Procédures modérées

Chaque femelle babouin est capturée et anesthésiée cinq fois, pour cinq prises de sang de 16 mL, des injections de denosumab ou de placebo, et l'ablation chirurgicale d'un ovaire suivie de deux à cinq jours d'isolement en infirmerie. 10 babouins femelles âgées de 15 à 25 ans vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer l'effet sur la fertilité d'un médicament contre l'ostéoporose. Le calcul d'effectif repose sur une étude pilote menée sur un seul babouin. Le porteur justifie leur maintien en vie par des prélèvements "pas invalidants", alors que l'une des cinq interventions retire un ovaire à des femelles étudiées pour leur fonction reproductive. Toutes retournent dans leurs groupes sociaux d'origine, et le champ structuré les compte comme réutilisées.

Objectifs

Dans le squelette, certaines cellules osseuses expriment une protéine "RANKL" qui se lie et active un récepteur spécifique "RANK". Ce système de signalisation RANKL est un régulateur reconnu de la santé osseuse, mais sa présence a été démontrée dans les gonades de souris et d'humains, et les données montrent que c'est un puissant régulateur dans la production de spermatozoïdes et de leur motilité. Récemment, des études ont montré que le système RANKL est également présent et actif dans la fonction reproductrice féminine (souris et humains). Les données chez les femmes qui subissent une fécondation in vitro suggèrent que le système RANKL intervient dans le stade précoce de la folliculogenèse et qu'il est également associé à l'âge (sa concentration son inhibiteur plus faible chez les femmes les plus jeunes que chez les femmes âgées de plus de 40 ans). Sur la base de nos données préliminaires, nous suggérons que la signalisation du RANKL joue deux rôles distincts dans la fonction ovarienne : l'un régulant la réserve folliculaire, l'autre jouant un rôle clé durant les dernières étapes de la maturation ovocytaire. Nous émettons l'hypothèse que la signalisation RANKL joue un rôle essentiel dans la fonction ovarienne en régulant la réserve folliculaire et en modulant la maturation ovocytaire pendant les étapes finales du développement folliculaire. Pour tester cette hypothèse, nous mènerons une étude chez le primate non humain (PNH) afin de découvrir le rôle régulateur de la signalisation RANKL pendant la folliculogenèse et la maturation des ovocytes. Ainsi, l'objectif global de ce projet est de découvrir une nouvelle biologie ovarienne qui pourrait être utilisée pour améliorer la fertilité des femmes infertiles et prolonger la longévité reproductive des femmes.

Bénéfices attendus

L'infertilité est un problème courant, qui touche jusqu'à 15 % des couples dans le monde. Actuellement, la plupart des couples infertiles sont traités par des techniques de procréation assistée. Ce traitement réussit dans 70 % des cas, mais il est coûteux, invasif et associé à de potentiels effets secondaires chez la mère. Nos résultats préliminaires indiquent que le système de signalisation RANKL est présent et actif dans la fonction reproductive féminine, constituant ainsi une nouvelle cible pour le traitement de l'infertilité. Le dénosumab, un inhibiteur du RANKL, est actuellement utilisé pour traiter l'ostéoporose et peut donc avoir une importance clinique immédiate. Cependant, les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'Homme ce qui limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les PNH. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'humain, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Nous avons réalisé une étude pilote au cours de laquelle l'analyse de marqueurs sanguins ont démontré que le babouin était sensible au traitement par le dénosumab. Le projet décrit fournira à court terme des informations précieuses sur les effets du traitement au denosumab sur la fonction reproductive féminine évaluée par les changements hormonaux et de l'ovaire. Lorsque nous traitons des animaux ou des humains in vivo avec un inhibiteur de RANKL tel que le Denosumab, moins de petits follicules meurent et plus de follicules survivent et peuvent être recrutés plus tard dans la vie. Cela implique que les femmes vieillissantes pourraient en bénéficier et que les femmes souffrant d'insuffisance ovarienne pourraient profiter de cette opportunité pour avoir de meilleures chances de réussir le prélèvement d'ovocytes lors d'une FIV.

Procédures

Chaque animal sera capturé et anesthésié 5 fois au cours de l'étude : - 3 courtes anesthésies (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin (16 mL) et injection de denosumab ou placebo (T0-T1-T2) - 1 anesthésie de 1 à 2h pour chirurgie (ovariectomie unilatérale) avec prélèvement sanguin (16mL) (T3) - 1 courte anesthésie (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin (16 mL) (T4)

Impact sur les animaux

Stress lors de la capture. Anesthésie (dépression cardiorespiratoire, déshydratation, hypotension, hypothermie). Prélèvement sanguin (risque hématome). Effets secondaires du denosumab : douleurs ostéo articulaires ou musculosquelettiques rapportées fréquemment chez la femme ménopausée sous traitement chronique, de manière moins fréquente infection du tractus urinaire ou respiratoire, constipation, gêne abdominale ou éruption cutanée (aucun effet secondaire rapporté chez le macaque cynomolgus à 8 fois la dose administrée). Complications chirurgicales : saignements, hémorragies, infection de plaie ou déhiscence. Isolement de 2 à 5 jours en post opératoire (ennui, stress).

Devenir

Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine car les prélèvements prévus ne sont pas invalidants.

Remplacement

Récemment, des études ont montré que le système étudié est présent et actif dans les gonades femelles de souris et humains. Cependant, ces études in vitro ont des limites, car l'administration de denosumab a des effets systémiques qui doivent être évalués in vivo. Ce protocole vise à étudier les effets du denosumab qui est un médicament qui agit sur différents organes par des effets systémiques. Ce projet est donc une étape ultérieure à ces analyse in vitro et qui est nécessaire pour étudier les effets du denosumab sur la résorption osseuse et la reproduction féminine. Pour étudier de tels effets systémiques et hormonaux, une étude in vivo est obligatoire et dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.

Réduction

Avant la mise en place de cette étude, une étude pilote a été réalisée pour s'assurer que les babouins sont sensibles au denosumab, et donc que les babouins sont des modèles animaux valables pour le traitement. Le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des données fiables a été choisi afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés. Le calcul de la puissance est basé sur une étude pilote menée sur un seul babouin, où le taux sanguin d'une hormone a augmenté de 40 %. Avec un niveau de test de 5 % (niveau de signification) et une puissance de 80 %, 5 babouins femelles dans chaque groupe à chaque point dans le temps seront suffisants pour atteindre une signification statistique. L'effet sur la folliculogenèse nécessitera également une comparaison entre le placebo et le traitement au denosumab. 4 à 5 animaux dans chaque groupe sont normalement utilisés pour effectuer une telle analyse, ce qui justifie la taille de l'échantillon. Pour réduire le nombre d'animaux, chaque babouin injecté servira également de contrôle interne. L'effet du denosumab sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l'injection.

