Procédures modérées

972 souris vont être utilisées, chacune pouvant passer jusqu'à trois séjours de 96 heures isolée en cage métabolique sur trois mois, à jeun seize heures avant chaque expérimentation. Elles reçoivent quinze administrations par voie orale en un mois, jusqu'à six anesthésies et jusqu'à trois prises de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les animaux homozygotes développent l'hypercalcémie recherchée, et le porteur affirme sur la base d'expériences antérieures qu'aucune nuisance n'est attendue, ne retenant comme stress que l'isolement en cage métabolique. Les points limites prévus décrivent pourtant une absence de gain de poids à la puberté, une incapacité à s'alimenter, un poids inférieur de plus de 15 % et des poils hérissés, autant de signes qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

Ce projet de recherche transversale vise à caractériser l'évolution d'une maladie rare, l'hypercalcémie induite par des excès de vitamine D, et de déterminer l'effet d'un nouveau traitement pour cette maladie sans traitement efficace à ce jour. Pour cela nous caractérisons les souris ayant une inactivation homozygote des gènes dont les variants homozygotes (CYP24A1, ou SLC34A1 ou SLC34A3) ont été identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des excès de vitamine D. De plus, les effets de la perte d'un seul allèle seront déterminés pour la 1ère fois dans cette étude.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans ce projet permettront d'améliorer le diagnostic et la prise en charge clinique des patients portants des variants homozygotes. De plus, cela permettra de conclure sur l'effet de l'état hétérozygote de ces gènes, la litterature étant très discordante sur ce point. Enfin, les résultats obtenus chez les souris traitées permettront de faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule, et donc accélérer le developpement de ce candidat médicament.

Procédures

isolement pendant la mise en cage métabolique (minimum 96h ; maximum 3*96h sur 3 mois), mise à jeun 16H avant l’expérimentation, administrations IP pour anesthésie (minimum 1, maximum 6 sur 3 mois, 15 sec par administration), administrations per os (15 sur 1 mois, 15 sec par administration), prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés (minimum 1, maximum 3 sur 3 mois, 30 sec par prise). Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats

Impact sur les animaux

Les animaux homozygotes sont hypercalcémiques, mais d'après nos expériences précedentes, aucune nuisance ni d'effet indésirable ne sont attendus (e.g. pas de perte de poids, pas de difficulté motrice, pas de signe de souffrance). A ce jour, les souris hétérozygotes n'ont pas été décrites comme hypercalcémiques. Durant la collecte des urines, un stress sera lié à l'isolement dans les cages métaboliques. Aucun effet indésirable n'a été observé précedement chez les souris traitées avec notre molécule. Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats

Devenir

Afin de caractériser l'évolution de la maladie et les effets de notre molécule sur les paramètres biochimiques urinaires et sanguins, l'expression de gènes/protéines et au niveau histologique, tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés et conservés pour des analyses.

Remplacement

L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. La compléxicité de ce réseau ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.

Réduction

L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux par groupe (6 males et 6 femelles) est le nombre d'animaux optimale afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%. Les tests utilisés seront soit paramétriques soit non paramétriques, dépendant de la normalité des valeurs obtenues. Au maximum, 4 doses seront utilisées. Si la molécule n’est pas efficace à une dose donnée, les doses inférieures ne seront pas testées. Les facteurs comparés seront les paramètres biochimiques urinaires et sanguins et l'expression de gènes/protéines.

Raffinement

Afin de minimiser le stress des souris qui seront isolées en cage métabolique, une phase d’habituation de 3 jours précède le test de 24h à proprement dit. Une partie des souris utilisées dans cette étude étant hypercalcémiques, des modalités de suivi de l’état de santé, des critères d’arrêts ainsi que des points limites seront mis en place (i.e. absence de gain de poids à la puberté, incapacité à s’alimenter, poids inférieurs de plus de 15 %, poils hérissés). Si nécessaire, des analgésiques pourraient etre administres selon les recommendations veterinaires. L’expertise du laboratoire sur l’étude des voies de signalisation de la vitamine D chez la souris permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Afin de limiter le stress des animaux lors des études longitudinales, ces derniers ne seront placés que 3 fois maximum dans les cages métaboliques avec mise à jeun, avec une distance de 28 jours entre 2 prélèvements. Lors des prises de sang, un volume équivalent de sérum physiologique sera administré en sous cutanée. Le jeûne (mise à jeun) avant la récolte d'urine et de sang est nécessaire pour garantir des résultats précis. Il permet d'éviter les fluctuations biochimiques sanguins tel que glycémie, des lipides et des hormones causées par l'alimentation, qui pourraient fausser les analyses. Cela assure une meilleure interprétation des résultats et une reproductibilité.

Choix des espèces

L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes finement régulés régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leur similitude avec les mécanismes chez l'Homme. De plus, les variants identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des exces de vitamine D induisent également cette pathologie chez la souris. Ainsi, le modèle murin est un modèle pertinent pour cette étude. Après le sevrage (4 semaines) et jusqu'à 12 mois, l'objectif étant de déterminer l'évolution de la maladie. Pour le traitement, cette pathologie étant une maladie affectant les enfants dès leur naissance, les souris seront traitées après le sevrage pendant 1 mois.

Former le personnel aux gestes techniques d'une activité de recherche et développement, sur des animaux vivants, constitue l'objet de ce projet. 1 340 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 souris, 80 lapins, 80 rats, 80 cochons d'Inde, 70 hamsters dorés, 10 hamsters de Chine et 20 cochons. Chaque séance comporte une à trois interventions par animal sur trente minutes, injections, prises de sang, anesthésies parfois répétées, lavages broncho-alvéolaires avec chute de la saturation en oxygène, le porteur reconnaissant que les personnes à former ne maîtrisent pas les gestes et peuvent provoquer saignements et douleurs par erreur technique. Quarante animaux seront réutilisés et vingt lapins ou cochons placés en adoption quand les conditions le permettent, les 1 280 autres étant tués, et le porteur justifie l'ensemble par une obligation réglementaire de formation qu'il qualifie d'"indispensable".

Objectifs

- Educatif : La formation sur animaux est indispensable pour la qualification du personnel et la maitrise des gestes techniques et ainsi pouvoir observer que ceux-ci correspondent bien aux règles de l’art et qu’aucun impact clinique n’est constaté suite à la réalisation des gestes techniques. - Réglementaire : La formation du personnel avec démonstration de la compétence est une obligation réglementaire (décret 2013-118, section 6, sous-section 4, paragraphe 2).

