrits dans un autre projet. Pour cela, nous analysons les effets de ces composés sur les mécanismes neuronaux fondamentaux à travers des expériences réalisées sur des rongeurs sauvages. Nos études seront réalisées soit sur la souris soit le rat selon la pathologie étudiée et la disponibilité des modèles animaux de la pathologie. Ces modèles offrent une base physiologique robuste, essentielle pour comprendre les processus fondamentaux dans un système neuronal non altéré. Les différentes structures cérébrales seront étudiées pour étudier la mémoire, la régulation émotionnelle, les circuits de récompense, pour analyser la coordination motrice et les interactions sensorimotrices, pour évaluer les fonctions motrices et certaines dimensions cognitives. Les composés sont administrés par voie orale ou parentérale selon des protocoles adaptés, avec des effets mesurés après des périodes d’exposition définies. Ce projet a pour but de fournir des données fondamentales pour orienter le développement de thérapies innovantes. On estime à 50 le nombre de molécules testées par an soit 250 pour la durée du projet.

Bénéfices attendus

En complément des recherches menées par nos clients, cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces composés et de contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les maladies neurodégénératives. Les résultats obtenus serviront de base pour la mise en place de stratégies thérapeutiques futures, qui seront approfondies à travers des études spécifiques sur des modèles pathologiques.

Procédures

Administrations : intrapéritonéale : 5 secondes, orale : 5 secondes, sous cutanée : 5 secondes, intraveineuse : 10 secondes, Sur animaux sous anesthésie et sous antalgie : prélèvements sanguins 5 secondes. prélèvements liquide céphalo rachidien 20 secondes, chirurgie terminale sans réveil 1 minute.

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les procédures uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont par nos clients, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. L’administration par gavage peut entraîner une gêne légère à modérée (gavage chronique), transitoire, due à la contention et à l’introduction de la sonde. Les produits administrés par cette voie peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire. L’injection sous-cutanée entraîne une douleur légère et brève, due à la piqûre et au produit injecté. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré. L’injection intrapéritonéale provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. L’injection dans la veine caudale induit une douleur légère au moment de la piqûre et un stress bref lié à l’immobilisation. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin à la veine caudale entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Le prélèvement submandibulaire provoque une douleur légère à modérée de courte durée en raison de la ponction. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire ainsi que celui du liquide céphalorachidien sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée sur des coupes cérébrales de rongeurs à l’aide de techniques d’électrophysiologie. Ces préparations ex vivo conservent certaines propriétés fonctionnelles des circuits neuronaux, permettant d’étudier l’activité synaptique et la dynamique des réseaux à une échelle locale. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, permettant d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas d’étudier les interactions au sein d’un réseau neuronal fonctionnel, ce qui justifie le recours aux coupes cérébrales ex vivo pour approfondir ces analyses dans un cadre plus proche de la physiologie neuronale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies d’éléments tels que des bûchettes de bois à grignoter, de la frisure papier, et des carrés de coton. Des tunnels en carton seront fournis pour les rats, tandis que des dômes transparents rouges seront utilisés pour les souris afin de faciliter les transferts entre cages tout en réduisant le stress. Des interactions quotidiennes avec les humains, combinées à une transition progressive de la lumière, amélioreront encore leurs conditions d’hébergement. Après chaque intervention technique, les réactions seront étroitement surveillées afin de minimiser toute souffrance animale. En cas de détérioration de leur état général, une surveillance renforcée sera mise en place, avec des soins appropriés prodigués en concertation avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les points limites établis pour le projet seront scrupuleusement respectés pour détecter et traiter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Les animaux seront pesés au moins une fois par semaine après l’acclimatation et avant le début des traitements. En cas de traitements répétés et consécutifs, des pesées 2 fois par semaine permettront d’ajuster précisément les volumes administrés. Les animaux seront toujours sous anesthésie générale / analgésie pour les procédures le nécessitant.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris et le rat, deux modèles largement utilisés en neurosciences pour l’étude des mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes importantes avec le cerveau humain. Ces similitudes en font des modèles de choix pour étudier les bases du fonctionnement normal du cerveau et les processus qui peuvent être perturbés dans les maladies neurodégénératives. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 4 semaines, (groupe de référence) correspondant au stade adolescent chez l'humain, jusqu'à 95 semaines, afin de couvrir toute la gamme des âges, du stade jeune (adolescent) à l'adulte âgé.