Raffinement

Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Tous les prélèvements sont réalisés sous anesthésie injectable. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires (i.e. ECG, Fréquence Cardiaque, Fréquence Respiratoire, Température rectale). Suite aux anesthésies, les femelles seront réveillées dans leurs loges d’origine et réintroduites dans leurs groupes dès qu’elles sont suffisament réveillées, selon la procédure validée par la SBEA. Pour l’ovariectomie (T3), l'intervention a lieu sous anesthésie ) et sous analgésie (anti inflammatoires et morphiniques). L’animal sera isolé la veille de l’intervention de son groupe pour assurer la mise à jeûn, puis restera en infirmerie pendant 2 à 5 jours en post opératoire sous traitement antalgique. Il sera alors suivi avec une grille de score et de douleur spécifique et disposera d’un planning d’enrichissement dédié avec 4 enrichissements manipulatoires ou alimentaires journaliers. Après validation de sa récupération et de son état de santé par l’équipe vétérinaire il sera réintroduit dans son groupe d’origine, en accord avec les procédures validées par la SBEA et sous surveillance de l’équipe BEA.

Choix des espèces

Les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'être humain et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'être humain. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Un autre avantage est qu'il est facile de suivre le stade du cycle œstral chez le babouin car il peut être distingué visuellement chez les babouins femelles par des modifications anatomiques de la région périnéale (gonflement et règles). Les animaux inclus seront tous des babouins femelles d'un âge avancé (15-25 ans), mais non ménopausées. En effet, ces animaux seront plus sensibles aux traitements affectant les résultats reproductifs que les jeunes animaux très fertiles, ce qui est important si nous voulons utiliser le médicament pour le traitement de l'ovaire vieillissant chez les femmes.

60 souris subissent chacune deux implantations de cellules tumorales, l'une sous la peau, l'autre directement dans la prostate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les effets attendus courent sur les trente jours de la procédure, perte de poids, perte d'appétit, douleurs prolongées au site de greffe, et pour l'implantation intra-prostatique des saignements, des difficultés urinaires et une gêne des mouvements. Les tumeurs sous-cutanées sont mesurées deux fois par semaine sous anesthésie gazeuse. Toutes sont tuées par dislocation cervicale après anesthésie, pour prélever les tumeurs, les organes lymphoïdes et le foie.

Objectifs

Le taux de cholestérol peut modifier la prolifération et l’activation des cellules immunitaires. La concentration du cholestérol dans les cellules est contrôlée par des récepteurs spécifiques, les récepteurs nucléaires LXRs (Liver X Receptors). Le rôle de ces LXRs dans la composante immunitaire de la prostate tumorale n’est pas clairement établi. Il existe deux récepteurs LXRs, alpha et beta codés par des gènes différents. Au niveau des cellules immunitaires, les deux types de récepteurs semblent avoir des rôles distincts et spécifiques de certains sous-types cellulaires. Ce projet consiste à définir si les deux types de récepteurs ont des conséquences différentes sur la nature et la fonction de l’infiltrat immunitaire des tumeurs prostatiques. Les études seront conduites sur des tumeurs greffées sur des souris avec des cellules immunitaires dont le gène codant pour chacun des récepteurs LXRs est non fonctionnel. Le but de ces travaux sera de définir l’impact de l’absence des récepteurs LXRs dans l’infiltrat immunitaire tumoral prostatique.

Bénéfices attendus

Plusieurs études montrent que les LXRs peuvent moduler le paysage immunitaire de différentes tumeurs avec des rôles différentiels pour les deux isoformes de LXRs . L’objectif de ce travail est de définir les différences d’implication des deux LXRs sur la croissance tumorale et sur la réponse immune antitumorale dans un modèle pré-clinique de cancer de la prostate. L’utilisation d’un modèle syngénique (cellules greffées et hôte de la même espèce) est pertinent pour s’approcher au mieux d’une réponse immunitaire réelle et complète, à l’inverse de l’utilisation de modèles xénogreffés sur souris immunodéprimées. A court terme ce projet donnera des arguments pour poursuivre l’investigation entre les LXRs et la réponse immune chez la souris, notamment pour établir des modèles transgéniques dans lesquels on manipulera de façon génétique l’expression des LXRs dans certaines cellules immunitaires. L’élucidation des rôles précis des LXRs dans ces sous-types immunitaires et la possibilité d’utiliser des modulateurs de leur activité permettrait le développement de thérapies adjuvantes pour accroître l’efficacité de l’immunothérapie du cancer de la prostate.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions :1) implantation sous-cutanée de cellules tumorales de souris réalisé 1 seule fois durée de la procédure maximum 10 secondes 2) une implantation intra-prostatiques des cellules tumorales de souris réalisé une seule fois, durée de la procédure maximum 10 minutes. Toutes les souris seront observées deux fois par semaine selon une grille de score permettant d'évaluer leur comportement et les tumeurs sous-cutanées mesurées deux fois par semaine sous anesthèsie gazeuse (environ 30 secondes).

Impact sur les animaux

Le projet proposé est susceptible d’induire des nuisances, telles qu’une perte de poids, un stress, une perte d’appétit et des douleurs successives au geste chirurgical et à la prise tumorale. En particulier , l’implantation de tumeur en sous-cutanée peut induire des grosseurs susceptibles de gêner les mouvements normaux de l’animal. Il peut induire des douleurs de longue durée ou gonflements au niveau du site de greffe. Une infection/inflammation locale au site d’injection, ainsi que l’apparition d’hématomes font également partie des effets indésirables possibles (sévérité modérée). Des effets systémiques peuvent être attendus : perte de poids, faiblesse musculaire, altération du comportement (sévérité modérée). Ces effets peuvent apparaître pendant toute la durée de la procédure c'est a dire 30 jours. L’implantation de tumeur en orthotopique (intra-prostatique) est une procédure pouvant également induire des effets néfastes, tels qu’une inflammation locale et des douleurs moyennes, de moyenne durée. L’insertion de cellules tumorales dans la prostate (organe richement vascularisé) peut entraîner des saignements locaux de courte durée. Malgré un geste maitrisé, la lésion des structure et tissus environnants est possible, entrainant des difficultés urinaires. La prise tumorale et le développement d’une masse pelvienne peuvent également entrainer des douleurs, et des difficultés urinaires et de motilité de l’animal (sévérité modérée). Ces effets peuvent apparaître pendant toute la durée de la procédure c'est a dire 30 jours. Des effets indésirables consécutifs à l’anesthésie sont possibles : détresse respiratoire, hypotension, bradycardie, hypothermie. Ces effets indésirables sont immédiats et seront pris en charge dans les minutes post-observation. Les données de la bibliographie n’indiquent pas de potentiel métastatique de cette lignée cellulaire, les effets indésirables liés aux métastases ne sont donc pas attendus.