Bénéfices attendus

La formation du personnel aux gestes techniques permet d’avoir des personnes parfaitement formées et compétentes, et travaillant de façon harmonisée avec du matériel optimisé. Les bénéfices sont principalement éthiques : pour le bien-être de l’animal manipulé (raffinement), ainsi que pour consolider la reproductibilité du geste et donc éviter d’avoir à refaire l’étude (réduction). Des gestes maitrisés permettent également de limiter le risque de blessure pour l’opérateur

Procédures

Les animaux sont soumis à des sessions de formation à l’administration de produits non irritants et/ou de prélèvements de sang. Par séance de formation, ils vivront entre 1 et 3 interventions ; pour une durée totale de 30 minutes

Impact sur les animaux

Les nuisances sont : - la sensation de piqûre de l’aiguille pour les injections et prélèvements. - l’anesthésie potentiellement répétée notamment pour certains types de prélèvements sanguins - la chute de la saturation en oxygène du sang pendant quelques minutes dans le cas des lavages broncho-alvéolaires. Par définition, les personnes à former ne maitrisent pas complètement les gestes techniques. Bien qu’une formation théorique préalable et un accompagnement par une personne compétente soit assurés, il est possible que des erreurs techniques surviennent induisant des effets indésirables comme des saignements de faible intensité et de courte durée lors des prélèvements sanguins, ou de légères douleurs induites par une injection dans un compartiment non adéquate (péri-veineux ou intra-intestinal par exemple).

Devenir

Lorsque cela est possible (pas de formation au prélèvement terminal, pas de procédure invasive, bon état de santé de l’animal, pas d’hébergement dans un milieu bioconfiné, statut sanitaire compatible, structure d’accueil identifiée et disponible), des démarches de réutilisation, de replacement et/ou d’adoption sont enclenchées. Lorsque toutes les conditions ne sont pas réunies, les animaux sont euthanasiés en fin de procédures expérimentales.

Remplacement

Lorsque cela est possible, les gestes sont réalisés sur des matières non vivantes (plastique, textile, tissus morts, ou composition diverse) afin de s’entrainer au geste avant de pratiquer sur animal vivant. Des dispositifs ont déjà été testés, tous n’ont pas été retenus (ex : des animaux en plastique trop rigides pour s’entrainer à de la contention). Une veille scientifique est assurée par notre équipe (vétérinaires, managers, techniciens) via les publications, le réseau, la visite d’un centre de formation aux gestes techniques sans animaux, les formations (ex : ComEd), etc. afin de ne rater aucune opportunité à la formation sans animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est raisonné selon le nombre de personnes à former, l’expérience de ces personnes, le nombre de techniques à apprendre, la difficulté technique, le nombre de techniques réalisables sur un même animal et sur la base des expériences terrain comme étant le minimum pour s’assurer qu’une personne maîtrise un geste technique. Aucune approche statistique n'est envisageable pour ce projet, le nombre d'animaux utilisé étant tributaire du nombre de personnes à former et de leur niveau initial. Dans la mesure du possible, des animaux d’autres procédures pourront être utilisés pour cette formation. Pour qu’ils soient réutilisés, il faut que la procédure précédente soit considérée comme « légère ou modéré» et qu’ils soient en bon état de santé. Aucun animal ayant subi une procédure sévère ou ne présentant pas un bon état général ne pourra être utilisé pour la formation. Enfin, un effort de réduction est appliqué chez les rongeurs par l’utilisation d’un appareil d’imagerie qui permet de visualiser la localisation de l’injection (IC, IP, IM, ICe ou SC) -et donc valider le geste technique sans avoir à euthanasier l’animal - permettant ainsi de réutiliser l’animal par la suite.

Raffinement

Moyens entrepris au niveau du projet ou de la procédure pour réduire le niveau de souffrance : une formation théorique est dispensée à l’arrivée des personnes avec du texte, des supports visuels (photos, vidéos). Avant maitrise des gestes de prélèvements et d’administration (hors IP), les animaux sont anesthésiés.

Choix des espèces

La formation du personnel doit prendre en compte toutes les espèces sur lesquelles il est amené à réaliser des gestes techniques dans le cadre des projets de recherche. Ces espèces sont définies et justifiées dans les protocoles des procédures de R&D. Le programme est développé en lien avec le responsable du suivi des compétences et le manager. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement,…). Ces espèces correspondent aux espèces déclarées et validées dans l’agrément d’établissement utilisateur, ainsi qu’aux espèces déclarées dans les projets de recherche et développement. Ce sont donc les espèces pour lesquelles le personnel doit être formé s’il ne l’est pas déjà Les animaux utilisés sont ceux demandés dans les protocoles d’étude de la R&D. Les souris peuvent être utilisées nouveau-nés dans le cadre de besoin projet (ex : développement de candidat vaccin pour des nouveau-nés). Si des souriceaux âgés entre 24h et

Légèrement immunodéficientes pour tolérer des neurones d'une autre espèce, les souris de ce projet reçoivent des greffes de neurones de cervelet humains, de primates non-humains et de souris. 985 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par chirurgie terminale sous anesthésie pour prélever leur cerveau. La greffe se fait soit in utero, la mère gestante étant opérée sous anesthésie générale pendant moins de quinze minutes avec injection dans le cerveau des fœtus, soit par injection dans le ventricule cérébral du souriceau nouveau-né. Le porteur revendique une approche qui évite l'expérimentation sur des primates non-humains et sur des humains, et annonce 985 animaux au maximum sans détailler le calcul qui aboutit à ce chiffre.

Objectifs

Le développement des neurones du cervelet des espèces de primates, dont l’espèce humaine, reste largement inexploré, malgré l’implication du cervelet dans des troubles cognitifs (autisme), du langage (dyslexie), et moteurs (ataxies). En particulier, se pose la question de propriétés propres aux neurones humains et de primates comparés aux autres espèces animales, dont la souris. Pour répondre à cette question, des protocoles de différentiation in vitro de cellules souches humaines en neurones du cervelet ont été publiés. Cependant, ces approches ne récapitulent pas le développement et l’anatomie normales du cervelet (mauvaise organisation ou absence de certaines structures anatomiques, croissance des neurones limitée, absence de stimulations sensorielles). C’est pourquoi nous proposons de créer un modèle de greffe de ces neurones humains, primates et de souris dans le cervelet de souris. Cette approche permettra d’étudier les propriétés propres aux neurones de cervelet de ces différentes espèces, sans expérimentation sur des individus humains et primates non-humains. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre de parenté entre espèces. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les propriétés propres aux neurones cérébélleux humains. Le développement de notre modèle de greffe permettra d’étudier in vivo des neurones d'espèces variées dont de primates non-humains et humains dans un contexte pathologique (spectre autistique, ataxie cérébelleuse, dyslexie). Il pourrait ainsi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles. La greffe elle-même pourrait aussi être envisagé comme approche thérapeutique pour les troubles du cervelet humain et des autres espèces de Mammifères.

Procédures

Procédure 1: greffe in utero sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection cérébrale sur foetus (

Impact sur les animaux

La greffe in utero est une technique chirurgicale qui peut entrainer une douleur et un stress modérés pendant l’opération (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et utilisés dans les procédures décrites pour analyses histologiques.

Remplacement

Les modèles in vitro différentiés à partir de cellules souches humaines sont encore trop immatures, manquent certaines structures anatomiques, et de stimulation sensorielle, ce qui ne sera pas le cas in vivo. De plus, notre étude in vivo pourrait permettre d’augmenter nos connaissances pour améliorer les protocoles de différentiation in vitro.