Devenir

Les animaux seront mis a mort par dislocation cervicale apres une anesthesie à l'isoflurane pour les prélèvements de tumeurs, organes lymphoïdes et foie pour analyses.

Remplacement

Ces études sont précédées par des études in vitro de cocultures de milieu tumoral obtenu à partir de lignées cellulaires (cellules tumorales de souris ou autres cellules de cancer de la prostate) et de cellules immunitaires. Nous évaluons notamment l’effet de l’activité ou de l’inactivation des LXRs sur les mécanismes cellulaires impliquant les cellules immunitaires (activation, capacités phagocytaires et migration), permettant de limiter le recours à l’expérimentation animale. Cependant l’utilisation de modèles tumoraux syngéniques (mêmes espèces entre tumeur greffée et animal receveur) permettra d’avoir une cartographie de l’ensemble des cellules immunitaires en fonction de l’état d’activation des LXRs au sein d’un système complet. .

Réduction

Une étude pilote, permettant d’ajuster la dose/le modèle de souris à utiliser dans l’étude principale, effectuée sur un petit lot d’animaux, permettra de limiter le nombre d’animaux inclus dans l’étude. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé et minimisé tout en maintenant la puissance statistique de l’étude. Le prélèvement de plusieurs organes par animal à la fin des expérimenations permet également d’optimiser ce nombre utilisé. Des données préliminaires obtenues par l’équipe in vitro/sur d’autres études ont également été utilisées dans la mise en place du design expérimental, afin d’affiner les hypothèses de recherche et d’éviter l’utilisation trop importante d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 4 souris avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre). L’ensemble des enrichissements est adapté aux éventuels changements de corpulence du rongeur induits par la prise tumorale (grosseurs/gènes locomotrices). Les animaux bénéficieront d’un suivi pré, per et post-opératoire renforcé, qui permettra de détecter toute apparition de souffrance ou de mal être (feuille de score pour chaque animal). Une observation quotidienne est réalisée par les zootechniciens et un suivi bihebdomadaire par les participantes au projet. Une intervention par des traitements analgésiques et anti-inflammatoires est prévue le cas échéant.

Choix des espèces

La réponse immunitaire anti-tumorale est un processus complexe impliquant le dialogue entre de nombreux types cellulaires notamment les cellules de la tumeur et les cellules immunes. L’utilisation d‘animaux immunocompétents permet d’étudier les mécanismes mis en jeu dans un organisme complet, ce qui est majeur pour le developpement de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. L’utilisation du modèle souris permet aussi d’utiliser des organismes modifiés génétiquement et d’étudier des régulateurs spécifiques. Nous utiliserons des individus post-puberts de 2 à 4 mois, correspondant à a période optimale pour les procédures d’implantation au niveau de la prostate.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries dès la gestation avec un régime carencé en oméga 3 ou équilibré, elles subissent une injection stéréotaxique de virus dans le cerveau, une injection de N-oxyde de clozapine, puis un test de mémoire de travail spatiale et un test de mémoire associative. Ce second test consiste à associer un environnement à des "stimulations" appliquées aux pattes, susceptibles selon le porteur de provoquer une douleur passagère, sans qu'il précise lesquelles. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale" et qu'aucune méthode de remplacement n'apparaît dans les bases de données consultées, l'apport annoncé étant une meilleure compréhension des liens entre alimentation et mémoire.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de notre équipe et fait suite à plusieurs années de recherche sur l'impact des acides gras polyinsaturés oméga 3 sur la physiologie du cerveau. Les données obtenues sur ce projet ont donné lieu à plusieurs publications et nous ont permis d'obtenir des soutiens financiers importants (ANR JCJC, JPND Solid européen). La carence en lipides oméga 3 est associée à des déficits du développement cérébral et des altérations de comportement à l'âge adulte. Nos résultats récents indiquent une augmentation de l'activité des neurones de l'hippocampe dans le cerveau lorsque les souris sont soumises à un régime déficient en lipides oméga 3 depuis la gestation chez les mâles et les femelles à l'âge adulte. Cette hausse d'activation de l'hippocampe est associée à une altération des mémoires de travail et associatives dépendantes de l'hippocampe en condition de carence en oméga 3. Notre objectif est de démontrer que cette hyper-activation est responsable des déficits comportementaux par des approches de pharmacogénétiques permettant de diminuer l'activité des neurones de l'hippocampe pendant la tâche comportementale.

Bénéfices attendus

Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche de pharmacogénétique et comportementale. Elle apportera des connaissances nouvelles visant à mieux comprendre les mécanismes cérébraux des troubles de la mémoire en lien avec l'alimentation.

Procédures

Les animaux seront soumis à des régimes carrencés ou équilibrés en oméga-3 depuis la gestation. Ils sont soumis à 1 test comportemental à 3 mois visant à mesurer la mémoire de travail spatiale et la mémoire associative, toutes deux dépendentes de l'hippocampe. Une injection intrapéritonéale de N-oxyde de clozapine juste avant le comportement sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux de la procédure 1 réaliseront un test de mémoire de travail spatiale qui dure 15 min au total sur deux jours (acquisition, test) et ne cause aucune détérioration de l'état général des animaux. Les animaux de la procédure 2 subiront un protocole d'association d'un environnement donné à des stimulations pouvant entrainer une douleur passagère au niveau des pates mais n'entrainant pas de perte de poids, ni d'altération de l'état général des animaux. Pour les deux procédures, les régimes équilibré, carencé en Oméga 3 n’impactent pas le bien-être général de l’animal en termes de comportements alimentaire ou social mais pourraient modifier les capacités cognitives que nous voulons étudier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection stéréotaxique chirurgicale d'un virus dans le cerveau, qui induira une douleur passagère chez les animaux, traitée par une approche d'antalgiques pré et post-opératoire. Une baisse de l'appetit et une diminution du poids des animaux est possible en post-opératoire et nécessitera un suivi post-opératoire journalier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection de N-oxyde de clozapine en périphérie, qui n'a pas d'effet indésirables à la dose et fréquence d'administration sur l'état de bien être des animaux, mais induira une légère douleur passagère liée au geste.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en oméga n-3 sur les mémoires à l'âge adulte chez la souris. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique afin de permettre un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre dans les destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer, notamment concernant l'étude des exosomes. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu tel que des igloo en carton ou en plastique, ainsi que de l'eau et de la nourriture à volonté. Les souris auront plusieurs phases d'habituation : une semaine d'habituation à l'arrivée des géniteurs, une habituation à l'experimentateur avant les tests et/ou les chirurgies, une habituation aux pièces de comportement avant les tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Le projet porte sur le stade adulte des animaux pour lequel des données préliminaires ont été générées chez la souris et la genèse de données nouvelles sur le modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et déclin cognitif, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement notamment à l'âge adulte.

Un patch d'ovalbumine posé chaque jour pendant quatorze jours sous anesthésie, ou du calcipotriol appliqué chaque jour pendant onze jours, avec démangeaisons, rougeurs, œdème et excoriations à la clé. 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que les modèles animaux "ne reproduisent pas fidèlement la complexité" de la dermatite atopique humaine et qu'ils en représentent seulement des sous-phénotypes, puis installe deux de ces modèles dans son laboratoire. Les bénéfices annoncés se limitent à cette installation, pour des projets de recherche à venir.

Objectifs

L’objectif du projet est la mise en place dans notre laboratoire de deux modèles murins de DA déjà établis pour nos futurs projets de recherche sur la DA. La dermatite atopique (DA) est la première et la plus fréquente maladie allergique, touchant 10 à 15 % des enfants en Europe. Cliniquement, elle se manifeste par une peau sèche, une inflammation cutanée et des démangeaisons intenses, qui peuvent être exacerbées par divers déclencheurs tels que les allergènes, les infections ou le stress. Chez les patients atteints de DA, les cellules de l’épiderme produisent de grandes quantités de molécules pro inflammatoire. Alors que 70 % des patients voient leurs symptômes disparaître naturellement pendant l’enfance, 30 % souffrent de symptômes persistants et présentent un risque accru de comorbidités atopiques associées telles que l’asthme, la rhinite ou les allergies alimentaires. Actuellement, il n’existe pas de stratégies préventives efficaces pour la DA. Il existe des phénotypes cliniques distincts de la DA ce qui conforte la nécessité d'une approche médicale personnalisée. La recherche préclinique sur la DA visant à développer de nouveaux traitements, à caractériser les mécanismes fondamentaux de la pathologie et à identifier les sous-types distincts de la DA a depuis longtemps rendu indispensables les modèles animaux appropriés. Malheureusement les modèles animaux ne reproduisent pas fidèlement la complexité de la DA humaine, mais représentent plutôt des sous-phénotypes de la maladie. Une publication récente résume très bien les différents modèles murins de DA existants, leurs caractéristiques et les avantages/inconvénients de chaque modèle. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi de mettre en place au laboratoire, deux modèles de DA différents – ovalbumine et calcipotriol – qui répondent à des questions biologiques différentes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont la mise en place dans notre laboratoire de deux modèles murins de DA pour nos futurs projets de recherche sur la DA.

Procédures

Procédure 1 = anesthésie et application journalière d’un patch ovalbumine pendant 14 jours. Procédure 2 = anesthésie et application journalière de calcipotriol pendant 11 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la présence d’un patch sur le dos, les symptômes liés à la mise en place de la DA (prurit, érythème, œdème et excoriations), les anesthésies gazeuses répétées.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de la DA et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum et calculé pour être statistiquement pertinent pour la mesure du score clinique mais aussi avoir assez de matériel biologique pour effectuer non seulement des coupes histologiques mais aussi les mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le sérum.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique (DA) en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la DA, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris seront âgées de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la DA chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.

Injection de cellules tumorales en moins d'une minute, mesure du volume de la tumeur tous les deux jours sur animal vigile, trois vaccinations sous anesthésie espacées d'une semaine, deux prises de sang, puis radiothérapie. 2 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans un modèle de cancer du sein pour les femelles et de mélanome pour les mâles. Le porteur affirme que le développement de la tumeur ne créera pas de contrainte mécanique et que la radiothérapie, administrée au quart ou à la moitié de la dose maximale tolérée, n'induit aucune nuisance. Toutes sont tuées, soit après avoir atteint les points limites, soit pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité antitumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par le matériel génétique tumoral hors des cellules. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération du matériel génétique tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et potentialise l’immunité antitumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité du matériel génétique dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité antitumorale. Nous avons caractérisé récemment une composante dont la fonction principale est de couper/digérer le matériel génétique libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience de cette enzyme limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de protéine, ciblant le matériel génétique tumoral, dans la régulation de l’immunité antitumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de cette composante dans la régulation de l’immunité antitumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser le rôle d'une composante ciblant le matériel génétique libéré dans les tumeurs dans la régulation de l’immunité antitumorale induite par différentes radiothérapies en oncologie. C’est une question fondamentale car le matériel génétique libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Des résultats préliminaires de nos collaborateurs semblent indiquer que cette composante soit requise pour l’induction de l’immunité antitumorale induite par certaines chimiothérapies, notre but est d’étudier les rôles de cette composante dans les mêmes modèles tumoraux mais traités par radiothérapies. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Procédures

1. L’injection des cellules tumorales ou des anticorps est réalisée en moins d’une minute. 2. Certains animaux de l’étude auront deux prélèvements de sang. 3. La mesure du volume tumoral est effectuée tous les deux jours sur des animaux vigiles. et dure moins d’une minute par souris. 4. La vaccination par des cellules s’effectue sur souris endormies à 3 reprises espacées d’une semaine ; l’injection dure au maximum une minute par souris.

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée à l'injection de cellules par voie sous-cutanée ou dans le coussinet de la glande mammaire est équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille. Le développement des tumeurs sera suivi par des mesures régulières et leur développement ne créera pas de contraintes mécaniques chez les souris. Concernant les nuisances associées aux traitements par les vésicules, des études préliminaires ont montré qu’elles ne seraient pas supérieures à celles induites par une piqûre d’aiguille ; aucune autre douleur n’est prévisible. Dans ce projet, la thérapie radioactive n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la dose maximale tolérée.