Réduction

Ce projet nécessitera au maximum 985 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. De plus, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans des cages ventilées d'une surface adéquate, dans un environnement enrichi, et changés sous flux d'air. Soins spécifiques apportés à la mère gestante. La greffe in utero est effectuée dans une pièce dédiée, après désinfection de la mère, sous analgésie locale et générale, et anesthésie, en température contrôlée (

Choix des espèces

Notre approche permet d’étudier les propriétés propres aux neurones du cervelet d’espèces de primates non-humains et humains sans avoir recours à l’expérimentation sur des animaux primates. Une option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré telle que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-mammifères est trop divergente comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences et envisager une bonne intégration dans des réseaux différents de ceux des Mammifères. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et au stade postnatals critiques dans le développement des neurones du cervelet de souris et humain.

Tués à cinq jours de vie pour prélever leurs tissus, 42 rats nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque raton reçoit quatre administrations de bixafen, un fongicide agricole, directement dans la cavité abdominale sous anesthésie générale, geste dont le porteur indique qu'il peut provoquer une douleur légère. L'étude est présentée comme exploratoire, destinée à récolter des résultats préliminaires pour de futures études, le bénéfice pour les populations exposées aux pesticides étant renvoyé au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme que les modèles in vitro de barrières sang-cerveau ne permettent pas de mimer des intoxications périnatales, ce qui "implique donc le recours à l'expérimentation animale".

Objectifs

Des études récentes montrent que certains pesticides utilisés contre des champignons, largement utilisés actuellement en agriculture, impactent également des cellules humaines. Ce manque de spécificité d’espèces pourrait poser un problème de santé publique important. Parmi les différents composés sur le marché, le bixafen réduit fortement la consommation d’oxygène des cellules. Dans le contexte du cerveau en développement, les barrières protectrices du cerveau nécessitent beaucoup d’énergie pour fonctionner correctement. Ainsi, l’altération de la consommation en oxygène des barrières protectrices du cerveau, provoquée par une exposition au Bixafen, est un facteur de risque méconnu de maladies du développement cérébral. Le premier objectif de cette étude exploratoire est de récolter des résultats préliminaires pour de futures études sur les effets toxiques pour le cerveau en développement des expositions à ces pesticides utilisés contre des champignons.

Bénéfices attendus

Le projet permettra l'acquisition de connaissances inédites concernant l'impact d'une famille de pesticide sur le développement du cerveau humain. A terme, ces connaissances permettront le développement de politique de santé publique qui bénéficieront aux professionnels et aux populations exposés à ces pesticides.

Procédures

Les animaux seront exposés à un pesticide par administration directe dans la cavité abdominale. Cette administration dure 5 secondes et est réalisée sous anesthésie générale. Chaque animal sera soumis à 4 administrations sur l'ensemble de la procédure.

Impact sur les animaux

L'administration directe dans la cavité abdominale est susceptible de provoquer une douleur légère chez les ratons, anticipée par une anesthésie générale. La manipulation des animaux est suscpetible d'engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux des portées sont mis à mort à 5 jours post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses.

Remplacement

Le projet envisage l'étude des barrières protectrices du cerveau en lien avec une exposition expérimentale à un pesticide. Les modèles in vitro de barrières sang-cerveau ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des intoxications périnatales. Ceci implique donc le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi. Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Des points limites concernant la perte de poids ont été définis et seront appliqués. L’administration directe dans la cavité abdominale est réalisée sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le projet sera réalisé sur des rats Sprague Dawley qui est une espèce de référence pour l'étude du neurodéveloppement qui requiert une optimisation de la gestation. Cette lignée a des portées nombreuses et récurrentes. Le projet prévoit d’utiliser des ratons entre 1 et 5 jours afin d’étudier l’impact d'un pesticide sur l’intégrité des barrières protectrices du cerveau au cours du développement précoce.

Cinq injections quotidiennes la première semaine pour déclencher une délétion génique, puis jusqu'à 24 injections sur huit semaines, puis quatre autres sur quatre semaines, toutes sur animal vigile, avec neuf à douze pesées : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les chimiothérapies administrées provoquent la cardiotoxicité et la néphrotoxicité recherchées, avec une perte de poids anticipée et, plus rarement, tachycardie, fibrillation ventriculaire ou insuffisance cardiaque aiguë. Le porteur qualifie cette toxicité aiguë de généralement asymptomatique, et affirme que l'usage d'animaux vivants est "indispensable" parce qu'aucune méthode in vitro ne rend compte de l'"organisme entier". Toutes les souris sont tuées pour prélever les organes destinés aux analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.

Objectifs

L'autophagie est un mécanisme naturel essentiel permettant aux cellules de se débarrasser de leurs composants endommagés et de recycler certains éléments pour faire face à différentes situations de stress. Ce processus joue un rôle clé dans le maintien de l’équilibre cellulaire, en adaptant les ressources de la cellule aux besoins environnementaux. Des molécules naturellement produites par l’organisme peuvent moduler ce processus d’autophagie. Certaines d’entre elles sont libérées par différents organes (comme le foie, le cœur, les reins ou les muscles) et circulent dans le sang. En plus de leur rôle dans la gestion des nutriments et de l’énergie, elles peuvent aussi agir sur des récepteurs présents sur les cellules, ce qui peut freiner ou activer l’autophagie. Des études récentes ont montré que bloquer certaines de ces molécules favorise l’activation du processus d’autophagie dans plusieurs organes, notamment le cœur, le foie et les reins. Certains traitements anticancéreux peuvent entraîner des effets secondaires importants, notamment au niveau du cœur et des reins, augmentant ainsi le risque d’insuffisance cardiaque ou rénale chez les patients. Ce projet vise à évaluer si l’activation de l’autophagie, par le blocage de certaines molécules régulatrices, pourrait protéger ces organes et limiter les effets secondaires de certaines chimiothérapies, dans des modèles expérimentaux chez la souris.

Bénéfices attendus

Le cancer demeure aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité. Bien que la chimiothérapie soit une stratégie anticancéreuse incontournable, son efficacité est souvent entravée par ses effets secondaires délétères. En particulier, la cardiotoxicité et la néphrotoxicité associées aux agents chimiothérapeutiques peuvent provoquer une détérioration progressive de la fonction rénale et cardiaque, limitant ainsi les options thérapeutiques disponibles et réduisant l’espérance de vie des patients. Environ 50 pour cent des patients atteints de cancer développent des complications cardiovasculaires liées aux traitements, et la toxicité cardiaque des anthracyclines concerne jusqu’à 26 pour cent des patients recevant des doses élevées. Par ailleurs, la maladie thromboembolique veineuse représente la deuxième cause de mortalité chez les patients cancéreux, soulignant l’ampleur de l’enjeu clinique et de santé publique. Dans ce contexte, il est urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques capables de prévenir ou de limiter ces toxicités sans compromettre l’efficacité des traitements anticancéreux. L’autophagie joue un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie cellulaire, notamment par l’élimination des organites et des protéines endommagés. La modulation de ce processus pourrait non seulement prévenir les dommages tissulaires causés par la chimiothérapie, mais aussi améliorer la tolérance des patients aux traitements anticancéreux. En ciblant les modulateurs de l’autophagie, cette approche innovante pourrait permettre d’activer les mécanismes naturels de protection cellulaire contre les stress chimiques. Les résultats attendus de ce projet pourraient ainsi déboucher sur le développement de nouvelles thérapies adjuvantes, limitant la toxicité des chimiothérapies, tout en préservant leur efficacité anticancéreuse. Cette stratégie pourrait significativement améliorer la qualité de vie et le pronostic vital des patients atteints de cancer. De plus, les bénéfices de cette recherche pourraient s’étendre au traitement d’autres pathologies où l’autophagie joue un rôle central, notamment dans les maladies cardiovasculaires et les maladies dégénératives. En résumé, ce projet ouvre la voie à des innovations thérapeutiques majeures dans le domaine de l’oncologie et pourrait contribuer à réduire de manière significative les risques liés aux traitements actuels, apportant ainsi une avancée précieuse pour la santé publique.

Procédures

La mise en place des modèles murins implique différentes séries d’injections, variables selon les groupes expérimentaux : Certaines souris recevront 5 injections quotidiennes sur une semaine (traitement par une molécule pour l’induction de la délétion génique). D’autres souris ne recevront aucune injection préalable. Enfin, certaines souris recevront 4 injections hebdomadaires sur 4 semaines. Chaque injection dure quelques secondes et est réalisée sur animal vigile. Pour la mise en place des traitements, les animaux recevront 4 injections sur 4 semaines et d’autres animaux recevront 24 injections sur 8 semaines puis 4 injections sur 4 semaines en fonction des groupes sur animal vigile. Chaque injection dure quelques secondes. Les animaux seront pesés entre 9- 12 fois en fonction des groupes. Chaque pesée dure également quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus dans ce projet sont principalement liés à l’induction de la cardiotoxicité et de la néphrotoxicité par les agents chimiothérapeutiques, effets bien documentés dans la littérature scientifique. Aucun effet indésirable supplémentaire n’est attendu en dehors de ces réactions prévisibles. La toxicité aiguë induite dans ce protocole est généralement asymptomatique, se manifestant parfois par des altérations transitoires de la fonction systolique ou des arythmies cardiaques. Toutefois, une perte de poids corporel est anticipée en raison des effets secondaires des traitements chimiothérapeutiques. Des manifestations symptomatiques graves mais rares peuvent survenir, notamment des épisodes de tachycardie, de fibrillation ventriculaire ou des signes d’insuffisance cardiaque aiguë. Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales (i.p.), qui peuvent provoquer un stress lié à la contention ainsi qu'une douleur localisée de courte durée au point d’injection. Enfin, la modulation du flux autophagique par l’administration de traitements pourrait induire des effets métaboliques imprévus. Ces effets incluent potentiellement des modifications du métabolisme énergétique et des altérations physiologiques générales.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques, car cela est nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable dans ce projet, car les modèles cellulaires ou informatiques ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les organes et des réponses physiologiques impliquées dans la toxicité de certains traitements. Ces effets indésirables résultent de mécanismes multiples qui mobilisent plusieurs systèmes biologiques de manière coordonnée, ce qu’aucune méthode in vitro ou in silico ne peut modéliser de façon fiable. Avant d’envisager l’expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés sur des cellules en culture afin d’analyser certains mécanismes moléculaires de manière simplifiée. Des approches informatiques ont également été utilisées pour prédire certaines interactions biologiques et effets pharmacologiques. Ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas d’évaluer la toxicité globale ou les effets à long terme sur l’organisme entier. Les modèles murins restent aujourd’hui les plus adaptés pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Ils permettent d’étudier simultanément la transformation des médicaments, les interactions entre organes et les réponses immunitaires et inflammatoires associées. Ils offrent également des outils génétiques permettant d’explorer le rôle de certaines voies biologiques dans les effets secondaires observés. L’expérimentation animale reste donc nécessaire à ce stade, mais nous restons attentifs aux avancées scientifiques qui pourraient, à terme, proposer des alternatives fiables permettant de limiter davantage le recours aux animaux.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris, réparties entre les différentes procédures expérimentales. Ce nombre a été déterminé à l’aide d’une analyse préalable, qui a permis d’estimer précisément le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables, tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Afin de réduire encore le nombre d’animaux, les expérimentations seront organisées de manière à mutualiser les groupes témoins chaque fois que cela est possible. Cette approche permettra de limiter la redondance des procédures tout en conservant des comparaisons scientifiquement exploitables. De plus, l’étude pourra être arrêtée dès que les premiers résultats indiqueront que l’objectif scientifique ne pourra pas être atteint, ce qui évitera de mobiliser des animaux inutilement. Chaque animal inclus dans ce projet contribuera à la collecte de plusieurs types de données. À l’issue des procédures, différents organes et tissus seront prélevés pour réaliser plusieurs analyses complémentaires, portant sur les effets immunologiques, les lésions tissulaires ou encore l’étude des mécanismes cellulaires impliqués dans les effets secondaires des traitements. Enfin, il sera nécessaire de réaliser une analyse statistique sur les données recueillies afin de s’assurer que les différences observées entre les groupes sont bien significatives et non dues au hasard. Nous restons attentifs aux évolutions scientifiques permettant de réduire ou de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce type de recherche.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, perte de poids corporel ou des comportements anormaux, ce qui permettra une intervention rapide pour adresser tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. En cas de comportement agressif, notamment chez les mâles, les animaux seront hébergés individuellement pour empêcher l’aggravation de blessures suite à des bagarres. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement.

Choix des espèces

Le choix des souris comme modèle animal se justifie par plusieurs raisons scientifiques. Elles représentent le modèle de laboratoire le plus couramment utilisé, permettant de s’appuyer sur une vaste expertise en élevage, manipulation expérimentale et suivi vétérinaire. Les souris offrent également l’avantage de disposer de modèles génétiquement modifiés ciblant les protéines d’intérêt, ce qui est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les lignées sélectionnées sont immunocompétentes et ne présentent pas de phénotypes spontanés susceptibles de perturber l’interprétation des résultats. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines, afin de disposer d’un organisme dont le développement est achevé.

Une souris qui atteint le score 3 de la grille d'évaluation, ou le score 2 sans amélioration après 48 heures, est mise à mort. 208 souris Alport, qui développent spontanément une insuffisance rénale chronique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leur sang, de leur urine et de leurs organes. À quatre semaines, elles sont castrées sous anesthésie, puis gavées cinq fois par semaine et implantées deux fois sous la peau de capsules d'estradiol ou de dihydrotestostérone, avec des prises de sang et une mesure de fonction rénale de 45 minutes, capteur fixé sur le dos. Le bénéfice annoncé se limite à une meilleure compréhension du dimorphisme sexuel de la maladie chez ces souris, quand la castration, les gavages répétés et l'injection rétro-orbitaire sont immédiats.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si elle n’est pas correctement traitée, l’IRC peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale. Le traitement de l’IRC doit être adapté en fonction du sexe car son incidence et sa gravité sont différents entre les femmes et les hommes. L’objectif du projet est d’étudier l’influence du sexe sur le développement et le traitement de l’IRC. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. Le projet sera mené chez des souris Alport chez qui l’IRC se développe spontanément et rapidement (quelques semaines) en raison d’une mutation homozygote (KO) dans un gène essentiel pour la fonction rénale. Des expériences menées au laboratoire ont montré que chez ces souris, l’IRC était plus fort chez les femelles que chez les mâles au même âge. De plus, seules les femelles étaient sensibles à l’effet protecteur contre l’IRC d’un agent pharmacologique : l’AP#1. Dans le present projet, nous souhaitons tester l’hypothèse de l’implication des hormones sexuelles dans ces dimorphismes sexuels. A cette fin, nous étudierons l’impact de la castration [ovariectomie (OVX) ou orquiectomie (ORX)] et des hormones sexuelles exogènes sur le développement de l’IRC et de son traitement par l’AP#1. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes responsables du dimorphisme sexuel dans l'installation et le traitement de l’insuffisance rénale chronique chez les souris Alport.