Devenir

Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront euthanasiés à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction d’une enzyme coupant/digérant le matériel génétique relargué par les cellules cancéreuses impliquée dans la mise en place de la réponse antitumorale suite aux traitements anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés avec une déficience de cette enzyme. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudierons l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Concernant la gestion de la colonie de souris, nous utilisons les souris femelles pour le modèle de cancer du sein, tandis que les souris mâles seront utilisées pour le modèle de mélanome. Ainsi, les mâles et les femelles issues de notre colonie seront utilisés pour l’un de nos modèles, afin d’optimiser au maximum la gestion de notre colonie.

Raffinement

Nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures (décrits dans la section procédure) mises en œuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. L’approche des points limites entrainera une surveillance accrue des animaux (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car nous avons une souche de souris génétiquement déficiente pour la composante que nous étudions afin répondre au mieux à nos objectifs. Nous utiliserons les souris adultes à partir de 8 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle d’une composante l’induction de l’immunité antitumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein et du mélanome, des pathologies qui affectent exclusivement l’adulte.

Trente minutes de temps de saignement mesuré, ou une thrombose artérielle provoquée pendant quarante-cinq minutes à une heure quinze. 2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent deux injections puis un prélèvement de sang terminal à l'aorte abdominale, d'autres sont anesthésiées, réveillées, puis endormies de nouveau pour deux modèles de saignement successifs. Le porteur indique que la thrombose peut provoquer un accident vasculaire cérébral avec atteinte de la locomotion, et que les animaux ne sont pas réveillés parce que le sang perdu ou la thrombose l'interdit. L'espèce est retenue pour ses lignées déficientes en protéines plaquettaires, et une procédure utilise des souris de trois semaines, dont les vaisseaux encore dépourvus de lipides se laissent léser plus profondément.

Objectifs

Les plaquettes jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement. Lors de ce processus, leur accumulation au niveau de la lésion d’un vaisseau forme un agrégat qui stoppe le saignement. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle qui survient dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes forment un thrombus pouvant entraîner des maladies ischémiques graves telles que l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Des antiplaquettaires sont actuellement utilisées en clinique pour traiter et prévenir la thrombose artérielle. Ils ont prouvé leur efficacité par leur capacité à réduire significativement la mortalité des pathologies de type thrombose, mais ils sont également responsables d’un risque de saignements important. Mieux comprendre les mécanismes impliquant les plaquettes dans l’arrêt des saignements et la thrombose artérielle permet de mieux maîtriser les traitements antiplaquettaires et de développer de nouveaux agents avec un risque hémorragique plus faible. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de prélèvement de sang à l’aorte abdominale permettant d’obtenir une grande quantité de sang non activé afin de réaliser des tests de thrombose in vitro, 2 modèles d’hémostase et 4 modèles de thrombose artérielle. Nous maitrisons largement ces modèles qui serviront d’outils d’évaluation de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la thrombose artérielle, tout en vérifiant l’absence d’une trop grande augmentation du risque de saignement.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de certaines protéines plaquettaires dans l’arrêt des saignements et la thrombose artérielle afin d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques pour la thrombose artérielle. Le bénéfice à long terme pourrait être une meilleure prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle ainsi qu’une réduction des séquelles à long terme de par le développement de nouveaux traitements antiplaquettaires impactant peu l’arrêt du saignement et donc plus sûr pour le patient que les traitements actuellement disponibles.

Procédures

Dans une procédure, les souris sont soumises à une anesthésie, 2 injections et un prélèvement de sang terminal (20 min). Dans une autre procédure, les souris sont soumises à une anesthésie et une injection puis réveillées. Elles sont soumises à 2 autres anesthésie et à 2 modèles de temps de saignement distinct (30 min). Dans une autre procédure, les souris sont soumises à une anesthésie et une injection puis réveillées. Elles sont soumises à une 2e anesthésie, à 2 injections et à une thrombose (entre 45 min et 1h15).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’injection ou d’incision. L’administration éventuelle de traitement pourrait induire des désagréments au niveau du site d’administration comme une douleur localisée, une irritation ou une inflammation, ou encore un saignement en cas de blessure. Un stress lié aux manipulations (administration de la molécule, contention) pourrait apparaitre. La thrombose stable pourrait conduire à un accident vasculaire cérébral avec un impact sur la locomotion.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car la quantité de sang perdu ou la thrombose artérielle ne permet pas de réveiller les animaux.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de protéines plaquettaires dans l’arrêt du saignement et la thrombose artérielle. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’arrêt du saignement in vitro. Cependant, il existe des modèles de perfusion de sang dans un système de flux qui miment partiellement les mécanismes de la thrombose artérielle. Ils seront utilisés au préalable pour tester certaines molécules sur du sang humain. Les processus d’arrêt du saignement et de thrombose étant particulièrement complexes et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, protéines plasmatiques) ainsi que le vaisseau, la pression artérielle et le flux sanguin, les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Si aucun effet n’est observé lors de l’étude de la thrombose in vitro, les autres procédures ne seront pas mises en œuvre. De même, si une trop forte augmentation du temps saignement est observée, les autres procédures ne seront pas réalisées. Les mêmes animaux seront utilisés pour 2 modèles de temps de saignement afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le critère recherché est la comparaison de moyennes. Les effectifs de chaque groupe ont été calculés. Pour la thrombose in vitro, le nombre de souris est fixé à 10 souris/groupe au maximum, pour le temps de saignement à 10 souris/groupe au maximum et pour les modèles de thrombose artérielle à 10 souris/groupe au maximum.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Pour réduire le stress provoqué par la manipulation des animaux, ceux-ci auront une phase d’habituation à la contention et à la manipulation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par la mise en place de nourriture de type « pâté » 3 jours avant le début des expérimentations faisant intervenir une chirurgie • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant l’expérimentation. • Par l’injection d’analgésique et d’antalgique avant chaque procédure chirurgicale. • Par application d’ocrygel sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signes de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont maitrisés, notamment les modèles d’arrêt du saignement et de thrombose artérielle. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris génétiquement déficientes pour certaines protéines plaquettaires parfaitement adaptées à cette étude et qui constituent des outils originaux et uniques. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 2 et 6 mois excepté pour une procédure. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Pour ladite procédure, les souris seront utilisées à l’âge de 3 semaines afin d’éviter la présence de lipides autour des vaisseaux sanguins, permettant ainsi de s’assurer de la lésion adéquate des couches de la paroi du vaisseau (en présence de lipides, la lésion serait trop superficielle).

Prélèvement du bout de la queue sous anesthésie gazeuse au sevrage, deux injections immunisantes, deux prises de sang, puis surveillance de l'apparition de tumeurs pendant douze mois. 486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les lignées sont construites pour surexprimer le facteur c-MYC dans les lymphocytes B, afin d'observer la transformation tumorale qui mène à la leucémie lymphoïde chronique, la moitié des souris de la lignée témoin développant un lymphome vers neuf semaines. Le porteur décrit une douleur continue dès que la tumeur devient palpable, tout en classant l'ensemble du projet en souffrance modérée, la détection de la tumeur servant de point limite.

Objectifs

La Leucémie Lymphoïde Chronique est un lymphome, c’est à dire un cancer des lymphocytes B, très fréquent, particulièrement chez les personnes âgées, dont l’évolution est variable mais qui demeure encore aujourd’hui incurable. Les lymphocytes B assurent normalement la défense de l’organisme contre les agents pathogènes (virus, bactéries…) mais peuvent être sujets à la transformation tumorale en cellules cancéreuses. Nous cherchons à identifier les mécanismes à l’origine de la transformation des lymphocytes B en cellules cancéreuses de la leucémie lymphoïde chronique. A partir de prélèvements de patients nous avons identifié l’altération de l’expression d’un gène qui régule la prolifération cellulaire et la mort cellulaire dans les cellules tumorales. Aujourd’hui, nous souhaitons reproduire cette dérégulation dans les lymphocytes B de souris afin d’étudier son impact sur la transformation tumorale des lymphocytes B. Le modèle murin présente une très forte homologie de structure et de fonction des gènes avec l’humain, et permet de récapituler la complexité des systèmes et interactions cellulaires des organismes entiers nécessaires pour comprendre les évènements mis en jeu dans la transformation tumorale. Dans ces animaux, nous détecterons l’émergence de lymphome et nous étudierons la fonction des lymphocytes B normaux et tumoraux.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence le rôle de l'altération génétique identifiée dans l'altération de la fonction des lymphocytes B ainsi que dans la transformation tumorale de ces cellules. Les bénéfices attendus sont l’apport de nouvelles données permettant une meilleure compréhension de la transformation tumorale dans la leucémie lymphoïde chronique mais aussi de façon plus générale des mécanismes physiologiques qui régissent le développement, la fonction et l’homéostasie des lymphocytes B.

Procédures

Tous les animaux générés seront génotypés au moment du sevrage par prélèvement de bout de queue sous anesthésie gazeuse, un seul prélèvement sera effectué par animal. Tous les animaux du groupe immunisation vont recevoir deux injections de solution immunogène et une injection de marqueur de prolifération cellulaire. Ces animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La survenue de tumeur peut entrainer de la douleur continue. L’injection en intra-péritonéale peut entrainer une douleur d’intensité légère de courte durée. Le prélèvement de bout de queue ainsi que la pose de boucle sous isoflurane induisent un stress physique et transitoire chez l'animal provoqué par la contention ainsi qu'une douleur de faible intensité durant une courte durée au réveil de l'animal. L'immunisation va provoquer un stress physique chez l'animal dû à la contention et une douleur de faible intensité et de courte durée suite à l'administration de l'aiguille. L’apparition de tumeur chez l'animal va entrainer une gêne et une douleur continue chez l'animal lorsque celle ci pourra être détectée par palpation. L'administration de l’analgésique va provoquer un stress physique chez l'animal dû à la contention et une douleur de faible intensité et de courte durée suite à l'administration de l'aiguille.

Devenir

A l’issue des procédures 1 et 2, les animaux de génotype non d’intérêt seront euthanasiés. Tous les animaux sont euthanasiés au cours des procédures 1, 2, 3 et 4. Pour caractériser les sous-populations de lymphocytes B et caractériser les cellules cancéreuses nous devons travailler à partir des lymphocytes B isolés à partir des cellules de la rate et de la moelle osseuse des souris ce qui nécessite l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Dans le but de remplacer l'utilisation des animaux, ce projet a été initié dans une étude pilote menée sur une lignée cellulaire cultivée in vitro. Les résultats obtenus justifient l'approfondissement du projet qui ne peut être mené autrement que dans un organisme entier qui récapitule la complexité du système immunitaire, des intéractions entre populations cellulaires et les évènements oncogéniques. La très forte homologie de structure et fonction entre les gènes d'immunoglobuline humains et murins faisant de la souris le modèle expérimental incontournable pour cette étude.

Réduction

Le nombre des animaux sera réduit au minimum permettant l'obtention de résultats avec une valeur statistique. L'analyse des lymphocytes B normaux et tumoraux des 4 lignées sera réalisée par 4 expériences indépendantes pour assurer la reproductibilité des données. Pour chaque expérience, l'utilisation de 5 souris de chaque lignée permettra de diminuer l'écart type entre les résultats obtenus. Nous pourrons ainsi réaliser une analyse statistique des résultats. Soit un total de 80 souris, c'est à dire 20 souris de chaque lignée. Pour les immunisations, 4 expériences indépendantes seront réalisées avec l'utilisation de 5 souris de chaque lignée (total de 80 souris). Pour l'analyse des lymphocytes B et les immunisations, nous utiliserons des souris d’âge entre 12 et 16 semaines. Pour le suivi du développement de lymphome dans la lignée test d'intérêt en comparaison de la lignée contrôle, pour avoir une valeur statistique, il est nécessaire d’observer l’émergence de tumeur sur un nombre suffisant de souris. Dans la lignée contrôle, l’incidence de lymphome est de 50% à l’âge moyen de 9 semaines. Alors, la surveillance de l’émergence de lymphome, sera effectuée par le suivi de 50 souris de chaque lignée, test et contrôle, jusqu’à l’apparition de tumeurs ou pendant 12 mois afin de pouvoir comparer l’émergence de lymphome entre les deux lignées.

Raffinement

Le phénotype de la lignée contrôle développant des lymphomes est bien décrit et connu, il s’agit d’un phénotype dommageable avec émergence de lymphome caractérisé par des tumeurs à un âge précoce. La lignée test est une lignée créée dans le projet. Son phénotype n’est pas encore connu mais très vraisemblablement il s’agira d’un phénotype dommageable proche de celui de la lignée contrôle avec émergence de lymphome. Les souris feront donc l’objet d’une surveillance accrue consistant à détecter les premiers signes de suspicion d’émergence de lymphome : -aspect : poils hérissés, dos courbé, perte de poids, anomalie du déplacement, apparition d’une masse; -comportement : isolement. En cas de suspicion, l’animal concerné sera palpé afin de déceler une masse cellulaire anormale non décelable à l’observation. La détection de tumeur est un point limite est les animaux concernés seront euthanasiés.