Procédures

Les souris femelles et males seront soumises à une castration (sous anesthésie gazeuse et analgésie, durée maximale d’environ 10 minutes) à l’âge de 4 semaines, puis traitées à un agent pharmacologique par gavage (5 fois par semaine) combiné ou non à des hormones sexuelle (estradiol ou dihydrotestostérone sous forme de capsules implantés sous la peau 2 fois au cours du protocole). Tous les animaux seront soumis à des prises de sang (sous anesthésie gazeuse) et à une mesures de leur fonction rénale (sous anesthésie gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 45 minutes et une molécule est injectée). Toutes les procédures non terminales et la mise à mort des animaux seront sont réalisées dans l’EU1. Dans le cas où le matériel nécessaire et/ou des salles de sacrifice seraient indisponibles à l’EU1, la mise à mort des animaux sera réalisée à l’EU2.

Impact sur les animaux

- Castration chirurgicale (OVX, ORX) et implantation de capsules en sous-cutanée: ces interventions peuvent provoquer de la douleur (administration d’anti-douleur) et du stress, et des complications sont possibles (saignement, complications au niveau de la cicatrice). Les problèmes de cicatrisation sont des risques faibles- Gavage et collecte d’urine peuvent induire un léger stress - Prise de sang : les prélèvements de sang seront faits sous anesthésie - Evaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’insuffisance rénale chronique. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.

Réduction

Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, limitant les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre connaissance du modèle utilisé, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 208 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique non paramétrique ou paramétrique (en fonction de la taille des groupes et de leurs distributions). La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autres test statistique.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés (service de zootechnie agréé par le ministère) par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie et les points limites seront soit l’atteinte du score 3 sur l’un des critères, soit l’atteinte du score 2 sans amélioration après 48h de surveillance. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport.

Choix des espèces

L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience antérieure, en tenant compte de la variabilité individuelle de la réponse aux différentes conditions expérimentales. Le nombre de souris par groupe (n=12) est calculé pour espérer observer une différence significative (P

Sept séances d'IRM de trente minutes sous anesthésie, du premier au trente-cinquième jour, et deux défauts osseux percés de part et d'autre de la suture crânienne : 130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après l'opération. La chirurgie dure cinq minutes, l'impression de bioencre au laser directement dans le crâne quinze secondes, et trois injections d'antidouleur suivent l'intervention. Le projet vise à améliorer une bioencre pour la régénération osseuse et à valider une station de bioimpression, des dépôts de brevet figurant parmi les bénéfices annoncés. Les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui permet de leur implanter des cellules humaines, et le porteur indique que ce modèle est le seul dont la taille rentre aujourd'hui dans sa station de bioimpression.

Objectifs

Les pertes de susbtance osseuse, d'origine traumatique, tumorale ou dégénérative, constituent actuellement un problème majeur de santé publique. Les solutions thérapeutiques actuelles présentent toutes des limites et des risques (manque de disponibilité, infections, douleurs au niveau du site de prélèvement, rejet immunitaire). C'est dans ce contexte que se sont développées les stratégies d'ingénierie tissulaire osseuse. De précédentes études ont démontré l'intérêt des technologies de bioimpression pour produire des substituts osseux avec des propriétés optimisées, mimant fidèlement le tissu osseux natif et avec une prévascularisation permettant de limiter le risque de nécrose du greffon. De récents travaux ont pu démontrer la faisabilité d’imprimer des biomatériaux et cellules à l'aide de la Bioimpression Assistée par Laser (LAB) directement au niveau de défauts osseux crâniens chez la souris, pour favoriser une meilleure vascularisation et régénération osseuse. Malgré des résultats prometteurs, les conditions expérimentales n’ont pas permis une régénération osseuse complète. L'objectif principal de ce nouveau projet est d'optimiser les précédents résultats obtenus en développant une nouvelle bioencre, basée sur l'utilisation d'hydrogels naturels et synthétiques associés à différentes particules minérales, ainsi que des cellules souches ou dérivés cellulaires, afin d'améliorer la régénération osseuse par Bioimpression Assistée par Laser in vivo. Le second objectif du projet est de développer une nouvelle stratégie d'imagerie par IRM pour suivre l’organisation des motifs cellulaires, la vascularisation et la maturation tissulaire avec une haute résolution. Afin de répondre à ces deux objectifs, le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet de la bioimpression in vivo combinée à de nouvelles formulations de bioencre, impliquant des nouveaux biomatériaux associés à différentes particules minérales et cellules/dérivés cellulaires. Ces résultats nous permettront d'envisager un/des dépôts de brevet dans le cadre de ces nouvelles applications. Ce projet visera également à évaluer, au niveau biologique, si des dérivés cellulaires pourraient remplacer les cellules elles-mêmes au sein d'une bioencre et si leur ajout est pertinent dans le contexte de régénération osseuse (permettant ainsi à terme de s'affranchir de l'utilisation des cellules souches). D'un point de vue technologique, ce projet constitue une étape-clé dans l'optimisation de notre station de bioimpression in situ, par l'intégration en son sein du dispositif anesthésique, les optimisations technologiques du dispositif au service d'une bioimpression plus précise et l'utilisation d'une nouvelle interface plus intuitive. Enfin, ce projet permettra de valider l'utilisation d'une nouvelle stratégie d'imagerie non-invasive haute résolution, basée sur l'IRM, pour assurer le suivi en temps des cellules bioimprimées in vivo.

Procédures

Au sein du premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ) et une procédure de bioimpression in situ (15 secondes pour l'impression en elle-même ; 5 minutes au total en comptant l'installation de la souris et le paramétrage de l'impression), sous anesthésie. Les animaux seront également soumis à l'administration d'un anti-douleur à 3 reprises (par injection intra-péritonéale) à différents temps (durée 30 secondes pour chaque injection) dans le cadre de la procédure analgésique. Au sein du second établissement utilisateur, l'acquisition de chaque séquence IRM sera de 30 minutes, sous anesthésie, et réalisée à 7 reprises (J1, J4, J7, J14, J21, J28, J35).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie (phase d'induction dans la boîte, entre 2 et 5 minutes) avant la chirurgie. Des douleurs pourront être ressenties lors des injections (anti-douleur), ainsi qu'après la chirurgie (procédure de classe modérée), sur les 3 jours post-opératoires. Le protocole de bioimpression et d'imagerie in vivo (IRM) n'engendreront aucune douleur (classe légère).

Devenir

Les animaux seront mis à mort 2 mois après l'intervention chirurgicale, afin de pouvoir évaluer la vascularisation et la régénération osseuse d'un point de vue quantitatif et qualitatif (microCT, histologie).