Choix des espèces

Il existe une très forte homologie de structure et fonction entre les gènes d'immunoglobuline humain et murin faisant de la souris un modèle expérimental incontournable pour l'étude du système immunitaire et des évènements oncogéniques aboutissant à des cancers des lymphocytes B, ainsi la souris est l'espèce de référence internationale pour l'étude des cancers des lymphocytes. Les souris utilisées seront adultes âgées d'au moins 10 semaines, âge à partir duquel le système immunitaire est mature, et euthanasiées à l'âge maximum de 12 mois, âge après lequel la lymphomégénèse peut être due à une immunodépression associée au vieillissement.

Achetés adultes chez des fournisseurs, à raison de dix individus par espèce, 120 oiseaux de douze espèces captives, du diamant mandarin au loriquet à tête bleue, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des billes métalliques leur sont implantées dans la langue, le larynx, la trachée et la syrinx, jusqu'à huit par structure, pour rendre visibles leurs mouvements sous rayons X pendant qu'ils vocalisent. Les séances de radiographie et de vélocimétrie laser durent trente minutes par individu et par demi-journée, les lasers étant placés sous les oiseaux pour éviter les brûlures de rétine. Le porteur écrit que les 120 individus seront tués si tous les oiseaux implantés vocalisent devant les caméras, le microscanner nécessaire à la reconstruction en trois dimensions imposant leur mort, et que les oiseaux non implantés qui n'auront pas vocalisé seront gardés en vie et adoptés.

Objectifs

Bien que la production de sons soit essentielle dans l'évolution des oiseaux, elle reste encore mal comprise, notamment au niveau de la mécanique des mouvements. La plupart des études sur la façon dont les oiseaux produisent des sons (chants, cris, appels) ont utilisé des méthodes indirectes, comme des dissections ou des tests sur des oiseaux anesthésiés. Notre objectif est d'exploiter les nouvelles techniques pour observer et mesurer en détail les mouvements des organes vocaux des oiseaux pendant qu'ils chantent, tout en enregistrant le flux d'air sortant de leur bec et les sons produits. L’objectif de cette étude est d’enregistrer, de quantifier pour ensuite modéliser : 1) Les mouvements du système vocal interne et externe lors de la vocalisation 2) Les flux d’air impliqués et 3) Les vocalisations produites sur une diversité d’espèces d’oiseaux. Le but est de comprendre comment les oiseaux produisent et modulent activement le son dans des conditions physiologiques, au plus proche des conditions naturelles de vocalisation. Pour cela, nous voulons filmer les oiseaux vocalisant, en utilisant à la fois un système multi caméras et de cinéradiographie biplanaire (rayons X), pour quantifier la cinématique des parties externes (par exemple bec, cou) et des parties internes (par exemple, trachée, syrinx) du haut du corps. Les enregistrements vidéo seront synchronisés avec des enregistrements acoustiques, à l’aide de microphones. Nous voulons également coupler ces observations à des mesures de flux d'air circulant à la sortie du bec, synchronisées avec des enregistrements acoustiques pendant la vocalisation. Pour cela nous utiliserons la méthode de Particle Image Velocimetry (PIV), une technique de mesure optique permettant d’obtenir le champ de vitesse d’un écoulement d’intérêt à partir de lasers. Pour comparer la production et la modulation du son entre les espèces et les sexes, nous avons choisi 4 familles d’oiseaux, représentant une diversité d’anatomies et de sons produits (c’est-à-dire Passeriformes, Columbiformes, Galliformes et Psittaciformes). Trois espèces par groupes ont été sélectionnées et des individus mâles et femelles seront utilisés pour chaque espèce de façon à mener des analyses comparatives en contexte phylogénétique.

Bénéfices attendus

En comparant la façon dont différentes espèces d'oiseaux produisent des sons, chez les mâles comme chez les femelles, nous allons identifier des structures importantes pour mieux comprendre leurs capacités vocales, à l’échelle de l’individu, du sexe et de l’espèce. Pour la première fois, nous pourrons observer tout le système vocal en mouvement, grâce à l'utilisation combinée de plusieurs techniques : des radiographies en mouvement (cinéradiographie), une méthode optique pour mesurer les flux d’air (PIV) et des enregistrements sonores. Les données détaillées que nous allons collecter permettront de répondre à d’anciennes questions non résolues sur les mécanismes impliqués dans la production de sons chez les oiseaux. En approfondissant notre connaissance de leur communication vocale, nous pourrons mieux comprendre comment des systèmes complexes de communication se développent et évoluent.

Procédures

Les animaux seront filmés à l’aide de caméras rayons X à haute vitesse et enregistrés par des microphones. 1) Les enregistrements par cinéradiographie (rayons X) couplés à des caméras haute vitesse permettront de quantifier les mouvements des structures externes et des structures internes rigides (par exemple le bec, les anneaux cartilagineux de la trachée). Pour quantifier la cinématique des structures non rigides (comme la langue, le larynx) des marqueurs radio-opaques constitués de billes de métal (alliage d’étain et d’argent) seront implantés dans les différentes structures du système vocal avant les enregistrements. Le nombre de marqueurs variera en fonction de la taille de la structure (par exemple, 5 pour la langue, 3 pour le larynx, de 5 à 8 pour la trachée, 3 pour la syrinx) et leur position sera adaptée à la forme et la fragilité de la structure (par exemple, implantés dans les anneaux cartilagineux plutôt que dans les parties molles de la trachée). Une étude pilote sur 2 individus par espèce sera réalisée pour s’assurer que les oiseaux implantés sont bien capables de vocaliser. 2) Les oiseaux filmés en cinéradiographie sans marqueurs ou avec marqueurs seront enregistrés en vélocimétrie par images de particules. Cette technique permet de quantifier les mouvements d’air impliqués dans la vocalisation à l’aide de particules en suspension dans l’air et de lasers. Cela permettra de s’assurer que les mouvements du système vocal et de l’air pendant la vocalisation ne diffèrent pas entre les oiseaux implantés et les oiseaux non implantés.