Remplacement

Ces expérimentations doivent se faire dans un modèle animal, car un environnement multifactoriel ne peut pas être reproduit in vitro. Seules ces conditions in vivo chez l'animal permettent l’étude de processus dynamiques complexes tels que la vascularisation et la cicatrisation osseuse, étroitement liées, dans un milieu proche des conditions physiologiques. Néanmoins, des expérimentations in vitro préalables seront réalisées (actuellement en cours) afin de déterminer les formulations optimales pour chaque biomatériau à évaluer in vivo et ainsi réduire considérablement le nombre de conditions expérimentales et donc d'animaux. Cinq conditions expérimentales in vivo sont ainsi finalement prévues pour chacun des deux biomatériaux (soit 2 x (5 x n=10) = 100 animaux) et 3 conditions expérimentales pour le suivi par IRM (soit 3 x n=10 = 30 animaux).

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, deux défauts osseux seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture crânienne. Il y aura 10 animaux par groupes, ce qui est le nombre minimal d'animaux que l'ont peut utiliser pour avoir ensuite des analyses statistiques qui soient pertinentes, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe (5 par cage), dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur environnement possible pendant l'étude (nid de coton, litière en copeaux de peupliers et jouets). Les expérimentateurs sont tous titulaires d'une formation Concepteur ou Applicateur, et satisfont aux obligations de formation continue en expérimentation animale. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Du gel lacrymal sera employé afin de limiter la sécheresse oculaire. Les interventions seront réalisées sous anesthésie. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin, après concertation avec le responsable du suivi du bien-être des animaux et en présence du vétérinaire référent. Les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée inférieure à 24h après l’opération pour préserver les sutures et permettre un meilleur rétablissement, puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe pré-opératoire. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet présentent une immuno-déficience marquée, les rendant compétentes pour l’implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Elles seront hébergées à l’animalerie pour une durée maximale de 4 semaines avant l’opération et 10 semaines après l’opération. Elles seront protégées des pathogènes et des opportunistes car hébergées en portoirs ventilés. Le défaut osseux de taille critique de calvaria chez ces souris est un modèle qui est largement validé dans la littérature scientifique. Il s’agit d’un modèle de choix en ingénierie tissulaire osseuse pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Ce modèle animal est également le seul ayant une taille adaptée à la procédure de bioimpression assistée par laser in vivo à l'heure actuelle, permettant son insertion dans la station de travail. De plus, le site d’implantation au niveau de la surface du crâne permet d’avoir une surface facilement accessible et relativement plane, permettant la focalisation du laser sur le centre du défaut osseux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 à 12 semaines, donc dans un stade adulte pour éviter des faux résultats liés à la croissance de l’animal.

Trois jours avant l'accouplement puis au septième jour de gestation, 120 souris femelles sont opérées sous anesthésie générale pour recevoir sous la peau une pompe qui délivre le traitement en continu. 372 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses de tissus. Les 192 descendants passent entre 45 et 60 jours d'âge cinq tests de motricité et de sociabilité, un par jour, pour savoir si des antiépileptiques pris pendant la grossesse augmentent le risque d'autisme, et le porteur prévient d'une possible malformation de la queue chez les petits des mères traitées. Aucun de ces cinq tests n'est nommé. Les procédures décrivent 120 femelles et 192 descendants, soit 312 souris sur 372, et le résumé évoque des pères sans en donner le nombre.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique sont des troubles du développement qui touchent environ trois fois plus d'hommes que de femmes. Ces troubles se manifestent principalement par des difficultés dans les interactions sociales et des comportements répétitifs. Les facteurs environnementaux, comme l'exposition à certains médicaments pendant la grossesse, jouent un rôle important dans l'apparition de ces troubles. Par exemple, des médicaments utilisés pour traiter l’épilepsie, comme l'acide valproïque, ont été confirmés comme pouvant augmenter le risque d’autisme chez l’enfant à naître. D'autres médicaments, comme le topiramate ou la lamotrigine, sont également utilisés pour traiter l’épilepsie, mais leurs effets sur la descendance n'ont pas été clairement étudiés. Bien que ces médicaments n’affectent pas directement le code génétique, ils peuvent influencer l'expression des gènes à travers des mécanismes appelés épigénétiques. Cela signifie qu'une exposition à ces médicaments à des moments critiques du développement de l'embryon ou du fœtus pourrait changer la façon dont certains gènes fonctionnent, augmentant ainsi le risque d’autisme. Notre étude se concentre sur des modèles animaux pour comprendre le rôle de ces mécanismes épigénétiques et le lien entre la prise de ces médicaments par la mère pendant la grossesse et l'autisme chez l’enfant.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à mieux comprendre les risques liés à l'utilisation de certains médicaments antiépileptiques chez les femmes enceintes, et leur impact sur les descendants. À court terme, nous espérons que cette recherche nous aidera à identifier les régions du génome affectées par ces médicaments chez les animaux, ce qui permettra à moyen terme de les étudier chez des personnes atteintes d’autisme qui ont été exposées à ces médicaments avant leur naissance. Cela pourrait conduire à des tests diagnostiques et à la découverte de nouveaux traitements pour l'autisme.

Procédures

3 jours avant l'accouplement et à nouveau à 7 jours de gestation, des pompes osmotiques seront implantées sous anesthésie générale (10 min par implantation) en sous cutané chez les 120 femelles adultes. Les 192 descendants seront soumis à des tests de motricité et d'évaluation de leur sociabilité, en condition vigile ; entre l'âge de 45 et de 60 jours, chaque souris subira 5 tests d'une durée maximale de 10 minutes pour les 4 premiers tests et de 35 minutes pour le cinquième test. Les tests seront réalisés sur 5 jours consécutifs avec 1 test par jour.

Impact sur les animaux

- Chirurgie pour mise en place de la pompe et douleur post-opératoire minorée par des antalgiques, avec inconfort transitoire au réveil - Pompe osmotique sous cutanée : gène légère pendant la durée de l’expérience. -Pour les descendants exposés aux traitements antiépileptiques : légère altération de la motricité et de la sociabilité. -Les tests comportementaux : L’ensemble des tests comportementaux évaluant le développement et la motricité générale pourront engendrer un stress léger et transitoire lié à la manipulation chez les souris et à la découverte d'un nouvel environnement. - Malformation de la queue (malformation congénitale) possible chez les petits issus de mères traitées avec les antiépileptiques

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses de tissus.

Remplacement

Ce projet inclut une étude du comportement, en particulier des aspects sociaux et moteurs, qui ne peut pas être reproduite en laboratoire sur des cellules ou via des modèles informatiques avec les connaissances actuelles. Il y a des éléments obtenus par des études cliniques, in silico et in vitro, sans animaux, qui indiquent une association entre anti-épileptiques et autisme. A ce stade de l'avancée des connaissances, seul une étude in vivo dans un organisme entier avec un réseau de neurones permet d'apporter la preuve du lien de cause à effet.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques pour l’interprétation des résultats obtenus. Le nombre d'animaux à utiliser par expérience a été calculé de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs malgré la variabilité interindividuelle. De plus nous mettrons en place une stratégie d’accouplement restreinte au juste nécessaire en réalisant les accouplements par étapes successives jusqu’à obtention du nombre d’animaux nécessaires à nos études.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée est réalisée 1 fois par semaine. Après leur naissance, les animaux resteront avec leur mère jusqu’au sevrage (J21-J28), hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fournie par l’animalerie avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum.. La prise de sang terminale pour l’analyse épigénétique sera réalisée sous anesthésie avec une couverture antalgique. Les animaux seront placés en habituation dans la pièce de comportement minimum 30 minutes avant le début des tests. Les cages d’hébergement présentent des capteurs et sont suivis par logiciel permettant d’améliorer le bien-être animal et de surveiller et vérifier les cages 24heures sur 24. Enfin afin de respecter le bien-être animal, nous avons choisi à la place d'injections quotidiennes, l'implantation de pompes sous-cutanées délivrant le traitement en continu.

Choix des espèces

Les rongeurs sont à ce jour les espèces modèles ayant un système nerveux moteur proche de l’Homme. Les souris ont l’avantage d’être un modèle de choix pour les études comportementales. La souche de souris que nous utilisons est consanguine ainsi ces animaux présentent un fond génétique identique entre eux. De plus un environnement contrôlé au sein de notre animalerie nous permetta d’identifier des marques épigénétiques spécifiquement liées à l’exposition à l’agent étudié. Les mères et les pères effectueront les reproductions entre l’âge de 12 et 20 semaines (femelles) et 25 semaines (mâles), âge optimal pour la reproduction. Les souris de la descendance seront incluses dans le projet dès leur naissance et manipulées entre Jour 45 et Jour 60 pour les analyses comportementales, âge de référence pour la mise en évidence de troubles du spectre autistique sur le plan comportemental avec les outils utilisés.

Quinze séances d'imagerie sous anesthésie pour les ouistitis infectés par une souche bioluminescente, huit prises de sang, huit écouvillonnages du nez et de la gorge et jusqu'à quatre lavages broncho-alvéolaires pour chacun : jusqu'à 70 ouistitis communs, des primates, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin de projet. Jusqu'à 66 d'entre eux sont infectés sous anesthésie par la grippe A H1N1, qui peut provoquer toux, éternuements, fièvre, diarrhée et perte de poids, et 8 ouistitis sains sont logés avec 16 congénères infectés pour mesurer la transmission. Le porteur justifie leur mise à mort par le risque de contamination et par l'emploi d'une souche génétiquement modifiée. Avant tout test de vaccin, le projet vise à faire reconnaître le ouistiti comme espèce d'étude de la grippe, et le porteur cite parmi ses atouts "la facilité de contention et sa facilité d'approvisionnement".

Objectifs

D’après l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les virus de la grippe saisonnière sont responsables de 3 à 5 millions de malades sévères chaque année, dont 650 000 morts annuellement. En particulier, le virus de la grippe A H1N1, qui a été à l’origine de la pandémie de grippe en 2009-2010, continue aujourd’hui de circuler en tant que grippe saisonnière et de nouveaux variants font peser la menace d’une nouvelle pandémie. Que ce soit pour prévenir ou contenir une infection saisonnière à la grippe A, ou pour soutenir les mesures d’urgence dès l’apparition d’une pandémie, il est essentiel d’avoir des candidats-vaccins et candidats-médicaments éprouvés et validés par les autorités sanitaires. Avant de valider ces candidats, le modèle animal sur lequel ces validations auront lieu doit lui-même être validé. L’objectif de ce projet est de confirmer la pertinence scientifique du ouistiti commun (Callithrix jacchus) comme espèce non-rongeur pour les études concernant le virus de la grippe A H1N1. Cette espèce a déjà fait l’objet d’études publiées sur l’infection à la grippe A H1N1 dans d’autres centres avec des résultats prometteurs. Les deux souches utilisées dans ce projet seront la souche A/California/07/2009 (H1N1) WT et la souche bioluminescente CA07-PASTN NanoLuc® luciferase. Afin de valider ce modèle, une phase d’étude de la cinétique d’infection virale sera réalisée par imagerie de bioluminescence associée à un suivi de la charge virale et un suivi de la réponse immunitaire. Une deuxième phase permettra d’étudier la transmission virale entre des animaux préalablement infectés par la grippe A H1N1 et des animaux naïfs, en co-hébergement.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de caractériser et valider l’utilisation du ouistiti commun comme espèce pertinente pour l’évaluation de la pharmacologie et de la sécurité des candidats-vaccins et candidats-médicaments contre la grippe A H1N1.

Procédures

4 animaux subiront au maximum 3 lavage broncho-alvéolaire réalisée sous anesthésie (geste répété au maximum 3 fois). La procédure de lavage broncho-alvéolaire durera environ 10 à 20 minutes incluant l’anesthésie. Au maximum 66 animaux seront infectés sous anesthésies. Ce geste durera maximum 25 minutes anesthésie comprise. Pour tous les animaux, 8 écouvillonnages nasaux et pharyngés et 8 prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés. Des lavages broncho-alvéolaires seront réalisés 3 à 4 fois sur chaque animal avec un minimum de 6 jours entre 2 lavages. Pour les animaux infectés avec les souches de virus bioluminescentes, des acquisitions d’imagerie par bioluminescence, sous anesthésie, seront réalisés 15 fois au cours de l’étude, avec une injection de substrat bioluminescent avant chaque acquisition. Une mise à jeun de 2 à 3h maximum sera réalisée avant chaque anesthésie. Afin de limiter les anesthésies, lorsque des actes auront lieu le même jour, ils seront faits au cours de la même anesthésie ainsi : - la durée d’une acquisition d’imagerie seule sera d’environ 20 minutes anesthésie comprise - la durée d’une acquisition d’imagerie associée à des écouvillonnages nasaux et pharyngés et un prélèvement de sang sera d’environ 35 minutes anesthésie comprise - la durée d’une acquisition d’imagerie associée à des écouvillonnages nasaux et pharyngés, un prélèvement de sang et un lavage broncho-alvéolaire sera de maximum 45 minutes anesthésie comprise. 8 animaux de ce projet seront hébergés en individuel pendant un maximum de 48h.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’infection par le virus de la grippe A H1N1 : éternuement, toux, jetage nasal, jetage oculaire, perte de poids, diarrhée, fièvre, modifications de la respiration. D’autres effets secondaires attendus sont liés aux actes techniques : - anesthésie : hypothermie, bradycardie, arythmie, arrêt cardio-respiratoire ; - prélèvement sanguin : hémorragie, hématome ; - LBA : toux, dyspnée ; - Ecouvillonnage nasal et laryngée : léger saignement, éternuement, toux ; - Injection IV : hémorragie, hématome.

Devenir

Le risque de contamination à l’homme ou à d’autres animaux par un pathogène de classe 2 et le risque pour l’environnement du fait de l’utilisation d’une souche génétiquement modifiée justifient que tous les animaux soient euthanasiés en fin de projet.