Impact sur les animaux

Les risques pour les oiseaux pendant les enregistrements par vélocimétrie par images de particules, cinéradiographie et système multi-caméras seront prévenus au maximum. Nous maintiendrons la salle à moins de 27°C, fournirons de l'eau et limiterons les enregistrements à 30 minutes par individu et par demi-journée. Les lasers susceptibles de provoquer des brûlures seront positionnés sous les oiseaux pour éviter les impacts sur les rétines, déclenchés après leur phase d'exploration, avec des flashs brefs en salle obscure et éclairée par des lampes infrarouges. Les oiseaux seront étroitement surveillés pour tout signe de détresse, et des ajustements seront faits si nécessaire. Pour la cinéradiographie, les animaux seront surveillés pour éviter la surexposition aux rayons X, bien que les études précédentes n'aient pas montré d'effets secondaires. Toute mesure sera prise pour éviter l'inconfort et la douleur lors de l’implantation des marqueurs, avec une surveillance régulière des zones implantées et du comportement des oiseaux.

Devenir

Les animaux implantés, ayant permis la prise de données cinématiques doivent être scannés en microtomographie (CTscans) pour reconstruire le mouvement en 3D des organes étudiées. Cette procédure nécessite la mise à mort des individus. Par exemple, si tous les oiseaux implantés vocalisent dans le champ des caméras rayons X, les 120 individus seront mis à mort. Les animaux n'ayant pas vocalisé dans le champ de caméras (Rayons X) ou du système de vélocimétrie par images de particules et n'ayant pas été implantés seront gardés en vie et seront adoptés.

Remplacement

Comme les organes vocaux internes sont difficiles à visualiser, la plupart des mesures et des expériences ont jusqu'ici utilisé des méthodes indirectes, telles que des dissections, des préparations d'organes vocaux excisés et des mesures de la pression des sacs aériens, ou ont été enregistrées lors de stimulations neurales d'oiseaux anesthésiés. Malgré les résultats importants fournis par ces études, une contrainte majeure demeure : les structures impliquées ne peuvent pas bouger et moduler le son comme elles le feraient in vivo. Nous souhaitons mettre à profit les progrès méthodologiques récents en termes de collecte et de traitement des données pour comprendre comment les oiseaux produisent et modulent activement le son, dans des conditions physiologiques proches des conditions naturelles. De ce fait l’utilisation d’animaux vivants, libres de leurs mouvements est incontournable.

Réduction

À part une étude réalisée en 2015, aucune n’a examiné la diversité des mécanismes de production des sons chez différentes espèces d'oiseaux. Nous nous basons sur cette étude pour choisir les espèces et le nombre d’individus à étudier. Dans cette étude, quatre groupes d’oiseaux avaient été sélectionnés : les Paléognathes, Columbiformes, Psittaciformes et Passériformes, car ils représentent une grande diversité anatomique, sonore et évolutive. Comme les Paléognathes (autruches, émeus, nandous) sont souvent de grande taille et difficiles d’accès, nous avons les avons remplacés par les Galloanserae, un autre groupe ancien qui diverge tôt dans l’évolution des oiseaux modernes. Nous avons choisi d’inclure 3 espèces par groupe (soit 12 espèces au total), afin d’avoir une étude plus équilibrée et statistiquement solide que celle de 2015, dans laquelle le nombre d’espèces par groupe variait de 1 à 2. Habituellement, les études en biomécanique impliquant la cinéradiographie ne concernent que peu d’individus (2 à 4) et d’espèces (1 à 3). Nous avons donc décidé d’étudier 5 individus par sexe (soit 10 individus par espèce), et d’analyser les données d’au moins 3 individus par sexe, ce qui permet de pallier aux difficultés de prise de données (comme un oiseau qui ne vocalise pas). Nous prévoyons d’analyser entre 5 et 20 séquences de sons par individu, ce qui nous donnera 30 à 120 séquences par espèce, un nombre considéré comme suffisant pour obtenir des données exploitables statistiquement pour des analyses comparatives entre les espèces. Nous utiliserons des modèles mathématiques appelés modèles linéaires mixtes pour comparer certains paramètres des sons (comme les fréquences de vocalisation) en fonction du type de vocalisation ou du sexe, et nous prendrons en compte les différences entre individus.

Raffinement

Les études biomécaniques sur les vocalisations des oiseaux nécessitent des observations sur des animaux non anesthésiés et en bonne santé. Le bien-être des oiseaux est essentiel à chaque étape de l'expérimentation. Ils proviendront de fournisseurs externes et seront logés dans des cages adaptées avec des enrichissements comme des perchoirs, des balançoires et des zones de bain. Chaque espèce sera hébergée individuellement pour minimiser le stress, et les sexes seront séparés pour éviter les reproductions non souhaitées. Toutes les méthodes seront adaptées pour réduire la douleur et le stress des animaux. Les procédures invasives seront limitées aux cas strictement nécessaires, avec un protocole d'anesthésie élaboré avec un vétérinaire. Une période d'acclimatation à la salle d'expérimentation sera mise en place, et des experts veilleront au bien-être des oiseaux 7 jours sur 7.

Choix des espèces

Les espèces choisies sont des espèces captives, habituellement utilisées en expérimentation animale (elles ont toutes fait l'objet d'études expérimentales sur les vocalisations ou dans des conditions expérimentales similaires). Elles sont de taille relativement réduite et donc compatible avec le protocole expérimental choisi : Poule domestique (Gallus gallus), Sarcelle à collier (Callonetta leucophrys), Caille des blés (Coturnix coturnix), Diamant mandarin (Taeniopygia guttata), Canari domestique (Serinus canaria domestica), Moineau du Japon (Lonchura striata domestica), Pigeon biset (Columba livia), Tourterelle domestique, (Streptopelia risoria), Colombe diamant (Geopelia cuneata), Calopsitte élégante (Nymphicus hollandicus), Perruche ondulée (Melopsittacus undulatus), Loriquet à tête bleue (Trichoglossus haematodus) Bien que pour certaines espèces, seuls les mâles soient considérés comme chanteurs, toutes les espèces choisies produisent des vocalisations stéréotypées (mâles et femelles) mais diversifiées avec des mécanismes de production variés. Ces espèces représentent donc une diversité morphologique et acoustique au sein du groupe des Aves. Tous les oiseaux seront achetés adultes ou sub-adultes (>1 ans), de façon à ce que leur apprentissage du chant soit consolidé et leurs organes vocaux matures. Tous les oiseaux seront achetés adultes ou sub-adultes (>1 ans), de façon à ce que leur apprentissage du chant soit consolidé et leurs organes vocaux matures.