Remplacement

A ce jour, aucune alternative in-vitro à l’expérimentation animale ne permet de mimer les mécanismes d’infection de la grippe à l’échelle d’un organisme entier. De plus, malgré l’emploi d’autres modèles animaux comme les rongeurs (hamsters ou souris) ou les furets, leurs éloignements génétiques liés à l’évolution des espèces comportent quelques limites d’un point de vue physiopathologique et immunitaire. A l’inverse, les modèles de Primates Non Humains dont le ouistiti commun sont plus proches de l’Homme et en font de bons modèles pour étudier la réponse immunitaire/vaccinale et les modalités de transmission des virus respiratoires comme la grippe. Le ouistiti, légèrement plus éloigné génétiquement que le macaque cynomolgus, est une forme de remplacement partiel.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus par étude et par groupe a été évalué en fonction de l’objectif de chaque étape. Ainsi, pour l’étape 1 (étude pilote), seuls 4 animaux seront inclus pour valider la méthode de lavage broncho-alvéolaire. Pour l’étape 2 (cinétique virale), 18 animaux seront inclus et répartis en 2 groupes de 9 animaux. De façon à réduire au maximum le nombre d’animaux et éviter l’utilisation d’un groupe contrôle non-infecté, chaque animal sera son propre témoin, à partir des données récoltées à J-5. Si les résultats obtenus sont insuffisants ou incomplets, cette étape pourrait être répétée sur 24 autres animaux réparties en 3 groupes de 8 animaux afin de tester d’autres souches de virus bioluminescents. Pour l’étape 3 (transmission), 24 animaux seront inclus et répartis en un groupe de 16 animaux (infectés) et un groupe de 8 animaux (non infectés). Ainsi, entre 46 et 70 ouistitis seront utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les ouistitis seront hébergés en groupes sociaux de 2 ou 3 individus (sauf maximum 48h pour 8 animaux) déjà constitués par le fournisseur. Les cages sont conformes aux normes en vigueur, et sont équipées de perchoirs et plateforme, d’un hamac et d’un nid. Le programme d’enrichissement inclut du temps dédié à la socialisation homme-animal et l’habituation aux actes, de la recherche alimentaire (tapis de fouille avec friandises) et un apport de gomme arabique. L’acclimatation durera au moins 2 semaines durant laquelle les animaux seront seulement socialisés et habitués à des actes non invasifs (approche au grillage, nourrissage à la main, pesée, examen clinique), dans la continuité du programme réalisé chez le fournisseur. Une surveillance du maintien de la cohésion des groupes sociaux sera réalisée dans les jours suivant le transport. Si les hiérarchies sont maintenus, l’habituation aux actes débutera la seconde semaine d’acclimatation. Pour éviter une réorganisation des hiérarchies après le transport, des enrichissements de leur cage chez l’éleveur (avec leurs odeurs) seront conservés pendant le transport et transférer dans les nouvelles cages. Tous les actes seront regroupés au même moment, pour réduire le nombre d’anesthésie. Lors de l’anesthésie, du gel oculaire sera appliqué et les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant jusqu’au réveil complet. Pour surveiller l’état de santé des animaux, une grille de score sera utilisée au moins quotidiennement (si nécessaire et en fonction du score, les observations seront effectuées 2 ou 3 fois par jour). Pendant la période d’isolement, les animaux seront maintenus individuellement à côté les uns des autres (communication possible) et ils recevront une socialisation homme-animal plus importante. Des enrichissements de leur cage (en groupe) avec leurs odeurs seront transférés dans leur nouvelle cage pour l’hébergement individuel et une surveillance du maintien de la cohésion des groupes sociaux sera réalisée dans les jours suivant la remise en groupe.

Choix des espèces

Bien que d’autres modèles animaux soient utilisés pour étudier la grippe A (souris, furet), leur éloignement génétique n’en font pas de bons modèles prédictifs chez l’Homme sur le plan physiopathologique et des modalités de transmission. A l’inverse, les Primates Non Humains dont le ouistiti, plus proches d’un point de vue immunologique et physiologique, sont les modèles les plus proches de l’Homme pour l’étude des infections aux virus respiratoires comme la grippe. Plusieurs études ont montré la pertinence de cette espèce pour étudier la grippe A H1N1. De plus, cette espèce a plusieurs atouts comme la susceptibilité aux infections virales à tropisme respiratoire, la facilité de contention et sa facilité d’approvisionnement. Les animaux seront des animaux adultes d’âge compris entre 2 et 5 ans afin que les animaux aient un système immunitaire complétement mature et ainsi réaliser les études avec des groupes immunologiquement homogènes.

Une société agroalimentaire cofinance ce projet pour développer un complément alimentaire réduisant la fatigue cognitive liée au sport intensif. 1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent une heure sur tapis cinq jours par semaine pendant huit semaines, puis passent six tests comportementaux de deux à dix minutes étalés sur deux semaines, censés mesurer leur état émotionnel et leur mémoire. Le porteur indique que ces tests induisent des stress modérés et que l'entraînement provoque une fatigue, sans nommer aucun des six tests, et rattache le tout à des extraits d'algues destinés à des sportifs adultes.

Objectifs

L'exercice intense et répété est associé à une fatigue cognitive. Un des objectifs d'une société agroalimentaire qui cofinance ce projet est de développer des compléments alimentaires qui réduisent la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et régulière. Ainsi, l'objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité d’un extrait végétal sur les performances cognitives et la fatigue après un entrainement physique intense chez la souris ainsi que les mécanismes d’action. Le milieu marin constitue la plus grande partie de la biosphère et contient les formes les plus anciennes et variées de la vie. Cette diversité de vie et d'environnements atypiques ouvrent des perspectives pour le développement de nouvelles molécules bio-actives. Les organismes marins, et notamment les algues marines possèdent un immense potentiel de molécules originales d'intérêt biologique. Ainsi, les extraits d’algues, qui contiennent des molécules aux potentiels bioactifs représentent une stratégie nouvelle. Ainsi, l'objectif de ce nouveau projet sera de tester si l'alimentation de souris avec ces extraits d'algues incorporés dans les croquettes permet de prévenir les troubles émotionnels et mnésiques associés au surentrainement sportif.

Bénéfices attendus

Nous anticipons que ce projet permette de mettre en évidence un effet protecteur d'un ou plusieurs extraits d'algue sur les troubles de la santé cérébrale assiciés au surentrainement physique.

Procédures

Les animaux seront entrainés à courir sur des tapis de course pendant 1h 5 jours par semaine pendant 8 semaines avant de réaliser 6 tests comportementaux durant chacun entre 2 et 10 minutes, étalés sur 2 semaines (3 tests par semaine), permettant d'étudier leur état émotionnel et leur mémoire.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux induiront des stress modérés aux animaux le temps de ces dits tests. L'entrainement physique des animaux induira une fatigue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des analyses biochimiques qui permettront d'étudier les mécanismes neurobiologiques des extraits d'algue.

Remplacement

Le modèle d’entrainement physique ne peut pas être développé in vitro. L’étude des comportements de type anxieux et de résignation, des performances cognitives et de la fatigue ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L'étude de l'effet de régimes alimentaires ne peut pas non-plus être modélisé in vitro

Réduction

Le nombre d'animaux sera reduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des differences entre plusieurs groupes. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les tapis de course que nous avons acquis insufflent de l’air pour encourager les animaux à courir. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bien-être animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la cellule SBEA. La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et du bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition et de l'entrainement physique, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois). Les expérimentations seront réalisées sur des animaux adultes, la finalité du projet étant d'étudier l'impact des extraits d'algues sur des sportifs adultes.